KR20010090510A

KR20010090510A - ｄａｐＣ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및Ｌ-라이신의 생산 방법

Info

Publication number: KR20010090510A
Application number: KR1020010014868A
Authority: KR
Inventors: 뫼켈벳티나; 바이쎈보른안케; 페페를레발터; 하르트만미하엘; 칼리노브스키외른; 퓌흘러알프레트
Original assignee: 펠드만 마르틴 및 봅 후베르트; 데구사 아게
Priority date: 2000-03-23
Filing date: 2001-03-22
Publication date: 2001-10-18
Also published as: ATE465259T1; US7759056B2; AU2816301A; CN1319668A; BR0101151A; HUP0101166A2; ZA200102385B; US20050100927A1; DE50115438D1; DE10014546A1; SK3382001A3; MXPA01002860A; US6740742B2; JP2001299372A; US20010049123A1; HU0101166D0; ID29693A; CA2339307A1; HUP0101166A3; EP1136559A3

Abstract

본 발명은,

서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드 a),

서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 b),

폴리뉴클레오타이드 a) 또는 b)와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 c) 및

폴리뉴클레오타이드 a), b) 또는 c)의 서열 중의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 d)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 L-아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

ｄａｐＣ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 Ｌ-라이신의 생산 방법{Nucleotide sequences coding for the dapC gene and process for the production of L-lysine}

본 발명은 dapC 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 및 dapC 유전자(N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제 유전자)가 증진된, 특히, 과발현된 코리네형 세균을 사용하여 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

아미노산, 특히, L-라이신은 사람 의학, 약제 산업 및 특히, 동물 사료에 사용된다.

아미노산이 코리네형 세균의 균주, 특히, 코리네박테리움 글루타미컴을 발효시켜 생산된다는 것은 공지되어 있다. 아미노산의 큰 중요성으로 인해 생산 방법을 개선시키고자 하는 노력이 꾸준히 진행되어 왔다. 방법은 예를 들어, 교반 및 산소 공급과 같은 발효 기술 관련 수단 또는 발효동안의 당 농도와 같은 영양 배지의 조성 또는 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 생성물의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 수행능 특성과 관련하여 개선될 수 있다.

이들 미생물의 수행능 특성은 돌연변이 방법, 선별 방법 및 돌연변이체 선별 방법을 사용하여 개선된다. 이와 같은 방식으로, 예들 들어, 라이신 유사체 S-(2-아미노에틸)시스테인과 같은 항대사물질에 내성이거나, 조절에 중요한 대사물질에 대해 영양 요구성이고 예를 들어, L-라이신과 같은 L-아미노산을 생산하는 균주가 수득된다.

몇년 동안, 재조합 DNA 기술의 방법이 또한 개개의 아미노산 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산 생산에 대한 효과를 연구함으로써 아미노산을 생산하는 코리네박테리움의 균주를 개선시키는데 사용되어 왔다. 이러한 논제에 대한 고찰은 문헌[참조: Kinoshita("Glutamic Acid Bacteria", in: Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142), Hilliger(BioTec 2, 40-44(1991)), Eggeling(Amino Acids 6:261-272(1994), Jetten and Sinskey(Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103(1995)) and Sahm et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39(1996)]에서 발견할 수 있다.

본 발명의 목적은 L-라이신의 발효 생산에 있어서 개선된 신규 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 플라스미드 pEC-XT99A의 지도이다.

도 2는 플라스미드 pXT-dapCexp의 지도이다.

L-라이신은 사람 의학, 약제 산업 및 특히 동물 사료에 사용된다. 따라서, L-라이신의 생산을 위한 개선된 신규 방법을 제공하는데 일반적인 관심이 있다.

계속되는 L-라이신 또는 라이신에 대한 언급은 기본 물질뿐 아니라, 예를 들어, 라이신 모노하이드로클로라이드 또는 라이신 설페이트와 같은 염을 의미하는 것으로 받아들여야 한다.

본 발명은,

폴리뉴클레오타이드 a) 또는 b)와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 c), 및

폴리뉴클레오타이드 a), b) 또는 c)의 서열 중의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 d)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하는 코리네형 세균으로부터 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 바람직하게,

서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열 (i) 또는

유전자 코드의 축퇴 범위내에서 서열 (i)와 일치하는 하나 이상의 서열 (ii) 또는

서열 (i) 또는 (ii)의 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열 (iii) 및 임의로,

서열 (i)에서 기능적으로 불변인 센스 돌연변이(iv)를 포함하는 복제가능한 DNA를 포함하는, 특허청구범위 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

본 발명은 또한,

서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 특허청구범위 제4항에 따른 폴리뉴클레오타이드,

서열 2에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드,

특허청구범위 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히, 셔틀 벡터 또는 도 2에 나타내고 균주 DSM 5715 속의 수탁번호 DSM 13254로서 기탁된 플라스미드 벡터 pXT-dapCexp 및

당해 벡터를 포함하는, 숙주세포로서 작용하는 코리네형 세균을 제공한다.

본 발명은 서열 1에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 완전한 유전자를 포함하는 적합한 유전자 라이브러리를 서열 1에 따른 기술된 폴리뉴클레오타이드의 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드화 수단에 의해 스크리닝함으로써 수득될 수 있는, 실질적인 폴리뉴클레오타이드 서열로 이루어진 폴리뉴클레오타이드 및 기술된 DNA 서열의 분리법을 제공한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제를 암호화하는 완전한 길이의 cDNA를 분리하고, 이러한 cDNA 또는 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제 유전자의 서열과 고도의 유사성을 나타내는 서열을 분리하기 위한, RNA, cDNA 및 DNA에 대한 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오타이드 서열은 추가로 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제를 암호화하는 유전자 DNA를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 상기 올리고뉴클레오타이드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 매우 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 길이가 40개 이상 또는 50개 이상인 뉴클레오타이드를 갖는 올리고뉴클레오타이드가 또한 적합하다.

"분리된"은 천연 환경으로부터 분리됨을 의미한다.

"폴리뉴클레오타이드"는 일반적으로 RNA 또는 DNA가 변형될 수 없거나 변형될 수 있는 폴리리보뉴클레오타이드 및 폴리데옥시리보뉴클레오타이드를 말한다.

"폴리펩타이드"는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩타이드 또는 단백질을 의미한다.

