PL202843B1 - Polinukleotyd z bakterii Corynebacterium kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy, polipeptyd, rekombinowany wektor, bakteria i rekombinowana bakteria Corynebacterium oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów - Google Patents

Polinukleotyd z bakterii Corynebacterium kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy, polipeptyd, rekombinowany wektor, bakteria i rekombinowana bakteria Corynebacterium oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów

Info

Publication number
PL202843B1
PL202843B1 PL346500A PL34650000A PL202843B1 PL 202843 B1 PL202843 B1 PL 202843B1 PL 346500 A PL346500 A PL 346500A PL 34650000 A PL34650000 A PL 34650000A PL 202843 B1 PL202843 B1 PL 202843B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
gene
gene encoding
amino acid
val
Prior art date
Application number
PL346500A
Other languages
English (en)
Other versions
PL346500A1 (en
Inventor
L.K. Dunican
Ashling Mccormack
Cliona Stapelton
Kevin Burke
Bettina Möckel
Original Assignee
Degussa
Nat Univ Ireland
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26840528&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL202843(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Degussa, Nat Univ Ireland filed Critical Degussa
Publication of PL346500A1 publication Critical patent/PL346500A1/xx
Publication of PL202843B1 publication Critical patent/PL202843B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1022—Transferases (2.) transferring aldehyde or ketonic groups (2.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/06—Alanine; Leucine; Isoleucine; Serine; Homoserine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C12P13/227—Tryptophan
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest polinukleotyd z bakterii Corynebacterium kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy, polipeptyd, rekombinowany wektor, bakteria i rekombinowana bakteria Corynebacterium oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie, w przemyśle farmaceutycznym oraz w żywieniu zwierząt.
Wiadomo, że można wytwarzać aminokwasy przez fermentacyjne hodowle szczepów bakterii z rodzaju Corynebacterium, zwłaszcza Corynebacterium glutamicum. Z powodu dużego ich znaczenia, opracowuje się wciąż ulepszenia tych sposobów wytwarzania. Ulepszania mogą dotyczyć np. zużycia i zapotrzebowania na tlen, albo składu pożywek hodowlanych, jak np. stężenia cukru podczas fermentacji albo obróbki produktu przez np. chromatografię jonowymienna, albo wewnętrzne właściwości samych drobnoustrojów.
W celu polepszenia właściwości produkcyjnych tych drobnoustrojów, stosuje się sposoby mutagenezy, selekcji i wyboru mutantów. W ten sposób, otrzymuje się szczepy odporne na antymetabolity, jak np. analog lizynowy S-(2-aminoetylo)-cysteiny albo auksotrofy w stosunku do regulacyjnych aminokwasów i wytwarzające L-lizynę.
Od kilku lat, stosuje się również metody rekombinacji DNA, w celu polepszenia szczepów Corynebacterium wytwarzających aminokwasy, w których amplifikuje się pojedyncze geny kodujące biosyntezę aminokwasów oraz bada się ich działanie na wytwarzanie aminokwasów.
Materiał przeglądowy dotyczący tego tematu można znaleźć w Kinoshita („Glutamic Acid Bacteria”: w Biology of Industrial Microorganisms, Demain i Solomon (wyd.) Benjamin Cummings, Londyn, UK, 1985: 115-142), Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino Acids 6: 261-272 (1994)), Jetten i Sinskey (Critical Reviews in Biotechnology, 15, 73-103 (1995)), Sahm i in., (Annuals of the New York Academy of Science 782: 25-39 (1996).
Istotność cyklu pentozofosforanów dla biosyntezy wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny przez bakterie Corynebacterium jest przedmiotem licznych badań.
Tak więc, Oishi i Aida (Agricultural and Biological Chemistry 29: 83-89 (1965)) donoszą o „przecieku monoofosforanu heksozy” w Brevibacterium ammoniagenes. Sugimoto i Shio (Agricultural and Biological Chemistry 51: 101-108 (1987)) donoszą o regulacji dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu w Brevibacterium flavum.
Twórcy postawili sobie za cel opracowanie nowych środków, do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów, w szczególności L-lizyny, L-treoniny, L-zoleucyny i L-tryptofanu.
Aminokwasy, zwłaszcza L-lizyna, znajdują zastosowanie w medycynie, przemyśle farmaceutycznym, a zwłaszcza w żywieniu zwierząt. Stąd powszechne jest zainteresowanie nowymi ulepszonymi sposobami wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny.
W znaczeniu tu zastosowanym, okreś lenie L-lizyna albo lizyna obejmuje zasady, jak również ich sole, np. monochlorowodorek lizyny albo siarczan lizyny.
Wynalazek dotyczy polinukleotydu z bakterii Corynebacterium, kodującego aktywność enzymatyczną transaldolazy wybranego z grupy składającej się z:
(a) polinukleotydu kodującego polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną na Id. Sekw. nr 2;
(b) polinukleotydu komplementarnego z polinukleotydem z (a).
Korzystny polinukleotyd koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną na Id. Sekw. nr 2.
Korzystny polinukleotyd obejmuje sekwencję nukleotydową przedstawioną na Id. Sekw. nr 3.
Korzystny polinukleotyd jest RNA.
Korzystny polinukleotyd koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na Id. Sekw. nr 2.
Korzystny polinukleotyd jest wybrany z:
(a) sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 3, (b) sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1, (c) fragmentu sekwencji przedstawionej na Id. Sekw. nr 1, (d) sekwencji nukleotydowej, która odpowiada sekwencji z (a) do (c) z uwzględnieniem degeneracji kodu genetycznego i (e) sekwencji nukleotydowej z funkcjonalnie neutralną mutacją sensowną z (a) do (c).
PL 202 843 B1
Korzystnie bakterią Corynebacterium jest Corynebacterium glutamicum.
Korzystny polinukleotyd kodujący polipeptyd o aktywności transaldolazy znajduje się na plazmidzie pSUZl, który został zdeponowany w szczepie DSM 5715, pod numerem DSM 13263.
Wynalazek dotyczy również polipeptydu o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 2, który ma aktywność enzymatyczną transaldolazy.
W korzystnym wykonaniu polipeptyd ma sekwencję aminokwasową przedstawioną na Id. Sekw. nr 2 zawierającą zamianę konserwatywnego aminokwasu wybraną z grupy składającej się z zamiany glicyny na alaninę lub zamiany kwasu asparaginowego na kwas glutaminowy.
Rekombinowany wektor obejmujący wyizolowany polinukleotyd według wynalazku jest również objęty zakresem wynalazku. Korzystny rekombinowany wektor jest wektorem pSUZ1 zdeponowanym w szczepie 5715 pod numerem DSM 13263.
W zakres wynalazku wchodzi również bakteria Corynebacterium stransformowana wektorem według wynalazku.
Wynalazek dotyczy również rekombinowanej bakterii Corynebacterium o zwiększonej wewnątrzkomórkowej aktywności transaldolazy, w której zwiększona wewnątrzkomórkowa aktywność jest wynikiem nadmiernego wyrażania polinukleotydu według wynalazku.
Ponadto wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania L-aminokwasów, który obejmuje następujące etapy:
a) hodowlę fermentacyjną bakterii według wynalazku w pożywce w celu wytworzenia L-aminokwasów,
b) akumulację L-aminokwasów w pożywce lub w komórkach bakterii,
c) izolację L-aminokwasów.
W korzystnym sposobie L-aminokwas jest wybrany z grupy skł adają cej się z L-lizyny, L-treoniny, L-izoleucyny albo L-tryptofanu.
W równie korzystnym sposobie według wynalazku L-aminokwasem jest L-lizyna i jest w tym samym czasie nadmiernie wyrażany jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:
a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinainową,
b) genu lysC kodującego kinazę asparaginianową niewrażliwą na sprzężenie zwrotne,
c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,
d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową.
e) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłaczanowo-chinonową,
f) genu tkt kodującego transketolazę,
g) genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu,
h) genu zwf kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,
i) genu lysE kodującego białko odpowiedzialne za eksport lizyny,
j) genu eno kodującego enolazę.
W innym korzystnym sposobie L-aminokwasem jest L-treonina i jest w tym samym czasie nadmiernie wyrażany jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:
a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową z allelu homdr, który koduje dehydrogenazę homoserynową niewrażliwą na sprzężenie zwrotne,
b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,
c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,
d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłaczanowo-chinonową,
e) genu tkt kodującego transketolazę,
f) genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu,
g) genu zwf kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu, i) genu thrE kodującego białko odpowiedzialne za eksport treoniny, j) genu eno kodującego enolazę.
W równie korzystnym sposobie jest w tym samym czasie atenuowany jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej sie z:
a) genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianową.
b) genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową,
c) genu poxB kodującego oksydazę pirogronianową.
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku można zastosować jako sondy hybrydyzacyjne dla RNA, cDNA i DNA, w celu izolowania cDNA pełnej długości, kodującego transaldolazę oraz takich cDNA albo genów, które wykazują duże podobieństwo sekwencji z genem transaldolazy.
PL 202 843 B1
Sekwencje polinukleotydowe według wynalazku mogą również służyć jako startery do wytwarzania DNA z genów, które kodują transaldolazę, przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR).
Takie oligonukleotydy służące jako sondy albo startery obejmują około 30, korzystnie około 20, szczególnie korzystnie około 15 kolejnych zasad. Nadają się zwłaszcza oligonukleotydy o długości około 40 albo 50 par zasad.
„Wyizolowany” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza wydzielony ze środowiska naturalnego.
Termin „polinukleotydy” dotyczy przede wszystkim polirybonukleotydów i polidoksyrybonukleotydów, przy czym może dotyczyć niemodyfikowanych albo modyfikowanych RNA albo DNA.
„Polipeptydy” w znaczeniu tu zastosowanym oznaczają peptydy albo białka, które zawierają dwa albo więcej aminokwasów, połączonych ze sobą wiązaniem peptydowym.
Określenie „wzmocnienie” w znaczeniu tu zastosowanym oznacza zwiększenie aktywności wewnątrzkomórkowej jednego albo wielu enzymów w drobnoustroju, które są kodowane przez odpowiedni DNA, przy czym zwiększeniu ulega przykładowo liczba kopii genu, względnie stosuje się wzmocniony promotor albo gen, który koduje enzym o zwiększonej aktywności, jak również można łączyć ze sobą powyższe możliwości.
Drobnoustroje, stanowiące przedmiot niniejszego wynalazku, potrafią wytwarzać L-aminokwasy, w szczególnoś ci L-lizynę z glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy albo z glicerolu i etanolu. Dotyczy to w szczególności przedstawicieli bakterii coryneform, zwłaszcza rodzaju Corynebacterium. Z rodzaju Corynebacterium w szczególności należy wymienić gatunek Corynebacterium glutamicum, znany specjalistom z tego, że jest zdolny do wytwarzania L-aminokwasów.
