CN100523193C - 编码dapC基因的核苷酸序列及生产L-赖氨酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的至少一个多核苷酸序列：a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70%相同的多核苷酸，b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70%相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。本发明还涉及发酵制备L-氨基酸特别是L-赖氨酸的方法。

Description

编码dapC基因的核苷酸序列及生产L—赖氨酸的方法
本发明提供了编码dapC基因的核苷酸序列，和用具有增强的特别是过表达的dapC基因(N—琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶基因)的棒状细菌发酵生产L—赖氨酸的方法。
氨基酸特别是L—赖氨酸用于人用药物和制药工业，特别是动物营养。
已知氨基酸可通过棒状细菌菌株，尤其谷氨酸棒杆菌的发酵而生产。由于其极其重要性，已持续进行改良生产方法的尝试。生产方法的改良可涉及发酵措施，如搅拌和供氧，或营养培养基的组成如发酵期间的糖浓度，或产物形式的加工方法，例如通过离子交换层析，或微生物本身的固有生产性质。
为改良这些微生物的生产性质，可使用诱变，选择及突变体选择等方法，以此方法可获得对抗代谢物如赖氨酸类似物S—(2—氨基乙基)半胱氨酸有抗性或重要的调节代谢物营养缺陷的并产生L—氨基酸如L—赖氨酸的菌株。
一段时间以来，重组DNA技术的方法也用于棒杆菌生产氨基酸的菌株的改良，其通过扩增各个氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的作用而进行改良。此方面的综述文章见Kinoshita(＂谷氨酸细菌＂，工业微生物的生物学，Demain和Soloman编辑，BenjaminCummings，英国伦敦，1985，115—142)，Hilliger(生物技术2，40—44(1991))，Eggeling(氨基酸6：261—272(1994))，Jetten和Sinskey(生物技术的关键回顾15，73—103(1995))和Sahm等(纽约科学协会年报782，25—39(1996))。
本发明人目的在于为改良L—赖氨酸的发酵生产而提供新措施。
L—赖氨酸用于人用药物及制药工业，特别是动物营养，因此提供生产L—赖氨酸的新改良方法总是令人感兴趣的。
当下文提到L—赖氨酸或赖氨酸时，不仅是指碱，也指盐，如赖氨酸单盐酸盐或赖氨酸硫酸盐。
本发明提供了一种来自棒状细菌的分离的多核苷酸，其含有选自如下一组的—种多核苷酸序列：
a)与编码包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸至少70％相同的多核苷酸，
b)编码包含与SEQ ID NO：2的氨基酸序列至少70％相同的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
c)与a)或b)的多核苷酸互补的多核苷酸，以及
d)包含a)，b)或c)的多核苷酸序列的至少15个连续核苷酸的多核苷酸。
本发明还提供了根据权利要求1的多核苷酸，其优选为能复制的DNA，包含
(i)选自SEQ ID NO：1的核苷酸序列，或
(ii)在遗传密码简并范围内相应于(i)序列的至少一个序列，或
(iii)与互补于(i)或(ii)序列的序列杂交的至少一个序列，和任选地，
(iv)(i)中中性功能有义突变。
本发明还提供了
权利要求4的多核苷酸，包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，
编码包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，
含有权利要求1的多核苷酸序列的载体，特别是穿梭载体或质粒载体pXT-dapCexp，其如图2所示并保藏在DSM 5715中，保藏号DSM 13254，
以及作为宿主细胞的含有载体的棒状细菌。
本发明还提供了基本上由一多核苷酸序列组成的多核苷酸，其可通过用含有相应于SEQ ID NO：1的多核苷酸或其片段的序列的探针杂交相应的基因文库，并分离所述的DNA序列来筛选获得，所述的文库包含具有相应于SEQ ID NO：1的多核苷酸序列的完整基因。
本发明的多核苷酸序列适用作RNA、cDNA和DNA的杂交探针，以分离编码N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的全长cDNA，以及分离与N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶基因具有高度序列相似性的cDNA或基因。
本发明的多核苷酸序列还适用作通过聚合酶链反应(PCR)制备编码N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的基因的DNA的引物。
作为探针或引物的这种寡核苷酸含有至少30个、优选至少20个、特别优选至少15个连续核苷酸。具有至少40或50个核苷酸的寡核苷酸也是合适的。
“分离的”是指从其天然环境中分离出来。
“多核苷酸”一般地涉及多聚核糖核苷酸和多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是非修饰的RNA或DNA，或修饰的RNA或DNA。
“多肽”应理解为包括经肽键结合的两个或多个氨基酸的肽或蛋白质。
本发明的多肽包括SEQ ID NO：2的多肽，特别是具有N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶生物学活性的多肽，以及与SEQ ID NO：2的多肽至少70％相同的多肽，优选地与SEQ ID NO：2的多肽至少80％、特别是90—95％相同并具有所述活性的多肽。
本发明另外还提供了用尤其已生产氨基酸的棒状细菌发酵生产氨基酸特别是L—赖氨酸的方法，在该棒状细菌中编码dapC基因的核苷酸序列是增强的，尤其是过表达的。
