KR20010086395A

KR20010086395A - ｔａｌ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열

Info

Publication number: KR20010086395A
Application number: KR1020017003061A
Authority: KR
Inventors: 듀니칸엘케이; 맥코르막크아실링; 스타펠톤클리오나; 부케케빈; 뫼켈베티나
Original assignee: 펠드만 마르틴 및 봅 후베르트; 데구사 아게; 추후제출; 내셔널 유니버시티 오브 아일랜드
Priority date: 1999-07-09
Filing date: 2000-07-05
Publication date: 2001-09-10
Also published as: DE60022612T2; BRPI0006915B8; MXPA01002412A; CA2348448A1; KR100731524B1; HUP0104450A2; ID29968A; US7901913B2; US20040214219A1; BR0006915B1; EP1109915A1; DE60022612T3; US8445241B2; ATE304596T1; AU768599B2; JP2003504066A; SK3022001A3; PL346500A1; RU2001108535A; DE60022612D1

Abstract

본 발명은, a) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드, b) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및 d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 코리네형 박테리아로부터 분리된 폴리뉴클레오티드; 및 a) 하나 이상의 tal 유전자가 증폭된, 목적하는 L-아미노산 생산-박테리아의 발효 단계, b) 배지 또는 박테리아 세포내에서의 목적하는 산물의농축 단계, 및 c) L-아미노산의 분리 단계를 수행함을 포함하여, L-아미노산을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

ｔａｌ 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열{Nucleotide sequences for the tal gene}

본 발명은 tal 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, 및 tal 유전자가 증폭된 코리네형 박테리아를 사용하여 아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-트립토판을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특히 동물의 사료에 사용된다.

아미노산이 코리네형 박테리아 균주, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)에 의한 발효를 통해 생산될 수 있다는 것이 공지되어 있다. 아미노산의 지대한 중요성 때문에, 생산 공정을 개선하기 위한 노력이 계속되어 왔다. 생산 공정의 개선은, 발효 기술(예: 교반 및 산소 공급), 영양 배지의 조성(예: 발효 동안의 당의 농도), 예를 들어, 이온 교환 크로마토그래피에 의한 제품 형태로의 후처리, 또는 미생물 자체의 고유 생산성에 관한 것이다.

돌연변이 유발법, 선별법 및 돌연변이체 선별법을 사용하여 이들 미생물의생산성을 개선시킬 수 있다. 이러한 방법에 의해, 항대사물질(예: 리신 동족체 S-(2-아미노에틸)-시스테인)에 대해 내성을 갖거나, 또는 조절상 중요한 대사물질에 대해 영양요구성이며, L-아미노산, 예를 들어, L-리신을 생산하는 균주가 수득된다.

각각의 아미노산의 생합성 유전자를 증폭시키고 아미노산의 생산에 미치는 효과를 연구하여, 아미노산을 생산하는 코리네박테리움 균주를 개량하기 위한 재조합 DNA 기술이 수년간 이용되어 왔다. 이에 관한 개관 논문은 특히 다음 문헌[참조: Kinoshita "Glutamic Acid Bacteria", Biology of Industrial Microorganisms, Demain and Solomon (Eds.), Benjamin Cummings, London, UK, 1985, 115-142; Hilliger, BioTec 2, 40-44 (1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272 (1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al., Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)]에서 찾아볼 수 있다.

코리네형 박테리아에 의한 아미노산, 특히 L-리신의 생합성 및 생산에 있어서 펜토즈 포스페이트 사이클은 당업자들 사이에서 상당한 노력을 기울이는 중요한 과제이다.

이와 같이, 문헌[참조: Oishi and Aida, Agricultural and Biological Chemistry 29, 83-89 (1965)]에는 브레비박테리움 암모니아게네스(Brevibacterium ammoniagenes)의 "헥소즈 모노포스페이트 전환"에 대한 보고가 기술되어 있다. 문헌[참조: Sugimoto and Shio, Agricultural and Biological Chemistry 51, 101-108(1987)]에는 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum)내에서의 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제의 조절에 대한 보고가 기술되어 있다.

발명의 목적

본 발명자들이 이루고자 하는 목적은 아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-트립토판의 발효적 생산을 개선하기 위한 신규한 수단을 제공하는 것이다.

아미노산, 특히 L-리신은 사람의 의약 및 약제 산업, 특히 동물의 사료에 사용된다. 따라서, 아미노산, 특히 L-리신을 생산하기 위한 신규한 개선된 방법을 제공하는 것이 전반적 관심의 대상이다.

이후, L-리신 또는 리신이 언급되는 경우, 이는 염기 뿐만 아니라, 예를 들면, 리신 모노하이드로클로라이드 또는 리신 설페이트와 같은 염을 의미하는 것이기도 하다.

본 발명은,

a) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로부터 분리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은,

(i) 서열 1 및 서열 3으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전자 암호의 축퇴성(degeneration) 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 서열 (i)에서 기능상 중성인 센스 돌연변이체를 포함하는 바람직하게는 복제가능한 DNA인, 특허청구의 범위 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 1 및 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열 중 하나를 포함하는, 특허청구의 범위 제4항에 따른 폴리뉴클레오티드; 서열 2 및 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는, 특허청구의 범위 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드; 및 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터; 및 벡터를 함유하는, 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 박테리아를 제공한다.

또한, 본 발명은, 서열 1 또는 서열 3에 상응하는 폴리뉴클레오티드 서열을갖는 완전한 유전자를 포함하는, 상응하는 유전자 라이브러리를 서열 1 또는 서열 3에 따른 상기 폴리뉴클레오티드 서열 또는 이의 단편을 포함하는 프로브와 하이브리드화하여 스크리닝하고, 언급된 DNA 서열을 분리함으로써 수득가능한, 폴리뉴클레오티드 서열을 실질적으로 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은, 트랜스알돌라제를 암호화하는 전장 cDNA를 분리하고, 트랜스알돌라제 유전자의 서열과 고도로 유사한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 RNA, cDNA 및 DNA와의 하이브리드화 프로브로서 적합하다.

