CN1305000A - 编码glk基因的新核苷酸序列 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分离的多核苷酸,其包括选自如下一组的多核苷酸序列:a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸,b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸,c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸,以及d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及通过增强编码葡糖激酶的glk基因发酵生产L－氨基酸的方法。

Description

编码glk基因的新核苷酸序列
本发明提供了编码glk基因的核苷酸序列，和用棒状细菌经发酵生产L-氨基酸，尤其L-赖氨酸的方法，其中棒状细菌中glk基因是增强的。
L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，但特别用于动物营养。
已知L-氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵生产。由于氨基酸的极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施如搅拌和供氧，或营养培养基的组分如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S-(2-氨乙基)一半胱氨酸有抗性，或重要的调节氨基酸缺陷的并产生L-氨基酸如L-赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒状菌生产L-氨基酸的菌株的改良。其通过扩增L-氨基酸生物合成基因，并研究对L-氨基酸生产的作用而进行改良。这方面的综述文章见Kinoshita(“谷氨酸细菌”，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，Benjamin Cummings，英国伦敦，1985,115-142),Hilliger(生物技术2,40-44(1991)),Eggeling(氨基酸6:261-272(1994)),Jetten和Soloman(生物技术的关键回顾15,73-103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782,25-39(1996))。
本发明人目的在于为改良L-氨基酸特别是L-赖氨酸的生产而提供新措施。
L-氨基酸特别是L-赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养。因此提供生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提及L-赖氨酸或赖氨酸时，不仅指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了衍生自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列。
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸序列互补的多核苷酸，
d)含有a)、b)或c)的多核酸序列的至少15个连续碱基的多核苷酸。
本发明还提供了在棒状细菌中能复制的优选重组DNA。
本发明还提供了是RNA的多核苷酸。
本发明另外还提供了如权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸优选是能复制的DNA，包括：
(ⅰ)SEQ ID NO:1的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
本发明还提供了：
含有权利要求1的多肽的载体及含有所述载体作为宿主细胞的棒状细菌。
本发明还提供了一种多核苷酸，其基本上包括一种多核苷酸序列，其可通过用含有相应于SEQ ID NO:1所述多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述文库含有具有相应于SEQ ID NO:1的多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码葡糖激酶的全长cDNA，以及分离与葡糖激酶基因具有高度相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码葡糖激酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸包括至少30个，优选至少20个，特别优选至少15个连续碱基，具有至少40个或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般指多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO:2的多肽，特别是具有葡糖激酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO:2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO:2的多肽至少80％，特别是90-95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产L-氨基酸的棒状细菌发酵生产L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码glk基因的核苷酸序列是增强的，尤其是过表达的。
文中术语“增强”是指微生物中由相应DNA编码的-或多种酶的胞内活性的提高，例如通过提高基因的拷贝数，用强启动子或用编码高活性相应的酶的基因，及如果需要组合使用这些方法。
本发明的微生物可以从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产氨基酸尤其是L-赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌的代表菌，尤其是棒杆菌属。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L-氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC13032
醋谷棒杆菌ATCC15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870
嗜热产氨酸棒杆菌FERM BP-1539
Corynebacterium melassecolaATCC17965
黄色短杆菌ATCC14067
乳发酵短杆菌ATCC13869和
扩展短杆菌ATCC14020和从中获得的生产L-氨基酸的突变体和/或菌株如：
谷氨酸棒杆菌FERM-P1709
黄色短杆菌FERM-P1708
乳发酵短杆菌FERM-P1712
谷氨酸棒杆菌FERM-P6463
谷氨酸棒杆菌FERM-P6464和
谷氨酸棒杆菌DSM5715
