DE19644566A1

DE19644566A1 - Mikrobielle Herstellung von Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel / I

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Publication number: DE19644566A1
Application number: DE19644566A
Authority: DE
Inventors: Georg Dr Sprenger; Ruth Dr Siewe; Hermann Prof Dr Sahm; Martin Karutz; Theodorus Sonke
Original assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Holland Sweetener Co VOF
Current assignee: Forschungszentrum Juelich GmbH; Holland Sweetener Co VOF
Priority date: 1996-10-26
Filing date: 1996-10-26
Publication date: 1998-04-30
Also published as: DE69735192T2; CN1256440C; KR20000052825A; CN1241214A; ZA979568B; US6316232B1; KR100528527B1; AU4727797A; WO1998018936A1; JP2001506486A; EP0934418B1; EP0934418A1; ATE317015T1; CA2269800A1; DE69735192D1; ES2258787T3

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen, insbesondere von aromatischen Aminosäuren, nach Anspruch 1-22, 35 und 36, Genstrukturen nach Anspruch 23-28, sowie transformierte Zellen nach Anspruch 29-34.

Mikrobiell hergestellte Substanzen, wie Feinchemikalien, insbesondere aromatische Aminosäuren sind von großem wirtschaftlichen Interesse, wobei der Bedarf an z. B. Aminosäuren weiterhin zunimmt. So wird beispielsweise L- Phenylalanin zur Herstellung von Medikamenten und insbesondere auch bei der Herstellung des Süßstoffes Aspartam (α-L-Aspartyl-L-phenylalaninmethylester) verwendet. L- Tryptophan wird als Medikament und Zusatz zu Futtermitteln benötigt; für L-Tyrosin besteht ebenfalls Bedarf als Medikament, sowie als Rohstoff in der pharmazeutischen Industrie. Neben der Isolierung aus natürlichen Materialien ist die biotechnologische Herstellung eine sehr wichtige Methode, um Aminosäuren in der gewünschten optisch aktiven Form unter wirtschaftlich vertretbaren Bedingungen zu erhalten. Die biotechnologische Herstellung erfolgt entweder enzymatisch oder mit Hilfe von Mikroorganismen.

Die letztere, mikrobielle Herstellung hat den Vorteil, daß einfache und preisgünstige Rohstoffe eingesetzt werden können. Da die Biosynthese der Aminosäuren in der Zelle aber in vielfacher Weise kontrolliert wird, sind bereits vielfältige Versuche zur Steigerung der Produktbildung unternommen worden. So wurden z. B. Aminosäure-Analoga eingesetzt, um die Regulation der Biosynthese auszuschalten. Beispielsweise wurden durch Selektion auf Resistenz gegen Phenylalanin-Analoga Mutanten von Escherichia coli erhalten, die eine erhöhte Produktion von L-Phenylalanin ermöglichten (GB-2,053,906). Eine ähnliche Strategie führte auch zu überproduzierenden Stämmen von Corynebacterium (JP-19037/1976 und JP-39517/1978) und Bacillus (EP-0,138,526).

Des weiteren sind durch rekombinante DNS-Techniken konstruierte Mikroorganismen bekannt, bei denen ebenfalls die Regulation der Biosynthese aufgehoben ist, indem die Gene, die für nicht mehr feedback-inhibierte Schlüsselenzyme kodieren, kloniert und exprimiert werden. Als ein Vorbild beschreibt EP-0,077,196 ein Verfahren zur Produktion von aromatischen Aminosäuren, bei dem eine nicht mehr feedback inhibierte 3-Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phosphatsynthase (DAHP-Synthase) in E. coli überexprimiert wird. In EP-0,145,156 ist ein E. coli-Stamm beschrieben, in dem zur Produktion von L-Phenylalanin zusätzlich Chorismatmutase/Prephenatdehydratase überexprimiert ist.

Den genannten Strategien ist gemeinsam, daß sich der Eingriff zur Verbesserung der Produktion auf den für die aromatischen Aminosäuren spezifischen Biosyntheseweg beschränkt. Für eine weitere Erhöhung der Produktion muß jedoch eine verbesserte Bereitstellung der zur Produktion aromatischer Aminosäuren benötigten Primärmetabolite Phosphoenolpyruvat (PEP) und Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) angestrebt werden.

PEP ist ein aktivierter Vorläufer des Glycolyseproduktes Pyruvat (Brenztraubensäure); Ery4P ist ein Intermediat des Pentosephosphatweges.