본 발명에 따른 폴리펩타이드는 서열 2에 따른 폴리펩타이드, 특히 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제의 생물학적 활성을 갖는 폴리펩타이드 및 또한 서열 2에 따른 폴리펩타이드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상 동일하고, 특히 서열 2에 따른 폴리펩타이드와 90% 내지 95% 이상 동일하고 상기된 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다.

추가로 본 발명은 특히 아미노산을 이미 생산하고 dapC 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이 증진, 특히 과발현되어 있는 코리네형 세균을 사용하여 아미노산, 특히 L-라이신을 발효적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

이와 관련하여, 용어 "증진"은 유전자 또는 유전자들의 카피수를 증가시키고 강한 프로모터, 또는 상승된 활성을 갖는 상응하는 효소를 암호화하는 유전자 또는 이의 대립 형질 유전자를 사용하고 임의로 이들 수단을 조합함에 의해 미생물내에서 상응하는 DNA에 의해 암호화되어 있는 하나 이상의 효소의 세포내 활성이 증가되었음을 의미한다.

본 발명에 의해 제공되는 미생물은 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분, 셀룰로스로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산할 수 있다. 미생물은 대표적으로 코리네형 세균, 특히 코리네박테리움 속을 포함할 수 있다. 코리네박테리움 속 중에서, 특히 코리네박테리움 글루타미컴 종이 언급될 수 있고 이것은 L-아미노산을 생산하는 능력에 대해 전문가들에게 공지되어 있다.

코리네박테리움 속의 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미컴 종은 하기와 같이 공지된 야생형 균주, 예를 들어,

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC13032,

코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC15806,

코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC13870,

코리네박테리움 써모아미노게네스 FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라쎄콜라 ATCC17965,

브레비박테리움 플라범 ATCC14067,

브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC13869 및

브레비박테리움 디바리카텀 ATCC14020이 적합하고;

이로부터 기원하는 L-라이신 생산 돌연변이체 또는 균주는 예를 들어,

코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라범 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토퍼멘텀 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미컴 FERM-P 6464,

코리네박테리움 글루타미컴 DSM5715,

코리네박테리움 글루타미컴 DSM12866 및

코리네박테리움 글루타미컴 DM58-1이 적합하다.

본 발명자는 씨. 글루타미컴으로부터 효소 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제(EC 2.6.1.17)를 암호화하는 신규 dapC 유전자를 분리하는데 성공하였다.

씨. 글루타미컴 기원의 dapC 유전자 또는 또 다른 유전자는 처음에 이. 콜리내에 상기 미생물의 유전자 라이브러리를 작제함으로써 분리되었다. 유전자 라이브러리의 작제는 일반적으로 공지된 교과서 및 매뉴얼에 기술되어 있다. 언급될 수 있는 문헌의 예는 다음과 같다: textbook by Winnacker, Gene and Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990) 또는 the manual by Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 매우 널리 공지된 유전자 라이브러리는코하라등(Kohara et al)[문헌 참조: Cell 50, 495-508(1987)]에 의해 γ-벡터에 작제된 이. 콜리 K-12 균주 W3110의 라이브러리이다. 문헌[참조: Bathe et al. (Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996]은 코스미드 벡터 슈퍼코스 I(SuperCos I)(참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 84:2160-2164)을 사용하여 이. 콜리 K-12 균주 NM 554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16:1563-1575]에 작제된 씨. 글루타미컴 ATCC13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 문헌[참조: Bormann et al.(Molecular Microbiology 6(3), 317-326, 1992)]은 또한 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298(1980)]를 사용하는 씨. 글루타미컴 ATCC 13032의 유전자 라이브러리를 기술하고 있다. 이. 콜리내 씨. 글루타미컴의 유전자 라이브러리는 또한 pBR322[문헌참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818(1979)] 또는 pUC9[문헌참조: Vieira et al., 1982, Gene, 19:259-268]과 같은 플라스미드를 사용하여 작제될 수 있다. 적합한 숙주는 특히, 제한 및 재조합 결함을 갖는 이. 콜리 균주이다. 상기 균주의 한 예는 문헌[참조: Grant et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87(1990) 4645-4649]에 기술된 균주 DH5αmcr이다. 코스미드의 도움으로 클론된 긴 DNA 단편은 이어서 서열 분석에 적합한 통상적인 벡터에 서브-클로닝되어 예를 들어, 문헌[참조: Sanger et al.(Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 74:5463-5467, 1977)]에 기술된 바와 같이 서열 분석된다.

서열 1에서와 같이 dapC 유전자를 암호화하는 씨. 글루타미컴 기원의 본 발명에 의해 제공되는 신규 DNA 서열은 상기 방식으로 수득된다. 상응하는 단백질의 아미노산 서열은 추가로 상기한 방법을 사용하여 상기 DNA 서열로부터 추론된다. 서열 2는 dapC 유전자 생성물에 대해 수득한 아미노산 서열을 나타낸다.

본 발명은 또한 유전자 코드의 축퇴성으로 인해 서열 1로부터 비롯된 암호화 DNA 서열을 제공한다. 본 발명은 또한 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화 하는 DNA 서열을 제공한다. 단백질내 아미노산의 보존적 치환, 예를 들어, 알라닌의 글라이신으로의 치환 또는 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환은 단백질의 활성에 근본적인 변화를 일으키지 않는, 즉, 이들은 기능적으로 불변인 "센스 돌연변이"로서 전문가들에게 공지되어 있다. 추가로, 단백질의 N 및/또는 C 말단에 대한 변화는 실질적으로 이의 기능을 손상시키지 않거나 오히려 이의 기능을 안정화시킬 수 있는 것으로 공지되어 있다. 당해 분야의 기술자는 이와 관련된 정보를 문헌[참조: Ben-Bassat et al.(Journal of Bacteriology 169:751-757(1987)), O'Regan et al.(Gene 77:237-251(1989), Sahin-Toth et al.(Protein Sciencces 3:240-247(1994), Hochuli et al. (Bio/Technology 6:1321-1325(1988)] 및 유전학 및 분자 생물학에 대한 공지된 교과서에서 찾을 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 2로부터 유래된 아미노산 서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다.

본 발명은 또한 유사하게, 서열 1 또는 서열 1의 일부와 하이브리드화하는 DNA 서열을 제공한다. 최종적으로, 본 발명은 또한 서열 1로부터 수득된 프라이머를 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조되는 DNA 서열을 제공한다. 전형적으로 상기 올리고뉴클레오타이드는 길이가 15개 이상인 뉴클레오타이드를 갖는다.