또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은, 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 트랜스알돌라제를 암호화하는 유전자의 DNA를 제조하기 위한 프라이머로서 적합하다.

프로브 또는 프라이머로서 작용하는 이러한 올리고뉴클레오티드는 30개 이상, 바람직하게는 20개 이상, 특히 바람직하게는 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함한다. 40개 또는 50개 이상의 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드도 또한 적합하다.

"분리된"이란 천연 환경으로부터 분리되어짐을 의미한다.

"폴리뉴클레오티드"는 일반적으로 폴리리보뉴클레오티드 및 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하며, 이들은 변형되지 않은 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수도 있다.

"폴리펩티드"란 펩티드 결합을 통해 결합된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 펩티드 또는 단백질로 이해된다.

본 발명에 따른 폴리펩티드로는, 서열 2 또는 서열 4에 따른 폴리펩티드, 특히 트랜스알돌라제의 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드, 및 서열 2 또는 서열 4에 따른 폴리펩티드와 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90 내지 95% 정도 동일하고, 위에서 언급한 활성을 갖는 폴리펩티드가 포함된다.

또한, 본 발명은, 특히 이미 아미노산을 생산하며 tal 유전자를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 증폭, 특히 과발현된 코리네형 박테리아를 사용하여, 아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-트립토판을 발효적으로 생산하는 방법을 제공한다.

이와 관련하여, "증폭"이란 용어는, 예를 들면, 유전자(들)의 복사체 수를 증가시키거나, 강한 프로모터를 사용하거나, 고활성의 상응하는 효소를 암호화하는 유전자를 사용하거나, 임의로 이들 수단을 조합함으로써, 상응하는 DNA에 의해 암호화되는 하나 이상의 효소의 세포내 활성을 미생물내에서 증강시키는 것을 의미한다.

본 발명이 제공하는 미생물은, 글루코즈, 수크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 또는 셀룰로즈로부터, 또는 글리세롤 및 에탄올로부터 L-아미노산, 특히 L-리신을 생산할 수 있다. 이러한 미생물의 대표적인 예는 코리네형 박테리아, 특히 코리네박테리움 속의 미생물이다. 코리네박테리움 속 중에서도, L-아미노산을 생산할 수 있는 이의 능력이 당업자에게 공지된 코리네박테리움 글루타미쿰 종이 특히 언급될 수 있다.

코리네박테리움 속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종 중에서 적합한 균주로는, 예를 들면, 공지된 야생형 균주:

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,

코리네박테리움 아세토글루타미쿰(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806,

코리네박테리움 아세토아시도필룸(Corynebacterium acetoacidophilum) ATCC 13870,

코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes) FERM BP-1539,

코리네박테리움 멜라스세콜라(Corynebacterium melassecola) ATCC 17965,

브레비박테리움 플라붐 ATCC 14067,

브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및

브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum) ATCC 14020; 및

이로부터 제조된 L-리신-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 1709,

브레비박테리움 플라붐 FERM-P 1708,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 1712,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6463,

코리네박테리움 글루타미쿰 FERM-P 6464,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032,

코리네박테리움 글루타미쿰 DM58-1, 및

코리네박테리움 글루타미쿰 DSM 12866; 및

이로부터 제조된 L-트레오닌-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21649,

브레비박테리움 플라붐 BB69,

브레비박테리움 플라붐 DSM 5399,

브레비박테리움 락토페르멘툼 FERM-P 269, 및

브레비박테리움 락토페르멘툼 TBB-10; 및

이로부터 제조된 L-이소로이신-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14309,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14310,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 14311,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 15168, 및

코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes) ATCC 6871; 및

이로부터 제조된 L-트립토판-생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면,

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 21850 및

코리네박테리움 글루타미쿰 KY9218(pKW9901)이 있다.

본 발명자들은 트랜스알돌라제(EC 2.2.1.2)를 암호화하는 코리네박테리움 글루타미쿰의 신규한 tal 유전자를 분리하는데 성공하였다.

코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 tal 유전자 또는 기타 유전자를 분리하기 위하여, 일차적으로 이. 콜라이(E. coli)내에 당해 미생물의 유전자 라이브러리를 작제한다. 유전자 라이브러리의 작제법은 일반적으로 공지된 교과서 및 논문집에 기술되어 있다. 예로써, 교과서[참조: Winnacker: Gene und Klone, Eine Einfuhrung in die Gentechnologie (Gene and Clone, An Introduction to Genetic Engineering)(Verlag Chemie, Weinheim, Germany, 1990] 또는 논문집[참조: Sambrook et al.: Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)]를 언급할 수 있다. 익히 공지된 유전자 라이브러리는 문헌[참조: Kohara et al., Cell 50, 495-508 (1987)]에 따라 λ 벡터내에 작제된 이. 콜라이 K-12 균주 W3110의 유전자 라이브러리이다. 문헌[참조: Bathe et al., Molecular and General Genetics, 252: 255-265, 1996]에는 코스미드 벡터 SuperCos I[참조: Wahl et al., 1987, Proceedings of the National Academy of Science USA, 84: 2160-2164]을 이용하여 이. 콜라이 K-12 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]내에 작제한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032의 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 또한, 문헌[참조: Bormann et al., Molecular Microbiology 6(3), 317-326 (1992)]에는 코스미드 pHC79[참조: Hohn and Collins, Gene 11, 291-298 (1980)]을 사용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 수득한 유전자 라이브러리가 기술되어 있다. 문헌[참조: O'Donohue, The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum. Ph.D. Thesis, National University of Ireland, Galway, 1997]에는, 문헌[참조: Short et al., Nucleic Acids Research, 16: 7583]에 기재된 λZap 발현 시스템을 사용하는 코리네박테리움 글루타미쿰 유전자의 클로닝이 기술되어 있다. 이. 콜라이내에 코리네박테리움 글루타미쿰로부터의 유전자 라이브러리를 제조하기 위하여, pBR322[참조: Bolivar, Life Sciences, 25, 807-818 (1979)] 또는 pUC9[참조: Vieira et al., 1982, Gene, 19: 259-268]와 같은 플라스미드를 사용할 수도 있다. 제한-결함 및 재조합-결함인 이. 콜라이 균주가 숙주로서 특히 적합하다. 이러한 균주의 예로는 문헌[참조: Grant et al., Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649)]에 기술된 균주 DH5αmcr이 있다. 이어서, 코스미드를 이용하여 클로닝된 장쇄 DNA 단편을 서열분석에 적합한 통상의 벡터내에 서브클로닝한 다음, 서열 분석할 수 있다[참조: Sanger et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74: 5463-5467, 1977].

