JPS62502934A - セリンヒドロキシメチルトランスフェラ−ゼ、テトラヒドロ葉酸及びトリプトファンシンテタ−ゼ叉はトリプトファナ−ゼの存在下における、グリシン、ホルムアルデヒド及びインド−ルからのｌ−トリプトファンの合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ、テトラヒドロ葉酸及びトリプトフ ァンシンテターゼ又はトリプトファナーゼの存在下における、グリシン、ホルム アルデヒド及びインドールからのし一トリプトファンの合成この発明は、グリシ ン、ホルムアルデヒド及びインドールからの酵素的なＬ−）−リプトファンの合 成に関する。

背景技術の記載 Ｌ−トリプトファンはヒトにとっての必須アミノ酸てあり、従って、過食溶液や 他の栄養製剤にとって重要な成分である。さらに、Ｌ−）リプトファンは、例え ばある合成方法の中間体又は出発材料として用いられる商業的に重要な物質であ る。このようにＬ−）リプトファンには需要があり、発酵法、化学合成及び酵素 的合成を包含する種々の製造方法が開発されている。

発酵法の共通の欠点は、長期間発酵させた後であっても、培養液中に生産され回 収されるＬ−）リブトファンの濃度が比較的低いことである。

化学合成によりトリプトファンを製造すると、トリプトファンがＤ及びＬの光学 異性体のラセミ混合物として生産され、又は好ましくないＤ−異性体として生産 される。　Ｄ、　Ｌ混合物を分割すると製品のコストかそれだけ高くなる。

従来、Ｌ−トリプトファンの酵素的な合成は、トリプトファンシンテターゼ又は トリプトファナーゼの存在下てし一セリンとインドールとを反応させることによ って行なわれている。生体内ては、トリプトファンシンテターゼはセリンからト リプトファンを生産するために用いられ、一方、トリプトファナーゼはトリプト ファンを分解してインドールにするために用いられている。

トリプトファンを酵素的に商業規模て生産する場合に、セリンの値段が大きな問 題になる。従って、セリンを出発材料として用いないトリプトファンの製造方法 が存在することか望ましい。

触媒量の補因子、テトラヒドロ葉酸塩 （ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ）の存在下て、酵素「セリンヒドロキシメ チルトランスフェラーゼ」を用いてグリシンとホルムアルデヒドとを縮合させて セリンにする酵素的な方法が１本出願人による米国特許出願第４４２，９６２号 に記載されている。ここにはまた、第２のＳＨＭＴ補因子、ピリドキサール−５ °−フォスフェートをセリン生成反応に有利に加え得ることが記載されている。

この発明の目的は、グリシン、ホルムアルデヒド及びインドールから、単一工程 てＬ−）リプトファンを合成する酵素的方法を提供することである。

発明の概要 この発明によると、Ｌ−）、リプトファンの合成は、生物触媒量の酵素セリンヒ ドロキシメチルトランスフェラーゼ、補因子テトラヒドロ葉酸、及び酵素トリプ トファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼの存在下でグリシン、ホルムアル デヒド及びインドールを反応させることによって達成される。セリンヒドロキシ メチルトランスフェラーゼ、トリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナー ゼは好ましくは、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファ ンシンテターゼ又はトリプトファナーゼをコードする発現ベクターを含有する。

形質転換された微生物の発現物質の形態で反応液中に提供される。

トリプトファンはこのように、セリンを出発物質として用いることなく単一工程 て合成される。この方法は、トリプトファンの水に対する溶解度が小さい（２５ ℃で１１．４ｇ／文、メルクインデックス、第３版ｐ、１２５６゜９４５８）こ とを利用している。従って、トリプトファンは反応溶液から沈殿し、容易に回収 することがてきる。

図面の簡単な説明 第１図は、この発明の方法において用いられるＳＨＭＴの製造を指示するプラス ミド９ＧＸ２２３６及びｐＧＸ２２３７の製造工程を模式的に示す図である。

第２図は、　ＥｅｏＲＩ−３ａｌｌ断片上にｔｒｐＢＡを有するクローニングベ クターであるｐＧＸ２２０８の製造工程を模式的に示す図である。

ターの制御下にある。トリプトファンシンテターゼの発現ベクターであるプラス ミドｐＧＸ２２１３の製造工程を模式％式％ めの発現ベクターであるプラスミドｐＧＸ２２１４の製造工程を模式的に示す図 である。

第５図は、ｔｒｐＢＡ遺伝子がｔｒｐプロモーターの制御下にある、トリプトフ ァンシンテターゼのための発現ベクターであるプラスミドｐＧＸ１５０の製造工 程を模式的に示す図である。

第６図は、　ＳＨＭＴ及びラムダファージエンドリシン酵素の生産を指示するプ ラスミドｐＧＸ２３０２の製造工程を模式的に示す図である。

第７図は、トリプトファナーゼ及びラムダファージエンドリシン酵素の製造を指 示するプラスミドｐＧＸ２：１０８の製造工程を模式的に示す図である。

発明の詳細な記載 この発明は、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（以下、　ＳＨＭＴと いう）、テトラヒドロ葉酸（以下、ＴＨＦという）、及びトリプトファンシンテ ターゼ（以下ＴＳという）又はトリプトファナーゼ（以下、ＴＡＳＥという）の 存在下でグリシン、ホルムアルデヒド及びインドールを反応させることによるＬ −）リブトファンの合成方法に関する。

酵素ＳＨＭＴ、　ＴＳ及びＴＡＳＥは微生物及び高等生物の代謝において重要で ある。従って、これらの酵素の潜在的な供給源は数多い。

セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、この酵素を含む全細胞、粗抽出 物又は生成された酵素の形態で用いることがてきる。全細胞が用いられるならば 、テトラヒドロ葉酸はＳＨＭＴと同一の供給源から得ることがてきる。なぜなら ＴＨＦはＳＨＭＴを含む微生物細胞中に見出されるからである。所望ならば、Ｔ ＨＦを加えてその濃度を上げることかてきる。

ＳＨＭＴは、従来の遺伝子工学技術により、高収率でこれを生産するように修飾 された微生物から得ることができる。スタウファー・ジーら、旺其見：６３−７ ２　（１９８１）を参照のこと。Ｓ）ＩＭＴ遺伝子（１戸）は単離して発現ベク ターにクローニングすることができ、次にこの発現ベクターて適当な宿主細胞を 形質転換して高濃度のＳＨＭＴを生産することがてきる。ベクターはファージで もプラスミドてもよいかプラスミドが好ましい。適当な宿主は、例えば、クレブ シラ、サルモネラ及びニジエリシア属細菌を包含する。

メチオニン代謝を修飾された突然変異微生物もまたＳＨＭＴを過剰生産するであ ろう。スタウファー・ジー・ブイ及びブレンクレイ・ジェイ・イー、Ｇｅｎｅｔ ｉｃｓ　８８：２２１（１９７８）参照のこと。遺伝子クローニング技術を用い ると５酵素活性は２０倍にも増え、酵素濃度は細胞の可溶性タンパク質の１０％ 以上にもなり得る。ＳＨＭＴ遺伝子が天然の供給源から取られた場合には、ラン ダムな突然変異発生により、又は特定部位に向けた突然変異発生により、改良さ れた安定性を有する酵素を生産することがてきる。遺伝子はまた、開示された工 程における酵素の安定性を改善するために複数の変更を付して完全に化学的に合 成することもできる。

ＳＨＭＴ供給源として用いるのに適した修飾微生物は、ＳＨＭＴ（ｇ１３１Ａ） を含むｐＢＲ３２２から話導したプラスミドであるｐＧＸ１２２て形質転換した 大腸菌菌株（ＧＸ１７０３）である。この形質転換株は、イリノイ州ベオリアの ノーザン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリーズにＮＲＲＬＮｏ、Ｂ−１５ ２１５として寄託されている。

類似のプラスミドであるがより小さく、コピー数が多くなるように変更したプラ スミドであるｐＧＸ１３９によって形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌 株（ＧＸ１７０４）がメリーラント州ロックビルのアメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、　３９２１４として寄託されており、ｐＧ Ｘｌ：１９て形質転換されたサルモネラ・チフィムリウム菌株（ＧＸ１６８２） がＡＴＣＣＮｏ、　３９２１５として寄託されている。

我々は、この発明の方法において用いられるＳＨＭＴの供給源として採用される 微生物を形質転換するのに用いられる好ましい発現ベクターを構築した。この好 ましいベクターは、関連するトリプトファンプロモーター−オペレーターと機能 的に連関したトリプトファンオペロンしい発現ベクターの構築は、以下のように して行なうことができる（第１図参照）。例えばｐＧＸｌｌｏ又はｐＥＰ３９２ のようなｔｒｐＥＤＣＢＡオペロンを有するベクターを、トリプトファンオペロ ンと調節領域の外側にある制限部位で開裂し、プラスミドを直線化する。プラス ミドｐＥＰ３９２はエンゲル−バルク・ビー・イーら、江Ｕ旦：６９−８５（１ ９８０）に記載されている。プラスミドｐＧＸ１１０はこの文献に記載きれてい るｐＨＰ１２と実質的に同一である。ｐＧＸｌｌｏとｐＥＰ３９２３の場合には 、トリプトファンオペロンのためのプロモー例えばｐＧＸ１３９のような、ＳＨ ＭＴ（ｇｌｙＡ）遺伝子とその関連する調節配列を有する第２のベクターもまた 、ＳＨＭＴ（ｇｌｙＡ）遺伝子及び調節領域の外側にある制限部位で開裂するこ とによって直線化される。ｐＧＸ１３９の場合には、ＳＨＭＴ（ｇｌｙＡ）遺伝 子のすぐ下流にある単一の５ａｌｌ制限部位が便利な制限部位として働く。２つ の直線化されたプラスミドが次に連結され、その調節領域と機能的に連関したト リプトファンオペロンと、その￥ｔｌｆｆｆｉ領域と機能的に連関したＳＨＭＴ （ｇｌｙＡ）遺伝子とを含む組換えプラスミドか生成される。２つの直線化プラ スミドが相補的末端を有さない場合には（第１図に示される２つの例のように） 、接着末端はＤＮＡポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）の存在下てｄＡＴ Ｐ、ｄＣＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰとの反応により、抜けた部分を埋めて平 滑末端を有するプラスミドをつくり、これを高いＤＮＡ濃度において平滑末端連 結することがてきる。好ましくは、２つのプラスミドはそれぞれトリプトファン オペロン及びｇｌ／Ａ遺伝子の外側に第２の制限部位を有し、これらの部位は、 環化されて不要なりＮＡを除去した所望の組換えプラスミドを形成する、単位長 さの連結産物を形成するために採用することができる。もちろん、これらの部位 は、開裂によりプラスミドの複製を制御するＤＮＡ配列、すなわちそのレプリコ ンを除去するような位置にあってはならない。