당해 기술분야의 기술자는 하이브리드화를 통하여 DNA 서열을 동정하기 위한 지침을 매뉴얼[The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" from Roche Diagnostics GmbH(Mannheim, Germany, 1993) 및 Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology(1991) 41:255-260]에서 찾을 수 있다. 당해 분야의 기술자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 사용한 DNA 서열을 증폭시키기 위한 지침을 매뉴얼[Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach(IRL Press, Oxford, UK, 1984) and Newton & Graham, PCR(Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Germany, 1994]에서 찾을 수 있다.

dapC 유전자를 과발현하는 경우 개선된 방식으로 코리네형 세균이 L-라이신을 생산한다는 것이 밝혀졌다.

과발현은 상응하는 유전자의 카피수를 증가시키거나 구조 유전자의 상부에 위치한 프로모터 및 조절 영역 또는 리보솜-결합 부위를 돌연변이시킴으로써 성취될 수 있다. 구조 유전자의 상부에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 유도성 프로모터를 사용한 L-라이신의 발효 생산동안에 발현을 추가로 증가시킬 수 있다. 발현은 또한 mRNA의 수명을 연장시키는 수단으로 개선된다. 효소 활성은 효소 단백질의 분해를 방지시킴으로써 보다 더 증진된다. 유전자들 또는 유전자 작제물은 다양한 카피수의 플라스미드내에 존재하거나 염색체에 통합되어 증폭될 수 있다. 또한, 관련 유전자의 과발현은 또한 배지의 조성 및 배양 조건을 변화시켜 성취될 수 있다.

당해 분야의 기술자는 이와 관련된 지침을 문헌[참조: Martin et al.(Bio/Technology 3, 137-146(1987)), Guerrero et al.(Gene 138, 35-41(1994)), Tsuchiya and Morinaga(Bio/Technology 6, 428-430(1988), Eikmanns et al.(Gene 102, 93-98(1991), EP 0 472 869, US 4,601,893, Schwarzer and Puhler(Bio/Technology 9, 84-87(1991), Reinscheid et al.(Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1944)), LaBarre et al.(Journal of Bacteriology 175, 1001-1007(1993), WO 96/15246, Malumbres et al. (Gene 134, 15-24(1993), JP-A-10-229891, Jensen and Hammer(Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195(1998), Makrides(Microbiological Reviews 60:512-538(1996)] 및 유전학 및 분자생물학에 대해 공지된 교과서에서 찾을 수 있다.

예를 들어, 본 발명에 따른 dapC 유전자는 플라스미드의 도움으로 과발현된다.

코리네형 세균에서 복제되는 플라스미드가 적합하다. 예를 들어, pZ1[문헌참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology(1989) 64:549-554], pEKEx1[문헌참조: Eikmanns et al., Gene 102:93-98(1991)] 또는 pHS2-1[문헌참조: Sonnen et al., Gene 107:69-74(1991)]와 같은 많은 공지된 플라스미드 벡터는 크립틱 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기초로 한 것이다. pCG4(US-A 4,489,160) 또는 pNG2(Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124(1990)) 또는 pAG1(US-A 5,158,891)를 기초로 한 또 다른 플라스미드 벡터가 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

dapC 유전자가 과발현될 수 있는 플라스미드의 한 예는 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 벡터 pXT-dapCexp이다. 벡터는 플라스미드 pTRC99A(Amann et al. (1988), Gene 69:301-315)의 복제 오리진, Trc 프로모터, 종결 영역 T1 및 T2 및 lacI^q유전자(이 콜리의 lac 오페론의 리프레서)와 함께 수탁번호 AF21000의 플라스미드 pAG1(US-A-5,158,891; GenBank entry at the National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 복제 효능 인자 per(US-A-5,175,108; Nesvera et al., Journal of Bacteriology 179, 1525-1532(1997)), 테트라사이클린 내성을 부여하는 tetA(Z) 유전자를 포함하는 플라스미드 pGA1의 복제 영역 rep를 포함한다.

셔틀 벡터 pXT-dapCexp는 도 2에 나타낸다.

추가의 적합한 플라스미드 벡터는 예를 들어, hom-thrB 오페론의 복제 또는증폭을 위해 문헌[참조: Reinscheid et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132(1994)]에 기술된 바와 같이 염색체내로 통합시킴에 의해 유전자가 증폭될 수 있는 벡터이다. 상기 방법에서, 완전한 유전자가 숙주(통상적으로 이. 콜리)에서 복제할 수 있지만 씨. 글루타미컴에서는 복제할 수 없는 플라스미드 벡터로 클로닝된다. 고려될 수 있는 벡터는 예를 들어, pSUP301[문헌참조: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791(1983)], pK18mob 또는 pK19mob[문헌참조: Schafer et al., Gene 145, 69-73(1994)], pGEM-T[문헌참조: Promega corporation, Madison, WI, USA], pCR2.1-TOPO[문헌참조: Shuman(1994). Journal of Biological Chemistry 269:32678-84;US-A 5,487,993], pCR^RBlunt[문헌참조: Invitrogen, Groningen, Netherlands; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541(1993)] 또는 pEM1[문헌참조: Schrumpf et al, 1991, Journal of Bacteriology 173:4510-4516]이다. 증폭될 유전자를 함유하는 플라스미드 벡터는 이어서 형질접합 또는 형질전환에 의해 목적하는 균주인 씨. 글루타미컴으로 전달된다. 형질접합 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Schafer et al. Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759(1994)]에 기술되어 있다. 형질전환 방법은 예를 들어, 문헌[참조: Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362(1988), Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070(1989) and Tauch et al.(FEMS Microbiological Letters 123, 343-347(1994))]에 기술되어 있다. 교차(crossing over)에 의한 상동성 재조합 후에 수득한 균주는 2개의 카피 이상의 목적하는 유전자를 포함한다.

추가로, 효소 단백질의 209번 위치에 있는 아미노산 L-프롤린(서열 2 참조)을 L-프롤린을 제외한 또 다른 단백질성 아미노산, 특히 L-류신(서열 4 참조)으로 대체함으로써 증진되고 상응하는 아미노산 대체물을 함유하는 코리네형 세균이 개선된 방식으로 L-라이신을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 209번 위치에서 L-프롤린을 L-류신으로 대체하는 것은 바람직하게 서열 3에 나타낸 바와 같이 716번 위치의 염기 사이토신을 티민으로 대체함으로써 성취될 수 있다.