文中术语“增强”是指微生物中由相应DNA编码的一或多种酶的胞内活性的增加，例如通过增加一或多个基因的拷贝数，通过用强启动子或编码具有升高的活性的相应酶的基因或等位基因，及任选地组合使用这些方法。
本发明的微生物可从葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麦芽糖、糖蜜、淀粉、纤维素或从甘油和乙醇中生产L—氨基酸特别是L—赖氨酸。此微生物可以是棒状细菌尤其是棒杆菌属的代表菌。在棒杆菌属中尤其应提及的是谷氨酸棒杆菌，本领域技术人员已知其生产L—氨基酸的能力。
适当的棒杆菌菌属，尤其谷氨酸棒杆菌菌株，是例如已知的野生型菌株：
谷氨酸棒杆菌ATCC 13032
醋谷棒杆菌ATCC 15806
嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC 13870
嗜热产氨棒杆菌FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
黄色短杆菌ATCC 14067
乳发酵短杆菌ATCC 13869和
扩展短杆菌ATCC 14020
和从中获得的生产L—赖氨酸的突变体或菌株如：
谷氨酸棒杆菌FERM—P 1709
黄色短杆菌FERM—P 1708
乳发酵短杆菌FERM-P 1712
谷氨酸棒杆菌FERM—P 6463
谷氨酸棒杆菌FERM—P 6464
谷氨酸棒杆菌DSM5715
谷氨酸棒杆菌DSM12866
谷氨酸棒杆菌DM58—1。
本发明人已成功地分离谷氨酸棒杆菌的编码N-琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶(EC 2.6.1.17)的新dapC基因。
为了分离谷氨酸棒杆菌的dapC基因或其他基因，首先在大肠杆菌中建立这一微生物的基因文库。可根据通常已知的教材和手册建立基因文库。例如由Winnacker所著教材：基因与克隆，基因工程入门(Verlag Chamie，Weinheim，德国，1990)，或由Sambrook等所著手册：分子克隆实验手册(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)。一非常熟知的基因文库是已由Kohara等(细胞50，495—508(1987))在λ载体中建立的E.coli K—12菌株W3110的基因文库。Bathe等(分子及普通遗传学，252；255—265，1996)阐述了借助于粘粒载体SuperCos I(Wahl等，1987，Proceeding of the NationalAcademy of Sciences USA，84：2160-2164)，在E.coli K—12菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563—1575)中建立的谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因文库。Bormann等(分子微生物学6(3)，317-326)描述了用粘粒pHC79(Hohn和Collins，基因11，291—298(1980))制备谷氨酸棒杆菌ATCC13032的基因文库。为在大肠杆菌中制备谷氨酸棒杆菌的基因文库，也可使用质粒如pBR322(Bolivar，生命科学25，807—818(1979))或pUC9(Viera等，1982，基因19：259—268)。合适的宿主尤其是限制和重组缺陷的大肠杆菌菌株，一个例子是菌株DH5αmcr，如Grant等(美国科学院院报7(1990)4645-4649)所述。借助于粘粒克隆的长DNA片段随后可亚克隆并用适于测序的通用载体测序，如Sanger等(美国科学院院报74：5463—5467，1977)所述。
本发明提供了编码dapC基因的谷氨酸棒杆菌的新DNA序列，示作SEQ ID NO：1，用前述方法从此DNA序列中也已衍生出相应蛋白质的氨基酸序列。所得dapC基因产物的氨基酸序列以SEQ IDNO：2表示。
通过遗传密码的简并性由SEQ ID NO：1产生的编码DNA序列也是本发明的一部分。同样，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。另外，蛋白质中的保守氨基酸置换，如用丙氨酸置换蛋白质中甘氨酸，或用谷氨酸置换蛋白质中天冬氨酸，本领域已知是“有义突变”，其不引起蛋白质任何功能的改变，即是中性的。另外已知蛋白质N和/或C—末端的改变基本不影响其功能，或者甚至可以稳定其功能，本领域技术人员可在以下文献中发现对此的论述，参见Ben-Bassat等(细菌学杂志169：751—757(1987))O’Regan等(基因77：237—251.(1989))，Sahin-Toth等(蛋白质科学3：240—247(1994))，Hochuli等(生物/技术6：1321—1325(1988))，及已知关于遗传和分子生物学的教材。以相应方式产生自SEQ ID NO：2的氨基酸序列也是本发明的一部分。
类似地，与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：1的部分杂交的DNA序列也是本发明的一部分。最后，用产生自SEQ ID NO：1的引物经聚合酶链反应(PCR)制备的DNA序列也是本发明的组成部分。这种寡核苷酸典型地具有至少15个核苷酸的长度。
通过杂交鉴别DNA序列的指导可参见宝灵格曼海姆有限公司的手册“用于滤膜杂交的DIG系统用户指南”(曼海姆，德国，1993)以及Liebl等(系统细菌学国际杂志(1991)41：255—260)。用聚合酶链反应(PCR)增强DNA序列的指导参见Gait的手册：寡核苷酸合成实用方法(IRL出版社，英国牛津，1984)及Newton和Graham：PCR(Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，德国，1994)。
本发明人发现，在dapC基因过表达后，棒状细菌以改良方式生产L—赖氨酸。
为获得过表达，可提高相应基因的拷贝数，或可使位于结构基因上游的启动子和调节区或核糖体结合位点突变。掺入结构基因上游的表达盒以同样方式工作。通过可诱导启动子，在L一赖氨酸发酵生产期间增强表达也是可能的。通过目的在于延长mRNA寿命的措施，也可改良表达。通过防止酶蛋白的分解也可提高酶促活性。基因或基因构建体可以不同拷贝数存在于质粒中，或可在染色体中整合与扩增。或者，通过改变培养基的组分和培养条件，也可获得相关基因的过表达。