Przydatne szczepy z rodzaju Corynebacterium, zwłaszcza z gatunku Corynebacterium glutamicum są przykładowo znanymi szczepami typu dzikiego:
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium acetoglutamicum ATCC 15806
Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM BP-1539
Corynebacterium melassecola ATCC 17965
Brevibacterium flavum ATCC 14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 i
Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-lizynę, takie jak, przykładowo
Corynebacterium glutamicum FERM-1709
Brevibacterium flavum FERM-1708
Brevibacterium lactofermentum FERM-P-1712
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6463
Corynebacterium glutamicum FERM-P 6464 i
Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Corynebacterium glutamicum DM58-1
Corynebacterium glutamicum DSM12866 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-treoninę, takie jak, przykładowo
Corynebacterium glutamicum ATCC 21649
Brevibacterium flavum BB69
Brevibacterium flavum DSM 5399
Brevibacterium lactofermentum FERM-BP 269
Brevibacterium lactofermentum TBB-10 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-izoleucynę, takie jak, przykładowo
Corynebacterium glutamicum ATCC 14309
Corynebacterium glutamicum ATCC 14310
Corynebacterium glutamicum ATCC 14311
Corynebacterium glutamicum ATCC 15168
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 6871 oraz wytworzone z nich mutanty lub szczepy wytwarzające L-tryptofan,takie jak, przykładowo
Corynebacterium glutamicum ATCC 21850 i
Corynebacterium glutamicum KY9218 (pKW9901).
Wynalazcom udało się wyizolować nowy gen tal z C. glutamicum, kodujący transaldolazę (EC 2.2.1.2).
PL 202 843 B1
W celu wyizolowania genu tal albo innych genów z C. glutamicum, tworzy się bank genów tego drobnoustroju w E. coli. Wytwarzanie banków genów jest powszechnie znane z podręczników i niżej opisanych publikacji. Przykładowo, można wymienić podręcznik Winnacker: Gene und Klone, Eine Eifuhrung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Niemcy, 1990) albo podręcznik Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Znane banki genów obejmują np. E. coli K-12 szczep W3110, wytworzony przy użyciu wektorów λ przez Kohara i in., (Cell 50, 495-508 (1987)).
Bathe i in., (Molecular General Genetics, 252: 255-265, 1996) opisują bank genów C. glutamicum ATCC 13032, który wytworzono przy użyciu wektorów kosmidowych SuperCos I (Wahl i in., 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84: 2160--2164) w E. coli K-12 szczepu NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucleic Acids Research, 16: 1563-1575). Bormann i in. (Molecular Microbiology 6 (3) 317-326) (1992) opisują bank genów C. glutamicum ATCC 13032 wytworzony przy zastosowaniu kosmidów pHC79 (Hohn i Collins, Gene 11: 291-298 (1980)). O'Donohue (The Cloning and Molecular Analysis of Four Common Aromatic Amino Acid Biosynthetic Genes from Corynebacterium glutamicum, praca doktorska, National University of Ireland, Galway, 1997) opisuje klonowanie genów Corynebacterium glutamicum przy użyciu układu ekspresji X Zap opisanego przez Short i in. (Nucleic Acids Research, 16: 7583). Do wytwarzania banku genów C. glutamicum w E. coli, można również zastosować plazmidy, takie jak pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25: 807-818 (1979)), czy pUC9 (Vieira i in., 1982, Gene, 19: 259-268).
Jako gospodarz, szczególnie nadają się szczepy E. coli wykazujące defekt enzymów restrykcyjnych i rekombinacyjnych. Przykładowo będzie to szczep DH5amrc opisany przez Grant i in., (Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 87 (1990) 4645-4649). Dłuższe fragmenty DNA sklonowane przy użyciu kosmidów można klonować do wektorów przydatnych do sekwencjonowania i sekwencjonować sposobem opisanym przez np. Sanger i in. (Proceedings of the National Academy of Sciences. USA 74 (1977) 5463-5467).
Otrzymane sekwencje DNA można badać znanymi algorytmami, względnie programami do analizy sekwencji, jak np. opisane przez Staden (Nucleic Acids Research 14: 217-232 (1986)), programem GCG (Butler, Methods of Biochemical Analysis 39, 74-97 (1998)), algorytmem FASTA, Pearson i Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444-2448 (1988)) albo algorytmem BLAST (Altshul i in., Nature Genetics 6: 119-129 (1994)) oraz porównywać z sekwencjami w dostępnych bazach danych. Dostępne powszechnie bazy danych sekwencji nukleotydowych obejmują przykładowo European Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Niemcy) albo National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, USA).
W opisie wynalazku przedstawione są nowe sekwencje DNA z C. glutamicum, które zawierają odcinki DNA, które kodują gen tal, pokazane na Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 3. Sekwencja aminokwasowa odpowiedniego białka została otrzymana z niniejszej sekwencji DNA przy użyciu opisanych wyżej sposobów. Uzyskaną sekwencję aminokwasową produktu genu tal pokazano na Id. Sekw. nr 2 i Id. Sekw. nr 4.
Biblioteka genów wytworzona w opisany sposób może być dalej badana przez hybrydyzację z sondami nukleotydowymi o znanej sekwencji, jak np. gen zwf (JP-A-09224661). Sklonowany DNA z klonów, które wykazują reakcję pozytywną w hybrydyzacji, sekwencjonuje się i uzyskuje się znaną sekwencję nukleotydową zastosowanej sondy oraz sąsiadujące nowe sekwencje DNA.
Kodujące sekwencje DNA, pochodzące z Id. Sekw. nr 3 na skutek degeneracji kodu genetycznego, stanowią również część wynalazku. W podobny sposób uzyskuje się sekwencje DNA, które hybrydyzują z Id. Sekw. nr 3 albo częściami Id. Sekw. nr 3.
W stanie techniki znane są konserwatywne zastąpienia w białkach aminokwasów, jak np. zamiana glicyny na alaninę albo kwasu asparginowego na kwas glutaminowy, jako tzw. „mutacje sensowne”, które nie powodują zasadniczych zmian aktywności białka, tzn. są neutralne czynnościowo. Dalej wiadomo, że zmiana końca N- i/lub C- białka, nie wpływa zasadniczo na czynność albo stabilność. Literatura dotycząca tego, m. in. Ben-Bassat i in., (Journal of Bacteriology 169: 751-757 (1987)), O'Regan i in., (Gene 77: 237-251 (1989)), Sahin-Toth i in., Protein Sciences 3: 240-247 (1994)), Hochuli i in., (Bio/Technology 6: 1321-1325 (1988)) i znane podręczniki genetyki i biologii molekularnej. Sekwencje aminokwasowe, które w ten sposób odpowiadają Id. Sekw. nr 2 i Id. Sekw. nr 4 stanowią część wynalazku.
W podobny sposób sekwencje DNA które hybrydyzują z Id. Sekw. nr 3 albo częścią Id. Sekw. nr 3 stanowią część wynalazku. Rozwiązania według wynalazku pozwalają otrzymać sekwencję DNA,
PL 202 843 B1 które wytworzono w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) przy zastosowaniu starterów pochodzących z Id Sekw. nr 3. Takie oligonukleotydy mają zwykle długość około 15 par zasad.
Sposoby identyfikacji sekwencji DNA przy użyciu hybrydyzacji można znaleźć przede wszystkim w podręczniku „The DIG System Users Guide for Filter Hybridization” firmy Behringer Mannheim GmbH (Mannheim, Niemcy, 1993) oraz w Liebl i in., (International Journal of Systematic Bacteriology, (1991) 41: 255-260). Sposoby amplifikacji sekwencjii DNA przy pomocy reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) można znaleźć m.in w podręczniku Gait: Oligonucleotide synthesis: a practical approach (IRL Press, Oxford, UK, 1984) oraz w Newton i Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Niemcy, 1994).
Wynalazcy stwierdzili, że bakterie Corynebacterium po nadmiernej ekspresji genu tal wytwarzają L-lizynę w sposób ulepszony.
W celu wywołania nadmiernej ekspresji moż na zwiększyć liczbę kopii genu albo mutować regiony promotorowe i regulatorowe albo miejsca przyłączania rybosomów, które znajdują się powyżej genów strukturalnych. W podobny sposób działają kasety ekspresji, które włącza się powyżej genów strukturalnych.
Przez zastosowanie indukowalnych promotorów możliwe jest dodatkowo zwiększenie ekspresji i wytwarzania L-lizyny w trakcie produkcji. Przez przed ł u ż enie czasu trwania mRNA moż na dodatkowo polepszyć ekspresję. Dalej, przez zapobieżenie rozkładowi białek enzymatycznych można zwiększyć aktywność białek enzymatycznych.
Geny albo konstrukty genetyczne można wyrazić w plazmidach w zwielokrotnionej liczbie albo integrować w chromosomie i powielać. Alternatywnie, można osiągnąć zwiększenie ekspresji konkretnego genu przez zmianę składu pożywki i warunków hodowli.
W tym celu moż na znaleźć wskazówki w Martin i in. (Bio/Technology 5, 137-146 (1987)), w Guerrero i in. (Gene, 138, 35-41 (1994)), Tsuchiya i Morinaga (Bio/Technology 6, 428-430 (1988)), w europejskim opisie patentowym EPS 0 472 869; w opisie patentu USA 4 601 893, Schwarzer i Puhler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991), Reinscheid i in., (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)), LaBarre i in. (Journal of Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), w zgłoszeniu patentowym WO 96/15246, Malumbres i in. (Gene 134, 15-24 (1993)), w japońskiej publikacji patentowej JP-A-10-229891, Jensen i Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58 191-195 (1998)), Makrides (Microbiological Reviews 60:512-538 (1996)) oraz w znanych podręcznikach genetyki i biologii molekularnej.
Przykładowo, gen tal według wynalazku można nadmiernie wyrażać przy użyciu plazmidów.
Jako plazmidy nadają się takie, które replikują w bakteriach z rodzaju Corynebacterium. Wiele znanych plazmidów jak np. pZl (Menkel i in., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554); pEKEx1 (Eikmanns i in., Gene 102: 93-98 (1991) ) albo pHS2-1 (Sonnen i in., Gene 107: 69-74 (1991)) wykorzystuje kryptoplazmidy pHM1519, pBLl albo pGAl.
Inne wektory plazmidowe, jak np. pochodzące z pCG4 (US-A 4 489 160) albo pNG2 (SerwoldDavis i in., FEMS Microbiology Letters 66 119-124 (1990)), albo pAGl (US-A 5 158 891), można również zastosować.
Również nadają się takie wektory plazmidowe, dzięki którym można osiągnąć amplifikację genu przez zintegrowanie z chromosomem, jak to przykładowo opisali Reinscheid i in. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) dla duplikacji, względnie amplifikacji operonu hom-thrB. Tą metodą klonuje się gen pełnej długości do wektora plazmidowego, który może replikować w gospodarzu (zwykle E. coli), ale nie w C. glutamicum.