돌연변이 유발은 예를 들어, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘과 같은 돌연변이 유발제 또는 자외선을 사용하는 통상적인 돌연변이 유발 방법에 의해 수행될 수 있다. 돌연변이 유발은 또한 예를 들어 하이드록실아민[문헌참조: Molecular and General Genetics 145, 101pp(1978)] 또는 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드(T.A. Brown: Gentechnologie fur Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993)로 처리하거나 문헌[참조: the manual by Newton and Graham(PCR, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1994)]에 기술된 바와 같이 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)과 같은 시험관내 방법을 사용하여 수행될 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 코리네형 세균으로부터 유래하고, 서열 2의 아미노산 서열의 209번 위치가 L-프롤린을 제외한 또 다른 아미노산으로 대체되어 있는, N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제를 암호화하는 DNA를 제공한다. 본 발명은 또한 효소 단백질의 209번 위치(서열 2)의 아미노산 L-프롤린이 L-류신으로대체된 DNA(서열 4)를 함유하는 코리네형 세균에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 서열 3에 나타낸 바와 같이 716번 위치의 염기 사이토신이 티민으로 대체됨으로써 209번 위치에서 L-프롤린이 L-류신으로 대체된 DNA를 함유한 코리네형 세균을 제공한다.

추가로 dapC 유전자 뿐만 아니라 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충(anaplerotic) 대사 또는 아미노산 수송에 관여하는 하나 이상의 효소를 증폭시키거나 과발현시키는 것이 L-라이신을 생산하기에 유리할 수 있다.

L-라이신을 생산하기 위해, 예를 들어, dapC 유전자 뿐만 아니라 하기의 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 증진시키고 특히 과발현시키거나 증폭시킬 수 있다:

● 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[문헌참조: Kalinowski et al.(1990), Molecular and General Genetics 224, 317-324],

● 아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자[문헌참조: EP-A 0 219 027; Kalinowski et al.(1991), Molecular Microbiology 5:1197-1204, and Kalinowski et al.(1991), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

● 디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(문헌참조: EP-B 0 197 335),

● 디하이드로피콜리네이트 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자[문헌참조: GenBank entry accession number X67737; Pisabarro et al.(1993), Journal ofBacteriology, 175(9): 2743-2749],

● 테트라하이드로피콜리네이트 숙시닐라제를 암호화하는 dapD 유전자[문헌참조: GenBank entry accession number AJ004934; Wehrmann et al. (1988), Journal of Bacteriology 180:3159-3163],

● N-숙시닐디아미노피멜레이트 데숙시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자[문헌참조: GenBank entry accession number X81379; Wehrmann et al. (1994), Microbiology 140: 3349-3356],

● 디아미노피멜레이트 에피머라제를 암호화하는 dapF 유전자[문헌참조: DE:199 43 587.1, DSM12968]

● 디아미노피멜레이트 데카복실라제를 암호화하는 lysA 유전자(문헌참조: GenBank entry accession number X07563; Yeh et al.(1988), Molecular and General Genetics 212:112-119),

● 디아미노피멜레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 ddh 유전자[문헌참조: Ishino et al. (1988), Agricultural and Biological Chemistry 52(11):2903-2909],

● 라이신 방출인자를 암호화하는 lysE 유전자[문헌참조: DE-A-195 48 222],

● 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자[문헌참조: Eikmanns(1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

● 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[문헌참조: Molenaar et al.(1998), European Journal of Biochemistry 254:395-403],

● zwa1 유전자(문헌참조: 19959328.0, DSM 13115) 및

● 글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gdh 유전자[문헌참조: Bormann et al.(1992), Molecular Microbiology 6, 317-326].

dapD, dapE 및 dapF 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증진시키는 것이 바람직하다.

dapD, dapE 및 dapF 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 dapC 유전자를 증진시킴과 동시에 하기의 유전자를 감쇠시키는 것이 L-라이신의 생산을 위해 유리할 수 있다:

● 포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자[문헌참조: DE 199 50 409.1, DSM 13047] 또는

● 글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자[문헌참조: US 09/396,478, DSM 12969] 또는

● 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자[문헌참조: DE 19951975.7, DSM 13114] 또는

● zwa2 유전자[문헌참조: DE 19959327.2, DSM 13113) 또는

● 숙시닐 CoA 신세타제를 암호화하는 sucC 또는 sucD 유전자[문헌참조: DE 19956686.0].

추가로, dapD, dapE 및 dapF 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자와 임의로 조합된 dapC 유전자를 증진시키는 것 뿐만 아니라 원하지 않는 부반응을 억제하는 것이 L-라이신의 생산을 위해 유리할 수 있다[문헌참조: Nakayama: "Breedingof Amino Acid Producing Micro-organism:, in: Over-production of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek(eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

L-라이신을 생산할 목적으로, 본 발명에 따른 미생물은 배치 공정 또는 유가식 공정 또는 반복적인 유가식 공정을 사용하여 연속적으로 또는 비연속적으로 배양할 수 있다. 공지된 배양 방법은 문헌[참조: the textbook by Chmiel(Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or the textbook by Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))]에 요약되어 있다.

사용될 배양 배지는 특정 균주의 요구를 적합하게 충족시켜야만 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 문헌[참조: Manual of Methods for General Bacteriology" from the American Society for Bacteriology(Washington D.C., USA, 1981)]에 기술되어 있다.

사용될 수 있는 탄소원은 예를 들어, 글루코스, 슈크로스, 락토스, 프럭토스, 말토스, 당밀, 전분 및 셀룰로스와 같은 슈가 및 탄수화물; 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코넛유와 같은 오일 및 지방; 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산과 같은 지방산; 글리세롤 및 에탄올과 같은 알콜 및 아세트산과 같은 유기산이다. 이들 물질은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 질소원은 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두분 및 우레아와 같이 질소를 함유하는 유기 화합물 또는 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄과 같은 무기 화합물을 포함한다. 질소원은 단독으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.