本领域熟练技术人员从以下文献中可发现对此的详述，参见Martin等(生物/技术5，137—146(1987))，Guerrero等(基因138，35—41(1994))，Tsuchiya和Morinaga(生物/技术6，428—430(1988))，Eikmanns等(基因102，93—98(1991))，欧洲专利说明书EPS0472869，美国专利4,601,893，Schwarzer和Puhler(生物/技术9，84—87(1991))，Reinscheid等(应用及环境微生物学60，126-132(1994))，LaBarre等(细菌学杂志175，1001—1007(1993))，专利申请WO 96/15246，Malumbres等(基因134，15—24(1993))，日本特许公开JP—A—10—229891，Jensen和Hammer(生物技术及生物工程58，191—195(1998))，Makrides(微生物学综述60：512—538(1996))及已知关于遗传及分子生物学的教材。
例如，本发明的dapC基因可借助于质粒过表达。
合适的质粒是在棒状细菌中复制的质粒。各种已知的质粒载体，如pZ1(Menkel等，应用及环境微生物学(1989)64：549-554)，pEKExl(Eikmanns等，基因102：93-98(1991))或pHS2-1(Sonnen等，基因107：69—74(1991))是基于隐蔽质粒pHM1519，pBL1或pGA1。其它质粒载体如基于pCG4(US-A4,489，160)，或pNG2(Serwold-Davis等，FEMS微生物学通信66，119—124(1990))或pAG1(US—A5,158,891)的质粒载体可以同样方式使用。
利用其可过表达dapC基因的质粒例如是大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体pXT-dapCexp。这一质粒载体含有质粒pGA1(US-B5,175,108)的复制区rep，包括复制效应子per(US-A-5175108；Nesvera等，细菌学杂志179，1525-1532(1997))，和质粒pAG1(国家生物技术信息中心的登记号为AF121000，Bethesda，美国马里兰州)的赋予四环素抗性的tetA(Z)基因，以及质粒pTRC99A(Amann等，(1988)，基因69：301-315)的复制起点，trc启动子，终止区T1和T2和lacIq基因。
穿梭载体pXT-dapCexp如图2所示。
其他合适的质粒载体是那些可通过整合进染色体而进行基因扩增的质粒载体，例如，由Reinscheid等(应用及环境微生物学60：126-132(1994))所述的用于复制或增强hom-thrB操纵子的质粒载体。在这一方法中，将完整基因克隆进能在宿主(典型地是大肠杆菌)中复制而在谷氨酸棒杆菌中不能复制的质粒载体中。可考虑的载体例如是pSUP301(Simon等，生物/技术1，784—791(1983))，pK18mob或pK19mob(Schafer等，基因145，69—73(1994))，pGEM-T(Promega公司，Madison，WI，USA)，pCR2.1-TOPO(Shuman(1994)，生物化学杂志269：32678—84；US—A5,487,993)，pCR
Figure C00811544D0011110652QIETU
Blunt(Invitrogen，Groningen，荷兰；Bernard等，分子生物学杂志，234：534—541(1993))，pEM1(Schrumpf等，1991，细菌学杂志173：4510—4516)或pBGS8(Spratt等，1986，基因41：337—342)。含有待扩增基因的质粒载体然后可经接合或转化转移进希望的谷氨酸棒杆菌菌株。接合方法例如如Schafer等(应用及环境微生物学60，756—759(1994))所述。转化方法例如如Thierbach等(应用微生物学及细菌学29，356—362(1988))，Dunican和Shivnan(生物/技术7，1067—1070(1989))和Tauch等(FEMS微生物学通信123，343—347(1994))所述。经“交换”事件而同源重组后，得到的菌株含有至少两个拷贝的所需基因。
另外发现通过用除L-脯氨酸之外的一种蛋白质来源的氨基酸特别是L-亮氨酸(参见SEQ ID NO：4)替换酶蛋白的209位的氨基酸L-脯氨酸(参见SEQ ID NO：2)，可产生增强，并且携带相应氨基酸替换的棒状细菌以改进方式生产L—赖氨酸。用L-亮氨酸置换209位的L-脯氨酸可优选地通过用胸腺嘧啶置换716位的胞嘧啶而实现，如SEQ ID NO：3所示。
可通过常规诱变方法用诱变剂如N—甲基—N′—硝基—N—硝基胍或紫外光进行诱变。诱变也可用体外方法进行，如用羟胺(分子和普通遗传学145，101页(1978))或诱变性寡核苷酸(T.A.Brown：Gentechnologie fur Einsteiger，Spektrum Akademischer Verlag，Heidelberg，1993)或如Newton and Graham的手册(PCR，SpektrumAkademischer Verlag，Heidelberg，1994)所述的聚合酶链反应(PCR)。
本发明相应地还提供了源自棒状细菌的编码N—琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的DNA，该酶中SEQ ID NO：2中209位的氨基酸序列用除L—脯氨酸之外的另一种氨基酸置换。本发明还涉及含有DNA的棒状细菌，其中酶蛋白的209位的氨基酸L-脯氨酸(参见SEQ IDNO：2)用L-亮氨酸(参见SEQ ID NO：4)置换。
本发明还提供了含有DNA的棒状细菌，其中209位的L-脯氨酸用L-亮氨酸置换是通过用胸腺嘧啶替换716位的胞嘧啶而进行，如SEQ ID NO：3所示。
另外，不仅是dapC基因，而且特定生物合成途径、糖酵解、回补代谢、柠檬酸循环或氨基酸输出的一或多种酶的扩增或过表达，对L—赖氨酸的生产可以是有益的。
因此，为生产L—赖氨酸，除了dapC基因外，例如可同时增强特别是过表达一或多种选自如下一组的基因：