Die gezielte Verbesserung der Bereitstellung des genannten Primärmetaboliten Ery4P wurde auf verschiedene Weise versucht. Durch Ausschaltung des Enzyms Phosphoglucose isomerase wurde ein verstärkter Kohlenstoff-Fluß über den Pentosephosphatweg in E. coli erreicht, mit der Folge, daß Tryptophan gebildet wurde (Mascarenhas D. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 2995-99). Aus US-A-5,168,056 ist bekannt, daß eine durch rekombinante DNS-Techniken erreichte Überexpression einer Transketolase eine erhöhte Bereitstellung von Ery4P und in Folge eine verbesserte Produktbildung von L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L- Phenylalanin ermöglicht. Selbigen Effekt zeigten sowohl Draths K.M. et al. (J. Am. Chem. Soc. 114 (1992) 3956-62) als auch Flores N. et al. (Nat. Biotechnol. 14 (1996) 620-3) Wie von Feldmann gezeigt, führt jedoch die alleinige Aktivitätssteigerung der Transketolase in Zymomonas mobilis Stämmen ohne Transaldolase-Aktivität zur Anreicherung von Metaboliten des Pentosephosphatweges in den Zellen und in der Folge zu negativen Auswirkungen auf das Zellwachstum (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61). Dieser physiologische Effekt ist möglicherweise auf eine überhöhte, intrazelluläre Konzentration von Sedoheptulose-7-Phosphat zurückzuführen. Eine entsprechende Hemmung des Biomassewachstums als Folge einer Überexpression der Transketolase wurde von den Erfindern auch für tal⁺- Stämme von E. coli gefunden.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein alternatives Verfahren zur Produktion von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren, zur Verfügung zu stellen, welches sich durch eine erhöhte Bereitstellung von intrazellulären Stoffwechselintermediaten für die Synthese dieser Substanzen auszeichnet, ohne durch die oben aufgezeichneten Nachteile der Verfahren gekennzeichnet zu sein, welche die Folge einer alleinigen Erhöhung der Aktivität der Transketolase sind.

Überraschenderweise wird diese Aufgabe erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen zur Verfügung gestellt wird, bei dem die Aktivität einer Transaldolase in einem diese Substanzen produzierenden Mikroorganismus erhöht wird.

Dieses Ergebnis ist besonders überraschend, als daß es keineswegs selbstverständlich ist, daß Transaldolasen eine wesentliche Rolle beim Wachstum von Mikroorganismen und deren Produktion von Substanzen haben. Dies gilt insbesondere beim Wachstum auf Hexosen. So sind beispielsweise Hefestämme bekannt, die eine Mutation im Transaldolasegen aufweisen, jedoch weiterhin in der Lage sind auf Glucose zu wachsen (Schaaff L. et al., Eur. J. Biochem. 188 (1990) 597-603). Demnach sollte eine Transaldolase keinen essentiellen Einfluß auf das Zellwachstum haben. Dies wird durch die Tatsache unterbaut, daß auch Bakterienarten bekannt sind, die in der Lage sind in Abwesenheit einer Transaldolase zu wachsen (Feldmann S.D. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61).

Außerdem können Hexosen wie Glucose, im Vergleich zu Xylose und anderen Pentosen, auch über andere Abbauwege als über den Pentosephosphatweg verstoffwechselt werden. Es ist daher auch keinesfalls selbstverständlich, daß die Transaldolase eine wesentliche Funktion beim Glucoseabbau hat.

Es sei noch bemerkt, daß in Extrakten von Saccharomyces cerevisiae Zellen, die durch eine erhöhte Aktivität einer Transaldolase charakterisiert waren, in vitro ein erhöhter Fluß über die Enzyme des Pentosephosphatweges gemessen wurde (Senac T. et al., Appl. Environ. Microbiol. 57 (1991) 1701-6). Die in dieser Arbeit gewählten experimentellen Bedingungen erlauben aber keine Übertragung der Ergebnisse auf die natürlichen, in lebenden Mikroorganismen, besonders Bakterien, auftretenden stoffwechselphysiologischen Phänomene. Daher ist es keineswegs zu erwarten, daß eine Erhöhung der Transaldolaseaktivität in Mikroorganismen ursächlich mit der Bereitstellung von Ery4P zur verbesserten Produktion von Substanzen in Verbindung steht.

Durch die Erhöhung der Aktivität (Überexpression) einer Transaldolase gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein alternatives Verfahren zur Verfügung gestellt, durch das ein erhöhter Kohlenstofffluß über den Pentosephosphatweg realisiert wird und somit eine verbesserte Bereitstellung des Primärmetaboliten Ery4P erfolgt. Ery4P steht somit in erhöhtem Maße für die mikrobielle Synthese von Substanzen, an deren Synthese mindestens ein Intermediat des Pentosephosphatweges und insbesondere Ery4P beteiligt ist, zur Verfügung.