사용될 수 있는 인 공급원은 인산, 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 나트륨을 함유하는 상응하는 염이다. 배양 배지는 추가로 예를 들어 증식에 필수적인 황산마그네슘 또는 황화철과 같은 금속 염을 함유해야만 한다. 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 증식-촉진 물질이 또한 상기 언급된 물질과 더불어 사용될 수 있다. 추가로 적합한 전구체가 배양 배지에 첨가될 수 있다. 언급된 공급 물질은 단일 배치로서 배양물에 첨가될 수 있거나 배양동안에 적절히 공급될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수와 같은 염기성 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산성 화합물이 배양물의 pH를 조절하기 위해 적절히 사용된다. 거품은 예를 들어, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 조절될 수 있다. 플라스미드 안정성은 적합하게 선택적으로 작용하는 물질, 예를 들어, 항생제를 배지에 첨가하여 유지될 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어, 공기를 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지시킨다. 배양 온도는 통상적으로 20℃ 내지 45℃이고 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 최대량의 라이신이 형성될때까지 계속적으로 배양한다. 이러한 목적은 10 내지 160시간이내에 성취된다.

문헌[참조: Spackman et al.(Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190]에 기술된 바와 같이 음이온 교환 크로마토그래피에 이어서 닌하이드린 유도체화로 L-라이신을 분석할 수 있다.

하기의 미생물은 부다페스트 조약하에 기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 기탁되었다:

● DSM 13254로서 코리네박테리움 글루타미컴 균주 DSM5715/pXT-dapCexp

본 발명에 따른 방법은 L-라이신을 발효적으로 생산하는데 사용된다.

본 발명은 하기의 실질적인 실시예를 통해 보다 상세하게 설명된다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032로부터 유래된 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 작제

코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13032로부터 유래된 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al.,(1995, Plasmid 33: 168-179)]에 기술된 바와 같이 분리하고 제한 효소 Sau3AI[문헌참조: Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, code no. 27-0913-02]로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은새우 알카린 포스파타제[문헌참조: Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, product description SAP, code no. 1758250]로 탈인산화시킨다. 스트라타겐(Stratagene)으로부터 구입한 코스미드 벡터 슈퍼코스1의 DNA(문헌참조: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:2160-2164)(La Jolla, USA, product description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, code no. 251301)를 제한 효소 XbaI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, productdescritption XbaI, code no. 27-0948-02)로 절단하고 또한 작은 새우 알카린 포스파타제로 탈인화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description BamHI, code no. 27-0868-04)로 절단한다. 상기 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product descritpion T4 DNA Ligase, code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서 연결 혼합물을 기가팩 II XL 팩킹 추출물(Gigapack II XL Packing Extracts)(Stratagene, La Jolla, USA, product description Gigapack II XL Packing Extract, code no. 200217)을 사용하여 파아지에 팩킹시킨다. 이. 콜리 균주 NM554(참조: Raleigh et al. 1988, Nucleic Acid Research 16:1563-1575)를 10mM MgSO₄중에 현탁시키고 이들을 파아지 현탁액의 적정액과 혼합하여 감염시킨다. 코스미드 라이브러리를 문헌[참조: Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와 같이 감염시키고 적정하여 세포를 앰피실린 100mg/l을 함유한 LB 한천(Lennox, 1955, Virology, 1:190)상에 도말한다. 37℃에서 밤새 배양한후에 각각의 재조합 클론을 선별한다.

실시예 2

dapC 유전자의 분리 및 서열 분석

각각의 콜로니로부터 유래된 코스미드 DNA를 퀴아프렙 스핀 미니프렙키트(Qiaprep Spin Miniprep Kit)(Product no. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 제조업자의 지침에 따라 분리하고 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmcia, Freiburg, Germany, product description Sau3AI, product no. 27-0913-02)를 사용하여 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 작은 새우 알카린 포스파타제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, product description SAP, product no. 1758250)로 탈인산화시킨다. 겔 전기영동으로 일단 분리시킨후 크기가 1500 내지 2000 bp인 코스미드 단편을 QiaExII 겔 추출 키트(product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한다. 인비트로겐(Invitrogen)으로부터 구입한 서열 분석 벡터 pZero-1의 DNA(Groningen, Netherlands, product description Zero Background Cloning Kit, product no. K2500-01)를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product description BamHI, product no. 27-0868-04)로 절단한다. 코스미드 단편을 문헌[참조: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와 같이 서열 분석 벡터 pZero-1에 연결시키고 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 항온처리한다. 상기 연결 혼합물을 이어서 이. 콜리 균주 DH5αMCR에 전기 천공시키고[문헌참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87:4645-4649, Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7] 제오신 50mg/l를 함유한 LB 한천[문헌참조: Lennox, 1955, Virology, 1:190]상에 도말한다. 재조합 클론의 플라스미드를 바이오로봇(Biorobot) 9600(product no. 900200, Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여작제한다. 짐머만(Zimmermann) 등[문헌참조: 1990, Nucleic Acids Research, 18:1067)에 의해 개질된 생거(Sanger)등[문헌참조: 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74:5463-5467]에 따른 디데옥시 연쇄 종결 방법을 사용하여 서열 분석한다. PE 어플라이드 바이오시스템(PE Applied Biosystems)으로부터 구입한 "RR 로다민 터미네이터 사이클 서열 분석 키트(RR dRhodamin Terminator Cycle Sequencing Kit)"(product no. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. "로티포레스 NF(Rotiphorese NF)" 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)(product no. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)중에서 PE 어플라이드 바이오시스템(Weiterstadt, Germany)으로부터 구입한 "ABI 프리즘 377(ABI Prism 377)" 서열 분석기를 사용하여 겔 전기영동하여 분리하고 서열 분석 반응물을 분석한다.

수득한 미처리 서열 데이터를 이어서 스타덴 소프트웨어 팩키지(1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231) 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. 각각의 pZerol 유도체 서열을 접착성 콘티그에 어셀블링한다. 컴퓨터-보조된 암호화 범위 분석은 XNIP 소프트웨어[Staden, 1986, Nucleic Acids Research, 14:217-231]를 사용하여 수행한다. 기관[National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)]"의 비-중복 데이타베이스에 대하여 블라스트 서치 프로그램(Blast search program)"[Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research, 25:3389-3402]을 사용하여 추가로 분석한다.

dapC 유전자의 수득한 뉴클레오타이드 서열을 서열 1에 나타낸다. 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 dapC 유전자로서 명명된 1101 염기쌍의 개방 판독 프레임을 밝힌다. dapC 유전자는 서열 2에 나타낸 367개 아미노산의 폴리펩타이드를 암호화하고 있다.