第１図に示す２つの例、すなわちｐＧＸ１１Ｇ／ｐＧＸ１３９３及びｐＥＰ３９ ２／ｐＧＸ１３９：ｌては、それぞれのプラスミドは、連結混合物を、最終的な 連結（環化）の前にＥｃｏＲＩて二次的に消化して不所望のＤＮＡ部分を除き、 機能的なｇｌｙＡ遺伝子と機能的なトリプトファンオペロンの両方を有する複製 可能なプラスミド発現ベクターを生成できるような、便利な位置にＥｃｏＲ１部 位を有する。その製造工程を第１図に示す、このように生成された発現ベクター は、ｐＧＸ２２３６及びｐＧＸ２２３７と命名された。ｐＧＸ１１０中ニアンビ シニアンビシリン耐性遺伝子のて、得られた組換え体ｐＧＸ２２３６を含む形質 転換体はアンピシリン耐性である。

プラスミドｐＧＸ２２３［ｉは、ラムダファージエンドリシン遺伝子（入ＲＲｔ ）を挿入することによって修飾され、第６図に示すようにプラスミドｐＧＸ２３ ０２か創製された。λエントリシン遺伝子の発現によってリゾチーム及び遺伝子 産物のエンドペプチダーゼ作用により細胞壁か崩壊することによって、細胞溶解 を引き起こされるが、Ｒ及びＲ２遺伝子産物は、細胞膜が破壊された後において のみ細胞壁と接触てきる。ゆっくりと膜を破壊し細胞溶解を開始するのにいくつ かの型の化学処理を用いることができる。例えば、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００、塩酸セチルピリジニウムのような洗剤、及びクロロホルム、塩化メチ レン又はブタノールのような溶媒を用いることができる。このように、エンドリ シン遺伝子の発現により細胞の自己溶解及び１機械的な崩壊やそれに関連するエ ネルギー所要工程を避けることができる酵素の分泌がもたらされる。

入ＲＲｚ遺伝子を発現する細胞の溶解を引き起こすのにクロロホルムを用いるこ とはこの分野において周知てあり、入　Ｓ遺伝子からラムダファージを形成する ために長年にわたって用いられている（ハリス・エイ・ダブリュ、マウント・ダ ブリュ・エイ、フェルスト・シー・アール及びシミノビッチ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ 、　３２：５５３．１９６７）。

エンドリシン遺伝子はまた、細胞溶解を行なうためにプラスミド上に置くことも てきる（ガレット・ジェイら、１９８４）　、プラスミドｐＧＸ２３０２の構築 は第６図に示されている。Ｓａｗ、　Ｒ及びＲ２遺伝子を有する、入　ｃ１８５ ７　Ｓａｍ７ＤＮＡ　（入ゲノムの４４９７３−４６４４１塩基対、サンガー・ エフら、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、１６２ニア２９−７７３．１９８２）のＥ ｃｏＲｒ−（：ｔａｌ！１１片は、　ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲｌ及びＣｌａｌ部 位の間てクローニングされてプラスミドｐＧＸ１０５６が形成された。エンドリ シン遺伝子は、上述したのと同じＥｃｏ８１部位と、　ｐＧＸ２２９４のｐＢＲ ３２２部分中に存在するＢａｍ８１部位を用いて、プラスミドｐＧＸ１０５６（ 菌株ＧＸ１１８６、ＡＴＣＣ３９９５５中に存在）上テ再びサブクローニングさ れてプラスミドｐＧＸ２２９８が創製された。エントリシン遺伝子は次に、再び ＥｃｏＲ１部位と、ｐＧＸ２２９８（７）　ｐＧＸ１０６６部分（７）Ｐｓｔ１ 部位を用いてｐＧｘ２２９８から１ハブラスミドｐＧＸ２２３６に移され、プラ スミドｐＧＸ２３０２が創製された。５ａ１１．　Ｒ及びＲ２遺伝子は、これら のプラスミド構築工程において除去されているけれども、溶解機箭を与えるのに 十分な、Ｒ及びＲ２遺伝子の低度の発現は存在する。存在するラムダＳ遺伝子も またアンバー突然変異を有しており、機能的な遺伝子タンパク質を生成しない。

ｐＧＸ２２３６３のβ−ラクタマーゼ遺伝子の一部はｐＧＸ２３０２の構築にお いて除去されているので、アンピシリン耐性はプラスミドの維持に用いることが てきない。

プラスミドｐＧＸ２２３６３、ｐＧＸ２２３７　及びｐＧＸ２３０２３（１、オ ペロンの両方を有する。このことにより、トリプトファンか培地から除去された 場合のプラスミドの安定化機構が提供される。プラスミドｐＧＸ２３０２は、自 己溶解使方を与えるラムダＲＲｚ遺伝子をさらに含む。

好ましい発現ベクターは、好ましくはトリプトファン突然変異体である微生物を 形質転換するのに用いることかでき、ＳＨＭＴを効率的に発現し、この発明の方 法においてＳＨＭＴの供給源として好ましく用いることかてきる形質転換体を形 成することができる。トリプトファン突然変異体でもあるし一セリンデアミナー ゼ（ｌｓｄ）突然変異体クレブシラ・アエロゲネス菌株（Ｇｘ１７０５）がｐＧ Ｘ２２’３６て形質転換され、メリーランド州ロックビルのアメリカン・タイプ ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、　３９４０８として寄託された。

同一の菌株はまたｐＧＸ２３０２で形質転換され、アメリカン・タイプ・カルチ ャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、　５３０５２として寄託された。我々は、 プラスミドｐＧＸ２２３６　、ｐＧＸ２２３７、及びｐＧＸ２３０２が、トリプ トファンを含まない培地中で増殖されたＧＸ１７０５形質転換体中て非常に安定 であることを発見した。

トリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼをコードするヌクレオチド 配列はＳＨＭＴ遺伝子を含むプラスミド中に挿入することができる。このような プラスミドで形質転換された微生物は、この発明において使用される酵素を産生 ずるであろう、あるいは、ＴＳ又はＴＡＳＥは、それぞれの酵素を高収率で生産 するように、従来の遺伝子工学手法を用いて修飾された微生物から別々に得るこ ともてきる。７３（ｔｒｐＢＡ）又はＴＡＳＥ（ｔｎａＡ）をコードするヌクレ オチド配列はまた、単離し、ベクター中にクローニングすることがてき、このベ クターは適当な宿主岬胞を形質転換するのに用いることかてき、それによってＴ Ｓ又はＴＡＳＥの発現を高くすることがてきる。ベクターはファージでもプラス ミドてもよいがプラスミドか好ましい。適当な宿主は１例えばクレブシラ、サル モネラ及びニジエリシア尿細菌を包含する。ＴＳ又はＴＡＳＥは、それぞれの酵 素を含む全細胞、粗抽出物又は生成酵素の形態て用いることがてきる。

好ましい具体例ては、　ＳＨＭＴ及びＴＳ又はＴＡＳＥは別々の供給源からのも のである。酵素は、非固定化形態又は−緒に若しくは別々に固定した形態で用い ることかできる。

補因子ＴＨＦも固定化されても活性を保持するのて、非固定化状態又は固定化状 態て用いることができる。

ＴＨＦを、バイオリアクター中て保持することがてきる支持体に結合することに よって固定化することが好ましい。なぜなら、そうすることによって、この発明 の工程中、補因子を繰り返し用いることが促進されるからである。例えば、ＴＩ （Ｆは、デキストラン、ポリエチレングリコール又はポリエチレンイミンのよう な可溶性ポリマーで固定化することがてきる。固定化は、デキストラン若しくは ポリエチレングリコールとの共有結合又はポリエチレンイミンとのイオン的相互 作用によって起きる。共有結合は、通常、ＴＨＥのカルボキシ基と支持体のアミ ノ基の間て起きる。あるいは、同様な結合方法を用いて。

ＴＨＦを不溶性の支持体に結合することもできる。

Ｔ）ＩＦは酸素の存在下において急速に分解される。

従って、この発明の方法は、望素雰囲気下のような、嫌気的条件下で行なうこと か好ましい。ＴＩ（Ｆの酸化を防止することを助けるために１反応器合物に還元 剤を加えることが好ましい。反応工程に悪影響を与えないいかなる還元剤も用い ることかてきる。好ましい還元剤はチオグリコレート、アスコルビン酸及び例え ば１，３−ジメルカプトプロパノール、１，２−ジメルカプトエタン、ジチオス レイトール、ジチオエリスリトール及びメルカプトエタノールのようなメルカプ タンを包含するチオアルコール、Ｌ−チアゾリジン−４−カルボン酸並びにアミ ノエチルイソチオウロニウムブロミトである。特に好ましい還元剤はメルカプト エタノール、ジチオスレイトール及びチオグリコレートである。２−メルカプト エタノールが最も好ましい。還元剤の反応混合物中での好ましい濃度は約０、Ｏ ＩＭないし約０．２Ｍてあり、最も好ましくは０．０２ないし０．１Ｍである。