Unter Substanzen im Sinne der Erfindung sind beispielsweise Feinchemikalien wie aromatische Aminosäuren, Indigo, Indolessigsäure, Adipinsäure, Melanin, Chinone, Benzoesäure, sowie deren potentielle Derivate und Folgeprodukte - oder allgemein Folgeprodukte von Intermediaten des Pentosephosphatweges zu verstehen. Jedoch sollen damit auch alle Verbindungen umfaßt sein, deren biochemische Synthese durch die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat begünstigt wird, z. B. Pyridoxin und seine Abkömmlinge. Alle diese Substanzen werden im Rahmen dieser Erfindung auch als Substanzen aus dem aromatischen Stoffwechsel angesehen. Es sei dabei bemerkt, daß für die Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere genetische Veränderungen an den die Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig sind.

Hinsichtlich der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase wird vorzugsweise die Aktivität einer Transaldolase aus Escherichia coli und insbesondere die Aktivität der Transaldolase B (TalB) aus Escherichia coli erhöht. Bei der Verwendung des korrespondierenden talB-Gens stammt dieses vorzugsweise aus Escherichia coli K-12 oder einem davon abgeleiteten Stamm. Daneben ist jedoch auch jedes Gen geeignet dessen Genprodukt eine Reaktion katalysiert, die der der Transaldolase, das heißt der Umsetzung von Sedoheptulose- 7-Phosphat plus Glycerinaldehyd-3-Phosphat zu Ery4P und Fructose-6-Phosphat, entspricht.

In einer besonders günstigen Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich zur Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase auch die Aktivität einer Transketolase erhöht. Die Expression eines Transketolasegens alleine führt in Gegenwart von Pentosen zum Stau von Metaboliten im Pentosephosphatweg (Feldmann S.D., Appl. Microbiol. Biotechnol. 38 (1992) 354-61).

Dies wirkt zellschädigend und hat unter anderem eine verminderte Wachstumsgeschwindigkeit der transformierten Zellen zur Folge. Ein identischer Effekt wurde von den Erfindern auch beim Wachstum eines Escherichia coli Stammes mit erhöhter Transketolase-Aktivität auf Glucose beobachtet. Die gleichzeitige Steigerung der Aktivität einer Transketolase neben der einer Transaldolase hat sich jedoch jetzt als sehr förderlich für die Bereitstellung von Ery4P erwiesen und zeigt nicht die negativen Nebenwirkungen einer alleinigen Überexpression einer Transketolase. Die bei der Erhöhung der Aktivität einer Transketolase auftretende Akkumulation von Metaboliten des Pentosephosphatweges entfällt somit durch die Aktivitätssteigerung einer Transaldolase, wodurch die Verschlechterung des Wachstums der Zellen nicht nur unterbunden wird, sondern sogar in eine Wachstumssteigerung umgewandelt wird. Es zeigt sich also, daß die Erhöhung der Aktivität einer Transketolase insbesondere in Stämmen mit erfindungsgemäß erhöhter Aktivität einer Transaldolase sinnvoll ist.

Hinsichtlich der Erhöhung der Aktivität einer Transketolase wird vorzugsweise die Aktivität einer Transketolase aus Escherichia coli und insbesondere die Aktivität der Transketolase A (TktA) aus Escherichia coli erhöht. Bei der Verwendung des entsprechenden tktA-Gens stammt dieses vorzugsweise aus Escherichia coli K-12 oder einem davon abgeleiteten Stamm. Daneben ist jedoch auch jedes Gen geeignet, dessen Genprodukt eine Reaktion katalysiert, die der der Transketolase, das heißt der Umsetzung von Ribose-5-phos phat plus Xylulose-5-phosphat zu Sedoheptulose-7-phosphat plus Glycerinaldehyd-3-phosphat bzw. der Umsetzung von Xylulose-5-phosphat plus Ery4P zu Fructose-6-phosphat plus Glycerinaldehyd-3-phosphat, entspricht.

In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird zusätzlich zur Aktivität einer Transaldolase oder zur Aktivität einer Transaldolase und einer Transketolase, die Aktivität eines Transportproteins zur PEP-un abhängigen Aufnahme eines Zuckers und/oder die Aktivität einer den entsprechenden Zucker phosphorylierenden Kinase erhöht. Im Falle des Transportproteins wird Aktivität dabei als proteinvermittelte Aufnahmerate verstanden.

