JP2509552B2 - 生合成の方法およびその細胞 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明はイン ビボで目的の化合物を産生する事に関
する。
する。
化合物を産生するイン ビボ法の基本的制限は生物が
しばしば生物自身の要求に十分な量だけに限定して合成
する調節機構を持つていることであり、それにより生物
の原料およびエネルギーの浪費を避けている。しばしば
生合成の調節は遺伝子発現のレベルで行なわれる。例え
ば特定の化合物の十分または過度の量は、その化合物の
生合成経路の反応を触媒する一つまたはそれ以上の酵素
の合成を中止する。酵素をコードする構造遺伝子の近く
に位置する遺伝子配列が酵素の発現を調節する。ある場
合には１種類以上の調節配列が遺伝子に結合している。
そのような調節配列にはプロモーター、オペレーター、
アテニユエーター、アンチターミネーター、リボソーム
結合部位および陽性エフエクターのための部位などが挙
げられる。
しばしば生物自身の要求に十分な量だけに限定して合成
する調節機構を持つていることであり、それにより生物
の原料およびエネルギーの浪費を避けている。しばしば
生合成の調節は遺伝子発現のレベルで行なわれる。例え
ば特定の化合物の十分または過度の量は、その化合物の
生合成経路の反応を触媒する一つまたはそれ以上の酵素
の合成を中止する。酵素をコードする構造遺伝子の近く
に位置する遺伝子配列が酵素の発現を調節する。ある場
合には１種類以上の調節配列が遺伝子に結合している。
そのような調節配列にはプロモーター、オペレーター、
アテニユエーター、アンチターミネーター、リボソーム
結合部位および陽性エフエクターのための部位などが挙
げられる。
Bernardら〔Gene5:59-75（1979）〕およびRemautら
〔Gene15:81-93（1981）〕はトリプトフアン合成経路の
酵素に関するサルモネラ遺伝子を含む制限フラグメント
をベクターのフアージPLプロモーターの下流へ挿入する
ことについて記載している。遺伝子の発現はPLの制御下
で行われる。Bernardのものは特異的にtrpオペロン遺伝
子を包含する。
〔Gene15:81-93（1981）〕はトリプトフアン合成経路の
酵素に関するサルモネラ遺伝子を含む制限フラグメント
をベクターのフアージPLプロモーターの下流へ挿入する
ことについて記載している。遺伝子の発現はPLの制御下
で行われる。Bernardのものは特異的にtrpオペロン遺伝
子を包含する。
Bernardはまた測定可能な酵素を特定する遺伝子を運搬
するプロモーターなしのDNAフラグメントを前記の発現
ベクターのEcoRI部位に挿入する事が可能であると言つ
ている。RemautのものはトリプトフアンシンセターゼＡ
のための遺伝子を包含している。
するプロモーターなしのDNAフラグメントを前記の発現
ベクターのEcoRI部位に挿入する事が可能であると言つ
ている。RemautのものはトリプトフアンシンセターゼＡ
のための遺伝子を包含している。
Franklin〔ラムダバクテリオフアージ,pp621-638;Col
d Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY
（Hershey編集）（1971）〕およびDavisonら〔Mol.Gen,
Genet,130:9-20（1974）〕はラムダフアージのPLプロモ
ーターまたは天然に存在するプロモーターからのトリプ
トフアンオペロンの転写について記載している。
d Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY
（Hershey編集）（1971）〕およびDavisonら〔Mol.Gen,
Genet,130:9-20（1974）〕はラムダフアージのPLプロモ
ーターまたは天然に存在するプロモーターからのトリプ
トフアンオペロンの転写について記載している。
Stryer〔生化学，第２版.pp675-678（Freeman and C
o.San Francisco 1981）〕によれば、trpおよびtrpＢを
含め、天然に存在する大腸菌のトリプトフアンオペロン
の発現は、トリプトフアンとtrpＲ遺伝子生成物との複
合体によるオペレーター共抑制を受ける。そのオペロン
の発現はまたリーダーペプチド合成におけるトリプトフ
アンの利用可能性に依存するリーダーペプチドアテニユ
エーション制御によつても調節される。
o.San Francisco 1981）〕によれば、trpおよびtrpＢを
含め、天然に存在する大腸菌のトリプトフアンオペロン
の発現は、トリプトフアンとtrpＲ遺伝子生成物との複
合体によるオペレーター共抑制を受ける。そのオペロン
の発現はまたリーダーペプチド合成におけるトリプトフ
アンの利用可能性に依存するリーダーペプチドアテニユ
エーション制御によつても調節される。
Tribe（オーストラリア特許出願72727/81）はコリス
メート・ムターゼ−プレフエネート・デヒドラターゼ
（CMPD）および３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソネート−７−ホスフエート（DAHP）シンセターゼの野
生型の調節を行う株において見いだされるより高い水準
のこれらの酵素を産生するように突然変異させた大腸菌
突然変異株について記載している。
メート・ムターゼ−プレフエネート・デヒドラターゼ
（CMPD）および３−デオキシ−Ｄ−アラビノ−ヘプツロ
ソネート−７−ホスフエート（DAHP）シンセターゼの野
生型の調節を行う株において見いだされるより高い水準
のこれらの酵素を産生するように突然変異させた大腸菌
突然変異株について記載している。
Sninskyら（米国特許第4,374,927号）はlacプロモー
ターオペレーターのクロラムフエニコールアセチルトラ
ンスフエラーゼの構造遺伝子への融合について記載して
いる。構造遺伝子の発現はその活性が温度相関している
レプレツサーにより調節されている。
ターオペレーターのクロラムフエニコールアセチルトラ
ンスフエラーゼの構造遺伝子への融合について記載して
いる。構造遺伝子の発現はその活性が温度相関している
レプレツサーにより調節されている。
Chemical Abstracts（1982）97:180140e（特願昭55-1
54,706号明細書）には、リプレツサーによりフイードバ