好ましい具体例ては、反応混合物を攪拌することによって反応が促進されるのて 、グリシン、ホルムアルデヒド及びインドールからＬ−）−リプトファンを生産 するのに必要な反応は、攪拌されたタンク反応器中て行なわれる。酵素セリンヒ ドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファンシンテターゼ又はトリプ トファナーゼは、好ましくは別々の発酵タンク中て、ＳＨＭＴ、　ＴＳ又はＴＡ ＳＥをコードするヌクレオチド配列をそれぞれ有する発現ベクターて形質転換さ れた微生物の細胞中での発現によって生産される。細胞は発酵器中で増殖され、 所望の酵素は発酵条件を制御することによって高濃度に語起され発現される。

反応は、悪影響を与えないいずれの溶媒の存在下においても行なうことかてきる 。このような溶媒の例としてエタノール、メタノール、イソプロパツール及びジ オキサンを挙げることがてきる。基質、すなわちグリシン、ホルムアルデヒド及 びインドール、酵素ＳＨＭＴ及びＴＳ又はＴＡＳＥ、及び補因子Ｔ）ＩＦは種々 の方法て互いに反応させることがてきる。グリシン、ホルムアルデヒド及びイン ドールからのＬ−）リプトファンの合成を説明すると信じられる酵素的経路が以 下に示されている。

ホルムアルデヒド 反応物質及び触奴を導入する順序は重要てはない。ただし、ホルムアルデヒドを トリプトファン又はインドールの存在下て蓄積させてはならない。なぜなら、こ れらは化学的に反応するからである．工程はバッチ式又は連続式で行なうことか てきる。好ましい手順は以下のとおりである。好ましくはＬ−セリンデアミナー ゼ突然変異体であるトリプトファン突然変異体を、ＳＨＭＴ遺伝子及びトリプト ファンオペロン（関連するトリプトファンプロモーター−オペレーターの制御下 にある）の両方を有する、ｐＧＸ２２３６、ｐＧＸ２２３７及びｐＧＸ２３０２ 　（７）ようなプラスミドて形質転換する。形質転換体は、ＳＨＭＴ生産条件下 で発酵タンク中で、トリプトファンを含まない培地中で選択され、高い細胞密度 になるまで増殖される。

（ｒＸ１７０５（ｐＧＸ２２３６）のような菌株からの細胞は次に発酵液を遠心 することによって好ましくは濃縮され、濃縮された細胞は攪拌タンク反応器中に 入れられる。細胞は死んており、細胞膜が破壊されていることが好ましい。

これは機械的手段によって、又は塩酸セチルピリジニウム、　Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ −１００、Ｔｗｅｅｎ　１００　、　ＮＰ４０のような洗剤若しくはトルエンの ような溶媒と接触させることによって行なうことができる。機械的に溶解した細 胞の粗抽出物は全細胞よりも好ましい。好ましいＳＨＭＴ酵素供給源であるＧＸ １７０５（ｐＧＸ２３０２）　ノような細胞から、ラムダＲＲ２，遺伝子の存在 の故に前ｅｌｌすることなしに発酵の終りに溶媒を加えることによって、激しい 細胞溶解が銹起される。クロロホルムおよび塩化メチレン（ジクロロメタン）の ような溶媒は非常に効果的である。発酵液中の放出された酵素は、遠心によって 細胞残骸を除去した後直接バイオリアクター中で用いられる．あるいは、溶媒の 添加か望ましくない場合には、発酵後、細胞のエイジングにより自己溶解を起こ すことがてきる。発酵中に抗泡化合物を用いるとエイジング中の溶解が促進され る。

反応器の内容物と空気との接触は不活性ガス（Ｎ２、アルゴン等）の層を反応器 の内容物上に与えることによって好ましくは防止され、反応混合物中に溶解した 酸素を減少させるために還元剤が導入される。ＴＨＦは反応条件に応した濃度に なるように反応器中の混合物に加えられる。大腸菌ＯＡ遺伝子をＳＨＭＴの供給 源として用いた場合には、これらの条件は通常、約４℃ないし約６０℃の反応温 度と約５ないし約１０のｐＨを包含する。好ましい反応条件は、約２０ないし約 ４５°Ｃの温度下で約６ないし約８．５のｐＨて反応を行なうことを包含する。

温度が約４°Ｃよりも低いと反応かかなり遅くなり、温度が約６０°Ｃ以上に上 ると酵素が不活性化される。例えば、ｐＨが約７．５てあり反応温度が約３７° Ｃである場合にいは、水性溶液中では、ＴＨＦは５０ｍＭよりも大きな濃度にな るように加えられる。もっとも、好ましい濃度は０．１ｓＭないし５ｓＭである 。

ＴＨＦは反応条件下において容易に酸化される。従って、反応混合物中では好ま しくは約−３００■Ｖの低酸化還元ポテンシャルを維持することが好ましい。こ れは、上述したように１反応器合物に還元剤を添加することによりて行なうこと がてきる。好ましい還元剤は２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）であり、こ れはＴＨＦと共に反応混合物に加えられた所望の酸化還元電位を達成することが てきる。反応混合物の酸化還元電位は反応工程中、酸化還元プローブを用いるこ とによって監視することがてき、所望の酸化還元電位は、反応混合物中への還元 剤の選択滴定によって維持することがてきる。

所望のｐＨはＴＨＦが反応混合物中に溶解する間維持される。これは、反応工程 に悪影響を与えない塩基溶液の反応混合物中への選択滴定によフて行なうことが できる。好ましい塩基性溶液は水酸化金属溶液であり、水酸化カリウムが最も好 ましい。

セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼはホルムアルデヒドによって容易に 不活性化される。　ＴＨＦはホルムアルデヒドと反応してメチレンＴＨＦを形成 し、不活性化からＳＨＭＴを守るのて、反応混合物中の量のＴＨＦのＴＨＦと反 応するのに必要な量以上のホルムアルデヒドは反応混合物に加えられず、このよ うにＳＨＭＴ不活性化から防御される。

所望ならば、ピリドキサール−５°−フォスフェートも反応に加えることができ る。Ｌ−セリンが反応器中で長昨間にわたり合成される場合には、ピリドキサー ルフォスフェートが不活性化される場合があり、このような場合にはピリドキサ ールフォスフェートをカロえることができる。反応に加えられるピリドキサール −５°−フォスフェートの濃度は必要に応じて０ないし約２０ｍＭまで変化し、 好ましくは約０．１■ＭないしｌｓＭである。

グリシン全量は直接バイオリアクター中に入れられ、ホルムアルデヒドは、存在 するＳＨＭＴ活性の予期される反応速度を決して超えることがない速度で、反応 混合物中に反応の進行と共に連続的に添加される。ｐ）Ｉを慎重に監視すること によって反応条件を評価することができる。反応混合物中への水酸化カリウムの 滴定は、ｐＨを調節するために採用することがてきる。一定のｐＨな維持するの に必要な、水酸化カリウムの添加時間の間隔が段々と短くなる場合には、ホルム アルデヒドを混合物中にあまりにも急速に加えているか、ＴＨＦの分解が起きて いるか、ＳＨＭＴの不活性化が起きているか、又はこれらの組み合わせが起きて いる。ホルムアルデヒド添加を制御するこの方法の使用は、出願中の第６１９， １１６号により詳細に記載されている。

反応が進行するにつれて、セリンの蓄積の故にセリン生成速度が小さくなる。こ れは生成物阻害及び／又はセリンの蓄積に起因する逆反応のためである。ホルム アルデヒドの添加速度はＳＨＭＴ濃度を増加させることによって一定に維持する ことができるし、あるいは、好ましくは、ホルムアルデヒドの添加速度はそれに 応じて減少させることがてきる。これは、溶液中の過剰なホルムアルデヒドはＳ ＨＭＴを不活性化するであろうからである０反応は比較的高濃度のセリンが生成 するまで、すなわち、反応混合物中のセリンの濃度が５０−Ｍを超えるまて統け られる。好ましくは、反応は１、得られたセリンの濃度が１Ｍないし飽和濃度よ りも大きくなる平衡に達するまで続けられる。

Ｌ−セリンをＬ−）リプトファンに転換するためのトリプトファンシンテターゼ の供給源を得るために、微生物、好ましくはトリプトファン突然変異体が、トリ プトファンシンテターゼをコードするヌクレオチド配列（トリプトファンオペロ ンのｔｒｐＢＡ部分）を有するｐＧｘ２２１３（ＡＴＣＣ３９３８８）ノヨウナ フラスミトテ形質転換すレる。形質転換体は、トリプトファン欠損培地中で、発 酵タンク中てＴＳ産生条件下で選択され高い細胞密度にまで増殖される。

細胞は次に発酵液を遠心することによって濃縮される。細胞は死んでおり膜が破 壊されていることが好ましい。これは、好ましくは細胞をＴｗｅｅｎ　１００、 ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ　１００、塩酸セチルピリジニウム等のような洗剤又は トルエンのような溶媒と接触させることによって行なうことができる。

ＴＳ含有細胞は次に、高濃度のセリンと非常に少量のホルムアルデヒドとを含む 反応混合物中に添加される。

インドールは、ジオキサン、エタノール等の、水と混じり合う訪起溶媒と混合さ れ、反応混合物にゆっくりと加えられる。インドールはトリプトファン、シンテ ターゼを阻害する傾向がある。従って、反応混合物中の遊離のインドールの濃度 を可能な限り低くすることが好ましい。

ＴＳが反応混合物中に、破壊された膜を有する死んだ全細胞（好ましい形８）と して存在する場合には、ＴＳは細胞中に存在するのてインドールによる不活性化 から守られる傾向にある。もっとも、細胞溶解物もまた用いることがてきる。

他の具体例では、トリプトファンシンテターゼに代えてトリプトファナーゼがＬ −セリンとインドールとをＬ−）リプトファンに転換するために用いられる。ト リプスミド安定化のためのｔｒｐＥＤ遺伝子及びラムダエンドリシン遺伝子ＲＲ ，を含む、ｐＧＸ２３０８のような遺伝子で微生物が形質転換される。プラスミ ドｐＧＸ２３０８の構築か第７図に示されている。ラムダＲ及びＲ２遺伝子は、 Ｒ遺伝子の開始コドンの５°側５８塩基対のところにあるＲｓａ　１部位と、ラ ムダＲ２遺伝子の丁度３゛のところにあるｐＧＸ２２９４の唯一の旧ｎｄｍ部位 を用いてプラスミドｐＧＸ２２９４からサブクローニングされた（上述したよう に、そして第６図に示すように）　、　ＲｓａＩ−Ｈｉｎｄｍ断片はｐＧＸ１０ ６６に挿入されてｐＧＸ２３００が創製された。ｐＧＸ２３００からのラムダＲ Ｒ。

