JPH03147792A - 新規ｄｎａ及び該ｄｎａを含有するプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規なりＮＡに関し、更に詳しくは、コリネ型
細菌細胞内でプロモーターとして機能する新規なりＮＡ
、及び該ＤＮＡを含有するコリネ型細菌細胞内で自律増
殖可能なプラスミドに関する。

ブレビバクテリウム属細菌を含むコリネ型細菌は、アミ
ノ酸、有機酸、プリンヌクレオチド等を゛生産する工業
的に有用な微生物であるが、組換えＤＮＡ技術の導入に
よる苗株の育種改良は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）等に比べて遅れている。特
に、挿入された有用遺伝子の発現のために必要なプロモ
ーターの構造についてはこれまで明らかにされておらず
、コリネ型細菌を宿主として用いて有用遺伝子を発現さ
せようとする場合にはかなり問題となっている。

一般に、プロモーターの構造に関しては、エシェリヒア
・コリ及びバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｕｓ　５
ｕｂｔｉｒｉｓ）由来のプロモーターが最もよく知られ
ており、該プロモーターの特徴的な塩基配列は既に報告
されている。それらは転写産物であるメツセンジャーＲ
ＮＡの開始点から上流のｌＯ塩基付近及び３５塩基対付
近に見られる塩基配列であり、ＲＮＡポリメラーゼの種
類に依存して、例えば以下に示す配列となっている。

コリネ型細菌では、前述のようにプロモーターの構造に
関する知見が極めて少なく、まｔ；、上記エシェリヒア
・コリ及びバチルス・サブチリスのプロモーターがコリ
ネ型細菌内で効率良く発現するかについては未だ不明で
ある。

従って、本発明の主たる目的は、有用遺伝子をコリネ型
細菌内で確実に発現せしめるような新規プロモーターを
創製することである。

以上の問題点に対して、本発明者らは鋭意研究した結果
、今回ＴＡＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と、該塩
基配列（ａ）の１５〜２０塩基対下流のＴＡＴＡＡＴで
示される塩基配列（ｂ）とを有することを特徴とするコ
リネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能するＤＮＡ
断片（ｃ）を創製し、このＤＮＡ断片（ｃ）を、コリネ
型細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクター
プラスミドに組み込み、該ベクタープラスミドをコリネ
型細菌内に導入することにより上記ＤＮＡ断片（ｃ）が
コリネ型細菌内でプロモーターとして機能することを見
い出し、本発明を完成するに至った。

かくして、本発明により提供されるＴＡＧＡＣＡで示さ
れる塩基配列（ａ）と、該塩基配列（ａ）の１５〜２０
塩基対下流のＴＡＴＡＡＴで示される塩基配列（ｂ）を
有するコリネ型細菌内でプロモーターとして機能するＤ
ＮＡ断片（ｃ）は、全長が５０〜ｌＯＯ塩基対より構成
され、両末端に制限酵素の認識部位を有し、その塩基配
列は、ＴＡＧＡＣＡで示される配列（ａ）の１５〜２０
塩基対、好ましくは１７〜１８塩基対下流にＴＡＴＡＡ
Ｔで示される配列（ｂ）を有する限り特に制限されるも
のではなく、上記した塩基配列（ａ）及び塩基配列（ｂ
）並びにその位置関係以外の部分はいかなる配列を有し
ていても良い。このＤＮＡ断片（ｃ）は、通常用いられ
るＤＮＡ合或合成、例えば、ベックマン社製Ｓ　ｙｓｔ
ｅｍ　−Ｉ　Ｐｌｕｓを用いて合成することができる。

一方、上記ＤＮＡ断片（ｃ）が組み込まれる「コリネ型
細菌内で自律増殖可能なプロモーター検出用ベクタープ
ラスミド」としては、例えば、コリネ型細菌内で自律増
殖可能なりＮＡ断片（ｅ）と、プロモーターが欠失して
いる発現されるべき遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｄ）とも
保有するプラスミドが包含される。