ツク阻害抵抗性のtrpオペロンを含む大腸菌株について
記載されている。
54,706号明細書）には、リプレツサーによりフイードバ
ツク阻害抵抗性のtrpオペロンを含む大腸菌株について
記載されている。
Sprinsonら〔Acta.Microbiol.Acad.Sci.Hung・23:167
-170（1976）〕はフエニルアラニン類似体に抵抗し、DA
HPシンセターゼ（tyr）およびプレフエネートデヒドロ
ゲナーゼ（aro）に対等な非抑制を示すサルモネラ突然
変異体について記載している。
-170（1976）〕はフエニルアラニン類似体に抵抗し、DA
HPシンセターゼ（tyr）およびプレフエネートデヒドロ
ゲナーゼ（aro）に対等な非抑制を示すサルモネラ突然
変異体について記載している。
Modrichら（1983年８月29日付のUSSN527,490）は、Ec
oRIエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの遺伝子をラ
ムダプロモーターの下流に位置させ、そのプロモーター
により発現されるようにせしめ、それによりラムダリプ
レツサーによる制御を利用することについて記載してい
る。報告されている構成におけるこれら大腸菌遺伝子の
振舞いは天然に存在する内部プロモーターを含んでいる
事を示している。
oRIエンドヌクレアーゼおよびメチラーゼの遺伝子をラ
ムダプロモーターの下流に位置させ、そのプロモーター
により発現されるようにせしめ、それによりラムダリプ
レツサーによる制御を利用することについて記載してい
る。報告されている構成におけるこれら大腸菌遺伝子の
振舞いは天然に存在する内部プロモーターを含んでいる
事を示している。
Roodら〔J.Bacteriology144:552（1980）〕はプラス
ミド上のオペロンの調節領域が特定のリプレツサーの制
御を受けないように変換されたチロシンオペロンにより
コードされた酵素の過剰産生のために設計されたある種
のプラスミドについて記載している。そのようなプラス
ミドは挿入または欠失により改変され、チロシンオペロ
ンの発現の水準が減少する事が報告されている。
ミド上のオペロンの調節領域が特定のリプレツサーの制
御を受けないように変換されたチロシンオペロンにより
コードされた酵素の過剰産生のために設計されたある種
のプラスミドについて記載している。そのようなプラス
ミドは挿入または欠失により改変され、チロシンオペロ
ンの発現の水準が減少する事が報告されている。
Liuら〔J.Biol.Chem.258:7469-7475（1983）〕はグア
ニン−キサンチンホスホリボシルトランスフエラーゼを
コードする遺伝子をラムダフアージ左方プロモーターの
制御下に置くことについて記載している。
ニン−キサンチンホスホリボシルトランスフエラーゼを
コードする遺伝子をラムダフアージ左方プロモーターの
制御下に置くことについて記載している。
De Boerら〔PNAS USA80:21-25（1982）〕はlacおよび
trpプロモーターから生じるハイブリツドプロモーター
の影響下にある酵素ガラクトキナーゼの発現について記
載している。ハイブリツドプロモーターはlacリプレツ
サーにより抑制できる。
trpプロモーターから生じるハイブリツドプロモーター
の影響下にある酵素ガラクトキナーゼの発現について記
載している。ハイブリツドプロモーターはlacリプレツ
サーにより抑制できる。
Jacobら〔J.of Molecular Biology13:704-719（196
5）〕は、lacオペロンの一部をpurオペロンの一部に融
合させ、プリンにより抑制性調節を受ける新しいオペロ
ンを形成する遺伝的欠失を持つ突然変異体の単離につい
て記載している。
5）〕は、lacオペロンの一部をpurオペロンの一部に融
合させ、プリンにより抑制性調節を受ける新しいオペロ
ンを形成する遺伝的欠失を持つ突然変異体の単離につい
て記載している。
Casadabanら〔Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA79（９）:453
0-4533（1979）〕はlacプロモーターを除いたラクト−
スオペロン（lac）構造遺伝子を非−lacオペロンプロモ
ーターに融合させる技術について記載しており、それに
よりlacオペロンは非−lacオペロンプロモーターの制御
下発現される。
0-4533（1979）〕はlacプロモーターを除いたラクト−
スオペロン（lac）構造遺伝子を非−lacオペロンプロモ
ーターに融合させる技術について記載しており、それに
よりlacオペロンは非−lacオペロンプロモーターの制御
下発現される。
Backmanら〔Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA71:4174（197
6）〕はlacオペロンのプロモーターをλバクテリオフア
ージのリプレツサー遺伝子（cＩ）に隣接して位置させ
たプラスミドの遺伝子組み換え技術による構成について
記載している。かくてλリプレツサーの合成はlacオペ
レーターおよびプロモーターにより調節される。利用可
能なlacリプレツサーに比較して過剰のlacオペレーター
部位を供給すばλリプレツサーの合成が増加する。
6）〕はlacオペロンのプロモーターをλバクテリオフア
ージのリプレツサー遺伝子（cＩ）に隣接して位置させ
たプラスミドの遺伝子組み換え技術による構成について
記載している。かくてλリプレツサーの合成はlacオペ
レーターおよびプロモーターにより調節される。利用可
能なlacリプレツサーに比較して過剰のlacオペレーター
部位を供給すばλリプレツサーの合成が増加する。
本発明は生合成経路により目的の化合物を産生する形
質転換細胞のための発現ベクターを提供することを第１
の目的とする。このベクターは１つの合成オペロンをな
す少くとも２つの構造遺伝子を含み、ベクターの構成に
おいて単一の調節配列およびプロモーターの制御下で発
現されるものである。これに対し、天然に起こる構成で
はオペロン遺伝子に対応する各遺伝子は明白に分離した
調節配列の制御下に発現される。このオペロンの各遺伝
子は各々生合成経路の各酵素をコードし、少くともこれ
らの遺伝子の１つはフイードバツクにより抑制されな
い。少くともオペロン遺伝子の１つに対応する天然の遺