遺伝子は、Ｘｂａｌ−Ｈ４ｎｄｍ断片に乗ってプラスミドｐＧＸ２２８７（ＮＲ ＲＬ　Ｂ−１５７８８）のＸｂａ　ＩとＮｃｏ１部位との間に移動されてｐＧＸ ２３０１が創製された。キモシン生産のためにデザインされたプラスミドｐＧＸ ２３０１は、ＲＲ，、遺伝子及びプラスミド安定化のために用いることができる ｔｒｐＥＤ遺伝子を便利に結合することができる。　Ｂａ＋＊旧−Ｐｖｕ　Ｉ断 片上にヤノフスキー、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ　１４７： ７８７−７９５）からの大腸菌ｔｎａＡ遺伝子はキモシン遺伝子の大部分と取り 換わってｐＧＸ２：１０ｇ中に挿入されてプラスミドｐＧＸ２３０１か創製され た。プラスミドｐＧＸ２３０８は、トリプトファン又はインドールを含まない培 地中で増殖される場合に、ＧＸ１７３４（Ｆ−、ΔｔｒｐＥＤ１０２．　ｔｎａ ２）のようなｔｒｐＥＤ突然変異体宿主中て安定であるという有利な性質を有す る。プラスミドｐＧＸ２３０８を含む細胞はトリプトファナーゼを過剰生産する 。よく増殖するいずれのｔｒｐＥＤ突然変異体も適当である。大腸菌トリプトフ ァナーゼ遺伝子はカタボライトレプレッションによって調節される（ジェイ・エ ル・ボ）ンフオート及びアール・Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、、　９２：１３３−１３ ７．１９７６）ので、グルコースを含まない発酵培地を用いることが好ましい。

さらに、大腸菌中てのトリプトファナーゼの発現はトリプトファンによって誘起 される（エイヂ・ジェイ・ボーゲルとディ・エム・ボナー、Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃ ｈｅｗ、、　２１８：９７−１０５．１９５６）。

従って、初期段階ではトリプトファンなしに増殖させてプラスミドの安定性を維 持し、細胞重量を増加させ１次にトリプトファン又は５−メチルトリプトファン のようなトリプトファン類似体を加えることによって高い酵素特異活性を得るこ とができる。

プラスミドｐＧＸ２：１０８を含む細胞は次に培養液を遠心することによって濃 縮される。細胞を殺し、膜を破壊することか好ましい。これは、好ましくは機械 的手段及び／又は細胞をＴｗｅｅｎ　１００、ＮＰ４０、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１ ００，塩酸セチルピリジニウム等のような洗剤又はトルエン、塩化メチレン又は クロロホルムのような溶媒と接触させることによって行なうことができる。ラム ダＲ２遺伝子産物は細胞溶解に寄与するが、最初の試験によるとＰＧＸ２３０８ がらのＲＲ，遺伝子の発現は、Ｓ）ＩＭＴ産生プラスミドｐＧＸ２３０２の場合 よりも幾分低いかもしれないことが示唆された。

ＴＡＳＥを含む細胞又は細胞溶解物が次に、高濃度のセリンと極めて少量のホル ムアルデヒドとを含む反応混合物中に加えられる。トリプトファナーゼは高濃度 のインドールの存在下でかなり安定であるのて、固体のインドールをセリン溶液 と直接混合することができる。インドールはまた、ＴＳを触媒として用いる場合 について上記したのと同様に、ジオキサン、エタノール等のような、水と混じり 合う有機溶媒と混合し、これを反応混合物にゆっくりと加えることもできる。

ＴＳを触媒として用いる場合には、インドールはセリンからのＬ−）−リブトフ ァンの合成に用いられるので、インドールは好ましくは反応混合物に連続的に加 えられる。し−トリプトファンが合成されると、これは反応混合物から沈殿する 。極めて少量のセリンが反応混合物中に残留する状態になった時にインドールの 添加を止め、残留するインドールを反応させる。

ＴＡＳＥを触媒として用いる場合には、計算量のインドールが直接反応混合物に 加えられる。

反応混合物から析出し、反応器の底に集められたＬ−トリプトファンは、便利な いずれの分離手段によっても取り除くことかてきる。

次にグリシンとホルムアルデヒドを上述したように反応混合物に加え、セリン合 成を再び開始することがてきる（ＳＨＭＴ酵素、ＰＬＰ及びＴＨＦ補因子をさら に加えることが望ましい）。トリプトファンシンテターゼ及びトリプトファナー ゼは、ＳＨＭＴに比べてホルムアルデヒドによる不活性化に対して感受性が低い 。ＴＨＦと反応てきる量以上のホルムアルデヒドを加えることを避けることによ って反応混合物中のホルムアルデヒド量が過剰になることを避けることにより、 反応器のセリン合成段階のポルムアルデヒドによる不活性化からＴＳ又はＴＡＳ Ｅを守ることができる。

この発明を以下の実施例によりさらに例示する。以下の実施例は、いかなる意味 においてもこの発明の範囲を限定する意図はない。

実施例１ ＳＨＭＴ産生形質転換体の製造 プラスミドＩ）ＧＸ２２：１６及びｐＧＸ２２３７が第１図ニ示し、後述するよ うにして製造された。プラスミドｐＥＰ３Ｉ］２３はエンガーーバルク・ビー・ イーら、Ｇｅｎｅ　９．：６９−８５　（１９８０）に詳細に記載されている。

プラスミドｐＧＸ１１０は、この文献に記載されたｐＨＰ１２と実質的に同一で ある。

この実施例及びＤＮＡの操作に関する以下の実施例において、全ての酵素は重版 のものであり、その使用方法は製造者の指示書に従った。酵素処理の後てあって 次の酵素処理の前に、ＤＮＡは中和されたフェノール−クロロホルム（１：１） で抽出された。水性相に対し、２Ｍ酢酸ナト！Ｊ　ラム（ｐＨ５，５）−０，２ Ｍ　２．５体積１７）９５１１り／−）Ｉｉが加えられた。溶液はドライアイス 中で凍結され、１１００００ｘで遠心されて沈殿され、次に脱イオン水に溶解さ れた。

プラスミドｐＧＸ１１０　（ｔｒｉ）プロモーターによって調節されるｔｒｐＥ ＤＣＢＡをコードするヌクレオチド配列、虫プロモーター上流にあるＸｈｏｌ制 限部位及びＸｈｏ１部位の上流にあるＥｃｏＲＩ制限部位を含む）をＸｈｏ　Ｉ ての開裂により直線化した。プラスミド　ｐＧＸ１３９　（ｇｌｙＡをコートす るヌクレオチド配列、１が遺伝子の下流に存在する５ａｌｌ制限部位及びｇｌｙ Ａ遺伝子の上流にあるＥｃｏＲＴ制限部位を含む）を５ａｌｌでの処理により直 線化し、ＤＮＡリガーゼを用いて高ＤＮＡ濃度（約１１０００ＪＬ／ｍｌ）て、 直線化されたｐＧＸｌｌｏに連結した。得られた連結混合物をＥｃｏＲＩで消化 し、短いＤＮＡ連結産物を得た。連結産物はＤＮＡリガーゼを用いて低ＤＮＡ６ 度（約１０μｇ／ｌ）で環化された。

個々の場合において、第１工程における高濃度の連結により、２つのプラスミド の長い連結体がつくられた。これらは第２のＥｃｏＲＩ消化により所望のサイズ に切断した。低ＤＮＡ濃度における第２の連結は、効率的な形質転換のための環 状の形成を促進した。世オペロンに突然変異を有する細胞を、カルシウムショッ ク操作を用いて連結混合物て形質転換し、トリプトファンを含まない培地上て増 殖したものを選択した。ｔｒｐ”形質転換体について、予期されるプラスミドサ イズの増大と高いＳＨＭＴ生産の特異活性をスクリーニングし、出発ｔｒｐプラ スミドが再環化したものと所望の組換え体とを識別した。両方の結合からの単離 体が同定され、それぞれｐＧＸ２２３６及びｐＧＸ２２３７と命名された。プラ スミド　ｐＧＸ２２３６もまた。細胞にアンピシリン耐性を与える。

プラスミドを次にクレブシラ・アエロゲネスＧＸ１７０Ｓを形質転換するのに用 いた。この菌株はＧＸ１７０４　（Ｌ−セリンデアミナーゼが欠失したクレブシ ラ・アエロゲネス菌株）をニトロソグアニジンで処理し、トリプトファン含有培 地中で増殖できるがインドール含有培地中で増殖てきないものをスクリーニング することによって創製されたトリプトファンシンテターゼ突然変異株である。

実施例１１ 便利な制限部位を有するプラスミド　ｐｃｘｚｚｏｓ　（第２図参照）中にサブ クローニングした。プラスミドｐＧＸ１１０をＢｇｌｌｌて消化し、Ｔ４リガー ゼの存在下で低濃度（約１０ルｇ／■１）で再連結し、狂パの一部、ｔｒｐＤの 全部及びｔｒｐＣの一部を包含する３つのＤＮＡ断片を欠失させた。

ｐＧＸ］１２と命名した得られたプラスミドは、トリプトファンシンテターゼ（ ＴＳ）のベータ及びアルファサブユニットをコートする機能的なｔｒｐＢＡ遺伝 子のみを含み、正常なトリプトファンプロモーターと調節領域を保持していた。