コリネ型細菌内で自律増殖可能なりＮＡ断片（ｅ）は、
コリネ型細菌内で自律増殖可能なものである限り特に制
限はなく、要はプラスミドの複製開始点を有するＤＮＡ
断片であればよく、複製開始点以外のＤＮＡを含有する
ものであっても特に問題はない。このＤＮＡ断片（ｅ）
の具体例としては、例えば、ブレビバクテリウム・スタ
チオニス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔａｔｉ
ｏｎｉｓ）　Ｉ　Ｆ　Ｏｌ　２１４４（ＦＥＲＭ　　Ｂ
Ｐ−２５１５）由来のｐＢＹ５０３プラスミドを制限酵
素Ｋ　ｐｎ　Ｉで切り出すことによって得られる約６ｋ
ｂのＤＮＡ断片が挙げられる。

また、プロモーターが欠失している発現されるべき遺伝
子を含むＤＮＡ断片（ｄ）としては、コリネ型細菌、エ
シェリヒア属細菌、シュードモナス属ｍＷ等の微生物起
源のものであってもよく、或いは動物又は植物起源のも
のであってもよい。

また、発現されるべき遺伝子産物は、酵素、ペプチド、
蛋白質等である。具体的には、例えば、エシェリヒア・
コリのトランポゾンＴｎ９由来のクロラムフェニコール
アセチルトランスフェラーゼ（ｃＡＴ）遺伝子を、プロ
モーター機能の評価として用いるＤＮＡ断片（ｄ）とし
て挙げることができる。

なおプロモーター検出用ベクタープラスミドには、必要
に応じて、選択マーカーとなる抗生物質耐性を発現する
遺伝子等を更に挿入することができる。

以上に述べた本発明のＤＮＡ断片（ｃ）と、発現される
べき遺伝子を含むＤＮＡ断片（ｄ）及びコリネ型細菌内
で自律増殖可能なりＮＡ断片（ｅ）等から、コリネ型細
菌内で自律増殖可能なプラスミドは、例えば、以下に述
べる方法で構築することができる。

基本プラスミドとして、コリネ型細菌内で機能するカナ
マイシン耐性遺伝子を担うプラスミドｐ）（ＳＧ２９８
　（宝酒造製）を用いる。このプラスミドＩ）ＨＳＧ２
９８を制限酵素ＨｉｎｄｌｌＩによって開裂させ、その
部位に前記したプロモーター機能の評価に用いることが
できるＤＮＡ断片（ｄ）を連結酵素処理により結合させ
る。次に、このプラスミドを制限酵素Ｋｐｎｌによって
開裂させ、さの部位に前記したコリネ型ｍ苗内で自律増
殖可能なりＮＡ断片（ｅ）を連結酵素処理により結合さ
せ、プロモーター検出用ベクタープラスミドが創製でき
る。さらに、このプロモーター検出用プラスミドベクタ
ーを制限酵素ＢａｍＨＩによって開裂させ、その部位に
前記した合皮ＤＮＡ断片（ｃ）を連結酵素処理によって
結合させ、本発明のプラスミドを溝築することができる
。

得られるプラスミドが導入される宿主としては、コリネ
型細菌、殊にブレビバクテリウム・７ラバムＢｒｅｖｉ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａｖｕｍ　　Ｍ　Ｊ　−２３
３（Ｆ　ＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）由来菌株を挙げる
ことができる。

本発明のプラスミドの導入に際して、ブレビバクテリウ
ム・フラバムＭＪ−２３３由来菌株を宿主として用いる
場合には、本菌株が保有するプラスミドｐＢＹ５０２（
特開昭６３−３６７８７号明細書参照）の存在により形
質転換が困難になる場合があるので、そのような場合に
は、本菌株より上記プラスミドｐＢＹ５０２を除去する
ことが望ましい。そのようなプラスミドを除去する方法
としては、例えば、継代培養を繰り返すことにより自然
に失わすことも可能であるし、人為的に除去することも
可能である［Ｂａｃｔ、　Ｒｅｖ、、　３６．３６１〜
４０５　（１９７２）参照１゜ プラスミドを人為的に除去する方法の一例を具体的に示
せば以下のとおりである。

宿主ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３の生育
を不完全に阻害する濃度のアクリジンオレンジ（濃度：
０．２〜５０周／ｍ１２）もしくはエチジウムプロミド
（濃度二〇、２〜５０趨／＋１１２）等を含む培地に、
１ｆｆＩＱ当り約ｌＯ細胞になるように植菌し、生育を
不完全に阻害しながら、約２４時間３５℃で培養する。