伝子はフイードバツクにより抑制される。フイードバツ
ク抑制されるとは、天然遺伝子の発現が経路の中間体ま
たは生成物などの制御物質により抑制を受けることを意
味する。対応するオペロン遺伝子が抑制されないとは、
抑制された天然の遺伝子に対しベクタープロモーターが
外来性であることを示し、生合成経路の中間体または生
成物からの抑制なしにオペロン遺伝子が発現されること
をいう。外来性のものとは、プロモーターが対応する天
然の遺伝子の転写を開始させる位置に自然に存在しない
ことを意味する。従つて、本発明ベクターは生合成経路
生成物並びにすべての生合成経路中間体の存在下でもオ
ペロン遺伝子の非阻害発現を可能にする。
質転換細胞のための発現ベクターを提供することを第１
の目的とする。このベクターは１つの合成オペロンをな
す少くとも２つの構造遺伝子を含み、ベクターの構成に
おいて単一の調節配列およびプロモーターの制御下で発
現されるものである。これに対し、天然に起こる構成で
はオペロン遺伝子に対応する各遺伝子は明白に分離した
調節配列の制御下に発現される。このオペロンの各遺伝
子は各々生合成経路の各酵素をコードし、少くともこれ
らの遺伝子の１つはフイードバツクにより抑制されな
い。少くともオペロン遺伝子の１つに対応する天然の遺
伝子はフイードバツクにより抑制される。フイードバツ
ク抑制されるとは、天然遺伝子の発現が経路の中間体ま
たは生成物などの制御物質により抑制を受けることを意
味する。対応するオペロン遺伝子が抑制されないとは、
抑制された天然の遺伝子に対しベクタープロモーターが
外来性であることを示し、生合成経路の中間体または生
成物からの抑制なしにオペロン遺伝子が発現されること
をいう。外来性のものとは、プロモーターが対応する天
然の遺伝子の転写を開始させる位置に自然に存在しない
ことを意味する。従つて、本発明ベクターは生合成経路
生成物並びにすべての生合成経路中間体の存在下でもオ
ペロン遺伝子の非阻害発現を可能にする。
第１の目的に於る好ましい具体例においては、非抑制
遺伝子生成物が生合成経路における律速反応を触媒す
る。非抑制オペロン遺伝子に対応する天然の遺伝子の発
現は２つの調節機構を受ける：即ち、１）天然に存在す
る調節DNAがコードしたリーダーペプチドが調節DNA転写
上のアテニユエーター部位の構造を変化させ、構造遺伝
子の発現を阻害するリーダー／アテニユエーター抑制
（リーダーペプチドの合成速度は生合成経路中間体また
は生成物の利用しやすさに依存している）；および２）
生合成経路中間体または生成物がリプレツサータンパク
質と相互作用して天然に存在する調節DNAのオペレータ
ー部位に結合し、構造遺伝子の転写を妨害するオペレー
ター／リプレツサー抑制の調節を受ける。対応する非抑
制遺伝子の両方の型の天然の制御のためのフイードバツ
ク制御物質は同一であり、生合成経路のアミノ酸生成物
である（例えばＬ−フエニルアラニン）。最も良好なベ
クタープロモーターは、pBR322のlacプロモーター、aro
Ｆプロモーターまたはtetプロモーターである。他の良
好なプロモーターにはaroＨプロモーターおよびフアー
ジm13遺伝子IIプロモーターがあげられる。オペロン遺
伝子は、pheＡおよびaroＦまたはaroHがあげられる。
遺伝子生成物が生合成経路における律速反応を触媒す
る。非抑制オペロン遺伝子に対応する天然の遺伝子の発
現は２つの調節機構を受ける：即ち、１）天然に存在す
る調節DNAがコードしたリーダーペプチドが調節DNA転写
上のアテニユエーター部位の構造を変化させ、構造遺伝
子の発現を阻害するリーダー／アテニユエーター抑制
（リーダーペプチドの合成速度は生合成経路中間体また
は生成物の利用しやすさに依存している）；および２）
生合成経路中間体または生成物がリプレツサータンパク
質と相互作用して天然に存在する調節DNAのオペレータ
ー部位に結合し、構造遺伝子の転写を妨害するオペレー
ター／リプレツサー抑制の調節を受ける。対応する非抑
制遺伝子の両方の型の天然の制御のためのフイードバツ
ク制御物質は同一であり、生合成経路のアミノ酸生成物
である（例えばＬ−フエニルアラニン）。最も良好なベ
クタープロモーターは、pBR322のlacプロモーター、aro
Ｆプロモーターまたはtetプロモーターである。他の良
好なプロモーターにはaroＨプロモーターおよびフアー
ジm13遺伝子IIプロモーターがあげられる。オペロン遺
伝子は、pheＡおよびaroＦまたはaroHがあげられる。
本発明は宿主細胞中でフエニルアラニンを産生する発
現ベクターを提供することを第２の目的とする。このベ
クターはpheＡ構造遺伝子およびpheＡ構造遺伝子に対し
て外来性でありフエニルアラニン合成経路中間体および
生成物の存在下、宿主細胞中でpheＡ遺伝子を発現させ
るのに有効な調節配列を含む人工構成物である。
現ベクターを提供することを第２の目的とする。このベ
クターはpheＡ構造遺伝子およびpheＡ構造遺伝子に対し
て外来性でありフエニルアラニン合成経路中間体および
生成物の存在下、宿主細胞中でpheＡ遺伝子を発現させ
るのに有効な調節配列を含む人工構成物である。
第２の目的の好ましい具体例においては、pheＡ遺伝
子は構造遺伝子から天然に存在する調節配列を除くこと
により天然のpheＡから誘導される。良好な調節配列は
前記第１の目的で記載したものである。
子は構造遺伝子から天然に存在する調節配列を除くこと
により天然のpheＡから誘導される。良好な調節配列は
前記第１の目的で記載したものである。
本発明の他の目的は、前記ベクターの１つで遺伝子操
作された宿主細胞および培養培地中で細胞を成長せしめ
て目的の化合物を作り、その培地から生成物を回収する
ことを特徴とする。
作された宿主細胞および培養培地中で細胞を成長せしめ
て目的の化合物を作り、その培地から生成物を回収する
ことを特徴とする。
上記目的の良好な具体例においては、細胞が大腸菌で
あり、目的の化合物はフエニルアラニンである。
あり、目的の化合物はフエニルアラニンである。
本発明は正常の合成−阻害調節機構を持たず、したが
つて高濃度の生成物に応答して合成低下しない前記の遺
伝子操作した細胞により化合物を産生することを可能に
する。多くの応用例において、生成物が生成されるとそ
れは上清環境に放出され生化学物質の回収をより簡便に
している。
つて高濃度の生成物に応答して合成低下しない前記の遺