プラスミドｐＧＸ１１２をＢｇｌ　ＩＩで消化した。プラスミドｐＢＲ３２２を Ｂａａ＋ＨＩて消化した。ＢａｍＨＩとＢｇｌ　ＩＩは相補的な末端を与える。

２つの直線化プラスミドをＴ４リガーゼの存在下て高ＤＮＡ濃度（約１０００　 ｇ　ｇ／鳳ｌ）で１０ルｌ中て連結した。得られた連結混合物を５ａｌｌで消化 し、　Ｔ４リガーゼの存在下て約１０　ｇｇ／ｗ＋１の濃度て再環化してプラス ミド　ｐＧＸ１４１をツくッた。　ＰＥＧ　１４１　（：ｉ　ｐＧＸ２３２２） で約１０ｇｇ／ｌの濃度で連結することにより、大きな断片を再環化して、ｔｒ ｐＢの３°末端と全てのｔｒｐＡを含むプラスミド　ｐＧＸ１４３をつくった。

プラスミド　ｐＧＸ１４１の一部、５７、ｇをＨａｅ　ｍで消化した。Ｈｉｎｄ ｍ認識部位を有する断片を５％アクリルアミドゲル上て単離した。この断片の両 端に、ＥｃｏＲＩ認識部位を有する８塩基対の合成オリゴヌクレオチドを連結し 、これをＥｃｏＲＩで消化した。プラスミドｐＧＸ１４３（５ｇ　ｇ）をＥｃｏ Ｒｌて消化し、直線化されたプラスミドを高ＤＮＡ濃度（約２５０　ｇ　ｇ／ｍ ｌ）て、ＥｃｏＲＴ消化リンカ−で処理したＨａｅ　ｍ断片に連結した。

得られた連結混合物を旧ｎｄＩＩＩて消化し、Ｔ４リガーゼの存在下で低ＤＮＡ 濃度（約１０ｇｇ／＋＊］）で再環化した。得られたプラスミドｐＧＸ１４９は 、　ｔｒｐＢＡ遺伝子と、この遺伝子のすぐ上流てあって、　ｔｒｐＣの最終的 な元の）ｌａｅ　ｍ部位にＥｃｏＲ１部位を有していた。プラスミドｐＧＸ１４ ９（５終ｇ）をＥｃｏＲｌで消化した。５’−ＧＡＴＣｆｌ：ＴＣＧＡＧ−３° 及び５’−ＡＡＴＴＣＴＣＧＡＧ−３°の配列を有する１０塩基対の合成オリゴ デオキシヌクレオチドをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼとＡＴＰとでリン酸化し １次にＴ４リガーゼの存在下でＥｃｏＲＩ直線化プラスミドに連結してプラスミ ド　ｐＧＸ２２０８をつくった。このプラスミド　ｐＧＸ２２０８はｔｒｐＢ遺 伝子及び、この遺伝子のすぐ上流に、合成りＮＡにより創製された、ＥｃｏＲＩ 　。

ｘｈｏｌ、　Ｂａｇ旧、　Ｘｈｏｌ、　ＥｃｏＲＩ認識部位をこの順序で有する 。

プラスミド　ｐＧＸ２２０８をＢａｍＨＩで消化した。プラスミド　ＰＧＸ１４ ５もＢａｍＨＴて消化した。プラスミド　ｐＧＸ１４ｓ（第３図参照）はｐＧＸ １３４　（ｐＧＸ１３４　テ形質転換り、　ｊ：　大腸菌株ＧＸ１０４５は、ア メリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣ３９０３７として寄託 されている。）の極めて近い類似体である。プラスミドｐＧＸ１４５は、記載さ れたｔｒｐ／Ｉａｃプロモーター（デボアーら、ゴｒａＩＩＧｅｎｅｔｏ　Ｐｒ ｏｔｅｉｎ：　Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　１ｎｔｏ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇ ｙ″、マイアミ冬季シンポジウム、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　 Ｙｏｒｋ（１９８２）　ｐｐ、２０９−３２７）に類似した、ｔｒｐ／Ｉａｃハ イブリッドプロモーターを有する。２つの直線化したプラスミド９ＧＸ１４５と 　９ＧＸ２２０８をＴ４リガーゼの存在下て約１０００ｇｇ＃＋Ｉの濃度で２０ 膳ｌの体積中で連結し、得られた連結混合物を５ａｉｌて消化して不所望のＤＮ Ａ配列を除去した。消化して連結混合物を次に約１０ＪＬｇｌＩＩｌの濃度でＴ ４リガーゼの存在下て再環化してｐＧＸ２２１３をつくった。

ｔｒｐ／ｌａｃハイブリットプロモーターの制御下にあるｔｒｐＢＡ遺伝子を有 するこのプラスミドは、この発明の方法においてＴＳの供給源として働くであろ う微生物を形質転換するのに用いることができる。

実施例３ プラスミドｐＧＸ２２１４の構築 ｔｒｐＢＡ遺伝子の発現ビークルであるプラスミドｐＧＸ２２１４を、　ｐＧＸ ２２０８　（実施例２参照）とｐＧｔｉ１７　（第４図参照）から出発してつく った。プラスミドｐｃｗ７は、先ずＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ断片上のλ　ｃ１８ ｓ７　ｃｒｏ１２の３４５００−３９１６８塩基対をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ 及びＢａｇ旧部位中にクローニングし、次に部分的なりｇｌ　ｍ消化及び再連結 によって元の入ＤＮＡの３５７１２−３８８１４塩基対を欠失させてｃｒｏ及び Ｏ遺伝子並びに全てのｃｌｌ遺伝子中に欠失を起こすことによって製造された。

（アブストラクト、Ｔ４ファージミーティング、ワシントン州オリンピック、エ バーグリーン州立大学（１９８０）参照）このプラスミドは、λＰＬプロモータ ーを有する１文献に記載された他のものと類似している（例えば江ｎｅ、　５： ５９−７６　（１９７９）参照）。

プラスミドｐＧＷ７？　Ｈｐａｌて消化した。Ｂａｌ１旧認識部位を有する８塩 基対の合成オリゴデオキシヌクレオチドリンカーを、低プラスミド濃度（約１０ ｐｇ　／ａｌ）で、ＤＮＡ末端に換算して高いリンカ−濃度（ＳＪＬｇ／ｍｌ） て、直線化されたプラスミドに連結した。連結混合物を次にＢａｍＨＩて消化し 、低ＤＮＡｇ度（約１ｐｇ／■ｌ）でＴ４リガーゼの存在下で連結することによ って再環化して元のＨｐａｌ−Ｂａ＋ｓＨＩ断片を除き単一のＢａ鳳旧部位を残 した。この新しいプラスミドは　ｐＧＸ２２０４と命名された。プラスミドｐＧ Ｘ２２０Ｂ　（第２図参照）（５μｇ）とプラスミドｐＧＸ２２０４（５＃Ｌｇ ）とをＢａＩＩ旧て消化した。直線化されたプラスミドをＴ４リガーゼの存在下 で高ＤＮＡ濃度（約１１０００Ｌ／ｓｌ）で連結し、５ａｉｌて消化して不所望 のＤＮＡ配列を除き、低濃度（約１０ｐｇ／ｍ＋）　”Ｑ再連結しテｐＧＸ２２ １４をつくった。このプラスミドは、λＮタンパク質のアミノ末端部分の少量残 存部分と、ｔｒｐｃタンパク質のカルボキシ末端部分の少量残存部分との融合タ ンパク質をコードする。従って、この構築タンパク質の合成は、ファージλにお いてλＮて通常行なわれているようにして開始され、大腸菌染色体中のトリプト ファンオペロン中のｔｒｐＣの末端て通常行なわれているようにして終結する。

これによりおそらく、正常なトリプトファンオペロンにおけると同様に、不所望 のｔｒｐＣタンパク質をあまり合成することなく、ｔｒｐＢタンパク質合成開始 のための結合部位にリポソームか効率的に分配される。プラスミド　ｐＧＸ２２ １４は、転写が入Ｐｔプロモーターから誘起された時にこの発明の方法のＴＳの 供給源として機能し得る宿主を形質転換するのに用いることができる。

実施例４ ＴＳ産生形質転換体の製造 トリプトファンプロモーターの制御下にあるｔｒｐＢＡ遺伝子を含むプラスミド 　ｐＧＸ１５０を第５図に示すようにして製造した。出願中の米国特許出願第４ １５，９５７号に記載され、　ＥｃｏＲ１部分にトリプトファンプロモーターを 有するプラスミド　ｐＧＸ９９（５ｏ　ｐ−ｇ　）をＥｃｏＲＩで消化し、トリ プトファンプロモーターを含む小さな断片を５％アクリルアミドゲル上て単離し た。実施例２で記載したプラスミドｐＧＸ１４９（５０ｇｇ　）をＥｃｏＲＩ　 テ消化し、細菌性アルカリフォスファターゼで処理してプロモーター配列が挿入 されることなく再環化されることを防止した。　ｐＧＸ９９からのトリプトファ ンプロモーターＥｃｏＲＩ断片を次にＴ４リガーゼの存在下で直線化されたｐＧ Ｘ１４９に連結してｐＧＸ１５０を製造した。ｐＧＸ１５Ｑの構造は、エンドヌ クレアーゼ消化分析により確認された。

クレブシラ・アエロゲネスＧＸＩ　７０５を形質転換するのにプラスミドｐＧＸ １５０を用いた。ＧＸ１７０５染色体中のトリプトファンシンテターゼ突然変異 により、トリプトファンを含有しない培地中で増殖される細胞中に維持されたプ ラスミドの安定な保持が可能になる。この形質転換体は、メリーランド州、ロッ クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションにＡＴＣＣＮｏ、３９ ４０６として寄託されている。

実施例５ テトラヒドロ葉酸、ｐＧＸ２２３６を含む形質転換体及びｐＧＸｌ　５０を含む 形質転換体の存在下における、グリシン、ホルムアルデヒド及びインドールから のＬ−トリプトファンの製造 クレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０５の１つのコロニー（ｐＧＸ２２３６ を含む）を１５０　ｍｌ＋７）下記培地Ｉに摂取し、３０°Ｃで一夜振盪した。