Jako wektory można zastosować pSUP301 (Simon i in., Bio/Technology 1, 784-791 (1983), pK18mob albo pK19mob (Schafer i in., Gene, 145, 69-73 (1994)), pGEM-T (Promega Corporation, Madison, WI, USA), pCR2.1-T0PO (Shuman (1994) Journal of Biolgical Chemistry 2 69: 32678-84; US-A 5 487 993), pCR®Blunt (Invitrogen, Groningen, Holandia; Bernard i in., Journal of Molecular Biology 234: 534-541 (1993); albo pEMl (Schrumpf i in., 1991, Journal of Bacteriology 173: 4510-4516) lub pBGS8 (Spratt i in., 1986, Gene 41: 337-342).
Wektor plazmidowy zawierający gen do amplifikacji, przenosi się przez koniugację albo transformację do pożądanego szczepu Corynebacterium glutamicum. Metodę koniugacji opisano, przykładowo, Schafer i in., Applied and Environmental Microbiology 60, 756-759 (1994)). Sposoby transformacji opisane są przez Thierbach i in. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1998)), Dunican i Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) i Tauch i in. (FEMS Microbiological Letters
PL 202 843 B1
123, 343-347 (1994)). Po rekombinacji homologicznej, powstały szczep otrzymuje na drodze zjawiska „cross over” przynajmniej dwie kopie odpowiedniego genu.
Przykładem wektora plazmidowego, przy pomocy którego można przeprowadzić proces amplifikacji przez integrację jest pSUZ1, który pokazano na fig. 1. Plazmid pSUZ1 składa się z wektora
E. coli pBGS8, opisanego przez Spratt i in. (Gene 41: 337-342 (1986)), do którego włączono gen tal.
Oprócz tego, do wytwarzania aminokwasów, zwłaszcza L-lizyny oprócz genu tal można również nadmiernie wyrażać inne enzymy szlaku biosyntezy, jak enzymy szlaku glikolizy, anaplerotyczne, cyklu kwasu cytrynowego i wydalania aminokwasów.
W celu wytwarzania L-aminokwasów, w szczególności L-lizyny można równocześ nie amplifikować, korzystnie nadmiernie wyrażać jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:
- gen dapA dla syntazy dihydrodipikolinanowej (EP-B 0 197 335);
- gen lysC dla kinazy asparaginianowej odpornej na sprzężenie zwrotne (Kalinowski i in. (1990) Molecular and General Genetics 224: 317-324);
- gen gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (Eikmanns (1992) Journal of Bacteriology 174: 6076-6086);
- gen pyc dla karboksylazy pirogronianowej (DE-A-198 31 609));
- gen mqo dla oksydoreduktazy jabł aczanowo:chinonowej (Molenaar i in., (1998) Eur. J. Blochem., 254, 395-403);
- gen tkt dla transketolazy (nr dostę pu AB023377 bank danych EMBL, Heidelberg, Niemcy);
- gen gnd dla dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (JP-A-9-224662);
- gen zwf dla dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (JP-A-9-224661);
- gen lysE dla wydalania lizyny (DE-A-195 48 222);
- gen zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115);
- gen eno dla enolazy (DE 19947791.4);
- gen devB;
- gen opcA (DSM 13264).
W celu wytwarzania L-treoniny można równocześnie nadmiernie wyraż ać następujące enzymy:
- gen hom dla dehydrogenazy homoserynowej (Peoples i in., Molec. Microbiol. 2, 63-72 (1988)) albo allel homdr, kodujący dehydrogenazę homoserynową „oporną na sprzężenie zwrotne” (Archer i in., Gene 107, 53-59 (1991));
- gen gap dla dehydrogenazy gliceraldehydo-3-fosforanowej (Eikmanns (1992) J. Bacteriol. 174: 60-16-6086);
- gen pyc dla karboksylazy pirogronianowej (DE-A-198 31 609);
- gen mqo dla oksydoreduktazy jabł aczanowo:chinonowej (Molenaar i in. (1998) European Journal of Biochemistry, 254, 395-403);
- gen tkt dla transketolazy (nr dostę pu AB023377 baza EMBL, Heidelberg, Niemcy);
- gen gnd dla dehydrogenazy 6-fosfoglukonianu (JP-A-9-224662);
- gen zwf dla dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu (JP-A-9-224661);
- gen thrE dla eksportu treoniny (DE 199 41 478.5; DSM 12840);
- gen zwal (DE 199 59 328.0; DSM 13115);
- gen eno dla enolazy (DE 19947791.4);
- gen devB;
- gen opcA (DSM 13264).
Oprócz tego, do wytwarzania aminokwasów można korzystnie równocześnie osłabić następujące enzymy:
- gen pck dla karboksykinazy fosfoenolopirogronianowej (DE 199 50 409.1, DSM 13047) i/lub;
- gen pgi dla izomerazy glukozo-6-fosforanowej (US 09/396 478, DSM 12969), albo
- gen poxB dla oksydazy pirogronianowej (DE 199 51 975.7; DSM 13114), albo
- gen zwa2 (DE 1.99 59 327.2; DSM 13113) w tym samym czasie, dodatkowo poza wzmocnieniem genu tal.
Dalej, w celu wytwarzania aminokwasów, korzystne jest, oprócz nadmiernej ekspresji genu tal, wyłączenie niepożądanych reakcji dodatkowych (Nakayama: „Breeding of Amino acids Producing Micro-Organisms”, w: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (wyd.) Academic Press, Londyn UK, 1982).
Drobnoustroje wytworzone zgodnie z wynalazkiem mogą być hodowane w sposób nieciągły albo ciągły, sposobem wsadowym albo innym, w celu wytwarzania L-aminokwasów. Podsumowanie
PL 202 843 B1 znanych sposobów hodowania opisano w podręczniku Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustaw Fischer Verlag, Stuttgart, 1991) albo w podręczniku Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994).
Stosowana pożywka hodowlana musi nadawać spełniać wymagania określonego szczepu. Opis pożywek hodowlanych dla różnych drobnoustrojów można znaleźć w podręczniku „Manual of Methods for General Bacteriology”, American Society for Bacteriology, (Washington D.C., USA, 1981). Jako źródło węgla można zastosować różne źródła węglowodanów i cukrów nie ograniczone do glukozy, sacharozy, laktozy, fruktozy, maltozy, melasy, skrobi, celulozy, olejów i tłuszczów jak np. olej sojowy, słonecznikowy, arachidowy i kokosowy, kwasów tłuszczowych jak np. kwas palmitynowy, stearynowy i linolowy, albo alkoholi jak np. gliceryna i etanol oraz kwasy organiczne, jak np. kwas octowy. Te związki można zastosować pojedynczo albo w mieszaninie. Jako źródła azotu można zastosować związki zawierające organiczny azot, takie jak peptony, ekstrakty drożdżowe, ekstrakty mięsne, ekstrakty słodu, syrop z kukurydzy, mąka sojowa i mocznik albo związki nieorganiczne jak siarczan amonu, chlorek amonu, fosforan amonu, węglan amonu i azotan amonu.
Źródła azotu można zastosować pojedynczo oraz jako mieszaninę. Jako źródła fosforanów można zastosować kwas fosforowy, fosforan potasu albo fosforan dipotasu albo odpowiednie sole zawierające azot. Pożywka hodowlana powinna zawierać również sole metali, jak np. siarczan magnezu albo siarczan żelaza, które są konieczne dla wzrostu. Na koniec, oprócz powyższych związków należy zastosować niezbędne czynniki wzrostowe, jak aminokwasy i witaminy. Do hodowli można również dodać odpowiednich prekursorów. Powyższe związki można dostarczać do hodowli w sposób ciągły albo w sposób wsadowy.
W celu kontrolowania pH, stosuje się związki zasadowe takie jak wodorotlenek sodu, wodorotlenek potasu, amoniak, względnie wodę amoniakalną albo związki kwasowe, jak kwas fosforowy albo siarkowy. W celu kontrolowania tworzenia się piany można zastosować substancję przeciwdziałające tworzeniu się piany, jak np. ester poliglikolowy kwasów tłuszczowych.
W celu uzyskania stabilności plazmidu, można zastosować w pożywce substancje wybiórczo działające, jak np. antybiotyki. W celu prowadzenia tlenowego procesu można doprowadzać do hodowli tlen albo mieszaniny zawierające tlen, jak np. powietrze. Temperatura hodowli w normalnych warunkach zawiera się w zakresie od 20°C do 45°C, zaś korzystnie od 25°C do 40°C. Hodowlę prowadzi się do uzyskania maksymalnego poziomu wytwarzania L-aminokwasów. Osiąga się to zwykle po 10 do 160 godzin hodowli.
Analizę L-aminokwasów przeprowadza się przez chromatografię anionowymienną z derywatyzacją ninhydryną według metody opisanej przez Spackman i in. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
Poniższy drobnoustrój zdeponowano w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkuren (DSMZ, Brunszwik, Niemcy), zgodnie z Traktatem Budapesztańskim:
- Escherichia coli JM109/pSUZl jako DSM 13263.
Id. Sekw. nr 1 obejmuje również nowy gen devB. Sposób według wynalazku służy do fermentacyjnego wytwarzania aminokwasów.
Dołączono następujące figury:
Figura 1: Mapa plazmidowa pSUZl
Zastosowano skróty i opisy o następującym znaczeniu: lacZ segmenty fragmentu genu lacZa kan r oporność na kanamycynę tal gen transaldolazy ori początek replikacji plazmidu pBGS8 Bell miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej Bcll EcoRI miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej EcoRI Hindlll miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej Hindlll Pstl miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej Pstl SacI miejsce cięcia endonukleazy restrykcyjnej SacId Przykłady
Poniższe przykłady wyjaśniają dalej rozwiązania według wynalazku. O ile inaczej nie zaznaczono, zastosowano techniki biologii molekularnej, np. izolowanie plazmidowego DNA, trawienie restrykcyjne, ligacje, standardowe transformowanie E. coli itp. jak opisane w Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)).
PL 202 843 B1
P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie genomowego banku genów w kosmidach z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Chromosomalny DNA z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 izolowano sposobem opisanym przez Tauch i in. (1995, Plazmid 33: 168-179) i częściowo trawiono enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, kod nr- 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano alkaliczną fosfatazą z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP kod nr 1758250). DNA wektora kosmidowego SuperCosl (Wahl i in., (1987) Proc. Natl. Acad. of Sciences USA 84: 2160-2164), wytworzony przez Stratagene (La Jolla, USA, opis produktu SuperCosl Cosmid vector Kit, kod nr 251301); cięto enzymem restrykcyjnym Xbal (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Xbal, kod nr 27-0948-02) i defosforylowano alkaliczną fosfatazą z krewetek.
Na koniec, kosmidowy DNA cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI kod nr 27-0868-04). Traktowany w ten sposób DNA kosmidowy zmieszano z DNA ATCC 13032 i traktowano ligazą DNA T4, Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu ligaza DNA T4, kod nr 27-0870-04). Mieszaninę ligacyjną pakowano do fagów przy użyciu ekstraktu Gigapack II XL Packing Extracts (Stratagene, La Jolla, USA, opis produktu Gigapack II XL Packing Extracts, kod nr 200217).