伝子操作した細胞により化合物を産生することを可能に
する。多くの応用例において、生成物が生成されるとそ
れは上清環境に放出され生化学物質の回収をより簡便に
している。
本発明の遺伝子工学ベクターは天然の調節機作を無効
にすることができる（例えばリーダー／アテニユエータ
ー調節およびオペレーター／レプレツサー調節）。特
に、外来性の調節DNAが、生合成経路を支配する酵素と
して遺伝子生成物に関する遺伝子の発現を有効に制御で
き、この発見はフアージm13遺伝子IIプロモーターおよ
びpBR322のtetプロモーターのごとき他のプロモーター
にも広く応用できる。最後に、同一の合成オペロン中に
数種の生合成経路遺伝子を包含させることは、効率的
で、形質転換を単純化し、必要な遺伝子要素の総数を減
少させ、それにより遺伝子操作した微生物のゲノムの複
雑さを減少させる。
にすることができる（例えばリーダー／アテニユエータ
ー調節およびオペレーター／レプレツサー調節）。特
に、外来性の調節DNAが、生合成経路を支配する酵素と
して遺伝子生成物に関する遺伝子の発現を有効に制御で
き、この発見はフアージm13遺伝子IIプロモーターおよ
びpBR322のtetプロモーターのごとき他のプロモーター
にも広く応用できる。最後に、同一の合成オペロン中に
数種の生合成経路遺伝子を包含させることは、効率的
で、形質転換を単純化し、必要な遺伝子要素の総数を減
少させ、それにより遺伝子操作した微生物のゲノムの複
雑さを減少させる。
これらの要素は遺伝子発現の高い水準を支え、それに
より経路中の律速反応の速度を増加させるとともに、オ
ペロン遺伝子生成物により触媒される他の生合成経路の
速度も増加させる。
より経路中の律速反応の速度を増加させるとともに、オ
ペロン遺伝子生成物により触媒される他の生合成経路の
速度も増加させる。
本発明の他の特徴および利点は以下に記載する好まし
い具体例および特許請求の範囲から明らかになろう。
い具体例および特許請求の範囲から明らかになろう。
好ましい具体例の説明 最初に簡単に図面を記載する。
図面 第１図〜４図は遺伝子工学によるプラスミドpKB663、
pKB750およびpKB766の造成工程を表わすダイアグラムで
ある。
pKB750およびpKB766の造成工程を表わすダイアグラムで
ある。
発現ベクター 目的の生成化合物を幾段階かの合成経路を経て細胞に
より合成させることが遺伝子−発現調節のねらいであ
る。合成経路の１段階の調節は、１つの酵素遺伝子の発
現の水準を変化させて、細胞中の酵素の量を変化させる
ことにより達成され、そのような調節には調節される遺
伝子に隣接するDNA配列が関与する。
より合成させることが遺伝子−発現調節のねらいであ
る。合成経路の１段階の調節は、１つの酵素遺伝子の発
現の水準を変化させて、細胞中の酵素の量を変化させる
ことにより達成され、そのような調節には調節される遺
伝子に隣接するDNA配列が関与する。
そのような調節DNA配列をDNA組み換え技術により、異
型の調節配列に置きかえて生合成経路の正常な調節を打
破するために使用し、正常な調節ではもはや産生を停止
するような範囲を超えて生化学物質の産生を増加させ
る。
型の調節配列に置きかえて生合成経路の正常な調節を打
破するために使用し、正常な調節ではもはや産生を停止
するような範囲を超えて生化学物質の産生を増加させ
る。
非抑制に選択される経路段階は律速段階であるべきで
あり、非抑制の成功により生成物収率の増加を示す。２
重−機構−抑制酵素が特別の標的である。両方の抑制機
構の不活性化のために、発現を非抑制化しようとする構
造遺伝子と共に天然に存在する調節DNAを除去し、外来
性のプロモーター（即ち、天然に存在する構造では遺伝
子の発現を支配しないもの）を加えることが好ましい。
あり、非抑制の成功により生成物収率の増加を示す。２
重−機構−抑制酵素が特別の標的である。両方の抑制機
構の不活性化のために、発現を非抑制化しようとする構
造遺伝子と共に天然に存在する調節DNAを除去し、外来
性のプロモーター（即ち、天然に存在する構造では遺伝
子の発現を支配しないもの）を加えることが好ましい。
合成オペロンを特徴とする良好な具体例においては、
プロモーターは両方の遺伝子に対して外来性であるか、
または非抑制のために選択した遺伝子のみに対し外来性
であろう。２つの合成オペロン遺伝子は互いに接近して
いるべきであるが、短くてもまたはかなり長くてもよ
く、その間の配列が遺伝子間に転写を停止させる信号が
なければよい。各々の合成オペロン遺伝子は天然に存在
する遺伝子の構造成分に対応する。“対応する”という
術語はオペロン遺伝子が天然に存在する構造遺伝子と同
一かまたは十分に相関していることを意味し、オペロン
遺伝子は、天然の遺伝子生産物に触媒される反応を触媒
する酵素をコードする。
プロモーターは両方の遺伝子に対して外来性であるか、
または非抑制のために選択した遺伝子のみに対し外来性
であろう。２つの合成オペロン遺伝子は互いに接近して
いるべきであるが、短くてもまたはかなり長くてもよ
く、その間の配列が遺伝子間に転写を停止させる信号が
なければよい。各々の合成オペロン遺伝子は天然に存在
する遺伝子の構造成分に対応する。“対応する”という
術語はオペロン遺伝子が天然に存在する構造遺伝子と同
一かまたは十分に相関していることを意味し、オペロン
遺伝子は、天然の遺伝子生産物に触媒される反応を触媒
する酵素をコードする。
他のオペロン成分を選択すれば他の経路の酵素を高度
に発現する構成を造製することが可能である。１つの良
好な選択は他の速度−決定的経路段階である。他のオペ
ロン成分もまた調節物質の遺伝子の選択によりクローニ
ング過程を単純化するため選択され、ベクター上で使用
される。その場合、オペロンの３′末端は非抑制構造遺
伝子であり、および５′末端は天然に存在する調節配列
を有する他方のオペロン構成員であつてよい。
に発現する構成を造製することが可能である。１つの良
好な選択は他の速度−決定的経路段階である。他のオペ
ロン成分もまた調節物質の遺伝子の選択によりクローニ
ング過程を単純化するため選択され、ベクター上で使用
される。その場合、オペロンの３′末端は非抑制構造遺
伝子であり、および５′末端は天然に存在する調節配列
を有する他方のオペロン構成員であつてよい。
もしオペロンの両方の構成員に対して異型性又は外来
性のプロモーターを使用するなら、構成員は任意順序に