細胞を遠心により集め、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ生物触媒と して用いた。

培」１１ に２）ＩＰＯ４１０，５ｇ／Ｉ ＫＨ２ＰＯ，４，５ｇ／１ （ＮＨ４）　２ＳＯ４１ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム−２８２００，５８ｇ／ｌＭｇ５０．　０．１１１１Ｍ Ｆｅ５Ｏ，０，５Ｂ／Ｉ シヨ糖　２０ｇ／ｌ クレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０５の１つのコロニー（ｐＧＸ１５０　 ）を１５０１の下記培地Ｉに摂取し、３０°Ｃて１８時間振盪した。細胞を遠心 により集め、トリプトファンシンテターゼ生物触媒として用いた。

良度１ に２ＨＰＯ，１０，５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４４，５ｇ／１ （ＮＨ４）２３０．　１　ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム−２８２００，５８ｇ／ｌグルコース　４ｇ／］ カザミノ酸　４ｇ／１ ７．００ｇのグリシンと、０．７＋ｓＭのピリドキサール−５−フォスフェート と、１０ｍＭのテトラヒドロ葉酸と、１５０　＋＊１の培地から集められた（ｐ ＧＸ２２３６）とを含む反応混合物３２ＩＩｌに、濃度が減少するホルムアルブ トの直線勾配（８，５ａｌのホルムアルデヒドと８．５ａｌの水とから成り、勾 配形成装置によって形成された）を１時間当り０．４１の速度で加えた。ｐＨを ７．０Ｍ　ＫＯＨて８．０に制御し、温度は３７°Ｃに維持した。反応混合物は 予め０．１Ｍの２−メルカプトエタノールを含んでおり、２−メルカプトエタノ ール（６Ｎ）を１時間当り０．０１ｍ１の一定速度て加えた。反応混合物上にＮ ２ガスを流して反応器から０２を排除した。反応のトリプトファン合成段階を開 始するために、１０時間及び２５時間後にＳＨＭＴ反応物の一部を取った。

反応１０時間後、５１の反応混合物をクレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０ ５　（ｐＧＸ１５０）　（２ａｌ、　Ｏ，Ｄ、５００ｎ＋ｅ＝１３０）と混合し た。インドール（Ｉｇ）を０．５１のジオキサン中に溶解し、室温にて１時間当 り０．０２２＋Ｉ＋の速度て反応混合物にポンプにより加えた。２４時間後、ア ミノ酸をＨＰＬＣにより分析した。

結果を下記第１表に示す。

Ｓｔ（ＭＴ反反応２蒔 合物（それぞれ０．５１　ｇ／ｌ及び１７３．３　ｇ／Ｉ）を、１．５ａｌの濃 縮したクレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０５（ｐＧＸ１５０）（０．Ｄ． 　５００ｎ＋ｗ＝１３０）と混合した．インドール（２ｇ）を１１のジオキサン に溶解し、最初の３６時間は０．０２２ｍ１／時間の速度てボンピングし、次の ２４時間は速度を０．０４ｍ１／時間に上げてボンピングした。

結果を下記第２表に示す。

トリプトファン合成段階が１０時間後に開始された反応により、トリプトファン は、セリン対グリシンの比が小さな場合てさえ合成し得ることが示された。トリ プトファン合成段階が２５時間後に開始される反応により、トリプトファンはよ り高い収率及び濃度て得られる。

プラスミド　ｐＧＸ２３０２の構築は第６図に示されている。これらの操作の目 的は，ラムダエンドリシン遺伝子（入ＲＲ４）をＳＨＭＴ産生プラスミド　ｐＧ Ｘ２２３６に加えることである。これを達成するために、入ＤＮＡの所望の部分 をｐＧＸ２２３６に加える前に便利な位置でサブクローニングした。二ニー・イ ングランド・バイオラボから購入した入ＤＮＡ　（ｃ１８５７　Ｓａｍ７，　１ ００　ｐｇ）を１１の体積中てＥｃｏＲＩて消化した。プラスミドｐＢＲ３２２ Ｄ　Ｎ　Ａ　（　９川ｇ）を１００＃Ｌ１の体積中てＥｃｏＲＩて消化した。Ｔ ４ＤＮＡリガーゼ（全ＤＮＡ２００　ｕＬｇ／ｍｌ、ＥｃｏＲＩ切断ｐＢＲ３２ ２ＤＮＡ：ＥｃｏＲＩ切断入ＤＮＡが１：５又は１：１０）による連結（体積２ ５ルｌ）を行なった。連結混合物の一部なＣ１ａｌて消化し、約０．２ａｌｇ／ ■１の濃度て再び連結した．第２の連結混合物は大腸菌Ｄ）ＩＩ　（Ｆ−、■す １，聾Ａｌ，用Ａ９６，リリ，ー１，田Ｒ１７。

５ｕｐＥ４４，　ｒｅｌＡｌ，　入−）を形質転換するのに用い，アンピシリン 耐性を用いて選択した。適当な大きさのプラスミドと、ＥｃｏＲＶ　、　Ｈｉｎ ｄｍ及びＮａｒｌての予期されるエンドヌクレアーゼ消化パターンを有する形質 転換体をｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−Ｃ　ｌａ　１部位中に入のＥｃｏｌＣ１ａ Ｉ断片（ｂｐ　４４９７３−４６４４１，サンガーら．　Ｊ．　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ．、　１６２：　７２９−７７３。

１９８２参照）を挿入するために選択した。このようなプラスミドの１つをｐＧ Ｘ２２９４と命名した。

ラムダエンドリシン遺伝子の両側に便利な制限エンドヌクレアーゼ部位を設ける ために、ラムダＤＮＡ断片をさらに　ｐＧＸ２２９４から　ｐＧＸ１０６６（Ａ ＴＣＣ　３９９５５）ニサブクローニングしてプラスミドｐＧＸ２２９８３を創 製した。両方のプラスミドｐＧＸ１０６６（１０１Ｌ、ｇ　）とｐＧＸ２２９４ 　（１０Ｐ　ｇ）を１００＃Ｉの体積中てＥｃｏＲＩで消化した。最初の連結混 合物Ｃａｔ、５　ｇｇ　ノＥｃｏＲＩ切断ｐＧＸ１０６６Ｄ　Ｎ　Ａ　ト５　ｊ Ｌ　ｇ　ノＥｃｏＲＩ切断ｐＧＸ２２９４Ｄ　Ｎ　ＡとＴ、ＤＮＡリガーゼとを ２０、Ｉの体積中に含んでいた。連結産物をＢａ１ｌＨＩて切断し、２．５　ｐ 、ｇ　（７）ＢａｍＨＩ消化ＤＮＡを２００ｐＬｌ（７）反応混合物中て連結し た。連結混合物を用いて大腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性コロニーを選択 した。ｐＧｘｌｏ６６のＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲ１部位中にｐＧＸ２２９４から のＲＲ，遺伝子を含むＥｃｏＲＩ　−ＢａｎＨＩ　断片を挿入するためにほぼ正 しい大きさく５１９７ｂｐ）のプラスミドを有する細胞を選択した。所望の型の 構造体をＢａｍ旧、　ＥｃｏＲＩ　、　ＥｃｏＲＶ　、　Ｘｂａｌ及びＨｉｎｄ ｍて消化して適当であることを確め、そのうちの１つをｐＧＸ２２９８と命名し た。

ｐＧＸ２２９８の単一のＥｃｏＲＩ及びＰｓｔ１部位を、入ＲＲｚ遺伝子を除去 しそれらをｐＧＸ２２３６中に挿入するために用いた。１１５ｇ　ｇ　ノｐＧＸ ２２３５と７．５　ｐ−ｇ　Ｏ）　ｐＧＸ２２９８を２００Ｐ＋の体積中てＥｃ ｏＲＩて消化した。２．５　ｐ−ｇのＥｃｏＲＩ消化ｐＧＸ２２３６と２．５　 ｐｇのＥｃｏＲＩ消化ｐＧＸ２２９８の連結を２０終ｌの体積中で行なった。連 結産物なＰｓｔｌで消化し、１５０．１の体積中て連結して再環化を行なった。

連結混合物を大腸菌ＡＥ−１（ΔｔｒｐＥＤＣＢＡ）を形質転換するのに用い、 トリプトファンを含まない最少培地中で増殖できる形質転換体を選択した。アン ピシリン感受性で、クロロホルムを加えると溶解し易い形質転換体をスクリーニ ングにより同定した。このような形質転換体の１つをｐＧＸ２３０２と命名した 。プラスミドｐＧＸ２３０２でクレブシラ・アエロゲネスＧＸ１７０Ｓ（ｌｓｄ 、　ｔｒｐ）を形質転換し、メリーラント州ロックビル、アメリカン・タイプ・ カルチャー、コレクションに寄託した（ＡＴＣＣ５３０５２）。この形質転換体 は、この発鳴の方法に用いるのに好ましいＳＨＭＴの供給源である。