실시예 3

씨. 글루타미컴내에서 dapC 유전자를 증진시키기 위한 셔틀 벡터 pXT-dapCexp의 작제

3.1. dapC 유전자의 클로닝

염색체 DNA를 문헌[참조: Eikmanns et al.(Microbiology 140:1817-1828(1994)]의 방법을 사용하여 균주 ATCC 13032로부터 분리한다. 실시예 2로부터 공지된 씨. 글루타미컴에 대한 dapC 유전자의 서열을 기초로 폴리머라제 연쇄 반응을 위해 하기의 올리고뉴클레오타이드를 선별한다(서열 5 및 6 참조):

DapC(dCex1):

5' GAT CTA (GAA TTC) GCC TCA GGC ATA ATC TAA CG 3'

DapC(dCexna2):

5' GAT CTA (TCT AGA) CAG AGG ACA AGG CAA TCG GA 3'

상기된 프라이머는 제조회사(company ARK Scientific GmbH Biosystems)(Darmstadt, Germany)에 의해 합성되었고 제조회사(Roche Diagnostics GmbH(Mannheim, Germany)의 Pwo 폴리머라제를 사용하여 PCR 반응을 문헌[참조: Innis et al.(PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, 1990,Academic Press)의 표준 PCR 방법에 따라 수행한다. 폴리머라제 연쇄 반응으로 프라이머를 사용하여 dapC 유전자를 함유하는 약 1.6kb DNA 단편을 증폭시킨다. 더욱이, 프라이머 DapC(dCex1)은 상기된 뉴클레오타이드 서열중에 괄호사이에 나타낸 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI의 제한 부위에 대한 서열을 함유하고 프라이머 DapC(dCexna2)는 제한 엔도뉴클레아제 XbaI의 제한 부위를 포함한다.

dapC 유전자를 함유하는 증폭된 약 1.6kb DNA 단편을 인비트로겐 코포레이션의 제로 브런트^TM키트(Zero Blunt^TMKit)(Carlsbad, CA, USA; Catalogue number K2700-20)를 사용하여 벡터 pCR^RBlunt II[문헌참조: Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234:534-541(1993)]에 연결시킨다. 이어서 이. 콜리 균주 Top10을 키트 제조업자의 지침(Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA)에 따라 연결 배치로 형질전환시킨다. 카나마이신 25mg/l로 보충된 LB 한천[문헌참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^ndEd., Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]상에서 형질전환 배치를 도말하여 플라스미드-함유 세포를 선별한다. 퀴아겐(Qiagen)의 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 XbaI 및 EcoRI로 분해한 다음 아가로스 겔(0.8%) 전기영동하여 확인한다. 증폭된 DNA 단편의 DNA 서열을 서열 분석하여 확인한다. 플라스미드를 pCRdapC로 명명한다. 균주를 이. 콜리 Top10/pCRdapC로 명명한다.

3.2 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 벡터 pEC-XT99A의 작제

이. 콜리 발현 벡터 pTRC99A(Amann et al. 1988, Gene 69:301-315)를 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 발현 벡터 pEC-XT99A를 작제하기 위한 출발 벡터로서 사용한다. BspHI 제한 절단(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, production description BspHI, product no. 1467123)에 이어서 Klenow 처리[Amersham Pharmacia Biotech, Freburg, Germany, product description Klenow Fragment of DNA Polymerase I, product no. 27-0928-01; method according to Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)후에, 앰피실린 내성 유전자(bla)를 씨. 글루타미컴 플라스미드 pAG1(GenBank accession no. AF121000)의 테트라사이클린 내성 유전자로 대체한다. 결국, 내성 유전자를 함유한 영역은 AluI 단편[Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description AluI, product no, 27-0884-01]으로서 선형화된 이. 콜리 발현 벡터 pTRC99A에 클로닝시킨다. 문헌[참조: Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 연결하고 DNA 혼합물을 T4 리가제(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description T4 DNA ligase, product no. 27-0870-04)와 함께 밤새 항온처리한다. 이어서 연결 혼합물을 이. 콜리 균주 DH5αmcr(Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S,A., 87:4645-4649)(Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters, 123:343-7)에 전기 천공시킨다. 작제된 이. 콜리 발현 벡터를 pXT99A로 명명한다.

플라스미드 pGA1(문헌참조: Sonnen et al. 1991, Gene, 107:69-74)를 코리네박테리움 글루타미컴 기원의 최소 레프리콘을 클로닝하기 위한 기본 플라스미드로서 사용한다. pGA1 벡터를 BalI/PstI 제한 절단(Promega GmbH, Mannheim, Germany, production description BalI, product no. R6691; Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, production description PstI, product no. 27-0976-01)하여 3484 bp 단편이, SamI 및 PstI(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description PstI, product no. 27-0976-01)로 단편화된 pK18mob2 벡터(문헌참조: Tauch et al., 1998, Archives of Microbiology 169:303-312)에 클로닝될 수 있음을 입증한다. 839 bp 단편을 BamHI/XhoI 제한 절단(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product descripiton BamHI, product no. 27-086803, product description XhoI, product no. 27-0950-01)에 이어서 Klenow 처리(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description Klenow Fragment of DNA polymerase I, product no. 27-0928-01; method according to Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)하여 839 bp 단편을 제거한다. T4 리가제(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description T4 DNA Ligase, product no. 27-0870-04)로 재연결된 작제물 기원의 2645 bp 단편으로서 씨. 글루타미컴 최소 레프리콘을 이. 콜리 발현 벡터 pXT99A에 클로닝시킬 수 있다. 결국, 최소 레프리콘을 함유하는 작제물의 DNA를 제한효소 KpnI(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description KpnI, product no. 27-0908-01) 및 PstI(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, productdescription PstI, product no. 27-0886-03)로 절단하고 이어서 Klenow 폴리머라제(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description Klenow Fragment of DNA Polymerase I, product no. 27-0928-01)를 사용하여 3'-5'-엑소뉴클레아제로 처리(Sambrook et al.,1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)한다.

병행 배치에서, 이. 콜리 발현 벡터 pXT99A를 제한 효소 RsrII(Roche Diagnostics, Mannheim, Germany, product description RsrII, product no. 1292587)로 절단하고 Klenow 폴리머라제(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, Klenow Fragment of DNA Polymerase I, product no. 27-0928-01)를 사용한 연결을 준비한다. 벡터 작제물 pXT99A와 최소 레프리콘은 문헌[참조: Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor)]에 기술된 바와같이 연결시키고 DNA 혼합물을 T4 리가제(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany, product description T4 DNA Ligase, product no. 27-0870-40)와 함께 항온처리한다.