結合できる。追加の構造遺伝子をオペロンに加えてもよ
く、それらの１つ以上がその天然に存在する構造ではフ
イードバツク抑制を受けるが、それはオペロンへの挿入
により非抑制となるようにすることができる。
性のプロモーターを使用するなら、構成員は任意順序に
結合できる。追加の構造遺伝子をオペロンに加えてもよ
く、それらの１つ以上がその天然に存在する構造ではフ
イードバツク抑制を受けるが、それはオペロンへの挿入
により非抑制となるようにすることができる。
以下の３つの実施例で好ましいベクターpKB663、pKB7
12およびpKB750を説明する。
12およびpKB750を説明する。
天然ではフエニルアラニンの存在量に応答して調節さ
れている大腸菌のpheＡの発現の非抑制によりアミノ酸
Ｌ−フエニルアラニンを合成するのに各々のベクターは
有用である。pheＡの生成物（２重−機構酵素コリスメ
ートムターゼ−プレフエネートデヒドラターゼ）はフエ
ニルアラニン生合成の終わりから２番目の段階に影響す
る。pheＡ発現の調節はリプレツサー／オペレーター系
およびリーダーペプチド／アテニユエーター系の両方で
起こる。十分または過剰のフエニルアラニンが存在する
場合、pheＡの発現が止まりフエニルアラニン合成が中
止される。
れている大腸菌のpheＡの発現の非抑制によりアミノ酸
Ｌ−フエニルアラニンを合成するのに各々のベクターは
有用である。pheＡの生成物（２重−機構酵素コリスメ
ートムターゼ−プレフエネートデヒドラターゼ）はフエ
ニルアラニン生合成の終わりから２番目の段階に影響す
る。pheＡ発現の調節はリプレツサー／オペレーター系
およびリーダーペプチド／アテニユエーター系の両方で
起こる。十分または過剰のフエニルアラニンが存在する
場合、pheＡの発現が止まりフエニルアラニン合成が中
止される。
phe−関連プロモーター／オペレーターおよびリーダ
ーペプチド／アテニユエーターのDNAを他のプロモータ
ーからのDNAと置きかえる。そのような構成物を持つ細
胞は多くなつたフエニルアラニンに応答してpheＡの発
現を停止しないだけでなくフエニルアラニン生合成も中
止しない。その結果、そのような細胞はフエニルアラニ
ンを上清環境中に放出する。
ーペプチド／アテニユエーターのDNAを他のプロモータ
ーからのDNAと置きかえる。そのような構成物を持つ細
胞は多くなつたフエニルアラニンに応答してpheＡの発
現を停止しないだけでなくフエニルアラニン生合成も中
止しない。その結果、そのような細胞はフエニルアラニ
ンを上清環境中に放出する。
実施例 pKB663の造成 フエニルアラニン産生のための１つの
発現ベクターを第１図に例示した。大腸菌のpheＡ遺伝
子を有するが、しかしその関連したプロモーター、オペ
レーター、リーダーペプチドまたはアテニユエーターを
有しないDNAフラグメントをプラスミドpKB45〔Zurawski
ら、Proceedings of the National Academy of Science
s75:4271-4274（1978）〕からエンドヌクレアーゼStuＩ
およびBglIIで消化して得る。次の段階はプラスミドpKB
430を含み、このものはpBR322の誘導体であり、pBR322
のエンドヌクレアーゼPvuII切断部位にクローニングし
たラクト−スオペロンプロモーター−オペレーターを含
有する95bpのAluＩ生成DNAフラグメントを有し、その際
新しいPvuII部位はlacプロモーターおよびpBR322配列の
境界に生成しており、lac転写はこのPvuII部位を通つて
tet領域の方向へ進行するようになつている。pheＡ−含
有DNAフラグメントを常法〔Bolivar,F.およびBackman,
K.Methods in Enzymology,68巻（1980）〕に従いpKB430
中のPvuIIおよびBamHI切断部位間にクローニングしてpK
B663を得る。pheＡ遺伝子に加え、pKB663はまたβ−ラ
クタム抗生物質抵抗性を決定する遺伝子を有している。
発現ベクターを第１図に例示した。大腸菌のpheＡ遺伝
子を有するが、しかしその関連したプロモーター、オペ
レーター、リーダーペプチドまたはアテニユエーターを
有しないDNAフラグメントをプラスミドpKB45〔Zurawski
ら、Proceedings of the National Academy of Science
s75:4271-4274（1978）〕からエンドヌクレアーゼStuＩ
およびBglIIで消化して得る。次の段階はプラスミドpKB
430を含み、このものはpBR322の誘導体であり、pBR322
のエンドヌクレアーゼPvuII切断部位にクローニングし
たラクト−スオペロンプロモーター−オペレーターを含
有する95bpのAluＩ生成DNAフラグメントを有し、その際
新しいPvuII部位はlacプロモーターおよびpBR322配列の
境界に生成しており、lac転写はこのPvuII部位を通つて
tet領域の方向へ進行するようになつている。pheＡ−含
有DNAフラグメントを常法〔Bolivar,F.およびBackman,
K.Methods in Enzymology,68巻（1980）〕に従いpKB430
中のPvuIIおよびBamHI切断部位間にクローニングしてpK
B663を得る。pheＡ遺伝子に加え、pKB663はまたβ−ラ
クタム抗生物質抵抗性を決定する遺伝子を有している。
pKB712の造成 第２図は２つの成分からのpKB712の造
成を示している： 第１の成分は上にpKB663に関して記載したlacオペロ
ン−pheＡ融合体である。pheＡ遺伝子の末端をちようど
過ぎたBanＩ部位をふさいだEcoRI部位を隣接することに
よりEcoRI部位に変換する。特に、pKB663はlacプロモー
ターの５′のTthIII部位にHindIIIリンカーを挿入して
処理されている。
成を示している： 第１の成分は上にpKB663に関して記載したlacオペロ
ン−pheＡ融合体である。pheＡ遺伝子の末端をちようど
過ぎたBanＩ部位をふさいだEcoRI部位を隣接することに
よりEcoRI部位に変換する。特に、pKB663はlacプロモー
ターの５′のTthIII部位にHindIIIリンカーを挿入して
処理されている。
第２の成分はaroＦ構造遺伝子である：具体的にはpKB
45に包含されているaroＦをpBR322にEcoRVからPvuIIま