培養液を希釈後寒天培地に塗布し、３５℃で約２日培養
する。出現したコ口二一から各々独立にプラスミド抽出
操作を行ない、プラスミドが除去されている株を選択す
る。

この操作によりｐＢＹ５０２が除去されたブレビバクテ
リウム・７ラバムＩＶｆＪ−２３３由来株が得られる。

また、本発明プラスミドの上記の如きコリネ型細菌内へ
の導入は、それ自体既知の方法、例えば、Ｃａ１ｖｉｎ
、　Ｎ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｈａｎａｗａｌｔ、　Ｐ、Ｃ，
、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　
　１７０　、２７９６　（１９８８）；１ｏｏ、　Ｋ、
、　Ｎ１５ｈｉｄａ、　Ｔ、　ａｎｄ　Ｉｚａｋｉ、　
Ｋ、、　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　５２　ｓ　２９
３（１９８８）等の文献に記載の方法により、例えば宿
主微生物にパルス波を通電することにより行なうことが
できる。

次に実施例により本発明をさらに具体的に説明する。し
かしながら、下記の実施例は本発明について具体的な認
識を得る一助としてのみ挙げたものであり、これによっ
て本発明の範囲は何ら限定されるものではない。

実施例１ プロモーター検出用ベクタープラスミドｐＰ　Ｒ３の遺
戒 （Ａ）プラスミドｐＢＹ５０３の調整ニブラスミドｐＢ
Ｙ５０３は、ブレビバクテリウム・スタチオニス（Ｂｒ
ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　５ｔａｔｉｏｎｉｓ）ＩＦ
Ｏ１２１４４［昭和６３年７月１８日工業技術院微生物
工業技術研究所に寄託（微工研条寄第２５１５号）］か
ら新たに分離された分子量的ｌＯメガダルトンのプラス
ミドであり、特開平１−９５７８５号明細書に記載のプ
ラスミドである。

プラスミドｐＢＹ５０３は次のようにして調製しｔこ　
。

半合成培地Ａ培地［尿素２　ｇ　％　（Ｎ　Ｈ４）２　
Ｓ　Ｏ４７ｇ、に！ＨＰＯ４０，５ｇ、ＫＨｚＰＯ４０
，５ｇ。

Ｍ　ｇ　Ｓ○、Ｑ、５ｇ、ＦｅＳＯ４−７ＨｊＯ５ｍｇ
、ＭｎＳ　０４４〜６　Ｈ２ｏ　　６　Ｑ、酵母エキス
２．５ｇ。

カザミノ酸５ｇｓ　ビチオン２００ｐｇ、塩酸チアミン
２００μｇ１グルコース２０ｇ１純水！（Ｎ１１２で、
ブレビバクテリウム・スタチオニスＩＦ０１２１４４を
対数増殖期後期まで培養し、菌体を集めた。得られた菌
体を１０■／−の濃度でリゾチームを含む緩衝液［２５
ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＥＤＴＡ。

５０ｍＭグルコース］　２０−に懸濁し、３７℃で１時
間反応させた。反応液にアルカリ−５ＤＳ液（０，２Ｎ
　　ＮａＯＨ，１％（ｖ／ｖ）ＳＤＳＩ　４０＋ｎ１２
を添加し、緩やかに混和して室温にて１５分間静置した
。

次に、この反応液に酢酸カリウム溶液［５Ｍ酢酸カリウ
ム溶液６０ｍ１２、酢酸１１．５ｍ＋２、純水２８．５
−の混合液１３０−を添加し、充分混和してから氷水中
に１５分間静置した。

溶曹物全量を遠心管に移し、４℃で１０分間、１５、ｏ
ｏＯＸｇの遠心分離にかけ、上澄液を得た。

これに等量のフェノール−クロロホルム液（フェノール
／クロロホルムｌ／１混和液）を加え懸濁後、遠心管に
移し、室温下で５分間、１５．０００×ｇの遠心分離に
かけ、水層を回収した。氷層に２倍量のエタノールを加
え、−２０℃で１時間静置後、４℃で１０分間、１５．
ｏｏＯＸｇの遠心分離にかけ、沈澱を回収した。

沈澱を減圧乾燥後、ＴＥ緩衝液［トリスｌｏｍＭ。

ＥＤＴＡ、　・１ｍＭ、Ｈ（１２にてｐＨ−８，０に調
整］２−に溶解した。溶解液に塩化セシウム溶液［５倍
濃度のＴＥ緩衝液工Ｏ〇−に塩化セシウム１７０ｇを溶
解］１５ｍ１２とｌＯ■／−エチジウムブロマイド溶液
ｌ−を加えて、密度を１．３９２ｇ／−に合わせた。こ
の溶液を１２℃で４２時間、１１６、ｏｏｏＸｇの遠心
分離を行なった。