本发明已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码葡糖激酶(EC2.7.1.2.)的新glk基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的glk基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chemie,Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(冷泉港实验室出版社，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50,495-508(1987))在入载体中建立的E.coli K-12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252:255-265,1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCosⅠ(Wahl等，1987，美国科学院院报84:2160-2164)，在E.coli K-12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。Borrnann等(分子微生物学6(3),317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11,291-298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒pBR322(Bolivar，生命科学25,807-818(1979))或pUC9(Vieira等，1982，基因19:259-268)。合适的宿主尤其限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74:5463-5467,1977)所述。
以此方式可获得编码glk基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO:1，是本发明的一部分。用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得glk基因产物的氨基酸序列以SEQ ID NO:2表示。
通过遗传密码简并性产生自SEQ ID NO:1的编码DNA序列也是本发明的一部分，另外，保守氨基酸置换如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是有义突变，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C-末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169:751-757(1987)),O’Regan等(基因77:237-251(1989)),Sahin-Toth等(蛋白质科学3:240-247(1994)),Hochuli等(生物/技术6:1321-1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO:2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
同样，与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:1的部分杂交的DNA序列也是本发明的组成部分。最后，用产生自SEQ ID NO:1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分，这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41:255-260)。用聚合酶链反应(PCR)扩增DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham:PCR(Spektrum Akademischen Verlag,Heiclelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在glk基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产L-氨基酸，尤其是L-赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L-氨基酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白质的分解也可提高酶活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增，或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5,137-146(1987)),Guerrero等(基因138,35-41(1994)),Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6,428-430(1988)),Eikmanns等(基因102,93-98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893,Schwarzer和Puhler(生物/技术9,84-87(1991)),Reinscheid等(应用及环境微生物学60,126-132(1994)),LaBarre等(细菌学杂志175,1001-1007(1993)),专利申请WO96/15246,Malumbres等(基因134,15-24(1993))，日本特许公开JP-A-10-229891,Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58,191-195(1998)),Makrides(微生物学综述60:512-538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的glk基因通过质粒被过表达。
适当的质粒载体是在棒状细菌中能复制的质粒。一些已知质粒载体例如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64:549-554),pEKEx1(Eikmanns等，基因102:93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107:69-74(1991))是基于隐蔽性质粒pHM1519,pBL1或pGA1的。其它质粒载体例如基于pCG4(US-A4,489,160)或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66,119-124(1990))或pAG1(US-A5,158,891)的质粒载体可以相同方式使用。
也可使用利用其通过整合入染色体扩增基因的那些质粒载体，例如已由Reinscheid等所述(应用及环境微生物学60,126-132(1994))用于复制和/或扩增hom-thrB-操纵子的质粒载体。在此方法中，全长基因在能在宿主(典型地为大肠杆菌)而不能在谷氨酸棒杆菌中复制的质粒载体中克隆，可提及的适当载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1,784-791(1983)),pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145,69-73(1994)),pGEM-T(Promega公司，Madison,WI，美国)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269:32678-84；美国专利5,487,993),pCRBlunt(Firma有限公司，Groningen，爱尔兰；Bemard等，分子生物学杂志234:534-541(1993))或pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173:4510-4516)。然后将包括待扩增基因的质粒载体通过接合或转化而转移入所需谷氨酸棒杆菌菌株中。接合方法例如由Schafer等所述(应用及环境微生物学60,756-759(1994))。转化方法例如由Thierbach等(应用微生物学及生物技术29,356-362(1988)),Dunican和Shivnan(生物/技术7,1067-1070(1989))及Tauch等(FEMS微生物学通信123,343-347(1994))所述。在通过交换同源重组之后，所得菌株包括至少2个拷贝的相关基因。