·编码抗反馈天冬氨酸激酶的lysC基因(Kalinowski等(1990)，分子和普通遗传学224：317—324)，
·编码天冬氨酸半醛脱氢酶的asd基因(EP—A—0219027；Kalinowski等(1991)，分子微生物学5：1197—1204；Kalinowski等(1991)，分子和普通遗传学224：317—324)，
·编码二氢—2，6—吡啶二羧酸合酶的dapA基因(EP—B—0197335)，
·编码二氢—2，6—吡啶二羧酸还原酶的dapB基因(GenBank登录号X67737；Pisabarro等(1993)，细菌学杂志，175(9)：2743-2749)，
·编码四氢吡啶二羧酸琥珀酰化酶的dapD基因(GenBank登录号AJ004934；Wehrmann等(1998)，细菌学杂志，180：3159-3163)，
·编码N—琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰化酶的dapE基因(GenBank登录号X81379；Wehrmann等(1994)，微生物学140：3349—3356)，
·编码二氨基庚二酸差向异构酶的dapF基因(DE19943587.1，DSM12968)，
·编码二氨基庚二酸脱羧酶的lysA基因(GenBank登录号X07563；Yeh等(1988)，分子及普通遗传学212：112一119)，
·编码二氨基庚二酸脱氢酶的ddh基因(Ishino等(1988)，农业和生物化学52(11)：2903-2909)，
·编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因(DE—A—19548222)，
·编码丙酮酸羧化酶的pyc基因(Eikmanns(1992)，细菌学杂志174，6076—6086)，
·编码苹果酸：醌氧化还原酶的mqo基因(Molenaar等(1998)，欧洲生物化学杂志254，395—403)，
·zwa1基因(DE19959328.0；DSM13115)，或
·编码谷氨酸脱氢酶的gdh基因(Bormann等(1992)，分子微生物学6，317—326)。
优选的是同时增强选自dapD，dapE和dapF的一或多个基因。
对于L—赖氨酸的生产，除了任选地与选自dapD，dapE和dapF的—或多个基因一起增强dapC基因外，还有利的是同时弱化
·编码烯醇丙酮酸磷酸羧激酶的pck基因(DE19950409.1，DSM13047)和/或
·编码葡萄糖—6—磷酸异构酶的pgi基因(US09/396,478，DSM12969)，或
·编码丙酮酸氧化酶的poxB基因(DE 19951975.7；DSM13114)，或
·zwa2基因(DE 19959327.2；DSM13113)，或
·编码琥珀酰辅酶A合成酶的sucC或sucD基因(DE19956686.0)。
除dapC基因任选地与选自dapD，dapE和dapF的一或多个基因一起增强之外，抑制非所需的副反应对L—赖氨酸的生产也是有益的(Nakayama：“生产氨基酸的微生物的育种”，微生物产物的过量产生，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(编辑)，学术出版社，伦敦，英国，1982)。
根据本发明产生的微生物可连续培养或用分批方法，补料分批方法或重复补料分批方法培养以生产L—赖氨酸。已知的培养法由Chmiel所著教材(生物方法技术1.生物方法技术导论(GustavFischer Verlag，Stuttgart，1991)，或由Storhas所著教材(生物反应器和外围设备(Vieweg Verlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中提供。
所用培养基必须以适当方式符合各菌株的需求，关于各种微生物培养基的阐述见于，美国细菌学会的“细菌学通用方法手册”(华盛顿D.C.，USA，1981)。
可使用的碳源包括糖及碳水化合物，例如葡萄糖，蔗糖，乳糖，果糖，麦芽糖，糖蜜，淀粉和纤维素，油和脂肪如豆油，葵花油，落花生油和椰子油，脂肪酸如棕榈酸，硬脂酸和亚油酸，醇如甘油和乙醇，及有机酸如乙酸，这些物质可单独或混合使用。
可使用的氮源包括含氮的有机化合物如胨，酵母提取物，肉膏，麦芽提取物，玉米浸液、大豆粉和尿素，或无机化合物如硫酸铵，氯化铵，磷酸铵，碳酸铵和硝酸铵。氮源可单独或混合使用。
可使用的磷源包括磷酸，磷酸二氢钾或磷酸氢二钾，或相应钠盐。培养基另外还必须含有为生长所需的金属盐如硫酸镁或硫酸铁。最后，除了上述物质之外，可使用生长必需物质如氨基酸和维生素，此外，可将适当前体加入培养基中上述物质可以单批形式或在培养期间以适当方式加入培养物中。
可以适当方式加入碱性化合物如NaOH，KOH，氨或氨水，或酸性化合物如磷酸或硫酸，以调节培养物的PH值，抗泡沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯可用于控制泡沫产生。适当的选择性作用物质例如抗生素，可加入培养基中以保持质粒的稳定性。氧气或含氧混合气，例如空气，可充入培养物中以保持有氧条件。培养温度通常在20℃～45℃，优选25℃～40℃，持续培养直至L—赖氨酸形成最大量。此目的通常在10～160小时范围达到。
L—赖氨酸的分析可通过阴离子交换层析，随后经如Speckman等(分析化学，30，(1958)，1190)所述茚三酮衍生化作用进行。
下述微生物已根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，德国不伦瑞克)：
·谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pxt-dapCexp，保藏号DSM13254。
本发明方法用于发酵制备L—赖氨酸。
本发明借助于以下提供的实施例得以更详述阐述。
实施例1 制备谷氨酸棒杆菌ATCC 13032的基因组粘粒基因文库