プラスミドｐＢＹ５０３は紫外線照射により遠心管内で
下方のバンドとして見い出される。このバンドを注射器
で遠心管の側面から抜きとることにより、プラスミドｐ
ＢＹ５０３を含む分画液を得た。

次いでこの分画液を等量のイソアミルアルコールで４回
処理してエチジウムブロマイドを抽出除去し、その後Ｔ
Ｅ緩衝液に対して透析を行なった。

このようにして得られたプラスミドｐＢＹ５０３を含む
透析液に３Ｍ酢酸ナトリウム溶液を最終濃度３０ｍＭに
添加した後、２＠量のエタノールを加え、−２０°Ｃ１
時間靜置した。この溶液を１５゜０００Ｘｇの遠心分離
にかけてＤＮＡを沈降させ、プラスミドｐＢＹ５０３を
約５０μｇ得た。

（Ｂ）プラスミドｐＨ５Ｇ２９８とプロモーターの欠失
したクロラムフェニコール耐性遺伝子の準備ニ グラスミドｐＨ５Ｇ２９８は、エシェリヒア・コリ内で
複製し、カナマイシン耐性を発現する分子量的１．７メ
ガダルトンのプラスミドであり、市販品として宝酒造よ
り購入可能である。

一方、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラー
ゼ（ｃＡＴ）ＧａｎＢｌｏｃｋは、プロモーターの欠失
したトランスポゾンＴｎ９由来のＣＡＴ遺伝子を有する
分子量的０．５メガダルトンのＤＮＡ断片であり、市販
品としてファルマシアジャパンより購入可能である。

（ｃ）グラスミドｐＨ５Ｇ２９８ｃａｔの遺戒ニブラス
ミド、）Ｈ３Ｇ２９８（宝酒造製）２μｇに制限酵素Ｈ
１ｎｄｌＩ［（ｌ　ｕｎｉｔｓ）を３７℃で３０分間反
応させ、プラスミドＤＮＡを部分分解した。

このＤＮＡ分解物とＣＡ　Ｔ　Ｇ　ｅｎＢ　１ｏｃｋを
混合し、制限酵素を不活化するために６５６０で１０分
間加熱処理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度とし
て各々５０ｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇ
ＣＱ、、１０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及
びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し
、１６℃で１５時間保温した。この溶液を用いてエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９コンピテントセル（宝酒造製）
を形質転換した。

形質転換株は３０℃ｇ／−（最終濃度）のクロラムフェ
ニコール、ｌＯＯμｇ／−（最終１１＆）ＩＰＴＧ（イ
ソグロピルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、１００μ
ｇ／ｍ１２（最終濃度）Ｘ−ｇａＱ（５−７’ロモー４
−クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
）を含むＬ培地（トリプトンｌ　Ｏｇ　ｓ酵母エキス５
ｇ、ＮａＣＱ５ｇ１純水ＩＩ２、ｐＨ７，２）で３７℃
にて２４時間培養し、生育様として得られた。これら生
育様の、プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［Ｔ　、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ＊　Ｅ　。

Ｆ　、Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ、　　Ｊ　、　　Ｓａａ＋ｂｒ
ｏｏｋ；　　“Ｍｏ１ｅｃｕｆａｒ　　ｃｌｏｎｉｎｇ
　　（１９８２）９０〜９１参照］により抽出した。

ＣＡ　Ｔ　ＧｅｎＢ　１ｏｃｋが正しく挿入されている
ことを制限酵素Ｈｉｎｄｌｌ［、ＥｃｏＲＩおよびＫ　
ｐｎ　Ｉによって切断されるＤＮＡ断片の大きさによっ
て確認し、このプラスミドをｐＨ５Ｇ２９８ｃａｔと命
名した。

（Ｄ）プロモーター検出用ベクタープラスミドｐｐ　Ｒ
３の遺戒： 上記（ｃ）項で得たプラスミドｐＨ３Ｇ２９８ｃａｔＯ
，５μｇに制限酵素Ｋ　ｐｎ　Ｉ　　（５ｕｎｉｔｓ）
を３７　’０１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを完全
に分解した。