W celu zakażania E. coli szczep NM554 (Raleigh i in., 1988, Nucl. Acids Res., 16: 1563-1575), komórki pobrano w 10 mM MgSO4 i zmieszano z porcją zawiesiny fagów. Zakażenie i miareczkowanie banku kosmidowego przeprowadzono sposobem według Sambrook i in. (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual Cold Spring Harbor, 1989), przy czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955,
Virology 1: 190) z dodatkiem 100 μg/ml ampicyliny. Po inkubacji przez noc, w 37°C selekcjonowano pojedyncze rekombinowane kolonie.
P r z y k ł a d 2. Izolowanie i sekwencjonowanie genu tal
Kosmidowy DNA pojedynczych kolonii izolowano przy użyciu zestawu Qiaprep Spin Miniprep Kit (produkt nr 27106, Qiagen, Hilden, Niemcy) według instrukcji producenta cięto częściowo enzymem restrykcyjnym Sau3AI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu Sau3AI, kod nr 27-0913-02). Fragmenty DNA defosforylowano fosfatazą alkaliczną z krewetek (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy, opis produktu SAP, kod nr 1758250).
Po rozdziale elektroforetycznym, izolowano fragmenty kosmidów w zakresie wielkości od 1500 do 2000 bp przy użyciu zestawu QiaExII Gel Extraction Kit (produkt nr 20021, Qiagen, Hilden, Niemcy). DNA wektora sekwencjonującego pZero-1 firmy Invitrogen (Groningen, Holandia, opis produktu Zero Background Cloning Kit, produkt nr K2500-01) cięto enzymem restrykcyjnym BamHI (Amersham Pharmacia, Freiburg, Niemcy, opis produktu BamHI, kod nr 27-0868-04). Ligację fragmentów kosmidów w wektorze do sekwencjonowania pZero-1 przeprowadzono sposobem opisanym przez Sambrook i in., (Molecular Cloning: A Laboroatory Manual Cold Spring Harbor, 1989), w którym mieszaninę DNA inkubowano przez noc z ligazą DNA T4 (Pharmacia, Freiburg, Niemcy).
Mieszaninę ligacyjną elektroporowano do bakterii E. coli DH5amcr (Grant i in., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990) 4645-4649), metodą Tauch i in., (1995, Plazmid 33: 168-179), po czym komórki wysiano na agar LB (Lennox, 1955, Virology 1: 190) z dodatkiem 50 μg/ml zeocyny. Preparaty plazmidowe rekombinowanych klonów otrzymano przy użyciu Biorobot 9600 (produkt nr 900200, Qiagen, Hilden, Niemcy).
Sekwencjonowanie przeprowadzono metodą przerywania łańcucha przy użyciu dideoksynukleotydów metodą Sanger i in., (1977, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467) z modyfikacjami Zimmermann i in., (1990, Nucl. Acids Res. 18: 11067). Zastosowano zestaw wykorzystujący Rodaminę „RR dRodamin Terminaror Cycle Sequencing Kit”, z PE Applied Biosystems (nr produktu 403044, Weiterstadt, Niemcy). Elektroforetyczny rozdział i analizę reakcji sekwencjonowania przeprowadzono przy użyciu żelu „Rotiophoresis NF Acrylamid/bisacrylamid (29: 1) (kod produktu A124.1, Roth, Karlsruhe, Niemcy) przy użyciu sekwenatora ABI Prism 377.
Otrzymane sekwencje opracowano przy użyciu pakietu oprogramowania Staden (1986, Nucl. Acids Res. 14: 217-231) wersja 97-0. Pojedyncze sekwencje pochodnej pZero-01 łączy się do postaci ciągłego kontigu. Komputerowe zastępniki zostały opracowane programem XNIP (staden, 1986, Nucleic Acids Reasearch, 14: 217-231). Dalszą analizę przeprowadzono programem poszukującym BLAST (Altshul i in., 1997, Nucl. Acids Res., 25: 3389-3402) na nie redundancyjnej bazie danych genów „National Center for Biotechnology Information” (NCBI, Bethesda, MD, USA).
Otrzymaną sekwencję nukleotydową przestawiono na Id. Sekw. nr 1 i Id. Sekw. nr 3.
PL 202 843 B1
P r z y k ł a d 3. Klonowanie genu tal
W celu amplifikowania fragmentów DNA zawierają cych cał y gen tal C. glutamicum 13032 i flankujące regiony powyżej i poniżej genu, zastosowano PCR. Reakcje PCR przeprowadzono stosując startery oligonukleotydowe opracowane w oparciu o sekwencję określoną w przykładzie 1 i 2.
Genomowy DNA izolowano z Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, według Heery i Dunican (Appl. Environmental Microbiol. 59: 791-799 (1993)) i zastosowano jako matrycę. Startery tal miały sekwencję:
starter naprzód 5' GGT ACA AAG GGT CTT AAG 3' starter wstecz 5' GAT TTC ATG TCG CCG TTA 3'
Zastosowano następujące parametry PCR:
cykli
95°C przez 3 minuty
94°C przez 1 minutę
47°C przez 1 minutę
72°C przez 45 sekund
2,0 mM MgCl2 około 150-200 ng matrycy DNA
Otrzymany produkt PCR klonowano do dostępnego w handlu wektora pGEM-T, zakupionego z Promega Corp. (pGEM-T Easy Vector System 1, nr kat. A1360, Promega UK, Southampton, UK) stosując szczep JM109 (Yanisch-Perron i in., Gene 33: 103-119 (1985)) jako gospodarza. Następnie, cały gen tal wyizolowano z wektora pGEM T jako fragment EcoRI i klonowano w miejsce EcoRI lacZa wektora E. coli pBGS8 (Spratt i in., Gene 41 (2-3): 337-342 (1986)).
Enzymy restrykcyjne, które zastosowano, pochodziły z Boehringer Mannheim UK Ltd. (Bell Lane, Lewes East Sussex BN7 ILG, UK) i zastosowano je według instrukcji producenta. E. coli JMI09 transformowano mieszaniną ligacyjną i selekcjonowano elektrotransformanty na agarze Luria z dodatkiem izopropylotiogalaktopiranozydu (IPTG), 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-galaktopiranozydu (XGAL) i kanamycyny w stężeniach, odpowiednio, 1 mM, 0,02 i 50 mg/l.
Płytki inkubowano przez 12 godzin w 37°C. Plazmidowy DNA izolowano z jednego z transformantów, charakteryzowano trawieniem restrykcyjnym z użyciem EcoRI. Nowy konstrukt oznaczono pSUZ1.
P r z y k ł a d 4. Wytwarzanie szczepu Corynebacterium glutamicum DSMS5715::pSUZ1
Szczep DSM5715 transformowano pSUZ1 przez elektroporację metodą opisaną przez Liebl i in. (FEMS Microbiol. Lett. 53: 299-303 (1989)). Selekcję transformantów przeprowadzono na agarze LBHIS, obejmującym 18,5 g/l bulionu infuzyjnego z mózgu i serca, 0,5 M sorbitolu, 5 g/l BactoTrypton, 2,5 g/ ekstraktu drożdżowego Bacto, 5 g/l NaCl 18 g/l agaru Bacto, z dodatkiem 25 mg/l kanamycyny. Inkubację przeprowadzono przez 2 dni w 33°C.
Ponieważ wektor pSUZ1 nie replikuje w szczepie DSM5715, zdolne do wzrostu były jedynie klony, które wykazują oporność na kanamycynę spowodowaną przez integrację pSUZ1.
Powstały integrant oznaczono DSM5715::pSUZ1.
P r z y k ł a d 5. Wytwarzanie lizyny
Szczep C. glutamicum DSM5715/pSUZ1 otrzymany w przykładzie 4 hodowano na pożywce odpowiedniej do wytwarzania L-lizyny i określano zawartość L-lizyny w supernatancie z hodowli.
W tym celu, szczep wysiano na płytkę agarową z odpowiednim antybiotykiem (agar z wyciągiem z mózgu i serca z kanamycyną (25 mg/l)) przez 24 godziny w 33°C. Z płytki wykonano hodowlę wstępną (10 ml pożywki w 100 ml kolbie stożkowej). Jako pożywkę do hodowli wstępnej zastosowano pożywkę Cglll.
Pożywka Cg III
NaCl 2,5 g/l
Bacto-Pepton 10 g/l
Ekstrakt drożdżowy Bacto 10 g/l
Glukoza (autoklawowana osobno) 2 (wag./obj.) pH ustalono na 7,4
Następnie dodano kanamycynę (25 mg/l). Hodowlę wstępną inkubowano wytrząsając z szybkością 240 obrotów na minutę 33°C na wytrząsarce przez 16 godzin. Tą hodowlą wstępną szczepiono główną hodowlę tak, że jej wyjściowe OD (660 nm) wynosiło 0,1.
Do hodowli głównej zastosowano pożywkę MM.
PL 202 843 B1
Pożywka MM
CSL (Corn Steep Liquor - syrop kukurydziany) 5 g/l
MOPS 20 g/l
glukoza (osobno autoklawowana) 50 g/l
Sole:
(NH4)2SO4 25 g/l
KH2PO4 0,1 g/l
MgSO4 x 7 H2O 1,0 g/l
CaCl2 x 2 H2O 10 mg/l
FeSO4 x 7 H2O 10 mg/l
MnSO4 x H2O 5,0 mg/l
Biotyna (sterylizowana przez filtrację) 0,3 mg/l
Tiamina x HCl (sterylizowana przez filtrację) 0,2 mg/l
L-Leucyna 0,1 g/l
CaCO3 25 g/l
CSL, MOPS i roztwór soli doprowadzono do pH 7 przy użyciu wody amoniakalnej i autoklawo-
wano. Na koniec, dodano sterylizowany roztwór substratów i witamin, jak również autoklawowany CaCO3 w postaci suchej.
Hodowlę prowadzono w 10 ml objętości w 100 ml kolbie stożkowej z progami. Dodano kanamycynę (25 mg/l).
Hodowla przebiegała w 33°C i 80% wilgotności powietrza.
Po 24 i 48 godzinach określono OD przy długości fali 660 nm na urządzeniu Biomek 1000 (Beckmann Instruments GmbH, Monachium).
Wytworzoną lizynę określono przy użyciu analizatora aminokwasów Eppendorf-BioTronik (Hamburg, Niemcy) przez chromatografię jonowymienną i derywatyzację z wykrywaniem metodą ninhydrynową.
W tabeli 1 pokazano wyniki doświadczenia.