수득된 DNA 서열을, 예를 들면, 문헌[참조: Staden, Nucleic Acids Research 14, 217-232 (1986)]의 프로그램, 문헌[참조: Butler, Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)]의 GCG 프로그램, 문헌[참조: Pearson and Lipman, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 85, 2444-2448 (1988)]의 FASTA 알고리듬 또는 문헌[참조: Altschul et al., Nature Genetics 6, 119-129 (1994)]의 BLAST 알고리듬과 같은 공지된 알고리듬 또는 서열분석 프로그램으로 조사하여, 일반인이 이용가능한 데이터뱅크에 존재하는 서열 목록과 비교할 수 있다.일반인이 이용가능한 뉴클레오티드 서열의 데이터뱅크로는, 예를 들면, 유럽 분자생물학 연구소(EMBL: The European Molecular Biologies Laboratories, Heidelberg, Germany)의 데이터뱅크, 또는 국립 생명공학 정보 센터(NCBI: The National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD, USA)의 데이터뱅크가 있다.

본 발명은, 서열 1 및 서열 3으로서 제시된, tal 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 함유하는, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 신규한 DNA 서열을 제공한다. 또한, 상응하는 단백질의 아미노산 서열도 상기한 방법에 의해 본 발명의 DNA 서열로부터 유도된다. 수득된 tal 유전자 산물의 아미노산 서열은 서열 2 및 서열 4에 제시되어 있다.

또한, 상기한 방식으로 제조된 유전자 라이브러리는 공지된 서열, 예를 들면 zwf 유전자(JP-A-09224661)의 뉴클레오티드 프로브와 하이브리드화시킴으로써 조사될 수 있다. 하이브리드화에서 양성 반응을 나타내는 클론의 클로닝된 DNA를 차례로 서열분석하여, 한편으로는 사용된 프로브의 공지된 뉴클레오티드 서열을 수득하고, 다른 한편으로는 인접한 신규한 DNA 서열을 수득한다.

또한, 유전 암호의 축퇴성으로 인해 서열 3으로부터 생성된 암호화 DNA 서열도 본 발명의 일부를 구성한다. 마찬가지로, 서열 3 또는 서열 3의 일부와 하이브리드를 형성하는 DNA 서열은 본 발명의 일부를 구성한다. 단백질에서 보존성 아미노산 교체, 즉 글리신의 알라닌으로의 교체 또는 아스파르트산의 글루탐산으로의 교체는, 단백질의 활성을 근본적으로 변화시키지 않는, 즉 기능상 중성인 "센스 돌연변이"로서 당업자들 사이에서 익히 공지되어 있다. 또한, 단백질의 N 및/또는 C 말단 상의 변화는, 이의 작용을 실질적으로 손상시키지 않거나, 오히려 안정화시킬 수 있다는 것이 공지되어 있다. 당업자는, 이와 관련된 정보를 특히 문헌[참조: Ben-Bassat et al., Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987); O'Regan et al., Gene 77: 237-251 (1989); Sahin-Toth et al., Protein Sciences 3: 240-247 (1994); Hochuli et al., Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다. 상응하는 방식으로 서열 2 또는 서열 4로부터 수득되는 아미노산 서열은 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

마찬가지로, 서열 3 또는 서열 3의 일부와 하이브리드를 형성하는 DNA 서열은 본 발명을 구성한다. 최종적으로, 서열 3으로부터 수득된 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의해 제조된 DNA 서열도 또한 본 발명을 구성한다. 이러한 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 15개 이상의 뉴클레오티드 길이를 갖는다.

당업자는 하이브리드화에 의한 DNA 서열의 동정에 대한 지침을 문헌["The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Germany, 1993); 및 Liebl et al., International Journal of Systematic Bacteriology (1991) 41: 255-260]에서 찾아볼 수 있다. 당업자는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)에 의한 DNA 서열 증폭에 대한 지침을, 특히 문헌[참조: Gait, Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984); 및 Newton & Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg,Germany, 1994)]에서 찾아볼 수 있다.

본원의 발명자들은, tal 유전자의 과발현 후, 코리네형 박테리아가 아미노산을 개선된 양상으로 생산한다는 것을 발견하였다.

과발현을 달성하기 위하여, 상응하는 유전자의 복사체 수를 증가시키거나, 또는 구조 유전자 상류에 위치하는 프로모터 및 조절 영역 또는 리보좀 결합 부위를 돌연변이시킬 수 있다. 구조 유전자의 상류에 삽입된 발현 카세트는 동일한 방식으로 작용한다. 또한, 유도성 프로모터를 사용하여, L-아미노산의 발효적 생산 과정 동안 발현을 증강시킬 수 있다. 또한, 발현은 m-RNA의 수명을 연장시키기 위한 수단에 의해 유사하게 향상될 수 있다. 또한, 효소 단백질의 분해를 방지함으로써 효소 활성을 증강시킬 수 있다. 유전자(들) 작제물은 상이한 복사체 수의 플라스미드내에 존재하거나, 또는 염색체내에 삽입되어 증폭될 수 있다. 또는, 목적 유전자의 과발현은 배지의 조성 및 배양 과정을 변화시킴으로써 성취될 수 있다.