前記（Ａ）項で調製したプラスミドｐＢＹ５０３　０．
５ｑに制限酵素Ｋ　ｐｎ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を３７
００で１時間反応させ、プラスミドＤＮＡを完全に分解
した。

両者のプラスミドＤＮＡ分解物を混合し、制限酵素を不
活化するｔ；めに６５℃で１０分間加熱処理した後、該
失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０１１Ｍトリ
ス緩衝液ｐＨ７，６、ｌＯｍＭＭｇＣａ、、１０ｍＭジ
チオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕ
ｎｉｔになるように各成分を強化し、１６℃で１５時間
保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭ１
０９コンピテントセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０Ｉｉｇ／ｍｌ！（最終濃度）のカナマ
イシン、１００μｇ／ｍ１２　（最終濃度）ＩＰＴＧ（
イングロビルーβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）、１００
μｇ／ｍＱ（最終濃度）Ｘ−ｇａＱ（５−プロモー４−
クロロ−３インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）
を含むＬ培地（トリプトン１０ｇ１酵母エキス５　ｇ、
　ＮａＣｆｆ　５　ｇ−純水１１２．ｐＨ７゜２）で３
７℃にて２４時間培養し、生育様として得られた。これ
ら生育様のうち、白いコロニーで生育して来たものを選
択し、各々プラスミドをアルカリ−３ＤＳ法［Ｔ　、　
Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ　、　Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃ
ｈ、　　Ｊ　、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ；　“Ｍｏ１ｅｃｕ
ｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８２）９０〜９１参照］
により抽出した。

（Ｅ）複合プラスミドのコリネ型細菌への形質転換： 形質転換には電気パルス法を用いた。ブレビバクテリウ
ム・７ラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｌａ
ｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）
プラスミド除去様を１００−の前記Ａ培地で対数増殖期
初期まで培養し、ペニシリンＧを１ユニット／−になる
ように添加し、さらに２時間振盪培養し、遠心分離によ
り菌体を集め、菌体を２０ｍ１２のパルス用溶液［２７
２ｍＭ　５ｕｃｒｏｓｅ、７ｍＭ　ＫＨ，Ｐｏ。

１　ｍＭ　ＭｇＣ（ｈ　：　ｐＨ７−４］にて洗浄する
。さらに菌体を遠心分離にて集め、５ｍ＋２のパルス用
溶液ｔこ懸濁し、０．７５−の細胞と前記（Ｄ）項で得
られたＤＮＡ＃液５０−を混合し、水中にて２０分間静
置する。シーンパルサー（バイオラド社製）を用いて、
２５００ポルト、２５μＦＤに認定し、パルスを印加後
水中に２０分間静置する。全量を３ｍ１２の前記Ａ培地
に移し３０°Ｃにて１時間培養後、カナマイシン５０ｓ
／ｍｄ（最終濃度）を含む前記Ａ寒天培地に種薯し３０
℃で２〜３日間培養する。

出現しｔ；カナマイシン耐性株より、上記（Ａ）項に記
載の方法を用いてプラスミドを得た。このプラスミドを
各種制限酵素で切断し分子量を測定した。その結果を下
記表１に示す。

表　　　１ ＢａｍＨＩ　　　　　　１　　　　６．１（９，４）Ｋ
ｐｎＩ　　　　　　　２　　　　３．９（６，０）、２
．２（３，４）Ｓ　ａｃ　Ｉ　　　　　　　１　　　　
　６．１（９，４）上記制限酵素により特徴づけられる
プラスミドを“ｐＰＲ３”と命名した。

実施例２ 合成プロモーターのｐＰＲ３への導入：プロモーターは
ＤＮＡ合成装置（Ｂ　Ｅ　ＣＫＭＡＮ　　Ｓ　ｙｓｔｅ
ｍ　Ｉ　Ｐ　１ｕｓ）を用いて合成した（その両末端が
ＢａｍＨＩ断片になるようにした）。そのＤＮＡ断片の
塩基配列を下記に示す。

ｎ　　　　　　　　　　ｒｍ ＧＡＴＣＣＣＧＡＡＡＣＴＡＧＡＣＡＡＧＡＡＣＣＣＡ
ＡＡＡＡＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＴＴＴＡＧＧＧＣＴＴＴ
ＧＡＴＣＴＧＴＴＣＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＡ
ＴＡＴＴＡＡＡＴＣＣ丁ＡＧ実施例１で調製したプラス
ミドｐＰＲ３０，５周に制限酵素Ｂ　ａｍＨＩ　（５ｕ
ｎｉｔｓ）を３７℃で１時間反応させ、プラスミドＤＮ
Ａを完全に分解した。