T a b e l a 1
Szczep Czas [godz.] Lizyna HCl g/l
DSM5715 24 8,1
DMS5715::pSUZ1 24 8,6
DSM5715 48 14,7
DS5715:pSUZ1 48 15,4
PL 202 843 B1
LISTA SEKWENCJI <110> National University of Ireland, Galway Degussa AG <120> Sekwencje nukleotydowe kodujące gen tal <130> 990228BT <140>
<141>
<160> 4
<170> Patentln Ver. 2. 1
<210> 1 <211> 6995 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum
<220> <221> CDS <222> (2471)..(3550) <223> tal-Gen
<400> 1 cacatttgaa ccacagttgg ttataaaatg ggttcaacat cactatggtt agaggtgttg 60
acgggtcaga ttaagcaaag actactttcg gggtagatca cctttgccaa atttgaacca 120
attaacctaa gtcgtagatc tgatcatcgg atctaacgaa aacgaaccaa aactttggtc 180
ccggtttaac ccaggaagga ttgaccacct tgacgctgtc acctgaactt caggcgctca 240
ctgtacgcaa ttacccctct gattggtccg atgtggacac caaggctgta gacactgttc 300
gtgtcctcgc tgcagacgct gtagaaaact gtggctccgg ccacccaggc accgcaatga 360
gcctggctcc ccttgcatac accttgtacc agcgggttat gaacgtagat ccacaggaca 420
ccaactgggc aggccgtgac cgcttcgttc tttcttgtgg ccactcctct ttgacccagt 480
acatccagct ttacttgggt ggattcggcc ttgagatgga tgacctgaag gctctgcgca 540
cctgggattc cttgacccca ggacaccctg agtaccgcca caccaagggc gttgagatca 600
ccactggccc tcttggccag ggtcttgcat ctgcagttgg tatggccatg gctgctcgtc 660
gtgagcgtgg cctattcgac ccaaccgctg ctgagggcga atccccattc gaccaccaca 720
tctacgtcat tgcttctgat ggtgacctgc aggaaggtgt cacctctgag gcatcctcca 780
tcgctggcac ccagcagctg ggcaacctca tcgtgttctg ggatgacaac cgcatctcca 840
tcgaagacaa cactgagatc gctttcaacg aggacgttgt tgctcgttac aaggcttacg 900
gctggcagac cattgaggtt gaggctggcg aggacgttgc agcaatcgaa gctgcagtgg 960
ctgaggctaa gaaggacacc aagcgaccta ccttcatccg cgttcgcacc atcatcggct 1020
tcccagctcc aactatgatg aacaccggtg ctgtgcacgg tgctgctctt ggcgcagctg 1080
PL 202 843 B1
aggttgcagc aaccaagact gagcttggat tcgatcctga ggctcacttc gcgatcgacg 1140
atgaggttat cgctcacacc cgctccctcg cagagcgcgc tgcacagaag aaggctgcat 1200
ggcaggtcaa gttcgatgag tgggcagctg ccaaccctga gaacaaggct ctgttcgatc 1260
gcctgaactc ccgtgagctt ccagcgggct acgctgacga gctcccaaca tgggatgcag 1320
atgagaaggg cgtcgcaact cgtaaggctt ccgaggctgc acttcaggca ctgggcaaga 1380
cccttcctga gctgtgggac ggttccgctg acctcgcagg ttccaacaac accgtgatca 1440
agggctcccc ttccttcggc cctgagtcca tctccaccga gacctggtct gctgagcctt 1500
acggccgtaa cctgcacttc ggtatccgtg agcacgctat gggatccatc ctcaacggca 1560
tttccctcca cggtggcacc cgcccatacg gcggaacctt cctcatcttc tccgactaca 1620
eyCguCG^gO ZT+· +· ζ'η 4 4- y ww y w»-w 4-nnarra rrrra v.y y wy wwwy w rnrt tarf-ar· rrf r-f· ππζΓΓ·/* 1 fiRh
acgactccat cggtctgggc gaagatggcc caacccacca gcctgttgaa accttggctg 1740
cactgcgcgc catcccaggt ctgtccgtcc tgcgtcctgc agatgcgaac gagaccgccc 1800
aggcttgggc tgcagcactt gagtacaagg aaggccctaa gggtcttgca ctgacccgcc 1860
agaacgttcc tgttctggaa ggcaccaagg agaaggctgc tgaaggcgtc CyCCyCyyty Λ OOP J.
gctacgtcct ggttgagggt tccaaggaaa ccccagatgt gatcctcatg ggctccggct 1980
ccgaggttca gcttgcagtt aacgctgcga aggctctgga agctgagggc gttgcagctc 2040
gcgttgtttc cgttccttgc atggattggt tccaggagca ggacgcagag tacatcgagt 2100
ccgttctgcc tgcagctgtg accgctcgtg tgtctgttga agctggcatc gcaatgcctt 2160
ggtaccgctt cttgggcacc cagggccgtg ctgtctccct tgagcacttc ggtgcttctg 2220
cggattacca gaccctgttt gagaagttcg gcatcaccac cgatgcagtc gtggcagcgg 2280
ccaaggactc cattaacggt taattgccct gctgttttta gcttcaaccc ggggcaatat 2340
gattctccgg aattttattg ccccgggttg ttgttgttaa tcggtacaaa gggtcttaag 2400
cacatccctt acttgcctgc tctccttgag cacagttcaa gaacaattct tttaaggaaa 2460
atttagtttc atg tct cac att gat gat ctt gca cag ctc ggc act tcc 2509
Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gin Leu Gly Thr Ser
10 act tgg ctc gac gac ctc tcc cgc gag cgc att act tcc ggc aat ctc 2557
Thr Trp Leu Asp Asp Leu Ser Arg Glu Arg Ile Thr Ser Gly Asn Leu
20 25 '
PL 202 843 B1
agc cag gtt att gag gaa aag tct gta
Ser 30 Gin Val Ile Glu Glu 35 Lys Ser Val
gct att ttc gca gca gca atg tcc aag
Ala Ile Phe Ala Ala 50 Ala Met Ser Lys
atc gca gag ctc aag gcc gct ggc gca
Ile Ala Glu Leu 65 Lys Ala Ala Gly Ala 70
gcc atg agc atc gac gac gtt cgc aat
Ala Met Ser 80 Ile Asp Asp Val Arg 85 Asn
atc ttc gag tcc tcc aac ggc tac gac
Ile Phe 95 Glu Ser Ser Asn Gly 100 Tyr Asp
gac cca cgt atc tct gct gac cgc gac
Asp 110 Pro Arg Ile Ser Ala 115 Asp Arg Asp
gag ctg tgg gca aag gtt gat cgt cca
Glu Leu Trp Ala Lys 130 Val Asp Arg Pro
gca a cc cca ggt tct ttg cca gca atc
Ala Thr Pro Gly 145 Ser Leu Pro Ala Ile 150
atc agc gtt aac gtc acc ttg atc ttc
Ile Ser Val 160 Asn Val Thr Leu Ile 165 Phe
gtc atc gct gcg ttc atc gag ggc atc
Val Ile 175 Ala Ala Phe Ile Glu 180 Gly Ile
cac gac gtc tcc aag atc cac tct gtg
His 190 Asp Val Ser Lys Ile Ί QC Λ. J His Ser Val
gtc gac gtt gag atc gac aag cgc ctc
Val Asp Val Glu Ile 210 Asp Lys Arg Leu
gct ttg gct ctg cgc ggc aag gca ggc
Ala Leu Ala Leu 225 Arg Gly Lys Ala Gly 230
tac gct gtg tac aag gag ctt ttc gac
Tyr Ala Val 240 Tyr Lys Glu Leu Phe 245 Asp
gcc aac act cag cgc cca ctg tgg gca
Ala Asn 255 Thr Gin Arg Pro Leu 260 Trp Ala
gcg tac gct gca act ctt tac gtt tcc
Ala 270 Tyr Ala Ala Thr Leu 275 Tyr Val Ser
gtc ggt gtc acc acc aac cca 2605
Val Gly 40 Val Thr Thr Asn Pro 45
ggc gat tcc tac gac gct cag 2653
Gly 55 Asp Ser Tyr Asp Ala 60 Gin
tct gtt gac cag gct gtt tac 2701
Ser Val Asp Gin Ala 75 Val Tyr
gct tgt gat ctg ttc acc ggc 2749
Ala Cys Asp Leu 90 Phe Thr Gly
ggc cgc gtg tcc atc gag gtt 2797
Gly Arg Val 105 Ser Ile Glu Val
ΠΠΛ SCO /'•f· rr fłrł- α o λ c
— — ~ '-'a ęcc 3ay 4. O
Ala Thr 120 Leu Ala Gin Ala Lys 125
aac gtc atg atc aag atc cct 2893
Asn 135 Val Met Ile Lys Ile 140 Pro
acc gac gct ttg gct gag ggc 2941
Thr Asp Ala Leu Ala 155 Glu Gly
tcc gtt gct cgc tac cgc gag 2989
Ser Val Ala Arg 170 Tyr Arg Glu
aag cag gct gct gca aac ggc 3037
Lys Gin Ala 185 Ala Ala Asn Gly
gct tcc ttc ttc gtc tcc cgc 3085
Ala Ser 200 Phe Phe Val Ser Arg 205
gag gca atc gga tcc gat gag 3133
Glu 215 Ala Ile Gly Ser Asp 220 Glu
gtt gcc aac gct cag cgc gct 3181
Val Ala Asn Ala Gin 235 Arg Ala
gcc gcc gag ctg cct gaa ggt 3229
Ala Ala Glu Leu 250 Pro Glu Gly
tcc acc ggc gtg aag aac cct 3277
Ser Thr Gly 265 Val Lys Asn Pro
gag ctg gct ggt cca aac acc 3325
Glu Leu 280 Ala Gly Pro Asn Thr 285
PL 202 843 B1
gtc Val aac Asn acc Thr atg Met cca Pro 290 gaa ggc Glu Gly acc Thr atc gac Ile Asp 295 gcg Ala gtt Val ctg gag cag ggc Gly 3373
Leu Glu Gin 300
aac ctg cac ggt gac acc ctg tcc aac tcc gcg gca gaa gct gac gct 3421
Asn Leu His Gly Asp Thr Leu Ser- Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala
305 310 315
gtg ttc tcc cag ctt gag gct ctg ggc gtt gac ttg gca gat gtc ttc 3469
Val Phe Ser Gin Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe
320 325 330
cag gtc ctg gag acc gag ggt gtg gac aag ttc gtt gct tct tgg agc 3517
Gin Val Leu Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser
335 340 345
gaa ctg ctt gag tcc atg gaa gct cgc ctg aag tagaatcagc acgctgcatc 3570
Glu Leu Leu Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys
350 355 360
agtaacggcg acatgaaatc gaattagttc gatcttatgt ggccgttaca catctttcat 3630 taaagaaagg atcgtgacac taccatcgtg agcacaaaca cgaccccctc cagctggaca 3690 aacccactgc gcgacccgca ggataaacga ctcccccgca tcgctggccc ttccggcatg 3750 gtgatcttcg gtgtcactgg cgacttggct cgaaagaagc tgctccccgc catttatgat 3810 ctagcaaacc gcggattgct gcccccagga ttctcgttgg taggttacgg ccgccgcgaa 3870 tggtccaaag aagactttga aaaatacgta cgcgatgccg caagtgctgg tgctcgtacg 3930 gaattccgtg aaaatgtttg ggagcgcctc gccgagggta tggaatttgt tcgcggcaac 3990 tttgatgatg atgcagcttt cgacaacctc gctgcaacac tcaagcgcat cgacaaaacc 4050 cgcggcaccg ccggcaactg ggcttactac ctgtccattc caccagattc cttcacagcg 4110 gtctgccacc agctggagcg ttccggcatg gctgaatcca ccgaagaagc atggcgccgc 4170 gtgatcatcg agaagccttt cggccacaac ctcgaatccg cacacgagct caaccagctg 4230 gtcaacgcag tcttcccaga atcttctgtg ttccgcatcg accactattt gggcaaggaa 4290 acagttcaaa acatcctggc tctgcgtttt gctaaccagc tgtttgagcc actgtggaac 4350 tccaactacg ttgaccacgt ccagatcacc atggctgaag atattggctt gggtggacgt 4410 gctggttact acgacggcat cggcgcagcc cgcgacgtca tccagaacca cctgatccag 4470 ctcttggctc tggttgccat ggaagaacca atttctttcg tgccagcgca gctgcaggca 4530 gaaaagatca aggtgctctc tgcgacaaag ccgtgctacc cattggataa aacctccgct 4590 cgtggtcagt acgctgccgg ttggcagggc tctgagttag tcaagggact tcgcgaagaa 4650 gatggcttca accctgagtc caccactgag acttttgcgg cttgtacctt agagatcacg 4710 tctcgtcgct gggctggtgt gccgttctac ctgcgcaccg gtaagcgtct tggtcgccgt 4770 gttactgaga ttgccgtggt gtttaaagac gcaccacacc agcctttcga cggcgacatg 4830