本发明因此还提供了L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的发酵生产方法，其中使用用质粒载体转化的菌株，且此质粒载体携带编码葡糖激酶的核苷酸序列。
另外，除增强glk基因之外，增强所需L-氨基酸生物合成途径的其它基因，从而相关生物合成途径，糖酵解，添补反应，柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶是过表达的，这对L-氨基酸的生产是有益的。
因此，为生产L-赖氨酸，例如以下基因可被同时过表达：
·编码二氢-2,6-吡啶二羧酶合酶的dapA基因(EP-B-0197335)，或
·编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等，(1990)，分子及普通遗传学224:317-324)，或
·编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，或
·编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，或
·编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，或
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikamanns(1992)，细菌学杂志174:6076-6086)，或
·编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等，欧洲生物化学杂志254,395-403(1998))，或
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE-A-19548222)。
另外，除glk基因之外，同时弱化以下基因对L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的生产可以是有益的：
·编码烯醇丙酮酸羧化酶的pck基因〔DE19950409.1；DSM13047〕和/或
·编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478；DSM12969)。
除过表达glk基因之外，排除非所需二级反应对L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl,Sikyta,Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或在分批方法(分批培养)，或在补料分批或重复补料分批法中分批培养以生产L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸。已知培养法由Chmiel(Bioprozesstechink l.Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik)(Gustav Fischer VerlagStuttgart,1991)所著教材，或由Storhas(Bioreaktoren und pepriphereEinrichtungen(Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))所著教材中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求。关于各种微生物培养基的阐述见于美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.USA,1981)。可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸。这些物质可单独或混合使用。可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液，大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素。此外，可将适当前体加入培养基中。上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH,KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的pH值。抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃-45℃，优选25℃-40℃，持续培养直至赖氨酸形成最大量。此目的通常在10-160小时范围达到。
本发明还提供了发酵生产L-氨基酸、尤其是L-赖氨酸的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵生产L-氨基酸的棒状细菌，其中至少编码葡糖激酶的基因是增强的，尤其是过表达的。
b)富集培养基或细菌细胞中的L-氨基酸，及
c)分离L-氨基酸。
L-氨基酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等〔分析化学，30(1958),1190〕所述茚三酮衍生化作用进行。
本发明的方法用于发酵制备L-赖氨酸。
本发明借助于以下实施例得以更详细阐述。
实施例1：制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因组粘粒基因文库。
如Tauch等(1995，质粒33:168-179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码号27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。将得自Stratagene公司(LaJolla,USA，产品描述Super Cos1粘粒载体试剂盒，编码号251301)的粘粒载体SuperCos1(Wahl等(1987)美国科学院院报84:2160-2164)的DNA，用限制性内切酶XbaⅠ(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述XbaⅠ，编码27-0948-02)酶切，并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，编码27-0868-04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032 DNA片段混合，并用T4 DNA连接酶(AmershamPharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA连接酶，编码27-0870-04)处理。连接混合物然后用GigapackⅡ XL包装提取物(Stratagene,La Jolla,USA，产品描述GigapackⅡ XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16:1563-1575)，将细胞置于10mM MgSO4中并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等，(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定。细胞在含100μg/ml氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板，在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2glk基因的分离与测序