당업자는 이와 관련된 지침을 특히 문헌[참조: Martin et al., Bio/Technology 5, 137-146 (1987); Guerrero et al., Gene 138, 35-41 (1994); Tsuchiya and Morinaga, Bio/Technology 6, 428-430 (1988); Eikmanns et al., Gene 102, 93-98 (1991); 유럽 특허 명세서 EPS 0 472 869; 미국 특허 제4,601,893호; Schwarzer and Puhler, Bio/Technology 9, 84-87 (1991); Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994); LaBarre et al., Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993); 국제특허출원 WO 96/15246; Malumbres et al., Gene 134, 15-24 (1993); 일본 특허 공개공보 JP-A-10-229891;Jensen and Hammer, Biotechnology and Bioengineering 58, 191-195 (1998); 및 Makrides, Microbiological Reviews 60: 512-538 (1996)], 및 유전학 및 분자생물학의 공지된 교과서에서 찾아볼 수 있다.

예로써, 본 발명에 따른 tal 유전자는 플라스미드에 의해 과발현된다.

적합한 플라스미드는 코리네형 박테리아에서 복제되는 것들이다. 다수의 공지된 플라스미드 벡터, 예를 들면, pZ1[참조: Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554], pEKEx1[참조: Eikmanns et al., Gene 102: 93-98 (1991)] 또는 pHS2-1[참조: Sonnen et al., Gene 107: 69-74 (1991)]은 잠재(cryptic) 플라스미드 pHM1519, pBL1 또는 pGA1을 기본으로 한다. 다른 플라스미드 벡터, 예를 들면, pCG4[참조: US-A-4,489,160], pNG2[참조: Serwold-Davis et al., FEMS Microbiology Letters 66, 119-124 (1990)] 또는 pAG1[참조: US-A-5,158,891]을 기본으로 하는 플라스미드를 동일한 방식으로 사용할 수 있다.

hom-thrB 오페론을 복제 또는 증폭시키기 위해, 예를 들어 문헌[참조: Reinscheid et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)]에 기술된 바와 같이, 염색체내로 삽입시켜 유전자를 증폭시키는데 도움을 줄 수 있는 플라스미드가 또한 적합하다. 이러한 방법하에서는, 숙주(전형적으로 이. 콜라이)에서는 복제될 수 있으나, 코리네박테리움 글루타미쿰에서는 복제될 수 없는 플라스미드 벡터내에 완전한 유전자를 클로닝한다. 가능한 벡터의 예로는, pSUP301[참조: Simon et al., Bio/Technology 1, 784-791 (1983)], pK18mob 또는pK19mob[참조: Schafer et al., Gene 145, 69-73 (1994)], pGEM-T[공급원: Promega corporation, Madison, WI, USA] , pCR2.1-TOPO[참조: Shuman (1994), Journal of Biological Chemistry 269: 32678-84; US-A 5,487,993], pCR^RBlunt(Invitrogen, Groningen, Holland; Bernard et al., Journal of Molecular Biology, 234: 534-541 (1993)], pEM1[참조: Schrumpf et al., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516] 또는 pBGS8[참조: Spratt et al., 1986, Gene 41: 337-342]이 있다. 이 후, 증폭시키고자 하는 유전자를 포함하는 플라스미드 벡터를 접합 또는 형질전환를 통해 목적하는 코리네박테리움 글루타미쿰 균주로 전달한다. 접합법은, 예를 들면, 문헌[참조: Schafer et al., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)]에 기술되어 있다. 형질전환법은, 예를 들면, 문헌[참조: Thierbach et al., Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988); Dunican and Shivnan, Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989); 및 Tauch et al., FEMS Microbiological Letters 123, 343-347 (1994)]에 기술되어 있다. "교차" 현상에 의한 상동 재조합 후, 생성된 균주는 당해 유전자의 2개 이상의 복사체를 함유한다.

삽입에 의한 증폭 방법을 수행하는데 이용될 수 있는 플라스미드 벡터의 예는 도 1에 제시된 pSUZ1이다. 플라스미드 pSUZ1은, 문헌[참조: Spratt et al., Gene 41: 337-342 (1986)]에 기술되어 있는, tal 유전자가 삽입된 이. 콜라이 벡터 pBGS8로 이루어진다.

또한, 아미노산의 생산에 있어서, tal 유전자는 물론, 특정 생합성 경로, 해당과정, 보충대사, 펜토즈 포스페이트 경로 또는 아미노산 이송에 관련된 하나 이상의 효소를 증폭 또는 과발현시키는 것이 유리할 수 있다.

따라서, 예를 들면, L-아미노산, 특히 L-리신의 생산을 위해, 하기 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 바람직하게는 과발현시킬 수 있다:

· 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자(EP-B 0 197 335),

· 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자[참조: Kalinowski et al., (1990), Molecular and General Genetics 224: 317-324],

· 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자[참조: Eikmanns (1992), Journal of Bacteriology 174: 6076-6086],

· 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자(DE-A-198 31 609),

· 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자[참조: Molenaar et al., European Journal of Biochemistry 254, 395-403 (1998)],

· 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자(유럽 분자생물학 연구소(EMBL, Heidelberg, Germany)의 데이터뱅크의 수탁번호 제AB023377호),

· 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자(JP-A-9-224662),

· 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자(JP-A-9-224661),

· 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자(DE-A-195 48 222),

· zwa1 유전자(DE 199 59 328.0; DSM 13115),

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자(DE: 19947791.4),

· devB 유전자, 및

· opcA 유전자(DSM 13264).