PL 202 843 B1 actgtatccc ttggccaaaa cgccatcgtg attcgcgtgc agcctgatga aggtgtgctc 4890 atccgcttcg gttccaaggt tccaggttct gccatggaag tccgtgacgt caacatggac 4950 ttctcctact cagaatcctt ćactgaagaa tcacctgaag catacgagcy cctcattttg 5010 gatgcgctgt tagatgaatc cagcctcttc cctaccaacg aggaagtgga actgagctgg 5070 aagattctgg atccaattct tgaagcatgg gatgccgatg gagaaccaga ggattaccca 5130 gcgggtacgt ggggtccaaa gagcgctgat gaaatgcttt cccgcaacgg tcacacctgg 5190 cgcaggccat aatttagggg caaaaaatga tctttgaact tccggatacc accacccagc 5250 aaatttccaa gaccctaact cgactgcgtg aatcgggcac ccaggtcacc accggccgag 5310 tgctcaccct catcgtggtc actgactccg aaagcgatgt cgctgcagtt accgagtcca 5370 ccaatgaagc ctcgcgcgag cacccatctc gcgtgatcat tttggtggtt ggcgataaaa 5430 ctgcagaaaa caaagttgac gcagaagtcc gtatcggtgg cgacgctggt gcttccgaga 5490 tgatcatcat gcatctcaac ggacctgtcg ctgacaagct ccagtatgtc gtcacaccac 5550 tgttgcttcc tgacaccccc atcgttgctt ggtggccagg tgaatcacca aagaatcctt 5610 cccaggaccc aattggacgc atcgcacaac gacgcatcac tgatgctttg tacgaccgtg 5670 atgacgcact agaagatcgt gttgagaact atcacccagg tgataccgac atgacgtggg 5730
cgcgccttac ccagtggcgg ggacttgttg cctcctcatt ggatcaccca ccacacagcg 5790
aaatcacttc cgtgaggctg accggtgcaa gcggcagtac ctcggtggat ttggctgcag 5850
gctggttggc gcggaggctg aaagtgcctg tgatccgcga ggtgacagat gctcccaccg 5910
tgccaaccga tgagtttggt actccactgc tggctatcca gcgcctggag atcgttcgca 5970
ccaccggctc gatcatcatc accatctatg acgctcatac ccttcaggta gagatgccgg 6030
aatccggcaa tgccccatcg ctggtggcta ttggtcgtcg aagtgagtcc gactgcttgt 6090
ctgaggagct tcgccacatg gatccagatt tgggctacca gcacgcacta tccggcttgt 6150
ccagcgtcaa gctggaaacc gtctaaggag /»+· ^+-A At 4 Λ 4- «+- anf- a γ'ΠΓ’
gcacgcgata ctgaagattt ggttgcacag gctgcctcca aattcattga ggttgttgaa 6270
gcagcaactg ccaataatgg caccgcacag gtagtgctca ccggtggtgg cgccggcatc 6330
aagttgctgg aaaagctcag cgttgatgcg gctgaccttg cctgggatcg cattcatgtg 6390
ttcttcggcg atgagcgcaa tgtccctgtc agtgattctg agtccaatga gggccaggct 64 50
cgtgaggcac tgttgtccaa ggtttctatc cctgaagcca acattcacgg atatggtctc 6510
ggcgacgtag atcttgcaga ggcagcccgc gcttacgaag ctgtgttgga tgaattcgca 6570
ccaaacggct ttgatcttca cctgctcggc atgggtggcg aaggccatat caactccctg 6630
ttccctcaca ccgatgcagt caaggaatcc tccgcaaagg tcatcgcggt gtttgattcc 6690
cctaagcctc : cttcagagcg tgcaactcta acccttcctg cggttcactc cgcaaagcgc 6750
PL 202 843 B1
gtgtggttgc tggtttctgg tgcggagaag gctgaggcag ctgcggcgat cgtcaacggt 6810
gagcctgctg ttgagtggcc tgctgctgga gctaccggat ctgaggaaac ggtattgttc 6870
ttggctgatg atgctgcagg aaatctctaa gcagcgccag ctctaacaag aagctttaac 6930
aagaagctct aacgaaaagc actaacaaac taatccgggt gcgaaccttc atctgaatcg 6990
atgga 6995
<210> 2 <211> 360 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2
Met Ser 1 His Ile . Asp 5 Asp Leu . Ala Gin Leu 10 Gly Thr Ser Thr Trp 15 Leu
Asp Asp Leu Ser 20 Arg Glu Arg Ile Thr 25 Ser Gly Asn Leu Ser 30 Gin Val
Ile Glu Glu 35 Lys Ser Val Val Gly 40 Val Thr Thr Asn Pro 45 Ala Ile Phe
Ala Ala 50 Ala Met Ser Lys Gly 55 Asp Ser Tyr Asp Ala 60 Gin Ile Ala Glu
Leu Lys 65 Ala Ala Gly Ala Ser 70 Val Asp Gin Ala 75 Val Tyr Ala Met Ser 80
Ile Asp Asp Val Arg 85 Asn Ala Cys Asp Leu 90 Phe Thr Gly Ile Phe 95 Glu
Ser Ser Asn Gly 100 Tyr Asp Gly Arg Val 105 Ser Ile Glu Val Asp 110 Pro Arg
Ile Ser Ala 115 Asp Arg Asp Ala Thr 120 Leu Ala Gin Ala Lys 125 Glu Leu Trp
Ala Lys 130 Val Asp Arg Pro Asn 135 Val Met Ile Lys Ile 140 Pro Ala Thr Pro
Gly Ser 145 Leu Pro Ala· Ile Thr 150 Asp Ala Leu Ala 155 Glu Gly Ile Ser Val 160
Asn Val Thr Leu Ile 165 Phe Ser Val Ala Arg 170 Tyr Arg Glu Val Ile 175 Ala
Ala Phe Ile Glu 180 Gly Ile Lys Gin Ala 185 Ala Ala Asn Gly His 190 Asp Val
Ser Lys Ile 195 His Ser Val Ala Ser 200 Phe Phe Val Ser Arg 205 Val Asp Val
Glu Ile 210 Asp Lys Arg Leu Glu 215 Ala Ile Gly Ser Asp 220 Glu Ala Leu Ala
Leu Arg 225 Gly ’ Lys Ala Gly Val 230 Ala Asn i Ala Gin 235 Arg Ala Tyr Ala Val 240
PL 202 843 B1
Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr
245 250 255
Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala
260 265 270
Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Asn Thr
275 280 285
Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Gin Gly Asn Leu His
290 295 300
Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser
305 310 315 320
Gin Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gin Val Leu
325 330 335
Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu
340 345 350
Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys
355 360
<210> 3 <211> 1083 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220>
<221> CDS <222> (1).-(1080) <223> tal <400> 3 . . . ,ο atg tct cac att gat gat ctt gca cag ctc ggc act tcc act tgg ctc 4«
Met Ser His Ile Asp Asp Leu Ala Gin Leu Gly Thr Ser Thr Trp Leu i 5 10 15
PL 202 843 B1
gac Asp gac Asp ctc Leu tcc Ser 20 cgc Arg gag Glu cgc Arg att Ile act Thr 25 tcc Ser ggc Gly aat Asn ctc Leu agc Ser 30 cag Gin gtt Val 96
att Ile gag Glu gaa Glu 35 aag Lys tct Ser gta Val gtc Val ggt Gly 40 gtc Val acc Thr acc Thr aac Asn cca Pro 45 gct Ala att Ile ttc Phe 144
gca Ala gca Ala 50 gca Ala atg Met tcc Ser aag Lys ggc Gly 55 gat Asp tcc Ser tac Tyr gac Asp gct Ala 60 cag Gin atc Ile gca Ala gag Glu 192
ctc Leu 65 aag Lys gcc Ala gct Ala ggc Gly gca Ala 70 tct Ser gtt Val gac Asp cag Gin gct Ala 75 gtt Val tac Tyr gcc Ala atg Met agc Ser 80 240
atc Ile gac Asp gac Asp gtt Val cgc Arg 85 aat Asn gct Ala tgt Cys gat Asp ctg Leu 90 ttc Phe acc Thr ggc Gly atc Ile ttc Phe 95 gag Glu 288
tcc Ser tcc Ser aac Asn nnn ZJ 3 — Gly 100 tl3C Tyr /ran Asp ggc Gly cgc Arg ytg Val 105 tcc Ser atc Ile gag Glu gtt Val gac Asp 110 cca Pro cgt Arg 336
atc Ile tct Ser gct Ala 115 gac Asp cgc Arg gac Asp gca Ala acc Thr 120 ctg Leu gct Ala cag Gin gcc Ala aag Lys 125 gag Glu ctg Leu tgg Trp 384
gca Ala aag Lys 130 gtt Val gat Asp cgt Arg cca Pro aac Asn 135 gtc Val · atg Met atc Ile aag Lys atc Ile 140 cct Pro gca Ala acc Thr cca Pro 432
ggt Gly 145 tct Ser ttg Leu cca Pro gca Ala atc Ile 150 acc Thr gac Asp gct Ala ttg Leu gct Ala 155 gag Glu ggc Gly atc Ile agc Ser gtt Val 160 480
528 aaC ttg 3tC ttc tcc gtt 9ct cgc tac cgc gag gtc atc gct
Asn Val Thr Leu Ile Phe SerVal Ala Arg Tyr Arg Glu Val Ile Ala 165 i7o
175
gcg ttc atc gag ggc atc aag cag
Ala Phe Ile Glu 180 Gly Ile Lys Gin
tcc aag atc cac tct gtg gct tcc
Ser Lys Ile 195 His Ser Val Ala Ser 200
gag atc gac aag cgc ctc gag gca
Glu Ile 210 Asp Lys Arg Leu Glu 215 Ala
gct gct gca aac ggc cac gac gtc 576
Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Val
185 190 F ttc ttc gtc tcc cgc gtc gac gtt 624
Phe Phe Val Ser Arg Val Asp Val
205 atc gga tcc gat gag gct ttg gct 672
Ile Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ala
220 cgc ggc aag g^a ggc gtt gcc aac gct cag cgc gct tac gct qtq 720
™.g UJ.y ^ys H±a Giy Val Ala Asn Ala Gin Arg Ala Tyr Ala Val 230 235 240
tac aag gag ctt ttc gac gcc gcc gag
Tyr Lys Glu Leu Phe 245 Asp Ala Ala Glu
cag cgc cca ctg tgg gca tcc acc ggc
Gin Arg Pro Leu 260 Trp Ala Ser Thr Gly 265
ctg cct gaa ggt gcc aac act 768
Leu 250 Pro Glu Gly Ala Asn 255 Thr
gtg aag aac cct gcg tac gct 816
Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala
270
PL 202 843 B1