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)，根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述Sau3AⅠ，编码27-0913-02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExⅡ凝胶提取试剂盒(产品号20021,Qiagen,Hilden，德国)分离大小范围为1500-2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500-01)的测序载体pZero-1的DNA，用限制性内切酶BamHⅠ(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述BamHⅠ，产品号27-0868-04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech,Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994,FEMS微生物学通信，123:343-7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant,1990,美国科学院院报87:4645-4649)，并在含有50μg/ml zeocin的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot9600(产品号900200,Qiagen,Hilden，德国)进行。测序用Zimmermann等(1990，核酸研究18:1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74:5463-5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044,Witerstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒。”在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“Rotiphoresis NF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29:1)(产品号A124.1,Roth,Karlsrwhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14:217-231)版本97-0处理，pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden,1986，核酸研究，14:217-231)制备计算机辅助编码区分析，同源性分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25:3389-3402)，对“国家生物技术信息中心”(NCBI,Bethesda,MD,USA)的非冗余数据库进行。
获得的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，对该核苷酸序列的分析显示一969碱基对的开放读框，其被称为glk基因，glk基因编码323个氨基酸的多肽。
实施例3增强谷氨酸棒杆菌的glk基因的穿梭载体pEC-K18mob2glkexp的构建
3.1克隆glk基因
根据Eikmanns等的方法(微生物学140:1817-1828(1994))分离菌株ATCC13032的染色体DNA。基于实施例2中已知的谷氨酸棒杆菌的glk基因的序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应：
glk-ex1:5’ACT GAC GTG AGC CAG AAC3’
glk-ex2:5’GAT CTA TCT AGA CAC CTA GTT GGC TTCCAC3’
通过ARK生物系统科学有限公司(Darmstadt，德国)合成所列引物，并根据Innis等的标准PCR方法(PCR方法及应用指导，1990，科学出版社)，用Roche Diagnostics GmbH(曼海姆，德国)的Pwo聚合酶进行聚合酶链反应(PCR)。借助于聚合酶链反应，引物使携带glk基因的1.45kb大小的DNA片段扩增，此片段携带具有潜在启动子区的glk基因。扩增的DNA片段的DNA序列通过测序检验。
3.2大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2的构建
根据现有技术构建大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体。此载体包括含有复制效应子per的质粒pGA1的复制起点rep(US-A-5,175,108；Nesvera等，细菌学杂志179,1525-1532(1997))，赋予卡那霉素抗性的转座子Tn5的aph(3’)-Ⅱa基因(Beck等，基因19,327-336(1982))，质粒pMB1的复制区oriⅤ(Sutcliffe，定量生物学冷泉港研讨会43,77-90(1979))，含有lac启动子和多克隆位点(mcs)的LacZα基因片段(Norrander,J.M.等，基因26,101-106(1983))以及质粒RP4的mob区(Simon等，生物/技术1:784-791(1983))。将构建的载体转化入大肠杆菌菌株DH5α中(Hanahan,DNA克隆实用方法，第1卷，IRL出版社，牛津，华盛顿DC，美国)。通过将转化体分批铺板于已补加25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，2ndEd，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.)上选择携带质粒的细胞。用Qiagen的QIA prepSpin微量制备试剂盒，从转化体中分离质粒DNA，并通过限制性内切酶EcoRⅠ和HindⅢ酶切，随后琼脂糖凝胶电泳(0.8％)进行检验。此质粒被称为pEC-K18mob2，并如图1所示。
以下微生物根据布达佩斯条约，保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，不伦瑞克，德国)：
·谷氨酸棒杆菌DSM5715/pEC-K18mob2，保藏号DSM13245。
3.3大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2中glk的克隆
实施例3.2中所述的大肠杆菌-谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-K18mob2用作载体。此质粒的DNA用限制性内切酶Ecl136Ⅱ完全酶切，然后用虾碱磷酸酶(Roche Diagnostics GmbH，曼海姆，德国，产品描述SAP，产品号No.1758250)去磷酸化。
如实施例3.1所述获得的glk片段与制备的载体pEC-K18mob2混合，并用T4-DNA-连接酶(Amersham Pharmacia,Freiburg，德国，产品描述T4-DNA-连接酶，编码No.27-0870-04)处理。连接物转化入大肠杆菌菌株，DH5αmcr(Grant,1990，美国科学院院报，87:4645-4649)中。通过将转化体铺板于具有25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Lennox,1955，病毒学，1:190)上选择携带质粒的细胞。重组的各个细胞在37℃保温过夜后选择。用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106,Qiagen,Hilden，德国)根据厂商指导从转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，以通过随后的琼脂糖凝胶电泳检测质粒，所得质粒被称为pEC-K18mob2glkexp，并示于图2。
实施例4用质粒pEC-K18mob2glkexp转化谷氨酸棒杆菌菌株RES167