でのフラグメントとしてサブクローンしてpKB648を得
る。aroＦ遺伝子はEcoRV部位の前（５′）に置き、その
部位を分解しエキソヌクレアーゼで一部を切断し、続い
てaroＦ遺伝子のリボソーム結合部位から約20-bp上流に
EcoRIリンカーを挿入する。aroＦの３′末端の近くにPv
uII部位があり、そこはpBR322のPvuII部位と結合でき
る。このようにクローニングした遺伝子の３′のTthIII
I部位をリンカーによりHindIIIに変換する。
45に包含されているaroＦをpBR322にEcoRVからPvuIIま
でのフラグメントとしてサブクローンしてpKB648を得
る。aroＦ遺伝子はEcoRV部位の前（５′）に置き、その
部位を分解しエキソヌクレアーゼで一部を切断し、続い
てaroＦ遺伝子のリボソーム結合部位から約20-bp上流に
EcoRIリンカーを挿入する。aroＦの３′末端の近くにPv
uII部位があり、そこはpBR322のPvuII部位と結合でき
る。このようにクローニングした遺伝子の３′のTthIII
I部位をリンカーによりHindIIIに変換する。
前記の２つの成分をそのEcoRI部位で結合し、pBR322
のHindIII部位にクローニングする。
のHindIII部位にクローニングする。
このpKB712においては、２つの構造遺伝子がpheＡの
末端の第１の停止コドンの約８ヌクレオチド後およびar
oＦ遺伝子のリボソーム結合部位から約20ヌクレオチド
上流の地点で結合している。
末端の第１の停止コドンの約８ヌクレオチド後およびar
oＦ遺伝子のリボソーム結合部位から約20ヌクレオチド
上流の地点で結合している。
pKB750の造成 lacプロモーターの制御ではなくaroＦ
プロモーターの制御下で発現するという点で、pKB750は
前に記載したすべての発現ベクターと異る。
プロモーターの制御下で発現するという点で、pKB750は
前に記載したすべての発現ベクターと異る。
pKB750は２つのフラグメントから第３図に示したごと
く造成される。
く造成される。
第１のフラグメントは天然に存在するプロモーターを
持つaroＦ遺伝子でpKB45からpKB648を経て得られる：こ
のセグメントは遺伝子の５′EcoRV部位で始まり、aroＦ
の末端のPvuII部位の次に位置するKpnＩ部位で終結す
る。
持つaroＦ遺伝子でpKB45からpKB648を経て得られる：こ
のセグメントは遺伝子の５′EcoRV部位で始まり、aroＦ
の末端のPvuII部位の次に位置するKpnＩ部位で終結す
る。
第２のフラグメントはPheＡ遺伝子であり、これは遺
伝子の５′末端がKpnＩ部位と遺伝子の３′末端がEcoRI
部位と結合している。このKpnＩ部位はpheＡの５′末端
のStuＩ部位を分解し（例えばpKB45または適当な誘導体
上で）、エキソヌクレアーゼでpheＡを切断し、次いでK
pnＩリンカーを添加して創る。EcoRI部位はふさいだEco
RI部位にBanＩ部位を隣接させることにより生成する。
伝子の５′末端がKpnＩ部位と遺伝子の３′末端がEcoRI
部位と結合している。このKpnＩ部位はpheＡの５′末端
のStuＩ部位を分解し（例えばpKB45または適当な誘導体
上で）、エキソヌクレアーゼでpheＡを切断し、次いでK
pnＩリンカーを添加して創る。EcoRI部位はふさいだEco
RI部位にBanＩ部位を隣接させることにより生成する。
これらのフラグメントはそのKpnＩ部位で結合し、pBR
322中でクローン化する。
322中でクローン化する。
pKB766の造成 pheＡ遺伝子またはpheＡを含む合成オ
ペロンはpheＡ合成経路化合物により調節されない多く
の外因性プロモーターの任意のものから発現できる。
ペロンはpheＡ合成経路化合物により調節されない多く
の外因性プロモーターの任意のものから発現できる。
適したこれらの構成を作るための多目的のクローン化
した伝達物は第４図に例示したpKB707またはpKB766であ
る。
した伝達物は第４図に例示したpKB707またはpKB766であ
る。
pKB766は第３図に例示したKpnＩ−EcoRIpheＡ−含有
フラグメントから出発して構成されベクターpKB678でク
ローン化しpKB707を得る。pKB707のKpnＩ部位はリンカ
ーを用いて容易にBgIII部位に変換され、pKB766を得
る。pKB707およびpKB766はpheＡ遺伝子の５′末端に対
する独特のクローニング部位を含む。pKB707のKpnI部位
またはpKB766のBglII部位に任意数のプロモーター−運
搬DNAフラグメントを挿入すると、フエニルアラニンに
より調節されない様式でコリスメートムターゼ−プレフ
エネート・デヒドラターゼが合成される。例えば、バク
テリオフアージm13からの遺伝子IIプロモーターおよびp
BR322tet領域（位置１のEcoRI部位および位置46のBanＩ
部位間）からの２つのプロモーターの各々をBglII接着
末端と合致する接着末端を持つDNAフラグメントに各々
クローニングし、続いてpKB766のBglII部位にクローニ
ングする。大腸菌を形質転換し、以下に記載するように
培養する。フエニルアラニン産生能はフエニルアラニン
を生長因子として要求する変異体をクロスフイードする
能力で評価する。pKB766を含有する株はフエニルアラニ
ン要求変異体とクロスフイードできないが、プロモータ
ーを含有するすべてのpKB766誘導体はフエニルアラニン
を産生し分泌できるのでフエニルアラニン要求変異体と
クロスフイードする。すなわち、プロモーター含有フラ
グメントは観察されるフエニルアラニン分泌に関与す
る。
フラグメントから出発して構成されベクターpKB678でク
ローン化しpKB707を得る。pKB707のKpnＩ部位はリンカ
ーを用いて容易にBgIII部位に変換され、pKB766を得
る。pKB707およびpKB766はpheＡ遺伝子の５′末端に対
する独特のクローニング部位を含む。pKB707のKpnI部位
またはpKB766のBglII部位に任意数のプロモーター−運
搬DNAフラグメントを挿入すると、フエニルアラニンに
より調節されない様式でコリスメートムターゼ−プレフ
エネート・デヒドラターゼが合成される。例えば、バク
テリオフアージm13からの遺伝子IIプロモーターおよびp
BR322tet領域（位置１のEcoRI部位および位置46のBanＩ