上記合成プロモーターＤＮＡとプラスミドＤＮＡ解物を
混合し、制限酵素を不活化するために６５℃で１０分間
加熱処理した後、該失活溶液中の成分が最終濃度として
各々５０ｆｆＩＭトリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌ　ＯｍＭ
　　ＭｇＣ（１，，１，０ｍＭジチオスレイトール、１
ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔｓになるよ
うに各成分を強化し、１６℃で１５時間保温した。この
溶液を用いてエシェリヒア・コリＨＢＩＯＩコンピテン
トセル（宝酒造製）を形質転換した。

形質転換株は５０／４ｒ／ｄ（最終濃度）のカナマイシ
ンを含むＬ培地（トリプトン１０）、酵母エキス５Ｉ、
ＮａＣα５１．純水１１２　、　ｐＨ７，２）で３７℃
にて２４時間培養し、生育株として得られた。これら生
育株のプラスミドをアルカリ−５ＤＳ法［Ｔ、　Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ、　Ｅ、Ｆ　、　Ｆ　ｒｉｔｓｃｈ、　Ｊ　
。

Ｓ　ａｍｂｒｏｏｋ　；　　“Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ａ
ｔｏｎｉｎｇ　　（１９８２）９０〜９１参照］により
抽出した。

得られたプラスミドは実施例１の（Ｅ）項に記載の方法
に従い、ブレビバクテリウム・フラバムＭＪ−２３３株
（ＦＥＲＭ　　ＢＰ−１４９７）プラスミド除去様へ形
質転換し、実施例１の（Ａ）項に記載の方法を用いてプ
ラスミドを抽出した。

このグラスミドの制限酵素Ｂ　ａｍＨＩ　ＳＫ　Ｉ’ｎ
　Ｉ　ｓＳ　ａｃ　Ｉ等の制限酵素による切断パターン
によってｐＰＲ３に合＋ｆｆ１ＤＮＡが組み込まれてい
ることを確認し、このプラスミドを“ｐＰＲ３ＢＴ２”
と命名した。

実施例３ 合成プロモーター強度の測定： 実施例２でｐＰ　Ｒ３に挿入したプロモーターの強度を
、りａラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（
ｃＡＴ）の活性を測定することによって調べた。

ｐＰ　Ｒ３を保有するブレビバクテリウム　フラバムＭ
Ｊ−２３３株とｐＰＲ３ＢＴ２を保有するブレビバクテ
リウム・フラバムＭＪ−２３３株をそれぞれ、実施例１
の（Ａ）項に記載の半合成培地Ａにカナマイシンを５０
μｇ／ｌ１１１２加えた培地１０ｍ１２の入った試験管
で一晩前培養し、その培養液を上記の培地１００−の入
った三角フラスコで約６時間培養後集菌し、活性測定に
用いｔ；。ＣＡＴの活性はＷ、Ｖ、Ｓｈａｗらの方法［
Ｊ　、　Ｂ　ａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＪａｎ、　（１９
６８）　２８〜３６参照］により測定した。その結果、
ｐＰＲ３ＢＴ２を有するＭＪ−２３３株は、プロモータ
ーの挿入されていないｐＰＲ３を有するＭＪ−２３３株
の約１４倍のＣＡＴ活性をもっていＩ；。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ＴＡＧＡＣＡで示される塩基配列（ａ）と、該塩基
   配列（ａ）の１５〜２０塩基対下流のＴＡＴＡＡＴで示
   される塩基配列（ｂ）とを有することを特徴とするコリ
   ネ型細菌細胞内でプロモーターとして機能するＤＮＡ断
   片（ｃ）。 ２、請求項１記載のＤＮＡ断片（ｃ）と、ＤＮＡ断片（
   ｃ）の下流に直接接続されている発現されるべき遺伝子
   を含むＤＮＡ断片（ｄ）とを保有することを特徴とする
   コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なプラスミド。 ３、コリネ型細菌細胞内で自律増殖可能なプラスミドｐ
   ＢＹ５０３由来のものである請求項２記載のプラスミド
   。 ４、遺伝子（ｄ）が酵素、蛋白質又はペプチドをコード
   する遺伝子である請求項２記載のプラスミド。