Die zusätzliche Aktivitätssteigerung eines dieser letzteren Proteine oder beider Proteine erlaubt eine noch höhere Produktion von Substanzen, insbesondere aromatischen Aminosäuren, dadurch daß PEP für die Kondensation mit Ery4P zum primären Metaboliten des allgemeinen Biosyntheseweges für aromatische Verbindungen Desoxy-D-arabino-heptulosonat-7-phos phat (DAHP) in erhöhtem Maße bereitgestellt wird. Bezüglich des Transportproteins zur PEP-unabhängigen Aufnahme eines Zuckers empfiehlt sich der Einsatz eines Facilitators, daß heißt eines Transportproteins, das nach dem Prinzip der proteinvermittelten erleichterten Diffusion wirkt. Insbesondere bietet sich der Einsatz des Glucosefacilitator- Proteins (Glf) aus Zymomonas mobilis an. Bei der Verwendung von letzterem stammt das das Protein kodierende Gen glf, z. B. aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder ATCC 31821. Andere Zuckertransportgene aus Bakterien, deren Genprodukte, z. B. Glucose, Fructose oder Saccharose transportieren und dabei kein PEP verwenden, sind für das erfindungsgemäße Verfahren aber ebenso geeignet, wie z. B. das GalP-System aus Escherichia coli. Außerdem sind Gene für Zuckertransport systeme wie HXT1 bis HXT7 aus eukaryontischen Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis oder Kluyveromyces lactis, oder allgemein wie Zuckertransportgene aus anderen Organismen einsetzbar, vorausgesetzt, daß sie in den Mikroorganismen funktionell exprimiert werden können und die Genprodukte dabei ohne PEP zum Transport der Zucker auskommen. Insbesondere empfiehlt es sich, daß die Zuckertransportgene in Aminosäuren produzierenden Mikroorganismen (Aminosäureproduzenten) exprimiert werden können. Für die Herstellung aromatischer Aminosäuren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich daher insbesondere das aus Z. mobilis ATCC 31821 isolierte Facilitator-Gen glf für die Aufnahme von Zuckern wie Glucose, Fructose oder Mannose. (Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-802; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4).

Die Einführung insbesondere des glf-Gens sollte vorzugsweise in einer niedrigen Genkopienzahl erfolgen, um schädliche Auswirkungen auf die Zelle durch übermäßige Expression von Membranproteinen zu verhindern. So wird beispielsweise für das glf-Gen eine Genkopienzahl von 2 bis 5 bevorzugt. Besonders vorteilhaft ist die Einführung des glf-Gens in eines der Gene des ptsHI-crr-Operons, z. B. in das ptsI-Gen.

Beim Einsatz einer Zucker-phosphorylierenden Kinase empfiehlt sich die Verwendung einer Hexosen-phosphorylierenden Kinase, bevorzugt einer Kinase, insbesondere der Glucokinase (Glk) aus Zymomonas mobilis. Bei der Verwendung von letzterer stammt das das Protein kodierende Gen glk z. B. aus Z. mobilis ATCC 10988, ATCC 29191 oder ATCC 31821. Andere Gene für Hexosen-phosphorylierende Kinasen aus Bakterien, deren Genprodukte die Hexosen unter Verbrauch von ATP phosphorylieren, wie beispielsweise eine Fructokinase oder Mannokinase, sind für das erfindungsgemäße Verfahren ebenso geeignet. Weiterhin sind auch Gene für z. B. Kinasen aus eukaryontischen Mikroorganismen geeignet, wie Saccharomyces cerevisiae oder allgemein Gene für Zucker-phosphorylierende Kinasen aus anderen Organismen, vorausgesetzt, daß sie in den Mikroorganismen, insbesondere Aminosäureproduzenten, funktionell exprimiert werden können und ohne PEP zur Phosphorylierung der Zucker auskommen.

Für die Herstellung aromatischer Aminosäuren nach dem erfindungsgemäßen Verfahren eignet sich insbesondere das aus z. mobilis ATCC 29191 isolierte Glucokinase-Gen glk für die Phosphorylierung von Glucose.