상기 방식으로 작제된 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 발현 벡터 pECXT99A를 전기 천공[Liebel et al., 1989, FEMS Microbiology Letters, 53:299-303]에 의해 씨. 글루타미컴 DSM5715에 전달한다. 테트라사이클린 5mg/l이 보충된, 뇌-심장 주입 육즙 18.5g/l, 소르비톨 0.5M, 박토 트립톤 5g/l, 박토 효모 추출물 2.5g/l, NaCl 5g/l 및 박토 한천 18g/l로 이루어진 LBHIS 한천상에서 형질전환체를 선별한다.

플라스미드 DNA를 통상적인 방법(참조: Peters-Wendisch et al., 1998, Microbiology, 144, 915-927)을 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 엔도뉴클레아제 HindIII로 절단함에 이어서 아가로스 겔 전기영동하여 플라스미드를 확인한다.

수득한 플라스미드 작제물을 pEC-XT99A로 명명하고 도 1에 나타낸다. 플라스미드 pEC-XT99A를 코리네박테리움 글루타미컴 DSM5715에 전기천공하여 수득한 균주를 DSM5715/pEC-XT99A로 명명하고 부다페스트 조약하에 기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, Braunschweig, Germany]에 기탁하였다.

3.3 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 벡터 pEC-XT99A에 dapC의 클로닝

사용된 벡터는 실시예 3.2에 기술된 이. 콜리-씨. 글루타미컴 셔틀 벡터 pEC-XT99A이다. 상기 플라스미드의 DNA를 제한효소 EcoRI 및 XbaI로 완전히 절단하고 이어서 작은 새우 포스파타제(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany, product description SAP, product no. 1758250)로 탈인산화시킨다.

실시예 3.1에 기술된 플라스미드 pCRdapC을 효소 EcoRI와 XbaI로 완전히 절단하여 dapC 유전자를 분리한다. 약 1600 bp의 dapC 단편을 QiaEXII 겔 추출 키트(product no. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 아가로스 겔로부터 분리한다.

상기 방식으로 수득한 dapC 단편을 작제된 pEC-XT99A 벡터와 혼합하고 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, product descriptionT4 DNA Ligase, code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서 연결 배치로 이. 콜리 균주 DH5α[Hanahan, in:DNA Cloning. A Practical Approach, Vol. I, IRL-Press, Oxford, Washington DC, USA]를 형질전환시킨다. 형질전환체 배치를 테르라사이클린 5mg/l을 함유한 LB 한천(Lennox, 1955, Virology, 1:190)상에 도말하여 플라스미드 함유 세포를 선별한다. 37℃에서 밤새 배양시킨후에 각각의 재조합 클론을 선별한다. 플라스미드 DNA를 제조업자 지침에 따라 퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(product no. 27106, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 효소 EcoRI 및 XbaI로 절단하고 이어서 아가로스 겔 전기영동하여 플라스미드를 확인한다. 수득한 플라스미드를 pXTdapCexp로 명명한다. 이것은 도 2에 나타낸다.

실시예 4

플라스미드 pXT-dapCexp를 사용한 균주 DSM5715의 형질전환

이어서 균주 DSM5715를 문헌[참조: Liebl et al.(FEMS Microbiology Letters, 53:299-303(1989)]에 기술된 전기 천공 방법을 사용하여 플라스미드 pXT-dapCexp로 형질전환시킨다. 테트라사이클린 5mg/l이 보충된, 뇌-심장 주입 육즙 18.5g/l, 소르비톨 0.5M, 박토 트립톤 5g/l, 박토 효모 추출물 2.5g/l, NaCl 5g/l 및 박토 한천 18g/l로 이루어진 LBHIS 한천상에서 형질전환체를 선별한다. 33℃에서 2일동안 배양한다.

플라스미드 DNA를 통상적인 방법(참조: Peters-Wendisch et al., 1998,Microbiology, 144, 915-927)을 사용하여 형질전환체로부터 분리하고 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 XbaI로 절단함에 이어서 아가로스 겔 전기영동하여 플라스미드를 확인한다. 수득한 균주를 DSM5715/pXT-dapCexp로 명명하고 부다페스트 조약하에 기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ, Braunschweig, Germany)]에 DSM 13254로서 기탁하였다.

실시예 5

L-라이신의 생산

실시예 4에서 수득한 씨. 글루타미컴 균주 DSM5715/pXT-dapCexp를 라이신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양하고 배양 상등액의 라이신 함량을 결정한다.

이후에, 처음에 균주를 적당한 항생제[테트라사이클린(5mg/l)을 함유한 뇌/심장 한천]를 함유한 한천 플레이트상에 33℃에서 24시간동안 배양한다. 상기 한천 플레이트 배양에서 출발한 전배양물을 접종(100ml 삼각 플라스크중 배지 10ml)한다. 완전한 배지 CgIII를 상기 전배양의 배지로서 사용한다.

배지 Cg III

NaCl 2.5g/l

박토 펩톤 10g/l

박토 효모 추출물 10g/l

글루코스(별도로 오토클레이빙) 2%(w/v)

pH 값을 pH 7.4로 조정한다.

테트라사이클린(5mg/l)을 상기 배지에 첨가한다. 전배양물을 16시간동안 240rpm, 33℃에서 진탕기상에서 배양한다. 상기 전배양물을 본배양물에 접종하여 본배양의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 한다. 배지 MM을 본배양에 사용한다.

배지 MM

CSL(옥수수 침지액) 5g/l

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/l

글루코스(별도로 오토클레이빙) 50g/l

(NH₄)₂SO₄25g/l

KH₂PO₄0.1g/l

MgSO₄*7H₂O 1.0g/l

CaCl₂*2H₂O 10mg/l

FeSO₄*7H₂O 10mg/l

MnSO₄*H₂O 5.0mg/l

비오틴(살균-여과됨) 0.3mg/l

티아민*HCl(살균-여과됨) 0.2mg/l

L-류신(살균-여과됨) 0.1g/l

CaCO₃25g/l

CSL, MOPS 및 염 용액을 암모니아수를 사용하여 pH 7로 조정하고 오토클레이빙한다. 이어서, 살균된 기질 및 비타민 용액을 건조-오토클레이빙된 CaCO₃와 함께 첨가한다.

유류 조정기를 갖는 100ml 삼각 플라스크의 10ml 용적에서 배양한다. 테트라사이클린(5mg/l)을 첨가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도에서 배양한다.