gca Ala act Thr ctt Leu 275 tac gtt tcc Ser gag Glu ctg Leu 280 gct Ala ggt Gly cca Pro aac Asn acc Thr 285 gtc Val aac Asn acc Thr 864
Tyr Val
atg cca gaa ggc acc atc gac gcg gtt ctg gag cag ggc aac ctg cac 912
Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Gin Gly Asn Leu His
290 295 300
ggt gac acc ctg tcc aac tcc gcg gca gaa gct gac gct gtg ttc tcc 960
Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser
305 310 315 320
cag ctt gag gct ctg ggc gtt gac ttg gca gat gtc ttc cag gtc ctg 1008
Gin Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gin Val Leu
325 330 335
gag acc gag ggt gtg gac aag ttc gtt gct tct tgg agc gaa ctg ctt 1056
Glu Thr Glu Gly Val Asp Lys Phe Val Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu
340 345 350
gag tcc atg gaa gct cgc ctg aag tag 1083
Glu Ser Met Glu Ala Arg Leu Lys
355 360 <210> 4 <211> 360 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 4
Met 1 Ser His Ile Asp 5 Asp Leu Ala Gin Leu 10 Gly Thr Ser Thr Trp 15 Leu
Asp Asp Leu Ser 20 Arg Glu Arg Ile Thr 25 Ser Gly Asn Leu Ser 30 Gin Val
Ile Glu Glu 35 Lys Ser Val Val Gly 40 Val Thr Thr Asn Pro 45 Ala Ile Phe
Ala Ala 50 Ala Met Ser Lys Gly 55 Asp Ser Tyr Asp Ala 60 Gin Ile Ala Glu
T T a »«- Λ T Λ 1 _ a, uxy Λ 1 O Λ·»- xr- i 7\ Π as 7\ T «a V-. 1 Φ,.ν-
Ut u 65 uyo ma nj.o 70 «JCX * OA <3X41 <-xxo 75 ν αχ MC U. 80
Ile Asp Asp Val Arg 85 Asn Ala Cys Asp Leu 90 Phe Thr Gly Ile Phe 95 Glu
Ser Ser Asn Gly 100 Tyr Asp Gly Arg Val 105 Ser Ile Glu Val Asp 110 Pro Arg
Ile Ser Ala 115 Asp Arg Asp Ala Thr 120 Leu Ala Gin Ala Lys 125 Glu Leu Trp
Ala Lys 130 Val Asp Arg Pro Asn 135 Val Met Ile Lys Ile 140 Pro Ala Thr Pro
Gly 145 Ser Leu Pro Ala Ile 150 Thr Asp Ala Leu Ala 155 Glu Gly Ile Ser Val 160
Asn Val Thr Leu Ile Phe Ser Val Ala Arg Tyr Arg Glu Val Ile Ala
PL 202 843 B1
165 170 175
Ala Phe Ile Glu Gly Ile Lys Gin Ala Ala Ala Asn Gly His Asp Val
180 185 190
Ser Lys Ile His Ser Val Ala Ser Phe Phe Val Ser Arg Val Asp •Val
195 200 205
Glu Ile Asp Lys Arg Leu Glu Ala Ile Gly Ser Asp Glu Ala Leu Ala
210 215 220
Łrrt m y T.u« Ala Cl 17 Val Ala A<;n Ala m n Am Al a Tvr - J - Ala Val
225 230 235* 240
Tyr Lys Glu Leu Phe Asp Ala Ala Glu Leu Pro Glu Gly Ala Asn Thr
245 250 255
Gin Arg Pro Leu Trp Ala Ser Thr Gly Val Lys Asn Pro Ala Tyr Ala
4-Λ £. OU A- J A. · V
Ala Thr Leu Tyr Val Ser Glu Leu Ala Gly Pro Asn Thr Val Asn Thr
275 280 285
Met Pro Glu Gly Thr Ile Asp Ala Val Leu Glu Gin Gly Asn Leu His
290 295 300
Gly Asp Thr Leu Ser Asn Ser Ala Ala Glu Ala Asp Ala Val Phe Ser
305 310 315 320
Gin Leu Glu Ala Leu Gly Val Asp Leu Ala Asp Val Phe Gin Val Leu
325 330 335
Glu Thr Glu Gly val Asp Lys Phe vai Ala Ser Trp Ser Glu Leu Leu
340 345 350
m n Mat Glu Al a Ara --3 Leu Lys
355 360
Zastrzeżenia patentowe

Claims (19)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Polinukleotyd z bakterii Corynebacterium, kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy wybrany z grupy składającej się z:
    (a) polinukleotydu kodującego polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest przynajmniej w 90% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną na Id. Sekw. nr 2;
    (b) polinukleotydu komplementarnego z polinukleotydem z (a).
  2. 2. Polinukleotyd według zastrz. 1, znamienny tym, że koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa jest w co najmniej 95% identyczna z sekwencją aminokwasową przedstawioną na Id. Sekw. nr 2.
  3. 3. Polinukleotyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową przedstawioną na Id. Sekw. nr. 3.
  4. 4. Polinukleotyd według zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że jest RNA.
  5. 5. Polinukleotyd według zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że koduje polipeptyd, którego sekwencja aminokwasowa przedstawiona jest na Id. Sekw. nr 2.
  6. 6. Polinukleotyd według zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że jest wybrany z:
    (a) sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 3, (b) sekwencji nukleotydowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 1, (c) fragmentu sekwencji przedstawionej na Id. Sekw. nr 1, (d) sekwencji nukleotydowej, która odpowiada sekwencji z (a) do (c) z uwzględnieniem degeneracji kodu genetycznego i (e) sekwencji nukleotydowej z funkcjonalnie neutralną mutacją sensowną z (a) do (c).
    PL 202 843 B1
  7. 7. Polinukleotyd według jednego z zastrz. od 1 do 6, znamienny tym, że bakterią Corynebacterium jest Corynebacterium glutamicum.
  8. 8. Polinukleotyd według zastrz. 3, znamienny tym, że koduje polipeptyd o aktywności transaldolazy i znajduje się na plazmidzie pSUZ1, który został zdeponowany w szczepie DSM 5715, pod numerem DSM 13263.
  9. 9. Polipeptyd o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na Id. Sekw. nr 2, który ma aktywność enzymatyczną transaldolazy.
  10. 10. Polipeptyd według zastrz. 9, znamienny tym, że ma sekwencję aminokwasowa przedstawioną na Id. Sekw. nr 2 zawierającą zamianę konserwatywnego aminokwasu wybraną z grupy składającej się z zamiany glicyny na alaninę lub zamiany kwasu asparaginowego na kwas glutaminowy.
  11. 11. Rekombinowany wektor obejmujący wyizolowany polinukleotyd określony w zastrz. od 1 do 6.
  12. 12. Rekombinowany wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że jest wektorem pSUZ1 zdeponowanym w szczepie 5715 pod numerem DSM 13263.
  13. 13. Bakteria Corynebacterium stransformowana wektorem określonym w zastrz. 11.
  14. 14. Rekombinowana bakteria Corynebacterium o zwiększonej wewnątrzkomórkowej aktywności transaldolazy, znamienna tym, że zwiększona wewnątrzkomórkowa aktywność jest wynikiem nadmiernego wyrażania polinukleotydu określonego w zastrz. 1-6.
  15. 15. Sposób wytwarzania L-aminokwasów, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:
    a) hodowlę fermentacyjną bakterii określonej w zastrz. 14, w pożywce w celu wytworzenia L-aminokwasów,
    b) akumulację L-aminokwasów w pożywce lub w komórkach bakterii,
    c) izolację L-aminokwasów.
  16. 16. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że L-aminokwas jest wybrany z grupy składającej się z L-iizyny, L-treoniny, L-izoleucyny albo L-tryptofanu.
  17. 17. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że L-aminokwasem jest L-lizyna i jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:
    a) genu dapA kodującego syntazę dihydrodipikolinainową,
    b) genu lysC kodującego kinazę asparaginianową niewrażliwą na sprzężenie zwrotne,
    c) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,
    d) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,
    e) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłaczanowo-chinonową,
    f) genu tkt kodującego transketolazę,
    g) genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu,
    h) genu zwf kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,
    i) genu lysE kodującego białko odpowiedzialne za eksport lizyny,
    j) genu eno kodującego enolazę, jest w tym samym czasie nadmiernie wyrażany.
  18. 18. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że L-aminokwasem jest L-treonina i jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej się z:
    a) genu hom kodującego dehydrogenazę homoserynową z allelu homdr, który koduje dehydrogenazę homoserynową niewrażliwą na sprzężenie zwrotne,
    b) genu gap kodującego dehydrogenazę gliceroloaldehydo-3-fosforanową,
    c) genu pyc kodującego karboksylazę pirogronianową,
    d) genu mqo kodującego oksydoreduktazę jabłczanowo-chinonową,
    e) genu tkt kodującego transketolazę,
    f) genu gnd kodującego dehydrogenazę 6-fosfoglukonianu,
    g) genu zwf kodującego dehydrogenazę glukozo-6-fosforanu,
    i) genu thrE kodującego białko odpowiedzialne za eksport treoniny,
    j) genu eno kodującego enolazę, jest w tym samym czasie nadmiernie wyrażany.