実施例７ プラスミドｐＧＸ２３［１８の構築 プラスミド　ｐＧＸ２３０８の構築は第７図に示されている。その目的とすると ころは、トリプトファナーゼ遺伝子（ｔｎａＡ）及びラムダエンドリシン遺伝子 （λＲＲ，）を含むプラスミドにｔｒｐＥＤ安定を与えることである。これをど のように行なったかを正確に記載するために、２つの前駆体プラスミドの構築を 先ず記載する。先ず、ｐＧＸ２３００は、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位に よって囲包されたラムダＲＲ，遺伝子のみを有するプラスミドである。プラスミ ドｐＧＸ２２９４　（第６図に示し実施例６に記載）は５つのＲｓａ　１部位を 有し、これらのうちの１つはＳ遺伝子中のＲ遺伝子のＡＴＧ開始コドンの５°側 ５８塩基対のところにある。Ｓ遺伝子はアンバー突然変異を有し、Ｓ遺伝子の機 爺はプラスミド中では望まれないので、ＲＲ，遺伝子をｐＧＸ１０６６　（菌株 ＧＸ１１８６、ＡＴＣＣ３９９５５中に存在）中にサブクローニングするのにＲ ｓａ　１部位を用いプラスミドｐＧＸ２２９４（Ｉｓ　ｐＬｇ　）を反応混合物 ７５．１中でＲｓａ　Ｉで消化し、ｐＧＸＤＮＡ（１０ｐＬｇ）を５０ｐ、Ｉの 反応混合物中でＳｍａ　Ｉで消化した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用い、２．５　Ｊ ＬｇのＲｓａ　Ｉ消化ｐＧＸ２２９４と２．５　ｐｇのＳｍａ　Ｉ消化ｐＧＸ１ ０６６とを２０ｐｌ中で連結した。Ｒｓａｌ及び５ｅａｌエンドヌクレアーゼは Ｍ７１ｊとも平滑末端ＤＮＡを与えるのて、異なるＤＮＡが容易に連結する。連 結産物を旧ｎｄｍて消化し１次に低ＤＮＡＷ度（１０ｇ　ｇ／ｍＩ未満）で連結 し、プラスミドＤＮＡの再環化を行なった。大腸菌を形質転換するのにこの連結 混合物を用い、アンピシリン耐性コロニーを選択した。少数の形質転換体が予期 されるサイズ（４３７６ｂｐ＞のプラスミドに基いてスクリーニングされ、所望 の構造はＥｃｏＲＶ　、　Ｘｍｎ１．ＸｈｏＴ及びＰｖｕｌｌで消化することに よって確認された。このようなプラスミドの１つをｐＧＸ２３００ト命名Ｌ／　 ｊ、：　。

へＲＲ，遺伝子をｐＧＸ２３００から取り除き、プラスミド安定化のための毀Ｅ 　Ｄ遺伝子を含むプラスミドであるｐＧＸ２２８７（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５７８８ ）中に挿入した。プラスミドｐＧＸ２２８７Ｄ　Ｎ　Ａ　（１９，５Ｐｇ　”） をＮｃｏｌて１００＃Ｌｌの体積の反応混合物中で消化し、プラスミド　ｐＧＸ ２３００Ｄ　Ｎ　Ａ　（９ｇｇ）を１００．１の体積の反応混合物中て旧ｎｄｍ で消化した０両方のＤ　Ｎ　Ａ　（７，８１ＬｇのＮｅｏ　Ｉ消化ｐＧＸ２２８ ７Ｄ　Ｎ　Ａと３．６　ｇｇ　（７））Ｉｉｎｄｍ消化ｐＧＸ２３００Ｄ　Ｎ　 Ａ　）を、０．２５１ＬＭのｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ及びｄＣＴＰを 含む２００終ｌの反応混合物中て２５ユニツトの大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ（ Ｐｏ１１）で室温で３０分間処理し、Ｎｃｏｌ及び旧ｎｄｍ消化によって残され た一木釦ＤＮＡ末端ｉ分を埋めた。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、３．９　ｐＬｇのＮｃ ｏＴ消化Ｐｏ１１処理ｐＧＸ２２８７と、１．５５＃Ｌｇ　（７）Ｈｉｎｄｌｌ １１Ｆ消化Ｐｏ１ｌ処理ｐＧＸ２：１００Ｄ　Ｎ　Ａを含む３０ＪＬｌの反応混 合物中て高ＤＮＡ濃度連結を行なった。得られた全ての連結産物をＸｂａ　Ｉて １００ＪＬｌ中て消化し、比較的低ＤＮＡ濃度（２００終ｌ体積）で連結し、再 環化した。　ｔｒｐＥＤ突然変異を含む大腸菌ＧＸ１７］１を形質転換するのに この連結混合物を用いた。トリプトファンを含まない最少培地中で増殖できる形 質転換体を選択した。スクリーニングにより予期される大きさく９３６１ｂｐ） のプラスミドが同定され、クロロホルムを加えた後の溶解し易さ及び適当なエン ドヌクレアーゼ部位の存在により確認した。このようなプラスミドの１つをｐＧ Ｘ２３０１と命ローニングされて塩基配列か決定されており（エム・シー・プー リーとシー・ヤノフスキー、Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１４７：７８７−７９Ｊ　１９８１）　、プラス ミドｐＭＤ６上に入手可能である。ｔｎａＡ、　ｔｒｐＥＤ及び入ＲＲ，遺伝子 を有する複合プラスミドを得るために、ｐＭＤ６からのｔｎａ遺伝子をプラスミ ド　ｐＧＸ２：１０１中に挿入した。プラスミドｐＭＤ６（５，０ｇｇ　）　ド ブラスミド　ｐＧＸ２３０１　（４，９ＪＬｇ　）とをそれぞれＰｖｕ　Ｉで１ ．００ＪＬｌの反応体積中でそれぞれ消化した、これらのＤＮＡ　（２，５ｐ− ｇのｐｖｕｌ消化ｐＧＸ２３０１．１ｇｇのＰｖｕ　Ｉ消化ｐ　Ｍ　Ｄ　’Ｉｌ ｉ　）を２０ＪＬＩの反応体積中てＴ４リガーゼで連結した。連結産物をＢａｍ ＨＩて消化した。得られたＤＮＡの一部（２，１川ｇ）を２００ルーの体積中て 連結しＤＮＡを再原化させた。この連結混合物で大腸菌ＧＸ３０２１（Ｆ−、ｔ ｎａ２．　ｎａｄＡ：：ＴｎｌＯ，Δ　ｔｒｐＥＤｃＢＡ［入　Ｓユ８５７ΔＢ ＡＭΔ旧］Δ［ｃｈｌＤ−ｐｇｌｌを形質転換し、形質転換体は、１％グリセロ ール、１０　ｇ　ｇ／１（７）インド−ＪＬ／、　５０ｇｇ／１１のり、Ｌ−５ −メチルトリプトファン及び０．４ｚのカザミノ酸（ディフコ社、トリプトファ ンフリー）を含む最少培地中て増殖させ、トリプトファナーゼ遺伝子の存在に基 いて選択した。トリプトファナーゼ陽性形質転換体をさらにアンピシリン耐性に 基いて選択した。形質転換体から単離した予期される大きさく〜ｎｚｏｏｂｐ） のプラスミドにツイテ、大腸菌ＧＸ１７３４　（Ｆ−１ＡｔｒｐＥＤ１０２、膿 ２）ノ形質転換及び最少グルコース培地上へのブレーティングによりｔｒｐＥＤ 遺伝子の存在を調べた。１つの形質転換体をＧＸ１７３４（ｐＧＸ２３０８）と 命名し、メリーラント州ロックビル、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク ション（ＡＴＣＣ５３０５１）に寄託した。

実施例７ ＧＸ１７０５（ｐＧＸ２２３６）及びＧＸ］７０Ｓ（ｐＧＸ２３０２）　ニよル ＳＨＭＴ（７）生産 クレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０Ｓ（ｐＧＸ２２３６）、ＡＴＣＣ：＋ ９４０８及びＧＸ１７０Ｓ（ｐＧＸ２：１０２）　、　ＡＴＣＣ５３０５２を実 施例５に記載した手順に従って増殖させた。菌株ＧＸ１７０５（ｐＧＸ２３０２ ）はプラスミド上にエンドリシン遺伝子を有しており、この菌株の自己溶解が次 の実験で示された。

発酵の終りに有機溶媒（Ｃ）ＩｃＩ：ｌ又はＣＨ２Ｃｌ２）を発酵液に導入し、 遠心によって細胞破砕物を除去した後、８時間インキュベート後の上清のＳＨＭ Ｔ活性を調べた。

Ｂ、　ＣＨ２Ｃｌ２ ２％ＣＨＣｌ１の存在下て８時間インキュベートした大腸菌ＧＸ１７０５（ｐＧ Ｘ２３０２）からの粗ＳＨＭＴ抽出物を、遠心テ細胞破砕物を除去した後に回収 し、実施例５て記載した操作に従ってセリンを生産するのに用いた。２５時間反 応させると、　２．２Ｍのセリンが、残留する０、６Ｍのグリシンと共に生産さ れた。

２％Ｃ８２ＣＩ２の存在下て８時間インキュベートした大腸菌ＧＸ１７０５（ｐ ＧＸ２：１０２）からの粗ＳＨＭＴ抽出物を上述のようにして製造し、実施例５ で記載した操作に従ってセリンを生産するのに用いた。２４時間反応させると、 ２．３Ｍのセリンか、残留する０、５５Ｍのグリシンと共に生産された。

実施例９ セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）を実施例５に記載した ように製造した。実施例５と同様に、ＳＨＭＴ生物触媒を用いてｌ、−セリンを 製造した。セリン生成反応は２５時間行なった。

トリプトファナーゼを次の方法により製造した。大腸菌菌株ＧＸ］７３４（ｐＧ Ｘ２３０８）　ｃ７）　１　つノ：Ｉ　ｏ　ニーを２００ｍ１１７）下記培地■ に接種し、３７°Ｃで一夜振盪した。遠心により細胞を回収し、トリプトファナ ーゼ生物触媒として用いた。

培地■ に２１（ＰＯ４１０，５ｇ／ｌ ＫＨ２ＰＯ４４，５ｇ／１ （ＮＨ４）２ＳＯ４１ｇ／ｌ クエン酸ナトリウム−２８２００，５８ｇ／ｌグリセロール　１ｚ カザミノ酸　０．４ｚ 上記セリン生成反応からの全２５時間反応混合物を、２００１培養物からの大腸 菌菌株ＧＸ１７３４（ｐＧＸ２３０８）　（７）湿った細胞ペーストと混合した 。インドール（８，８ｇ）と水を加えて終体積を７５１とした。ｐｕを１０χＫ ＯＨで８．０に調整し、ピリドキサール−５−フォスフェートを終濃度が０．５ ｍＭになるように加えた。混合物は３７°Ｃで攪拌した。０及び２８時間後、ア ミノ酸をＨＰＬＣにより分析した。結果を次の表に示す。