따라서, 예를 들면, L-트레오닌의 생산을 위해, 하기 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를 동시에 증폭, 바람직하게는 과발현시킬 수 있다:

· 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자[참조: Peoples et al., Molecular Microbiology 2, 63-72 (1988)] 또는 "피드백 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자[참조: Archer et al., Gene 107, 53-59 (1991)],

· 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자(유럽 분자생물학 연구소(EMBL,Heidelberg, Germany)의 데이터뱅크의 수탁번호 제AB023377호),

· 트레오닌 이송을 암호화하는 thrE 유전자(DE 199 41 478.5; DSM 12840),

· zwa1 유전자(DE 199 59 328.0; DSM 13115),

· 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자(DE: 19947791.4),

· devB 유전자, 및

· opcA 유전자(DSM 13264).

또한, 아미노산의 생산을 위하여, tal 유전자를 증폭시키는 것 이외에, 하기 유전자를 동시에 감쇠시키는 것이 유리할 수 있다:

· 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자(DE 199 50 409.1, DSM13047), 및/또는

· 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자(US 09/396,478; DSM12969), 또는

· 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자(DE 199 51 975.7; DSM 13114], 또는

· zwa2 유전자(DE: 199 59 327.2; DSM 13113).

또한, 아미노산의 생산에 있어서, tal 유전자를 과발현시키는 것외에, 바람직하지 않은 부반응을 제거하는 것이 유리할 수 있다[참조: Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms", Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982].

본 발명에 따라 제조된 미생물을 회분 공정(회분 배양), 또는 유가 배양(유가 공정)나 반복적 유가 공정(반복 공급 공정)에서 연속적 또는 불연속적으로 배양하여 L-아미노산을 생산할 수 있다. 공지된 배양 방법은 교과서[참조: Chmiel, Bioprozeβtechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik {Bioprocess Technology 1. Instruction to Bioprocess Technology (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)}; Storhas, Bioreaktoren und periphere Einrichtungen {Bioreactors and Peripheral Equipment (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)}]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적합한 방식으로 특정 균주의 요구를 충족시켜야 한다. 각종 미생물에 대한 배양 배지에 관한 내용은 논문집[참조: "Manual of Methods for General Bacteriology" The American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에 포함되어 있다. 당류와 탄수화물(예: 글루코즈, 슈크로즈, 락토즈, 프럭토즈, 말토즈, 당밀, 전분 및 셀룰로즈), 유지(예: 대두유, 해바라기유, 땅콩유 및 코코낫유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올(예: 글리세롤 및 에탄올), 및 유기산(예: 아세트산)이 탄소원으로서 사용될 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다.질소를 함유하는 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침적액, 대두분 및 요소), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)이 질소원으로서 사용될 수 있다. 질소원은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인산, 이수소인산칼륨, 수소인산이칼륨, 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 인 공급원으로서 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속 염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유해야 한다. 최종적으로, 필수 성장 물질, 예를 들면, 아미노산 및 비타민이 위에서 언급된 물질에 추가하여 사용될 수 있다. 게다가, 적합한 전구체가 배양 배지에 가해질 수 있다. 상기 출발 물질은 상기 배지에 단일 배치 형태로 가해지거나, 또는 배양 중에 적당한 방식으로 공급될 수 있다.

배지의 pH를 조절하기 위하여, 염기성 화합물, 예를 들면, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 또는 암모니아수, 또는 산 화합물, 예를 들면 인산 또는 황산을 적합한 방식으로 사용할 수 있다. 소포제, 예를 들면, 지방산 폴리글리콜 에스테르를 사용하여 발포 형성을 조절할 수 있다. 플라스미드의 안정성을 유지하기 위하여, 선택적으로 작용하는 적합한 물질, 예를 들면, 항생제를 배지에 가할 수 있다. 호기성 조건을 유지하기 위하여, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물(예: 공기)를 배지에 가할 수 있다. 배지의 온도는 통상 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. L-아미노산의 최대 수율이 수득될 때까지, 배양을 계속한다. 이러한 목표는 통상적으로 10시간 내지 160시간내에 달성될 수 있다.

L-아미노산의 분석을, 음이온 교환 크로마토그래피 처리 후, 닌하이드린 유도화를 통해 수행한다[참조: Spackman et al., Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190].

하기 미생물은 부다페스트 조약에 따라 독일 브라운쉬바이크에 소재하는 국제기탁기관[Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) = German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]에 기탁되었다:

ㆍ 에스케리키아 콜라이 JM109/pSUZ1(수탁번호: DSM 13263).

서열 1은 또한 신규한 devB 유전자도 함유한다. 본 발명에 따르는 방법을 사용하여, 아미노산을 발효적으로 생산한다.

도면은 첨부한다.

도 1은 플라스미드 pSUZ1의 지도이다.

사용된 약어 및 명칭은 다음과 같은 의미를 갖는다:

lacZ : lacZα 유전자 단편의 절편

kan r: 카나마이신 내성

tal: 트랜스알돌라제 유전자

ori: 플라스미드 pBGS8의 복제 기점

BclI: 제한 효소 BclI의 절단 부위

EcoRI : 제한 효소 EcoRI의 절단 부위

HinIII: 제한 효소 HinIII의 절단 부위

PstI: 제한 효소 PstI의 절단 부위

SacI: 제한 효소 SacI의 절단 부위

하기 실시예는 본 발명을 추가로 설명할 것이다. 사용된 분자생물학 기술, 예를 들면, 플라스미드 DNA 분리, 제한 효소 처리, 연결, 에스케리키아 콜라이의 표준 형질전환, 등은(달리 명시하지 않는 한) 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbor Laboratories, USA]에 기술되어 있다.