如Tauch等(1995，质粒33：168—179)所述分离谷氨酸棒杆菌ATCC13032的染色体DNA并用限制性内切酶Sau3AI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27—0913—02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche Molecular Biochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。得自Stratagene公司(La Jolla，USA，产品描述SuperCosl粘粒载体试剂盒，编码251301)的粘粒载体SuperCosl(Wahl等(1987)美国科学院院报84：2160—2164)的DNA用限制性内切酶XbaI(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述XbaI，编码27—0948—02)酶切并类似地用虾碱性磷酸酶去磷酸化。粘粒DNA然后用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码27—0868—04)酶切。以此方式处理的粘粒DNA与处理的ATCC13032DNA片段混合并用T4DNA连接酶(AmershamPharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4—DNA—连接酶，编码27—0870—04)处理。连接混合物然后用Gigapack II XL包装提取物(Stratagene，La Jolla，USA，产品描述Gigapack II XL包装提取物，编码200217)包装进噬菌体中。为感染大肠杆菌菌株NM554(Raleigh等，1988，核酸研究16：1563—1575)，将细胞置于10mM MgSO4并与噬菌体悬液混合。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒文库的感染和滴定，细胞在含100微克/毫升氨苄青霉素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。在37℃保温过夜后，选择重组克隆。
实施例2 dapC基因的分离和克隆
用Qiaprep Spin微量制备试剂盒(产品号27106，Qiagen，Hilden，德国)根据厂商指导分离各个菌落的粘粒DNA，并用限制性内切酶Sau3AI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述Sau3AI，编码27—0913—02)部分酶切。用虾碱性磷酸酶(Roche MolecularBiochemicals，德国曼海姆，产品描述SAP，编码1758250)将DNA片段去磷酸化。凝胶电泳分离后，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)分离大小范围为1500—2000bp的粘粒片段。得自Invitrogen公司(Groningen，荷兰，产品描述Zero背景克隆试剂盒，产品号K2500—01)的测序载体pZero-1的DNA用限制性内切酶BamHI(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述BamHI，产品号27—0868—04)酶切。如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行粘粒片段在测序载体pZero-1中的连接，DNA混合物与T4连接酶(Pharmacia Biotech，Freiburg，德国)保温过夜。然后将连接混合物电穿孔(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信，123：343—7)进大肠杆菌菌株DH5αMCR(Grant，1990，美国科学院院报87：4645—4649)并在含有50mg/l zeocin的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学，1：190)上铺板。重组克隆的质粒制备用Biorobot9600(产品号900200，Qiagen，Hilden，德国)进行。测序用Zimmeermann等(1990，核酸研究18：1067)改良的Sanger等(1977，美国科学院院报74：5463—5467)的双脱氧链终止法进行。使用得自PE应用生物系统公司(产品号403044，Weiterstadt，德国)的“RR罗丹明终止循环测序试剂盒”。在带有购自PE应用生物系统公司(Weiterstadt，德国)的“ABI Prism377”测序仪的“RotiphoresisNF丙烯酰胺/双丙烯酰胺”凝胶(29：1)(产品号A124.1，Roth，Karlsruhe，德国)中进行凝胶电泳分离和序列分析。
得到的原始数据资料然后用Staden程序包(1986，核酸研究，14：217—231)版本97—0处理。pZero-1衍生物的各个序列组装成连续重叠群。用XNIP程序(Staden，1986，核酸研究，14：217—231)进行计算机辅助编码区分析。进一步分析用“BLAST搜索程序”(Altschul等，1997，核酸研究，25：3389—3402)对“国家生物技术信息中心”(NCBI，Bethesda，MD，USA)的非冗余数据库进行。
获得的dapC基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。对该核苷酸序列的分析显示一1101碱基对的开放读框，其被称为dapC基因。dapC基因编码367个氨基酸的多肽，如SEQ ID NO：2所示。
实施例3 制备扩增谷氨酸棒杆菌中dapC基因的穿梭载体pXT-dapCexp
3.1 dapC基因的克隆
通过Eikmanns等(微生物学140，1817—1828(1994))的方法，从菌株ATCC13032中分离染色体DNA。基于从实施例2中所知的谷氨酸棒杆菌dapC基因的序列，选择以下寡核苷酸进行聚合酶链反应(也参见SEQ ID NO：5和6)。
DapC(dCexl)：
5’GAT CTA(GAA TTC)GCC TCA GGC ATA ATC TAA CG3’DapC(dCexna2)：
5’GAT CTA(TCT AGA)CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA3’