Ｆ工αＪＲＥＩ ｐｉ学ゞ０２ ”Ｆ’−Ｇ、ｗ−ｅ−３ Ｆ′ＸΔ曝花　へ ｌ　Ｔ、　ＤＮＡリガーゼ（低ＤＮＡ濃度）国際調査報告 ｍａｔ″ａｘｉｏｍ　ａｅＤｌ＝Ｉｌ″”Ｎ″’　ＰＣＴ／ＬＪＳ８６１０１’ ｌ郭ｎｌｆｉｌｌＴＭｌｌｅｎｌｌ＾ｏｏｈｅｈｖａｐｓａ、ＰＣＴ／ＵＳＳ６ １００５３０

Claims (35)

【特許請求の範囲】
1. １．生物触媒量の酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと、補因子テ トラヒドロ葉酸と、酵素トリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼの 存在下で、Ｌ−トリプトファン生産条件下においてグリシン、ホルムアルデヒド 及びインドールを反応させることから成るＬ−トリプトファンの合成方法。
2. ２．生物触媒量の酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼと補因子テト ラヒドロ葉酸との存在下で、Ｌ−セリン生産条件下でグリシンとホルムアルデヒ ドとを反応させて反応混合物中にＬ−セリンを生成させ、次にＬ−トリプトファ ン生産条件下でインドールと生物触媒量の酵素トリプトファンシンテターゼ又は トリプトファナーゼとを加えてトリプトファンを生産する請求の範囲第１項記載 の方法。
3. ３．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファンシンテター ゼ又はトリプトファナーゼは、宿主微生物中での発現を指示する調節配列の制御 下にある、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファンシン テターゼまたはトリプトファナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有 する、形質転換微生物中の発現ベクターの発現によって生産され、反応混合物中 に提供される請求の範囲第１項記載の方法。
4. ４．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、宿主微生物中での発現を指 示する調節配列の制御下にある、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼの アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、形質転換微生物中の発現ベクタ ーの発現によって生産され、反応混合物中に提供されてＬ−セリンの生産を触媒 し、トリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼは、宿主微生物中での 発現を指示する調節配列の制御下にある、トリプトファンシンテターゼ又はトリ プトファナーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を有する、形質転換微生 物中の発現ベクターの発現によって生産され、反応混合物中に提供されてＬ−ト リプトファンの生産を触媒する、請求の範囲第２項記載の方法。
5. ５．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファンシンテター ゼ又はトリプトファナーゼは、発現されたセリンヒドロキシメチルトランスフェ ラーゼ及びトリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼを含み破壊され た細胞膜を有する全細胞を反応混合物中に加えることによって反応混合物中に提 供される請求の範囲第３項記載の方法。
6. ６．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ及びトリプトファンシンテター ゼ又はトリプトファナーゼは、発現されたセリンヒドロキシメチルトランスフェ ラーゼ及びトリプトファンシンテターゼ又はトリプトファナーゼを含み破壊され た細胞膜を有する全細胞を反応混合物中に加えることによって反応混合物中に提 供される請求の範囲第４項記載の方法。
7. ７．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、関連するプロモーター−オ ペレーター配列と機能的に連関したトリプトファンオペロンと、関連するプロモ ーター−オペレーター配列と機能的に連関したＳＨＭＴ（ｇｌｙＡ）遺伝子とを 含む複製可能なプラスミド発現ビークルを有する形質転換微生物中で生産される 請求の範囲第５項記載の方法。
8. ８．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは、関連するプロモーター−オ ペレーター配列と機能的に連関したトリプトファンオペロンと、関連するプロモ ーター−オペレーター配列と機能的に連関したＳＨＭＴ（ｇｌｙＡ）遺伝子とを 含む複製可能なプラスミド発現ビークルを有する形質転換微生物中で生産される 請求の範囲第６項記載の方法。
9. ９．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼがその中で生産される前記形質 転換微生物は、形質転換されたｔｒｐ突然変異株である請求の範囲第７項記載の 方法。
10. １０．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼがその中で生産される前記形 質転換微生物は、形質転換されたｔｒｐ突然変異株である請求の範囲第８項記載 の方法。
11. １１．その中でセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが生産される前記形 質転換微生物は、ｐＧＸ２２３６、ｐＧＸ２２３７及びｐＧＸ２３０２から成る 群より選ばれるもので形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０ ５である請求の範囲第９項記載の方法。
12. １２．その中でセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼが生産される前記形 質転換微生物は、ｐＧＸ２２３６、ｐＧＸ２２３７及びｐＧＸ２３０２から成る 群より選ばれるもので形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌株ＧＸ１７０ ５である請求の範囲第１０項記載の方法。
13. １３．トリプトファンシンテターゼがその中で生産される形質転換微生物はｐＧ Ｘ２２１３、ｐＧＸ２２１４及びｐＧＸ１５０から成る群より選ばれるプラスミ ドによって形質転換されたクレブシラ・アエロゲネスである、酵素トリプトファ ンシンテターゼを用いる請求の範囲第１１項記載の方法。
14. １４．トリプトファンシンテターゼがその中で生産される形質転換微生物はｐＧ Ｘ２２１３、ｐＧＸ２２１４及びｐＧＸ１５０から成る群より選ばれるプラスミ ドによって形質転換されたクレブシラ・アエロゲネスである、酵素トリプトファ ンシンテターゼを用いる請求の範囲第１２項記載の方法。
15. １５．トリプトファナーゼがその中で生産される形質転換微生物は、プラスミド ｐＧＸ２３０８によって形質転換された大腸菌である、酵素トリプトファナーゼ を用いる請求の範囲第１１項記載の方法。
16. １６．トリプトファナーゼがその中で生産される形質転換微生物は、プラスミド ｐＧＸ２３０８によって形質転換された大腸菌である、酵素トリプトファナーゼ を用いる請求の範囲第１２項記載の方法。
17. １７．発現ベクターの少なくとも１つが、ラムダファージエンドリシンタンパク 質のアミノ酸をコードする発現可能な遺伝子をさらに含む請求の範囲第３項記載 の方法。
18. １８．セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは形質転換株クレブシラ・ア エロゲネスＧＸ１７０５（ｐＧＸ２３０２）ＡＴＣＣ５３０５２によって生産さ れ、トリプトファナーゼは形質転換株大腸菌ＧＸ１７３４（ｐＧＸ２３０８）Ａ ＴＣＣ５３０５１によって生産される請求の範囲第１７項記載の方法。
19. １９．（ａ）レプリコン、 （ｂ）関連するブロモーター−オペレーター配列に機能的に連関するセリンヒド ロキシメチルトランスフェラーゼのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列、及び （Ｃ）関連するブロモーター−オペレーター配列に機能的に連関したトリプトフ ァンオペロンをコードするＤＮＡ配列を有する複製可能なプラスミド発現ベクタ ー。
20. ２０．ｐＧＸ２２３６、ｐＧＸ２２３７及びｐＧＸ２３０２から成る群より選ば れる、請求の範囲第１９項記載の複製可能なプラスミド発現ベクター。
21. ２１．請求の範囲第１９項記載の複製可能なプラスミド発現ベクターにより形質 転換された形質転換微生物。
22. ２２．請求の範囲第２０項記載の複製可能なプラスミド発現ベクターにより形質 転換された形質転換微生物。
23. ２３．形質転換された微生物はｔｒｐ突然変異株である特許請求の範囲第２１項 記載の形質転換微生物。
24. ２４．形質転換された微生物はｔｒｐ突然変異株である特許請求の範囲第２２項 記載の形質転換微生物。
25. ２５．プラスミドｐＧＸ２２３６で形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌 株ＧＸ１７０５，ＡＴＣＣ３９４０８。
26. ２６．プラスミドｐＧＸ２２３７で形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌 株ＧＸ１７０５，ＡＴＣＣ３９４０７。
27. ２７．プラスミドｐＧＸ２３０２で形質転換されたクレブシラ・アエロゲネス菌 株ＧＸ１７０５，ＡＴＣＣ５３０５１。
28. ２８．プラスミドｐＧＸ２３０８で形質転換された大腸菌菌株ＧＸ１７３４，Ａ ＴＣＣ５３０５１。
29. ２９．（ａ）トリプトファンオべロンとｇｌｙＡ遺伝子とを含む発現ベクターで 形質転換されたトリプトファン突然変異宿主細胞を包含する、形質転換微生物を 培養して酵素セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ＳＨＭＴ）を生産し 、 （ｂ）培養した微生物の細胞壁を破壊してＳＨＭＴを放出させ、 （ｃ）ホルムアルデヒド、グリシン及びテトラヒドロ葉酸を、反応を触媒するの に効果的な量の、細胞壁が破壊された培養微生物又はこれから単離されたＳＨＭ 丁を含む水性反応媒体中で反応させることから成る、Ｌ−セリンの合成方法。
30. ３０．発現ベクターはまたλファージのＲ及びＲｚ遺伝子を含み、細胞壁はエン ドリシンの作用によって酵素的に破壊される請求の範囲第２９項記載の方法、。
31. ３１．ホルムアルデヒドは、Ｌ−セリンが反応混合物中に蓄積されるにつれて小 さくなる速度で連続的に水性反応媒体中に供給され、それによって反応混合物中 のホルムアルデヒドの濃度を、ホルムアルデヒドがＳＨＭＴ活性を阻害する濃度 未溝の濃度に維持する請求の範囲第２９項記載の方法。
32. ３２．発現ベクターはｐＧＸ２３０２、ｐＧＸ２２３６及びｐＧＸ２５２２３７ から成る群より選ばれる請求の範囲第２９項記載の方法。
33. ３３．形質転換微生物は、ｐＧＸ２３０２、ｐＧＸ２２３６及びｐＧＸ２２３７ から成る群より選ばれるプラスミドによって形質転換されたクレプシラ・アエロ ゲネス菌株１７０５である請求の範囲第２９項記載の方法。
34. ３４．発現ベクターはプラスミドｐＧＸ２３０２である請求の範囲第２９項記載 の方法。
35. ３５．形質転換微生物はプラスミドｐＧＸ２３０２で形質転換されたクレプシラ ・アエロゲネス菌株１７０５である請求の範囲第２９項記載の方法。