실시예 1

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터의 게놈성 코스미드 유전자 라이브러리의 제조

코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 염색체 DNA를 문헌[참조: Tauch et al., 1995, Plasmid 33: 168-179]에 기술된 바와 같이 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Code no. 27-0913-02)으로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 소하(shrimp) 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Code no. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 코스미드 벡터 SuperCos1(구입원: Stratagene, La Jolla, USA, Product Description SuperCos1 Cosmid Vector Kit, Code no. 251301)[참조: Wahl et al. (1987) Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84, 2160-2164]의 DNA를 제한 효소XbaI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description XbaI, Code no. 27-0948-02)로 절단하고, 마찬가지로 소하 알칼리 포스파타제로 탈포스포릴화시킨다. 이어서, 코스미드 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Code no. 27-0868-04)로 절단한다. 이러한 방식으로 처리된 코스미드 DNA를 처리된 ATCC 13032 DNA와 혼합하고, 당해 배치를 T4 DNA 리가제(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description T4 DNA ligase, Code no. 27-0870-04)로 처리한다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 Gigapack II XL 패킹 추출물(Stratagene, La Jolla, USA, Product Description Gigapack II XL Packing Extract, Code no. 200217)을 사용하여 파아지내에 충전시킨다. 이. 콜라이 균주 NM554[참조: Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research 16: 1563-1575]를 감염시키기 위해, 세포를 10mM MgSO₄에 침지시키고, 파아지 현탁액의 분액과 혼합한다. 세포를 100㎍/ℓ의 앰피실린을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190] 상에 플레이팅하여, 코스미드 라이브러리의 감염 및 역가측정을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행한다. 밤새 37℃에서 배양한 후, 각각의 재조합체 클론을 선별한다.

실시예 2

tal 유전자의 분리 및 서열분석

각 콜로니의 코스미드 DNA를 제조업자의 지침에 따라 Qiaprep Spin Miniprep Kit(Product No. 27106, Qiagen, Hilden, Germany) 사용하여 분리하고, 제한 효소 Sau3AI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description Sau3AI, Product No. 27-0913-02)로 부분적으로 절단한다. DNA 단편을 소하 알칼리 포스파타제(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany, Product Description SAP, Product No. 1758250)로 탈포스포릴화시킨다. 겔 전기영동으로 분리한 후, 크기가 1500 내지 2000bp 범위내인 코스미드 단편을 QiaExII Gel 추출 키트(Product No. 20021, Qiagen, Hilden, Germany)로 분리한다. 서열분석용 벡터 pZero-1(공급원: Invitrogen, Groningen, Holland, Product Description Zero Background Cloning Kit, Product No. K2500-01)의 DNA를 제한 효소 BamHI(Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany, Product Description BamHI, Product No. 27-0868-04)으로 절단한다. 서열분석용 벡터 pZero-1내로의 코스미드 단편의 연결을 문헌[참조: Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor]에 기술된 바와 같이 수행하는데, 이 경우 DNA 혼합물을 T4 리가제(Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany)와 함께 밤새 배양한다. 이어서, 당해 연결 혼합물을 전기천공[참조: Tauch et al. 1994, FEMS Microbiol Letters 123: 343-7]에 의해 이. 콜라이 균주 DH5αMCR[참조: Grant, 1990, Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A., 87: 4645-4649]내에 도입하고, 50㎍/ml의 제오신을 함유하는 LB 아가[참조: Lennox, 1955, Virology, 1: 190) 상에 플레이팅한다. 재조합체 클론의 플라스미드 제조는Biorobot 9600(Product No. 900200, Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 수행한다. 서열 분석은 문헌[참조: Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academies of Sciences U.S.A., 74: 5463-5467]의 디데옥시 쇄 종결법을 문헌[참조: Zimmermann et al., 1990, Nucleic Acids Research 18: 1067]에 기술된 바와 같이 변형시켜 수행한다. "RR dRhodamin 터미네이터 사이클 서열분석 키트"(구입원: PE Applied Biosystems; Product No. 403044, Weiterstadt, Germany)를 사용한다. 겔 전기영동에 의한 분리 및 서열형성 반응의 분석을, "ABI Prism 377" 서열분석기(구입원: PE Applied Biosystems, Weiterstadt, Germany)를 사용하여 Rotiphoresis NF 아크릴아미드/비스아크릴아미드 겔(29:1)(Product No. A124.1, Roth, Karlsruhe, Germany)에서 수행한다.

이어서, 수득된 미처리 서열 데이터를 스타덴(Staden) 프로그램 패키지[참조: 1986, Nucleic Acids Research, 14: 217-231] 버젼 97-0을 사용하여 처리한다. pZero-1 유도체의 각각의 서열을 연속 콘티그(contig)로 어셈블링한다. 컴퓨터-지원된 암호화 영역 분석을 XNIP 프로그램[참조: Staden, 1986, Nucleic Acids Research. 14: 217-231]을 사용하여 수행한다. 추가 분석을, "국립 생명공학 정보 센터"(NCBI, Bethesda, MD, USA)]의 비-중복성 데이터뱅크에 대해 "BLAST 서치 프로그램"[참조: Altschul et al., 1997, Nucleic Acids Research. 25: 3389-3402]을 사용하여 수행한다.

수득된 뉴클레오티드 서열은 서열 1 및 서열 3에 제시되어 있다.

실시예 3

tal 유전자의 클로닝

PCR을 사용하여, 코리네박테리움 글루타미쿰 13032의 완전한 tal 유전자를 함유하고 상부 및 하부 영역을 플랭킹시키는 DNA 단편을 증폭시킨다. PCR 반응은 실시예 1 및 2에서 결정된 바와 같은 서열로부터 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 수행한다. 게놈성 DNA를 문헌[참조: Heery and Dunican, Applied and Environmental Microbiology 59: 791-799 (1993)]에 따라 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032로부터 분리하여, 주형으로서 사용한다. 사용된 tal 프라이머는 다음과 같다:

정방향 프라이머: 5' GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3'C

역방향 프라이머: 5' GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3'

PCR 파라미터는 다음과 같다:

35사이클

3분 동안 94℃,

1분 동안 94℃,

1분 동안 47℃,

45초 동안 72℃,

2mM MgCl₂,

약 150 내지 200ng DNA 주형.