部位間）からの２つのプロモーターの各々をBglII接着
末端と合致する接着末端を持つDNAフラグメントに各々
クローニングし、続いてpKB766のBglII部位にクローニ
ングする。大腸菌を形質転換し、以下に記載するように
培養する。フエニルアラニン産生能はフエニルアラニン
を生長因子として要求する変異体をクロスフイードする
能力で評価する。pKB766を含有する株はフエニルアラニ
ン要求変異体とクロスフイードできないが、プロモータ
ーを含有するすべてのpKB766誘導体はフエニルアラニン
を産生し分泌できるのでフエニルアラニン要求変異体と
クロスフイードする。すなわち、プロモーター含有フラ
グメントは観察されるフエニルアラニン分泌に関与す
る。
フエニルアラニンの産生 大腸菌K12株YMC9〔American Type Culture Collectio
nに預けられており、ATCC33927の寄託番号を持つ;Backm
anら、Proceedings of the National Academy of Scien
cs USA78（1981）、3743−3747〕をpKB663で形質転換し
てYMC9/pKB663を得る。プラスミドpKB663はYMC9/pKB663
株（American Type Culture Collectionに預けられてお
り、ATCC39462の寄託番号を持つ）から入手可能であ
る。YMC9/pKB663を、M9塩類に4mg/mlの酢酸ナトリウム
および１μg/mlチアミンを加えた培養液中、37℃で培養
し、培養液の混濁度をKlett-Summerson比色計（緑のフ
イルター）を用いてモニターする。酢酸塩でのこの株の
成長の間は上清に検出できるフエニルアラニンは出現し
なかつた。培養密度が各々45または148Klett単位に達し
たら、過して細胞を集め、等量の新しい培地に再び懸
濁し、グルコースを添加する（最終濃度:4mg/ml）。イ
ンキュベーションを10から15時間続け、その時点の上清
中のフエニルアラニン含量を測定する。
nに預けられており、ATCC33927の寄託番号を持つ;Backm
anら、Proceedings of the National Academy of Scien
cs USA78（1981）、3743−3747〕をpKB663で形質転換し
てYMC9/pKB663を得る。プラスミドpKB663はYMC9/pKB663
株（American Type Culture Collectionに預けられてお
り、ATCC39462の寄託番号を持つ）から入手可能であ
る。YMC9/pKB663を、M9塩類に4mg/mlの酢酸ナトリウム
および１μg/mlチアミンを加えた培養液中、37℃で培養
し、培養液の混濁度をKlett-Summerson比色計（緑のフ
イルター）を用いてモニターする。酢酸塩でのこの株の
成長の間は上清に検出できるフエニルアラニンは出現し
なかつた。培養密度が各々45または148Klett単位に達し
たら、過して細胞を集め、等量の新しい培地に再び懸
濁し、グルコースを添加する（最終濃度:4mg/ml）。イ
ンキュベーションを10から15時間続け、その時点の上清
中のフエニルアラニン含量を測定する。
別の例として、pKB663をKB285およびKB280（細胞ライ
ン及び発酵方法と題した1983年10月７日付のUSSN539,98
1のの明細書中に、本願と同一出願人により記載されて
おり、参照によりここに含める）と命名されたYMC9誘導
体を形質転換するのに使用する。KB280およびKB285はAm
erical Type Culture Collectionに各々寄託番号ATCC39
461およびATCC39463として預けられている。KB285/pKB6
63またはKB285/pKB663は前記参照明細書に記載した如
く、Ｌ−フエニルアラニンの合成に使用されうる。
ン及び発酵方法と題した1983年10月７日付のUSSN539,98
1のの明細書中に、本願と同一出願人により記載されて
おり、参照によりここに含める）と命名されたYMC9誘導
体を形質転換するのに使用する。KB280およびKB285はAm
erical Type Culture Collectionに各々寄託番号ATCC39
461およびATCC39463として預けられている。KB285/pKB6
63またはKB285/pKB663は前記参照明細書に記載した如
く、Ｌ−フエニルアラニンの合成に使用されうる。
フエニルアラニン濃度はフエニルアラニン検定培地
（Difco）およびペジオコツカス アシジラクチシ（Pedio
coccus acidilactici）ATCC8042（Difco Manual,195
3）を使用して微生物的に測定できる。
（Difco）およびペジオコツカス アシジラクチシ（Pedio
coccus acidilactici）ATCC8042（Difco Manual,195
3）を使用して微生物的に測定できる。
pKB663に対して上で記載したごとく、pKB712およびpK
B750も大腸菌YMC9またはその誘導体のごとき宿主を形質
転換するのに使用でき、上清環境にフエニルアラニンを
分泌する株を得ることができる。
B750も大腸菌YMC9またはその誘導体のごとき宿主を形質
転換するのに使用でき、上清環境にフエニルアラニンを
分泌する株を得ることができる。
pheＡの発現は外来性プロモーターにより支配され、
フエニルアラニンの産生はpheＡ構造遺伝子が単一の非
制御構造遺伝子としてよりもむしろ合成オペロンの一部
として導入された場合促進される。
フエニルアラニンの産生はpheＡ構造遺伝子が単一の非
制御構造遺伝子としてよりもむしろ合成オペロンの一部
として導入された場合促進される。
ベクターpKB663,pKB712,pMB750およびpKB766は、Amer
ican Type Culture Collection:（Rockville,Marylan
d）に預けられ各々寄託番号は39,462、39,856、39,85
7、および39,858である。
ican Type Culture Collection:（Rockville,Marylan
d）に預けられ各々寄託番号は39,462、39,856、39,85
7、および39,858である。
本出願人（Biotechnica International,Inc.）はこの
特許の権利期間の終了前にそれらが死滅したときは、こ