  19. 19. Sposób według zastrz. 15, znamienny tym, że jeden lub więcej genów wybranych z grupy składającej sie z:
    a) genu pck kodującego karboksykinazę fosfoenolopirogronianową,
    b) genu pgi kodującego izomerazę glukozo-6-fosforanową,
    c) genu poxB kodującego oksydazę pirogronianową, jest w tym samym czasie atenuowany.
PL346500A 1999-07-09 2000-07-05 Polinukleotyd z bakterii Corynebacterium kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy, polipeptyd, rekombinowany wektor, bakteria i rekombinowana bakteria Corynebacterium oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów PL202843B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US14291599P 1999-07-09 1999-07-09
US09/531,266 US6797509B1 (en) 1999-07-09 2000-03-20 Nucleotide sequences which code for the tal gene

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL346500A1 PL346500A1 (en) 2002-02-11
PL202843B1 true PL202843B1 (pl) 2009-07-31

Family

ID=26840528

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL346500A PL202843B1 (pl) 1999-07-09 2000-07-05 Polinukleotyd z bakterii Corynebacterium kodujący aktywność enzymatyczną transaldolazy, polipeptyd, rekombinowany wektor, bakteria i rekombinowana bakteria Corynebacterium oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów

Country Status (18)

Country Link
US (3) US6797509B1 (pl)
EP (1) EP1109915B2 (pl)
JP (1) JP2003504066A (pl)
KR (1) KR100731524B1 (pl)
CN (1) CN1317050A (pl)
AT (1) ATE304596T1 (pl)
AU (1) AU768599B2 (pl)
BR (1) BRPI0006915B8 (pl)
CA (1) CA2348448A1 (pl)
DE (1) DE60022612T3 (pl)
ES (1) ES2249293T5 (pl)
HU (1) HUP0104450A3 (pl)
ID (1) ID29968A (pl)
MX (1) MXPA01002412A (pl)
PL (1) PL202843B1 (pl)
RU (1) RU2001108535A (pl)
SK (1) SK3022001A3 (pl)
WO (1) WO2001004325A1 (pl)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6822084B1 (en) * 1999-06-25 2004-11-23 Basf Aktiengesellschaft Corynebacterium glutamicum genes encoding stress, resistance and tolerance proteins
US7270984B1 (en) * 1999-06-25 2007-09-18 Basf Aktiengesellschaft Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum
WO2001021774A1 (fr) * 1999-09-21 2001-03-29 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Nouveau gene transaldolase
DE19947791A1 (de) * 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
US6713289B2 (en) 1999-10-05 2004-03-30 Degussa Ag Nucleotide sequences which code for the eno gene
DE19959328A1 (de) * 1999-12-09 2001-06-13 Degussa Neue für das zwa1-Gen codierende Nukleotidsequenzen
AU2001285878A1 (en) * 2000-09-12 2002-03-26 Degussa A.G. Nucleotide sequences which code for the roda gene
AU2001287682A1 (en) * 2000-09-12 2002-03-26 Degussa A.G. Nucleotide sequences coding for the ftsx gene
DE10046625A1 (de) * 2000-09-20 2002-04-11 Degussa Neue für das ndkA-Gen kodierende Nukleotidsequenzen
US20030017554A1 (en) * 2000-11-15 2003-01-23 Mechthild Rieping Process for the fermentative preparation of L-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family
WO2003008613A2 (en) * 2001-07-18 2003-01-30 Degussa Ag Process for the preparation of l-amino acids using strains of the enterobacteriaceae family which contain an enhanced soda gene
DE60231333D1 (de) * 2001-12-03 2009-04-09 Kyowa Hakko Kogyo Kk Mutierte 6-phosphogluconat-dehydrogenase
DE10219714A1 (de) * 2002-05-02 2003-11-27 Holland Sweetener Co Verfahren zur mikrobielien Herstellung von aromatischen Aminosäuren und anderen Metaboliten des aromatischen Aminosäurebiosyntheseweges
DE102004003410A1 (de) * 2004-01-23 2005-08-25 Degussa Ag Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
US8647642B2 (en) 2008-09-18 2014-02-11 Aviex Technologies, Llc Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment
KR101335853B1 (ko) 2011-12-01 2013-12-02 씨제이제일제당 (주) Ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 동시에 생산하는 미생물 및 이를 이용한 ｌ-아미노산 및 리보플라빈을 생산하는 방법
IN2014MN01298A (pl) * 2011-12-21 2015-07-03 Cj Cheiljedang Corp
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria

Family Cites Families (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5835197A (ja) 1981-08-26 1983-03-01 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd プラスミドｐｃｇ２
US4601893A (en) 1984-02-08 1986-07-22 Pfizer Inc. Laminate device for controlled and prolonged release of substances to an ambient environment and method of use
GB2165546B (en) 1984-08-21 1989-05-17 Asahi Chemical Ind A plasmid containing a gene for tetracycline resistance and dna fragments derived therefrom
JPH0655149B2 (ja) 1985-03-12 1994-07-27 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―リジンの製造法
JPH03147791A (ja) 1989-11-01 1991-06-24 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド
JPH03147792A (ja) 1989-11-01 1991-06-24 Mitsubishi Petrochem Co Ltd 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド
DE4027453A1 (de) 1990-08-30 1992-03-05 Degussa Neue plasmide aus corynebacterium glutamicum und davon abgeleitete plasmidvektoren
DE69133389T2 (de) 1990-09-27 2005-06-02 Invitrogen Corp., Carlsbad Direkte Klonierung von PCR amplifizierten Nukleinsäuren
US5693781A (en) 1991-06-03 1997-12-02 Mitsubishi Chemical Corporation Promoter DNA fragment from coryneform bacteria
JP3473042B2 (ja) 1992-04-28 2003-12-02 味の素株式会社 変異型アスパルトキナーゼ遺伝子
DE4440118C1 (de) 1994-11-11 1995-11-09 Forschungszentrum Juelich Gmbh Die Genexpression in coryneformen Bakterien regulierende DNA
DE19548222A1 (de) 1995-12-22 1997-06-26 Forschungszentrum Juelich Gmbh Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Aminosäuren durch gesteigerte Aktivität von Exportcarriern
JPH09224661A (ja) 1996-02-23 1997-09-02 Mitsubishi Chem Corp グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ
JPH09224662A (ja) 1996-02-23 1997-09-02 Mitsubishi Chem Corp ６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼおよびそれをコードするｄｎａ
JP3147791B2 (ja) 1996-10-22 2001-03-19 住友金属工業株式会社 センサー追従装置
JPH10229891A (ja) 1997-02-20 1998-09-02 Mitsubishi Rayon Co Ltd マロン酸誘導体の製造法
DE19831609B4 (de) 1997-10-04 2009-11-12 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren der Aspartat- und/oder Glutamatfamilie und im Verfahren einsetzbare Mittel
KR20070087093A (ko) 1999-06-25 2007-08-27 바스프 악티엔게젤샤프트 탄소 대사 및 에너지 생산과 관련된 단백질을 코딩하는코리네박테리움 글루타미쿰 유전자
US7270984B1 (en) * 1999-06-25 2007-09-18 Basf Aktiengesellschaft Polynucleotides encoding a 6-phosphogluconolactonase polypeptide from corynebacterium glutamicum
ID29569A (id) * 1999-07-09 2001-09-06 Degussa Ag Cs Urutan nucleotida yang menyandi gen opca
DE19941478A1 (de) 1999-09-01 2001-03-08 Degussa Neue für das thrE-Gen codierende Nukleotidsequenzen und Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Threonin mit coryneformen Bakterien
DE19947791A1 (de) 1999-10-05 2001-04-12 Degussa Neue für das eno-Gen codierende Nukleotidsequenzen
DE19950409A1 (de) 1999-10-20 2001-04-26 Degussa Neue für das pck-Gen codierende Nukleotidsequenzen
DE19951975A1 (de) 1999-10-28 2001-05-03 Degussa Neue für das poxB-Gen codierende Nuleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド

Also Published As

Publication number Publication date
JP2003504066A (ja) 2003-02-04
ID29968A (id) 2001-10-25
ES2249293T5 (es) 2014-09-17
US20110117611A1 (en) 2011-05-19
MXPA01002412A (es) 2003-09-10
DE60022612T2 (de) 2006-06-29
BRPI0006915B8 (pt) 2021-05-25
CN1317050A (zh) 2001-10-10
US6797509B1 (en) 2004-09-28
DE60022612D1 (de) 2005-10-20
HUP0104450A3 (en) 2003-09-29
WO2001004325A1 (en) 2001-01-18
US7901913B2 (en) 2011-03-08
CA2348448A1 (en) 2001-01-18
BR0006915B1 (pt) 2014-02-25
AU6822000A (en) 2001-01-30
KR20010086395A (ko) 2001-09-10
ES2249293T3 (es) 2006-04-01
US20040214219A1 (en) 2004-10-28
EP1109915A1 (en) 2001-06-27
BR0006915A (pt) 2001-07-31
RU2001108535A (ru) 2003-06-20
EP1109915B2 (en) 2014-05-28
PL346500A1 (en) 2002-02-11
HUP0104450A2 (hu) 2002-04-29
DE60022612T3 (de) 2014-10-30
US8445241B2 (en) 2013-05-21
KR100731524B1 (ko) 2007-06-25
AU768599B2 (en) 2003-12-18
ATE304596T1 (de) 2005-09-15
EP1109915B1 (en) 2005-09-14
SK3022001A3 (en) 2002-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8445241B2 (en) Process for the preparation of L-amino acids
US7262036B2 (en) Process for the preparation of l-amino acids
PL206384B1 (pl) Izolowany polinukleotyd z bakterii maczugowatych i izolowany polinukleotyd o sekwencji komplementarnej, ich zastosowanie, zawierające je wektor i bakteria oraz sposób wytwarzania L-aminokwasów
US6759218B2 (en) Nucleotide sequences coding for the glbO gene
US6939695B2 (en) Nucleotide sequences which code for the rpsL gene
US6924134B2 (en) Nucleotide sequences which code for the gorA gene
US6806068B1 (en) Nucleotide sequences which encode the pfk gene
US6830921B2 (en) Nucleotide sequences which code for the ACP gene
US20020040129A1 (en) Nucleotide sequences encoding the glk-gene
KR20010051876A (ko) ｐｆｋＡ 유전자를 암호화하는 신규한 뉴클레오타이드 서열
US20020042107A1 (en) Nucleotide sequences which code for the fadD15 gene
US20020106750A1 (en) Nucleotide sequences which code for the def gene
US6987015B1 (en) Nucleotide sequences encoding the pfkA gene
US20040092710A1 (en) Nucleotide sequences coding for the cdsA gene
US6638753B2 (en) Nucleotide sequences which code for the cma gene
US20020155555A1 (en) Nucleotide sequences which code for the pgsA2 gene
KR20020097245A (ko) ｃｄｓＡ 유전자를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열
ZA200101703B (en) Nucleotide sequences for the tal gene.