由APK生物系统科学有限公司(Darmstadt，德国)合成所示引物，并用Innis等(PCR实验方法和应用介绍，1990，学术出版社)的标准PCR方法，用Roche诊断试剂有限公司(德国曼海姆)的Pwo聚合酶进行PCR。通过聚合酶链反应，引物扩增出携带dapC基因的大约1.6kb DNA片段。另外，引物DapC(dCexl)含有限制性内切酶EcoRI的限制位点序列，引物DapC(dCexna2)含有限制性内切酶XbaI的限制位点序列，其在上述核苷酸序列中以括号表示。
用购自Invitrogen公司(Carlsbad，CA，USA；目录号K2700—20)的Zero BluntTM试剂盒将扩增的携带dapC基因的约1.6kb DNA片段连接进载体pCR
Figure C00811544D0011110652QIETU
Blunt II(Bernard等，分子生物学杂志，234，534—541(1993))。将连接混合物根据厂商指导(Invitrogen公司，Carlsbad，CA，USA)转化入大肠杆菌菌株Top10。通过在含25mg/l卡那霉素的LB琼脂(Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约)上铺板转化混合物，选择携带质粒的细胞。用Qiagen的QIAprep Spin微量制备试剂盒〔Hilden，德国〕从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，以随后的(0.8％)琼脂糖凝胶电泳证实质粒。扩增的DNA片段的DNA序列经测序证实。质粒命名为pCRdapC，菌株称为大肠杆菌Top10/pCRdapC。
3.2 大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XT99A的构建
大肠杆菌表达载体pTRC99A(Amann等，1988，基因69：301—315)用作起始载体构建大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭表达载体pEC-XT99A。BspHI限制裂解(Roche诊断试剂有限公司，德国曼海姆，产品描述BspHI，产品号1467123)和随后Klenow处理(AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶I的Klenow片段，编码27—0928—01；根据Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港，的方法)之后，氨苄青霉素抗性基因(bla)用谷氨酸棒杆菌质粒pGA1(GenBank登录号AF121000)的四环素抗性基因置换。为此，携带该抗性基因的区域作为AluI片段(AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述AluI，编码27—0884—01)克隆进线性化大肠杆菌表达载体pTRC99A中。如Sambrook等(分子克隆实验手册，第2版，冷泉港)所述进行连接，DNA混合物与T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述T4DNA连接酶，编码号27—0870—04)保温过夜。将连接混合物电穿孔入大肠杆菌DH5αmcr(Grant，1990，美国科学院院刊，87：4645—4649)(Tauch等，1994，FEMS微生物学通信123，343—7)。构建的大肠杆菌表达载体称为pXT99A。
质粒pGA1(Sonnen等，1991，基因107：69—74)用作从谷氨酸棒杆菌克隆最小复制子的基础。通过BalI/PstI限制裂解(Promega有限公司，德国曼海姆，产品描述BalI，产品号R6691；AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述PstI，编码号27—0796—01)pGA1载体，证明可以将3484bp克隆进已用SmaI和PstI片段化(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述SmaI，编码号27—0942—02；产品描述PstI，编码号27—0796—01)的pK18mob2载体(Tauch等，1998，微生物学档案169：303—312)。通过BmHI/XhoI限制裂解(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述BamHI，编码号27—0868—03；产品描述XhoI，编码号27—0950—01)和随后Klenow处理(Amersham PharmaciaBiotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶I的Klenow片段，编码27—0928—01；根据Sambrook等，分子克隆实验手册，第2版，冷泉港，的方法)之后缺失839bp片段。谷氨酸棒杆菌最小复制子可作为来自已用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述T4DNA连接酶，编码号27—0870—04)重新连接的构建体的2645bp片段克隆进大肠杆菌表达载体pXT99A中。为此，携带最小复制子的构建体的DNA用限制酶KpnI(AmershamPharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述KpnI，编码号27—0908—01)裂解，随后用Klenow聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶I的Klenow片段，编码27—0928—01)进行3′—5′外切酶处理(Sambrook等，1989，分子克隆实验手册，冷泉港)。
在平行批次中，大肠杆菌表达载体pXT99A用限制酶RsrII(Roche诊断试剂有限公司，德国曼海姆，产品描述RsrII，产品号1292587)裂解，并用Klenow聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述DNA聚合酶I的Klenow片段，编码27—0928—01)制备以用于连接。最小复制子与载体构建体pXT99A的连接如Sambrook等(1989，分子克隆实验手册，冷泉港)所述进行，DNA混合物与T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，德国，产品描述T4DNA连接酶，编码号27—0870—04)保温过夜。