れらの培養物を交換する責任およびそのような特許権発
行をATCCに通知する責任を承認し、その時点において寄
託物は一般に入手可能になる。その時まで寄託物は37CF
Rセクション1.14および35USCセクション112の約定下特
許庁長官に入手可能であろう。
特許の権利期間の終了前にそれらが死滅したときは、こ
れらの培養物を交換する責任およびそのような特許権発
行をATCCに通知する責任を承認し、その時点において寄
託物は一般に入手可能になる。その時まで寄託物は37CF
Rセクション1.14および35USCセクション112の約定下特
許庁長官に入手可能であろう。
他の態様は特許請求の範囲にある。例えばpKB663、pK
B712およびpKB750の各ベクターの誘導体は発現ベクター
として使用されうる：またはpKB766の誘導体は適したプ
ロモーターが挿入されている発現ベクターの前駆体とし
て使用されうる。誘導体という術語は目的の機能を保存
しているベクターの天然または遺伝子工学による変形を
意味する。
B712およびpKB750の各ベクターの誘導体は発現ベクター
として使用されうる：またはpKB766の誘導体は適したプ
ロモーターが挿入されている発現ベクターの前駆体とし
て使用されうる。誘導体という術語は目的の機能を保存
しているベクターの天然または遺伝子工学による変形を
意味する。
第１図ないし第４図は、夫々遺伝子工学によるプラスミ
ドpKB663,pKB712,pKB750およびpKB766の造成工程を表わ
す図である。
ドpKB663,pKB712,pKB750およびpKB766の造成工程を表わ
す図である。
Claims (8)
- 【請求項１】生合成経路によりフェニルアラニンを生産
する宿主細胞を形質転換するための発現ベクターであっ
て、Phe Ａ構造遺伝子、および 前記PheＡ構造遺伝子の発現を支配するように位置した
調節DNA配列、を含み、前記調節DNA配列が前記PheＡ構
造遺伝子に対して外来性であり、前記宿主細胞中でフェ
ニルアラニンまたは前記生合成経路中間体の存在下にお
いても前記PheＡ構造遺伝子の発現を起こすのに有効で
ある； ことを特徴とする合成構成物を含有する前記ベクター。 - 【請求項２】PheＡ構造遺伝子が大腸菌遺伝子である、
特許請求の範囲第１項に記載のベクター。 - 【請求項３】調節配列が1acプロモーター、aroＦプロモ
ーター、aroＨプロモーター、m13遺伝子IIプロモーター
またはpBR322のtetプロモーターを含む特許請求の範囲
第１項に記載のベクター。 - 【請求項４】ａ）pBK663（ATCC39462）およびその誘導
体；および ｂ）pBK766（ATCC39858）と前記調節DNA配列との合成構
成物； から選択される特許請求の範囲第１項記載のベクター。 - 【請求項５】生合成経路によりフェニルアラニンを産生
する宿主細胞を形質転換するための発現ベクターであっ
て、Phe Ａ構造遺伝子、および 前記PheＡ構造遺伝子の発現を支配するように位置した
調節DNA配列、を含み、前記調節DNA配列が前記PheＡ構
造遺伝子に対して外来性であり、前記宿主細胞中でフェ
ニルアラニンまたは前記生合成経路中間体の存在下にお
いても前記PheＡ構造遺伝子の発現を起こすのに有効で
ある； ことを特徴とする合成構成物を含有する前記ベクター、
を有することを特徴とする大腸菌細胞。 - 【請求項６】フェニルアラニンの産生能力が高められ
た、特許請求の範囲第５項に記載の大腸菌細胞。 - 【請求項７】前記ベクターで形質転換した大腸菌YMC9で
ある特許請求の範囲第５項に記載の大腸菌細胞。 - 【請求項８】前記ベクターが： ａ）pKB663（ATCC39462）およびその誘導体；および ｂ）pKB766（ATCC39858）と前記調節DNA配列とからなる
合成構築物； から選択される特許請求の範囲第５項に記載の大腸菌細
胞。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US54019083A | 1983-10-07 | 1983-10-07 | |
| US540190 | 1983-10-07 | ||
| US653193 | 1984-09-24 | ||
| US06/653,193 US4839286A (en) | 1983-10-07 | 1984-09-24 | Method of biosynthesis and cells therefor |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60149390A JPS60149390A (ja) | 1985-08-06 |
| JP2509552B2 true JP2509552B2 (ja) | 1996-06-19 |
Family
ID=27066358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59211187A Expired - Fee Related JP2509552B2 (ja) | 1983-10-07 | 1984-10-08 | 生合成の方法およびその細胞 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4839286A (ja) |
| EP (1) | EP0145156B1 (ja) |
| JP (1) | JP2509552B2 (ja) |
| CA (1) | CA1236411A (ja) |
| DE (1) | DE3485415D1 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1283375C (en) * | 1984-09-24 | 1991-04-23 | H.J. Heinz Company | Method of biosynthesis and cells therefor |
| US4774180A (en) * | 1986-02-26 | 1988-09-27 | Massachusetts Institute Of Technology | Construction and application of polyproteins |
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