수득된 PCR 산물을 숙주로서 이. 콜라이 JM109 균주[참조: Yanisch-Perron et al., Gene, 33: 103-119 (1985)]를 사용하여, 시판되는 pGEM-T 벡터(판매원: Promega Corp.; pGEM-T Easy Vector System 1, cat. no. A1360, Promega UK, Southampton, UK)내에 클로닝한다. 후속적으로, 완전한 tal 유전자를 EcoRI 단편 상에서 pGEM T-벡터로부터 분리하고, EcoRI 벡터 pBGS8[참조: Spratt et al., Gene 41(2-3): 337-342 (1986)]의 lacZα EcoRI 부위내로 클로닝한다. 사용된 제한 효소는 베링거 만하임 유케이 리미티드(Boehringer Mannheim UK Ltd., Bell Lane, Lewes, East Sussex BN7 1LG, UK)로부터 구입하고, 제조업자의 지침에 따라 사용한다. 이어서, 이. 콜라이 JM109를 상기 연결 혼합물로 형질전환시키고, 전기형질전환체를 이소프로필-티오갈락토피라노사이드(IPTG), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-갈라토피라노사이드(XGAL) 및 카나마이신이 각각 1mM, 0.02% 및 50mg/ℓ의 농도로 보충된 루리아(Luria) 아가 상에서 선별한다. 플레이트를 37℃에서 12시간 동안 배양한다. 플라스미드 DNA를 하나의 형질전환체로부터 분리하고, Eco RI을 사용하는 제한 효소 분석에 의해 특성을 결정한다. 이들 신규한 작제물을 pSUZ1으로 명명한다.

실시예 4

균주 코리네박테리움 글루타미쿰 DSM5715::pSUZ1의 제조

균주 DSM 5715를, 문헌[참조: Liebl et al., FEMS Microbiology Letters, 53: 299-303 (1989)]에 기술된 전기천공 방법을 사용하여 플라스미드 pSUZ1로 형질전환시킨다. 당해 형질전환체를, 25mg/ℓ의 카나마이신이 보충된, 18.5g/ℓ의 뇌-심장 주입 브로쓰, 0.5M 소르비톨, 5g/ℓ의 박토-트립톤, 2.5g/ℓ의 박토-효모 추출물, 5g/ℓ의 NaCl 및 18g/ℓ의 박토-아가를 포함하는 LBHIS 아가 상에서 선별한다. 이를 2일 동안 33℃에서 배양한다.

벡터 pSUZ1은 균주 DSM 5715내에서 복제될 수 없기 때문에, pSUZ1의 삽입에 의해 제공된 카나마이신 내성을 나타내는 클론만이 성장할 수 있다.

생성된 삽입체는 DSM5715::pSUZ1로 명명한다.

실시예 5

리신의 제조

실시예 4에서 수득된 코리네박테리움 글루타미쿰 균주 DSM5715/pSUZ1을 L-리신 생산에 적합한 영양 배지에서 배양한 다음, 배양 상층액 중의 L-리신 함량을 측정한다.

이를 위하여, 당해 균주를 일차적으로 상응하는 항생제(카나마이신(25mg/ℓ)을 함유하는 뇌-심장 아가)와 함께 아가 플레이트 상에서 33℃에서 24시간 동안 배양한다. 이러한 아가 플레이트 배양물로부터 출발하여, 예비배양물을 시딩한다(100ml 원추형 플라스크당 10ml 배지). 완전 배지 CgIII을 예비배양용 배지로서 사용한다.

Cg III 배지:

NaCl 2.5g/ℓ

박토-펩톤 10g/ℓ

박토-효모 추출물 10g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙시킴) 2%(w/v)

pH는 7.4로 조정한다.

카나마이신(25mg/ℓ)을 이에 가한다. 예비배양물을 진탕기 상에서 240rpm으로 33℃에서 16시간 동안 배양한다. 본 배양물의 초기 OD(660nm)가 0.1이 되도록 상기 예비배양물로부터 본 배양물을 시딩한다. MM 배지를 본 배양에 사용한다.

MM 배지:

CSL(옥수수 침지액) 5g/ℓ

MOPS(모르폴리노프로판설폰산) 20g/ℓ

글루코즈(별도로 오토클레이빙시킴) 50g/ℓ

(NH₄)₂SO₄25g/ℓ

KH₂PO₄0.1g/ℓ

MgSO₄* 7H₂O 1.0g/ℓ

CaCl₂* 2H₂O 10mg/ℓ

FeSO₄* 7H₂O 10mg/ℓ

MnSO₄* H₂O 5.0mg/ℓ

비오틴(멸균 여과) 0.3mg/ℓ

티아민 * HCl(멸균 여과) 0.2mg/ℓ

L-로이신(멸균 여과) 0.1g/ℓ

CaCO₃25g/ℓ

암모니아수를 사용하여 CSL, MOPS 및 염 용액의 pH를 7로 조정한 다음, 오토클레이빙시킨다. 이어서, 멸균 기질과 비타민 용액, 및 무수-상태로 오토클레이빙시킨 CaCO₃를 가한다.

배플이 장착된 100ml 원추형 플라스크당 10ml 용적에서 배양을 수행한다. 카나마이신(25mg/ℓ)을 가한다. 33℃ 및 80% 대기 습도하에 배양을 수행한다.

24시간 및 48시간 후, Biomek 1000(Beckmann Instruments GmbH, Munich)을 사용하여, 측정 파장 660nm에서 OD를 측정한다. 생성된 리신의 양을, 아미노산 분석기(제조원: Eppendorf-BioTronik, Hamburg, Germany)를 사용하여, 이온 교환 크로마토그래피 및 닌하이드린 검출을 이용한 포스트-컬럼 유도화에 의해 측정한다.

시험 결과는 표 1에 제시되어 있다.