将如此构建的大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC—XT99A电穿孔(Liebl等，1989，FEMS微生物学通信53，299—303)入谷氨酸棒杆菌DSM 5715中。在已补加5mgl四环素的，由18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l细菌培养用胰化蛋白胨，2.5g/l细菌培养用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂组成的LBHIS琼脂上，选择转化体。在33℃保温培养2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915—927)从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶Hind III酶切，此质粒随后经琼脂糖凝胶电泳检验。
所得质粒构建体被称为pEC-XT99A，如图1所示。将质粒pEC-XT99A电穿孔入谷氨酸棒杆菌DSM5715中所得菌株被称为DSM5715/pEC-XT99A，且根据布达佩斯条约以保藏号DSM12967保藏于德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德国)。
3.3 大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XT99A中dapC的克隆
所用载体是实施例3.2中所述的大肠杆菌—谷氨酸棒杆菌穿梭载体pEC-XT99A。此质粒的DNA用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，然后用虾碱性磷酸酶(Roche诊断试剂有限公司，德国曼海姆，产品描述SAP，产品号1758250)去磷酸化。
通过用限制性内切酶EcoRI和XbaI完全酶切从实施例3.1所述的质粒pCRdapC分离dapC基因，用QiaExII凝胶提取试剂盒(产品号20021，Qiagen，Hilden，德国)从琼脂糖凝胶分离约1600bp dapC片段。
将如此方式获得的dapC片段与制备的载体pEC-XT99A混合，并用T4DNA连接酶(Amersham Pharmacia，Freiburg，德国，产品描述T4DNA连接酶，编码号27—0870—04)处理此混合物。将连接混合物转化入大肠杆菌DH5α(Hanahan，DNA克隆实用方法，第一卷，IRL出版社，Oxford，华盛顿DC，美国)。通过在含5mg/l四环素的LB琼脂(Lennox，1955，病毒学1，190)上铺板转化混合物，选择携带质粒的细胞。在37℃保温过夜后，选择重组单个克隆。根据厂商指导，用Qiaprep Spin微量制备试剂盒〔产品号27106，Qiagen，Hilden，德国〕从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，以通过随后的琼脂糖凝胶电泳分析质粒。所得质粒被称为pXT-dapCexp，示于图2。
实施例4 用质粒pXT-dapCexp转化菌株DSM5715
用如Liebl等所述(FEMS微生物学通信53，299—303(1989))的电穿孔法，用质粒pXT-dapCexp转化菌株DSM5715。在补加5mg/l四环素的由18.5g/l脑心浸液，0.5M山梨醇，5g/l细菌培养用胰化蛋白胨，2.5g/l细菌培养用酵母提取物，5g/l NaCl和18g/l细菌培养用琼脂组成的LBHIS琼脂上选择转化体。在33℃保温2天。
通过常规方法(Peters-Wendisch等，1998，微生物学144，915—927)从一个转化体中分离质粒DNA，并用限制性内切酶EcoRI和XbaI酶切，随后经琼脂糖凝胶电泳分析此质粒。所得菌株被称为DSM5715/pXT-dapCexp，并根据布达佩斯条约保藏在德意志微生物保藏中心(DSMZ，Brunswick，德国)，保藏号DSM13254。
实施例5生产L—赖氨酸
实施例4中制备的谷氨酸棒杆菌菌株DSM5715/pXT-dapCexp在适于生产赖氨酸的营养培养基中培养，并确定培养物上清中的赖氨酸含量。
为此，首先在33℃在具有合适抗生素的琼脂板(具有四环素(5mg/l)的脑心琼脂)上培养菌株24小时。从这些琼脂板培养物开始，接种预培养物(10ml培养基于100ml锥形瓶)。用于预培养的培养基是完全培养基CgIII。
培养基CgIII：
NaCl                       2.5g/l
Bacto-肽胨                 10g/l
Bacto-酵母膏               10g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)       2％(w/v)
pH调至pH7.4。
向培养基中加入四环素(5mg/l)。在摇床上于33℃以240rpm振荡培养预培养物16小时。从此预培养物接种主培养物，从而主培养物的起始OD(测量波长660nm)是0.1。培养基MM用作主培养物。培养基MM：
CSL(玉米浆)           5g/l
MOPS(吗啉代丙磺酸)    20g/l
葡萄糖(单独高压灭菌)  50g/l
NH)2SO4               25g/l
KH2PO4                0.1g/l
MgSO4·7H2O           1.0g/l
CaCl2·2H2O           10mg/l
FeSO4·7H2O           10mg/l
MnSO4·H2O            5.0mg/l
生物素(过滤灭菌)     0.3mg/l
硫胺素·HCl(过滤灭菌)0.2mg/l
L—亮氨酸(过滤灭菌)  0.1g/l
CaCO3                25g/l
用氨水将CSL，MOPS和盐溶液调至pH7并高压灭菌。然后加入无菌的底物和维生素溶液，并加入干态高压灭菌的CaCO3。
以在具有档板的100ml锥形瓶中的10ml体积进行培养，加入四环素(5mg/l)。在33℃和80％大气湿度下进行培养。