72시간후에 바이오멕(Biomek) 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하는 660nm의 측정 파장에서 OD를 측정한다. 이온 교환 크로마토그래피 및 후-칼럼 유도화에 이어서 닌하이드린 검출에 의한 제조회사(Eppendorf BioTronik(Hamburg, Germany))의 아미노산 분석기를 사용하여 형성된 라이신의 양을 결정한다.

표 1은 시험의 결과를 나타낸다.

균주	OD(660nm)	라이신 HCl 25g/l
DSM5715	7.0	13.7
DSM5715/pXT-dapCexp	7.1	14.7

약어 및 명칭은 하기와 같이 정의된다:

per: pGA1 기원의 카피수를 조절하기 위한 유전자,

oriE: 이. 콜리의 플라스미드-암호화된 복제 오리진,

rep: 씨. 글루타미컴 플라스미드 pGA1 기원의 플라스미드 암호화된 복제 오리진,

Ptrc: pTRC99A 기원의 trc 프로모터,

T1, T2: pTRC99A 기원의 터미네이터 영역 1 및 2,

lacIq: Lac 오페론의 리프레서 유전자,

Tet: 테트라사이클린에 대한 내성 유전자

dapC: 씨. 글루타미컴 기원의 dapC 유전자,

EcoRI: 제한 효소 EcoRI의 제한 부위,

EcoRV: 제한 효소 EcoRV의 제한 부위,

HindIII: 제한 효소 HindIII의 제한 부위,

KpnI: 제한 효소 KpnI의 제한 부위,

SalI: 제한 효소 SalI의 제한 부위,

SmaI: 제한 효소 SmaI의 제한 부위,

NdeI: 제한 효소 NdeI의 제한 부위,

BamHI: 제한 효소 BamHI의 제한 부위,

NcoI: 제한 효소 NcoI의 제한 부위,

XbaI: 제한 효소 XbaI의 제한 부위,

SacI: 제한 효소 SacI의 제한 부위.

본 발명의 방법은 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제를 암호화하는 dapC 유전자를 재조합 기술로 과발현시킴으로써 기존의 L-라이신을 생산하는 코린네형 세균의 생산 능력을 개선시켰다.

Claims

서열 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오타이드 a),

서열 2의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 b),

폴리뉴클레오타이드 a) 또는 b)와 상보적인 폴리뉴클레오타이드 c) 및

폴리뉴클레오타이드 a), b) 또는 c)의 15개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 d)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, 바람직하게는 코리네형 세균 속에서 복제 가능한 재조합 DNA인 폴리뉴클레오타이드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서, 서열 1에 나타낸 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드.
제2항에 있어서,

서열 1에 나타낸 뉴클레오타이드 서열(i),

유전자 코드의 축퇴성 범위내에서 서열(i)과 일치하는 하나 이상의 서열(ii),

서열(i) 또는 서열(ii)와 상보적인 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 서열(iii) 및

서열(i)내의 기능적으로 불변인 임의의 센스 돌연변이 서열(iv)을 포함하는 복제 가능한 DNA.
도 2에 나타낸 제한 지도를 특징으로 하고 코리네형 글루타미컴내에 기탁번호 DSM 13254로 기탁된, 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터, 특히 pXT-dapCexp.
제6항에 따르는 벡터를 포함하고 zwal 유전자가 증진된, 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 세균.
적어도 dapC 유전자가 증진된, 목적하는 L-아미노산을 생산하는 세균을 발효시키는 단계 a),

배지 속에 또는 세균 세포 내에 목적하는 생성물을 축적시키는 단계 b) 및

L-아미노산을 분리하는 단계 c)를 포함하여, L-아미노산, 특히 L-라이신을 생산하는 방법.
재8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 중의 추가의 유전자가 추가로 증진된 세균이 사용되는 방법.
제8항에 있어서, L-라이신의 형성을 감소시키는 대사 경로가 적어도 부분적으로 억제된 세균이 사용되는 방법.
제8항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 있어서, L-라이신을 생산하는 코리네형 세균이 사용되는 방법.
제8항에 있어서, dapC 유전자 뿐만 아니라,

피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자(12.1),

아스파르테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제를 암호화하는 asd 유전자(12.2),

디하이드로피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(12.3),

디하이드로피콜리네이트 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자(12.4),

테트라하이드로피콜리네이트 숙시닐라제를 암호화하는 dapD 유전자(12.5),

N-숙시닐디아미노피멜레이트 데숙시닐라제를 암호화하는 dapE 유전자(12.6),

디아미노피멜레이트 에피머라제를 암호화하는 dapF 유전자(12.7),

디아미노피멜레이트 데카복실라제를 암호화하는 lysA 유전자(12.8),

디아미노피멜레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 ddh 유전자(12.9),

라이신 방출인자를 암호화하는 lysE 유전자(12.10),

피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(12.11),

말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자(12.12),

zwa1 유전자(12.13) 및

글루타메이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gdh 유전자(12.14)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 증진되고, 특히 과발현되거나 증폭된 미생물을 발효시켜 L-라이신을 생산하는 방법.
제8항에 있어서,

포스포에놀피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자(13.1),

글루코스 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자(13.2),

피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자(13.3),

zwa2 유전자(13.4) 및

숙시닐 CoA 신세타제를 암호화하는 sucC 또는 sucD 유전자(13.5)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 세균을 발효시켜 L-라이신을 생산하는 방법.
제8항 내지 제13항 중의 어느 한 항에 있어서, 코리네박테리움 글루타미컴 속의 미생물이 사용되는 방법.
dapC 유전자의 생성물을 암호화하는 cDNA를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.
cDNA 또는 dapC 유전자의 서열과 고도의 유사성을 나타내는 유전자를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서 제1항에 따르는 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도.
서열 2에 나타낸 아미노산 서열내 209번 위치의 아미노산이 L-프롤린을 제외한 다른 아미노산으로 대체된 N-숙시닐아미노케토피멜레이트 트랜스아미나제를 암호화하는, 코리네형 세균으로부터 기원하는 DNA.
제17항에 있어서, 효소 단백질내 209번 위치의 아미노산 L-프롤린(서열 2 참조)이 L-류신으로 대체되어 있는(서열 4 참조) DNA.
제18항에 있어서, 209번 위치에서 L-프롤린의 류신으로의 대체가 서열 3에 나타낸 바와 같이 716번 위치에서의 핵산 염기 사이토신이 티민으로 대체됨으로써 수행되는 DNA.
제17항 내지 제19항 중의 어느 한 항에 따르는 DNA를 포함하는 코리네형 세균.