通过由Liebl等所述电穿孔法(FEMS微生物学通信，53:299-303(1989))，用质粒pEC-K18mob2glkexp转化谷氨酸棒杆菌RES167(Schafer,A等，细菌学杂志176:7309-731(1994))。在含有18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l Bacto-胰胨，2.5g/l Bacto-酵母膏，5g/l NaCl和18g/l Bacto-琼脂，且已补加25mg/l卡那霉素的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃培养二天。
通过通用方法(Peters-Wendisch等，微生物学，144:915-927(1998)从转化体中分离质粒DNA，用限制性内切酶EcoRⅠ和XbaⅠ酶切，并经随后的琼脂糖凝胶电泳检测质粒。所得菌株被称为谷氨酸棱杆菌RES167/pEC-K18mob2glkexp。
实施例5：赖氨酸的生产
实施例4中获得的谷氨酸棒杆菌菌株RES167/pEC-K18mob2glkexp在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有适当抗生素的琼脂平板(具有25mg/l卡那霉素的脑心琼脂)上培养菌株24小时。用此琼脂平板培养物接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)，完全培养基CgⅢ用作预培养的培养基。培养基CgⅢ NaCl           2.5g/l
       Bacto-胨       10g/l
       Bacto-酵母膏   10g/l
       葡萄糖         2％(w/v)(单独高压灭菌)
       pH调节为7.4
向此培养基中加入卡那霉素(25mg/l)。在摇床上于33C以240rpm振荡培养预培养物24小时。用此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始光密度OD(测量波长660nm)是0.05。培养基MM用作主培养基。培养基MM：CSL             5g/l
      MOPS            20g/l(吗啉代丙磺酸)
      葡萄糖          50g/l(单独高压灭菌)
      (NH4)2SO4   25g/l
      KH2PO4       0.1g/l
      MgSO4·7H2O  1.0g/l
      CaCl2·2H2O  10mg/l
      FeSO4·7H2O  10mg/l
      MnSO4·H2O   5.0mg/l
      生物素          0.3mg/l(过滤灭菌)
      硫胺素·HCl     0.2mg/l
      CaCO3         25g/l
用氨水将CSL,MOPS和盐溶液调节至pH7并高压灭菌。然后加入无菌底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养。加入卡那霉素(25mg/l)。在33C和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckmann Instruments GmbH,Munich)测定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测栓后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
菌株 OD(660) 赖氨酸HCl(mg/l)
谷氨酸棒杆菌RES167  13.8  287
谷氨酸棒杆菌RES167/pEC-K18mob2glkexp  15  345
本发明具有如下附图：
图1：质粒pEC-K18mob2图谱
图2：质粒pEC-K18mob2glkexp图谱
图中缩写和符号含义如下：
per：pGA1的控制拷贝数的基因
oriV：pMB1的ColE1复制起点
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒复制区
RP4mob:RP4移动位点
Kan：卡那霉素抗性基因
glk：谷氨酸棒杆菌的glk基因
EcoRⅠ：限制酶EcoRⅠ的酶切位点
HindⅢ：限制酶HindⅢ的酶切位点
Ecl186Ⅱ：限制酶Ecl186Ⅱ的酶切位点
序列表<110>德古萨-于尔斯股份公司<120>编码gl k基因的新核苷酸序列<130>990177ET<140><141><160>2<170>PatentIr Ver.2.1<210>1<211>1540<212>DNA<213>谷氨酸棒杆菌<220><221>CDS<222>(461).(1429)<400>1aaattccttg ggcgccttga atatcaagat atgatcaaca cgcttgccgc cgcagatatt 60ttcgcgatgc cagcgcgcac ccgcggtggc ggacttgatg ttgaaggctt gggcattgtc 120tatctcgagg caaaagcctg cggagtgccg gtgatagccg gcacctctgg cggcgcgcca 180gagacggtga ctccggcaac tggcctggtt gtggaggggt cggacgtcga taagctgtct 240gagcttttaa ttgagcttct cgacgatccg atccgccgcg ccgcgatggg cgctgcaggt 300agggcgcatg tggaggccga atggtcgtgg gaaatcatgg gggagcggtt gaccaatatt 360ttgcagagtg aaccacgatg atggttggac agctgttgat agctatactt tgaaagatta 420aattcaccta aatcctgtgt agaacgcgag gggcactctt atg cca caa aaa ccg   475
                                        Met Pro Gln Lys Pro
                                          1               5gcc agt ttc gcg gtg ggc ttt gac atc ggc ggc acc aac atg cga gcc   523Ala Ser Phe Ala Val Gly Phe Asp Ile Gly Gly Thr Asn Met Arg Ala
             10                  15                  20ggg ctt gtc gac gaa tcc ggg cgc atc gtg acc agt ttg tcg gcg ccg   571Gly Leu Val Asp Glu Ser Gly Arg Ile Val Thr Ser Leu Ser Ala Pro
         25                  30                  35tcg ccg cgc acg acg cag gca atg gaa cag ggg att ttt gat cta gtc   619Ser Pro Arg Thr Thr Gln Ala Met Glu Gln Gly Ile Phe Asp Leu Val
     40                  45                  50gaa cag ctc aag gcc gaa tac ccg gtt ggt gct gtg gga ctt gcc gtc   667Glu Gln Leu lys Ala Glu Tyr Pro Val Gly Ala Val Gly Leu Ala Val