72小时后，用Biomek1000(Beckman仪器有限公司，慕尼黑)确定在660nm测量波长的OD。用Eppendorf-BioTronik公司的氨基酸分析仪(汉堡，德国)经离子交换层析和用茚三酮检测柱后衍生化而确定形成的赖氨酸量。
所得结果示于表1。
表1
 
菌株 OD 赖氨酸HClg/L
DSM5715 7.0 13.7
DSM5715/pXT-dapCexp 7.1 14.7
本发明包括如下附图：
图1：质粒pEC-XT99A图。
图2：质粒pXT-dapCexp图。
图中所采用的缩写有如下含义：
per：pGA1的控制拷贝数的基因
oriE：大肠杆菌质粒编码的复制起点
rep：谷氨酸棒杆菌质粒pGA1的质粒编码的复制起点
Ptrc：来自pTRC99A的trc启动子
T1，T2：来自pTRC99A的终止区1和2
lacIq：lac操纵子的阻遏物基因
Tet：四环素抗性基因
dapC：dapC基因
EcoRI：限制酶EcoRI的酶切位点
EcoRV：限制酶EcoRV的酶切位点
HindIII：限制酶HindIII的酶切位点
KpnI：限制酶KpnI的酶切位点
SalI：限制酶SalI的酶切位点
SmaI：限制酶SmaI的酶切位点
NdeI：限制酶NdeI的酶切位点
BamHI：限制酶BamHI的酶切位点
NcoI：限制酶NcoI的酶切位点
XbaI：限制酶XbaI的酶切位点
SacI：限制酶SacI的酶切位点
序列表
<110>德古萨-于尔斯股份公司
<120>编码dapC基因的核苷酸序列及生产L-赖氨酸的方法
<130>990217 BT
<140>
<141>
<160>6
<170>PatentIn Ver.2.1
<2i0>1
<211>1300
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(91)..(1191)
<223>dapC基因
<400>1
Figure C01110011D00261
Figure C01110011D00281
<210>2
<211>367
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>2
Figure C01110011D00282
Figure C01110011D00291
<210>3
<211>1300
<212>DNA
<213>谷氨酸棒杆菌
<220>
<221>CDS
<222>(91)..(1191)
<223>dapc等位基因
<400>3
Figure C01110011D00311
<210>4
<211>367
<212>PRT
<213>谷氨酸棒杆菌
<400>4
Figure C01110011D00312
Figure C01110011D00321
<210>5
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<220>
<223>引物Dapc(dCexl)
<400>5
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的描述：引物
<220>
<223>引物DapC(dCexna2)
<400>6
Figure C01110011D00331

Claims (20)

1、分离的多核苷酸，其包含选自如下一组的一个多核苷酸序列：
a)编码含有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽并且编码的多肽具有N—琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶功能的多核苷酸，
b)与a)的多核苷酸互补的多核苷酸。
2、权利要求1的多核苷酸，其中多核苷酸是能在棒杆菌属细菌中复制的重组的DNA。
3、权利要求1的多核苷酸，其中该多核苷酸是RNA。
4、权利要求2的多核苷酸，包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
5、权利要求2的可复制的多核苷酸，包含如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。
6、含有权利要求1的多核苷酸的载体。
7、权利要求6的载体，其中所述载体由保藏号DSM13254的载体pXT-dapCexp组成。
8、作为宿主细胞的棒杆菌属细菌，其含有权利要求6或7的载体或权利要求1或4的多核苷酸在其中过表达。
9、制备L—赖氨酸的方法，其中进行以下步骤：
(a)发酵产生L—赖氨酸的细菌，该细菌中权利要求1或4的多核苷酸过表达，
(b)在培养基或细菌细胞中积累所需产物，及
(c)分离所需的L—氨基酸。
10、权利要求9的方法，其中使用产生L—赖氨酸的棒杆菌属细菌。
11、权利要求9的方法，其中发酵这样的细菌制备L—赖氨酸，所述细菌中除了dapC基因，选自如下一组的一或多个基因也同时增强：
11.1编码二氢—2，6—吡啶二羧酸合酶的dapA基因，
11.2编码二氨基庚二酸差向异构酶的dapF基因，
11.3编码赖氨酸输出蛋白的lysE基因，
11.4zwal基因。
12.权利要求11的方法，其中增强是通过过表达实现的。
13、权利要求9的方法，其中使用谷氨酸棒杆菌。
14、由SEQ ID NO：1的至少15个连续核苷酸组成的探针或引物。
15、权利要求14的多核苷酸序列作为作为杂交探针分离编码dapC基因的产物的cDNA的应用。
16、权利要求14的多核苷酸序列作为杂交探针分离与dapC基因具有高水平相似性的cDNA或基因的应用。
17、编码N—琥珀酰氨基酮庚二酸转氨酶的来自棒杆菌属的DNA，该酶中SEQ ID NO：2所示的209位氨基酸序列用除L—脯氨酸之外的另一种蛋白质来源的氨基酸置换。
18、权利要求17的DNA，其中SEQ ID NO：2的酶蛋白的209位L—脯氨酸用L—亮氨酸置换，如SEQ ID NO：4所示。
19、权利要求18的DNA，其中用L—亮氨酸置换209位的L—脯氨酸是通过如SEQ ID NO：3所示用胸腺嘧啶置换716位的胞嘧啶而进行。
20、含有权利要求17、18或19的DNA的棒状细菌。
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