균주	시간(hr)	리신-HCl(g/ℓ)
DSM5715	24	8.1
DSM5715::pSUZ1	24	8.6
DSM5715	48	14.7
DSM5715::pSUZ1	48	15.4

원본(제출용)

0-10-1-1	PCT/RO/134 서식(EASY)미생물 또는 기타 생물학적 재료에 관한 사항(PCT 규칙 13 bis)작성 버젼	PCT-EASY 버젼 2.90(2000년 3월 8일 갱신)
0-2	국제출원번호
0-3	출원인 또는 대리인의 참조번호	990228 BT

11-11-2	아래에 기재된 사항은 당해 면 및행에서 언급된 기탁된 미생물 또는기타 생물학적 재료에 관한것이다:면행	216
1-31-3-11-3-21-3-31-3-4	기탁의 표시기탁기관의 명칭기탁기관의 주소기탁일수탁번호	도이체 삼풍 폰 미크로오르가니즈멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ)독일 데-38124 브라운 슈바이그 마쉐로더 벡 1베2000년 1월 26일(2000. 1. 26.)DSMZ 13263
1-4	추가 사항	없음
1-5	기재 사항이 적용되는 지정국	모든 지정국
1-6	별도로 제공되는 사항이들 사항은 후에 국제사무국에 제출될 것이다.	없음
수탁기관용
0-4	본 서식은 국제출원과 함께 접수되었다:(예 또는 아니오)	예
0-4-1	확인관	판 암스텔 체
국제사무국용
0-5	본 서식은 국제사무국에 의해 접수되었다:	2000년 9월 18일
0-5-1	확인관

Claims

a) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드와 70% 이상 동일한 폴리뉴클레오티드,

b) 서열 2 또는 서열 4의 아미노산 서열과 70% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드,

c) a) 또는 b)의 폴리뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드, 및

d) a), b) 또는 c)의 폴리뉴클레오티드 서열 중 15개 이상의 연속 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 코리네형 박테리아로부터 분리된 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, 코리네형 박테리아에서 복제가능한 바람직한 재조합 DNA이고, 유전자 tkt, zwf, opcA 및 devB를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제1항에 있어서, RNA인 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서, 서열 2 및 서열 4에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
제2항에 있어서,

(i) 서열 3에 제시된 뉴클레오티드 서열,

(ii) 유전자 암호의 축퇴성 범위내에서 서열 (i)에 상응하는 하나 이상의 서열, 또는

(iii) 서열 (i) 또는 (ii)에 상보적인 서열과 하이브리드를 형성하는 하나 이상의 서열, 및 임의로,

(iv) 서열 (i)에서 기능상 중성의 센스 돌연변이체를 포함하는, 복제가능한 DNA인 폴리뉴클레오티드.
제1항에 따른 폴리뉴클레오티드를 보유하는 벡터를 함유하는, 숙주 세포로서 작용하는 코리네형 박테리아.
a) 하나 이상의 tal 유전자 및 임의로 하나 이상의 유전자 tkt, zwt, opcA 또는 devB가 동시에 증폭된, 목적하는 L-아미노산 생산-박테리아를 발효시키는 단계,

b) 배지 또는 박테리아 세포내에서 목적하는 산물을 농축시키는 단계, 및

c) 목적하는 L-아미노산을 분리하는 단계를 수행함을 특징으로 하여, L-아미노산을 생산하는 방법.
제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생합성 경로 중의 다른 유전자가 추가로 증폭된 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 목적하는 L-아미노산의 생성을 감소시키는 대사 경로가 일부 내지 전부 제거된 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제8항 내지 제10항 중의 어느 한 항에 있어서, L-리신, L-트레오닌, L-이소로이신 및 L-트립토판으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산을 생산하는 코리네형 박테리아를 사용함을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서,

12.1 디하이드로디피콜리네이트 신타제를 암호화하는 dapA 유전자,

12.2 피드백 내성 아스파르테이트 키나제를 암호화하는 lysC 유전자,

12.3 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

12.4 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

12.5 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

12.6 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

12.7 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자,

12.8 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

12.9 리신 이송을 암호화하는 lysE 유전자,

12.10 zwa1 유전자,

12.11 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자, 및

12.12 opcA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를, 특히 L-아미노산을 이미 생산하는 코리네형 미생물내에서 동시에 증폭시키거나 과발현시킴을 특징으로 하여, L-아미노산, 특히 리신을 발효적으로 생산하는 방법.
제8항에 있어서,

13.1 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom 유전자 또는 "피드백 내성" 호모세린 데하이드로게나제를 암호화하는 hom^dr대립유전자,

13.2 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gap 유전자,

13.3 피루베이트 카복실라제를 암호화하는 pyc 유전자,

13.4 말레이트:퀴논 옥시도리덕타제를 암호화하는 mqo 유전자,

13.5 트랜스케톨라제를 암호화하는 tkt 유전자,

13.6 6-포스포글루코네이트 데하이드로게나제를 암호화하는 gnd 유전자,

13.7 글루코즈 6-포스페이트 데하이드로게나제를 암호화하는 zwf 유전자,

13.8 트레오닌 이송을 암호화하는 thrE 유전자,

13.9 zwa1 유전자,

13.10 에놀라제를 암호화하는 eno 유전자, 및

13.11 opcA 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자를, 특히 L-트레오닌을 이미 생산하는 코리네형 미생물내에서 동시에 증폭, 특히 과발현시킴을 특징으로 하여, L-트레오닌을 발효적으로 생산하는 방법.
제10항에 있어서,

14.1 포스포에놀 피루베이트 카복시키나제를 암호화하는 pck 유전자,

14.2 글루코즈 6-포스페이트 이소머라제를 암호화하는 pgi 유전자,

14.3 피루베이트 옥시다제를 암호화하는 poxB 유전자, 및

14.4 zwa2 유전자로 이루어진 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 유전자가 동시에 감쇠된 박테리아를 발효시킴으로 특징으로 하여, L-아미노산, 특히 L-리신, L-트레오닌, L-이로소이신 또는 L-트립토판을 생산하는 방법.
tal 유전자 산물을 암호화하는 cDNA를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서의 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 용도.
tal 유전자의 서열과 고도로 유사한 cDNA 또는 유전자를 분리하기 위한 하이브리드화 프로브로서의 제1항에 따른 폴리뉴클레오티드 서열의 용도.