 55                  60                  65gcg gga ttt ttg gat cct gag tgc gag gtt gtt cga ttt gcc ccg cac    715Ala Gly Phe Leu Asp Pro Glu Cys Glu Val Val Arg Phe Ala Pro His70                  75                  80                  85ctt cct tgg cgc gat gag cca gtg cgt gaa aag ttg gaa aac ctt ttg    763Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Val Arg Glu Lys Leu Glu Asn Leu Leu
             90                  95                 100ggc ctg cct gtt cgt ttg gaa cat gat gcc aac tca gca gcg tgg ggt    811Gly Leu Pro Val Arg Leu Glu His Asp Ala Asn Ser Ala Ala Trp Gly
        105                 110                 115gag cat cgt ttt ggt gca gct caa ggc gct gac aac tgg gtt ttg ttg    859Glu His Arg Phe Gly Ala Ala Gln Gly Ala Asp Asn Trp Val Leu Leu
    120                 125                 130gca ctc ggc act gga att ggt gca gcg ctg att gaa aaa ggc gaa att    907Ala Leu Gly Thr Gly Ile Gly Ala Ala Leu Ile Glu Lys Gly Glu Ile
135                 140                 145tac cgt ggt gca tat ggc acg gca cca gaa ttt ggt cat ttg cgt gtt    955Tyr Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Phe Gly His Leu Arg Val150                 155                 160                 165gtt cgt ggc gga cgc gca tgt gcg tgt ggc aaa gaa ggc tgc ctg gag   1003Val Arg Gly Gly Arg Ala Cys Ala Cys Gly Lys Glu Gly Cys Leu Glu
            170                 175                 180cgt tac tgt tcc ggt act gcc ttg gtt tac act gcg cgt gaa ttg gct   1051Arg Tyr Cys Ser Gly Thr Ala Leu Val Tyr Thr Ala Arg Glu Leu Ala
        185                 190                 195tcg cat ggc tca ttc cgc aac agc ggg ctg ttt gac aag atc aaa gcc   1099Ser His Gly Ser Phe Arg Asn Ser Gly Leu Phe Asp Lys Ile Lys Ala
    200                 205                 210gat ccg aat tcc atc aat gga aaa acg arc act gcg gca gcg cgc caa   1147Asp Pro Ash Ser Ile Asn Gly Lys Thr Ile Thr Ala Ala Ala Arg Gln
215                 220                 225gaa gac cca ctt gct ctc gcc gtt ctg gaa gat ttc agc gag tgg ctg   1195Glu Asp Pro Leu Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp Phe Ser Glu Trp Leu230                 235                 240                 245ggc gaa act ttg gcg atc att gct gat gtc ctt gac cca ggc atg atc   1243Gly Glu Thr Leu Ala Ile Ile Ala Asp Val Leu Asp Pro Gly Met Ile
            250                 255                 260atc att ggt ggc gga ctg tcc aat gct gcc gac ctt tat ttg gat cgc   1291Ile Iie Gly Gly Gly Leu Ser Asn Ala Ala Asp Leu Tyr Leu Asp Arg
        265                 270                 275tcg gtc aac cac tat tcc acc cgc atc gtc ggc gca gga tat cgc cct   1339Ser Val Asn His Tyr Ser Thr Arg Ile Val Gly Ala Gly Tyr Arg Pro
    280                 285                 290ttg gca cgc gtt gcc aca gct cag ttg ggt gcg gat gct ggc atg atc   1387Leu Ala Arg Val Ala Thr Ala Gln Leu Gly Ala Asp Ala Gly Met Ile
295                 300                 305ggt gtc gct gat cta gct cga cgc tct gta gtg gaa gcc aac              1429Gly Val Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ser Val Val Glu Ala Asn310                 315                 320taggtgtttt tcggtgggct gcgatgacgc atgtccacca aaagagccac cccttaaaga    1489aattaaaaag tggttttggt agcttcgcag caaaatacac atcgtgggta a             1540<210>2<211>323<212>PRT<213>谷氨酸棒杆菌<400>2Met Pro Gln Lys Pro Ala Ser Phe Ala Val Gly Phe Asp Ile Gly Gly1               5                  10                  15Thr Asn Met Arg Ala Gly Leu Val Asp Glu Ser Gly Arg Ile Val Thr
         20                  25                  30Ser Leu Ser Ala Pro Ser Pro Arg Thr Thr Gln Ala Met Glu Gln Gly
     35                  40                  45Ile Phe Asp Leu Val Glu Gln Leu Lys Ala Glu Tyr Pro Val Gly Ala
 50                  55                  60Val Gly Leu Ala Val Ala Gly Phe Leu Asp Pro Glu Cys Glu Val Val65                  70                  75                  80Arg Phe Ala Pro His Leu Pro Trp Arg Asp Glu Pro Val Arg Glu Lys
             85                  90                  95Leu Glu Asn Leu Leu Gly Leu Pro Val Arg Leu Glu His Asp Ala Asn
        100                 105                 1l0Ser Ala Ala Trp Gly Glu His Arg Phe Gly Ala Ala Gln Gly Ala Asp
    115                 120                 125Asn Trp Val Leu Leu Ala Leu Gly Thr Gly Ile Gly Ala Ala Leu Ile
130                 135                 140Glu Lys Gly Glu Ile Tyr Arg Gly Ala Tyr Gly Thr Ala Pro Glu Phe145                 150                 155                 160Gly His Leu Arg Val Val Arg Gly Gly Arg Ala Cys Ala Cys Gly Lys
            165                 170                 175Glu Gly Cys Leu Glu Arg Tyr Cys Ser Gly Thr Ala Leu Val Tyr Thr
        180                 185                 190Ala Arg Glu Leu Ala Ser His Gly Ser Phe Arg Asn Ser Gly Leu Phe
    195                 200                 205Asp Lys Ile Lys Ala Asp Pro Asn Ser Ile Asn Gly Lys Thr Ile Thr
210                 215                 220Ala Ala Ala Arg Gln Glu Asp Pro Leu Ala Leu Ala Val Leu Glu Asp225                 230                 235                 240Phe Ser Glu Trp Leu Gly Glu Thr Leu Ala Ile Ile Ala Asp Val Leu
            245                 250                 255Asp Pro Gly Met Ile Ile Iie Gly Gly Gly Leu Ser Asn Ala Ala Asp
        260                 265                 270Leu Tyr Leu Asp Arg Ser Val Asn His Tyr Ser Thr Arg Iie Val Gly
    275                 280                 285Ala Gly Tyr Arg Pro Leu Ala Arg Val Ala Thr Ala Gln Leu Gly Ala
290                 295                 300Asp Ala Gly Met Iie Gly Val Ala Asp Leu Ala Arg Arg Ser Val Val305                 310                 315                 320Glu Ala Asn

Claims (22)

1、来自谷氨酸棒杆菌的分离的多核苷酸，其包括选自如下一组的多核苷酸序列：
a)与编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸；
b)编码含有与SEQ ID NO:2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)含有a)、b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
2、如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸是能在棒状细菌中复制的优选重组的DNA。
3、如权利要求1所述的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、如权利要求2所述的能复制的DNA，含有
(ⅰ)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或
(ⅱ)在遗传密码简并范围内相应于(ⅰ)序列的至少一个序列，或
(ⅲ)与互补于(ⅰ)或(ⅱ)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地
(ⅳ)(ⅰ)中有功能的中性有义突变。
5、如权利要求2所述的多核苷酸序列，其编码含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。
6、含有权利要求1所述的多核苷酸序列的载体。
7、含有如权利要求6所述的载体的棒状细菌。
8、经发酵生产L-氨基酸的方法，其中进行以下步骤：
a)发酵产生L-氨基酸的棒状细菌，其中至少编码葡糖激酶的基因是增强的，尤其是过表达的；
b)富集培养基或细菌细胞中L-氨基酸；及
c)分离L-氨基酸。
9、如权利要求8所述的方法，其中使用的细菌中所需L-氨基酸的生物合成途径的其它基因被额外增强。
10、如权利要求8所述的方法，其中使用的细菌中，降低L-氨基酸生成的代谢途径至少被部分关闭。
11、如权利要求8所述的方法，其中使用用质粒载体转化的菌株，所述载体携带编码葡糖激酶的基因的核苷酸序列。
12、如权利要求8-11的任一项方法，其中使用产生L-赖氨酸的棒状细菌。
13、如权利要求9所述的方法，其中编码二氢-2,6-吡啶二羧酸合酶的dapA基因是同时过表达的。
14、如权利要求9所述的方法，其中编码反馈抗性天冬氨酸激酶的lysC基因是同时过表达的。
15、如权利要求9所述的方法，其中编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的gap基因是同时过表达的。
16、如权利要求9所述的方法，其中编码丙糖磷酸异构酶的tpi基因是同时过表达的。
17、如权利要求9所述的方法，其中编码3-磷酸甘油酸激酶的pgk基因是同时过表达的。
18、如权利要求9所述的方法，其中编码丙酮酸羧化酶的pyc基因是同时过表达的。
19、如权利要求9所述的方法，其中编码苹果酸醌氧化还原酶的mqo基因是同时过表达的。
20、如权利要求9所述的方法，其中编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因是同时过表达的。
21、如权利要求10所述的方法，其中编码葡糖-6-磷酸异构酶的pgi基因是同时弱化的。
22、如权利要求10所述的方法，其中编码烯醇丙酮酸羧激酶的pck基因是同时弱化的。
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