In Mikroorganismen, in denen der Stofffluß nach Ery4P erhöht ist, kann die Verfügbarkeit von PEP zur Produktion des ersten Intermediaten des aromatischen Aminosäurestoffwechsels limitiert sein. In solchen Fällen kann es vorteilhaft sein, andere PEP-verbrauchende Reaktionen im Metabolismus, wie z. B. die Reaktion des PEP : Zucker-Phosphotransferasesystems (PTS), welches eine PEP-abhängige Zuckeraufnahme katalysiert, sofern anwesend, zu reduzieren oder vollständig auszuschalten. Erfindungsgemäß können sowohl Organismen eingesetzt werden, die noch aktive PTS-Gene aufweisen (pts⁺-Stämme), als auch, zur weiteren Verbesserung des Verfahrens, PTS-Mutanten eingesetzt werden, in denen das PTS in seiner Aktivität vermindert ist (hier auch als pts⁺ zu betrachten) oder in denen das PTS ausgeschaltet (pts⁻-Stämme) ist. Eine derartige Verminderung kann entweder auf enzymatischer Ebene oder durch genetische Methoden erfolgen, z. B. durch Insertion eines glf- und/oder eines glk-Gens in das Chromosom und insbesondere in den Genort des ptsI-Gens, was zugleich eine Stabilisierung der rekombinanten DNS im Chromosom (Segregationsstabilität) und damit den Verzicht auf die Verwendung eines Vektors mit sich bringt.

Als Maßnahmen zur Steigerung der Aktivität im Sinne der Erfindung sind alle Maßnahmen zu verstehen, die dazu geeignet sind, die Aktivität der Transaldolase, der Transketolase, des Transportproteins und der Kinase zu steigern. Insbesondere sind hierzu geeignet:

- Einführung von Genen z. B. mittels Vektoren oder temperenter Phagen;
- Erhöhung der Genkopienzahl z. B. mittels Plasmiden mit dem Ziel die erfindungsgemäßen Gene in erhöhter Kopienzahl, von leicht (z. B. 2 bis 5 fach) bis zu stark erhöhter Kopienzahl (bis 50 fach), in den Mikroorganismus einzubringen;
- Erhöhung der Genexpression z. B. durch Steigerung der Transkriptionsrate z. B. durch Verwendung von Promotorelementen wie z. B. Ptac, Ptet oder anderen regulatorischen Nucleotidsequenzen und/oder durch Steigerung der Translationsrate z. B. durch Verwendung einer Konsensusribosomenbindungsstelle;
- Erhöhung der endogenen Aktivität von vorhandenen Enzymen z. B. durch Mutationen, die nach klassischen Methoden ungerichtet erzeugt werden, wie beispielsweise durch UV- Bestrahlung oder mutationsauslösenden Chemikalien, oder durch Mutationen, die gezielt mittels gentechnologischer Methoden wie Deletion(en), Insertion(en) und/oder Nucleotidaustausch erzeugt werden;
- Erhöhung der Aktivität von Enzymen durch Veränderung der Struktur von Enzymen z. B. durch Mutagenese mit physikalischen, chemischen, molekularbiologischen oder sonstigen mikrobiologischen Methoden;
- Verwendung von deregulierten Enzymen, z. B. nicht mehr feedback-inhibierten Enzymen;
- Einführung entsprechender die deregulierten Enzyme kodierenden Gene.

Auch Kombinationen der genannten und weiteren, analogen Methoden können zur Erhöhung der Aktivität eingesetzt werden. Im Falle von Transportproteinen kann die endogene oder eingeführte Aktivität erhöht werden z. B. durch Klonierung des Gens mit beispielsweise o.g. Methoden oder über Selektion von Mutanten mit erhöhtem Transport von Substraten.

Bevorzugt erfolgt die Steigerung der Aktivität dadurch, daß eine Integration des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erfolgt, wobei jedes Gen oder die Gene als einzelne Kopie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird.

Als Genstruktur im Sinne der Erfindung ist ein Gen und jede andere Nucleotidsequenz zu verstehen, die die erfindungsgemäßen Gene trägt. Entsprechende Nucleotidsequenzen können beispielsweise Plasmide, Vektoren, Chromosomen, Phagen oder andere, nicht zirkulär geschlossene, Nucleotidsequenzen sein.

Für ein Chromosom im Sinne der Erfindung gilt, daß in dieses mindestens ein erfindungsgemäßes Gen inseriert wurde, und daß die entstandene Nucleinsäuresequenz dadurch mindestens ein Gen oder eine Genkopie mehr enthält, als natürlicherweise in diesem Chromosom enthalten ist. Dagegen führt beispielsweise die homologe Rekombination innerhalb eines Genortes zu einem Chromosom, welches sich von der natürlichen Form nicht notwendigerweise unterscheiden muß. Die durch homologe Rekombination hergestellten Chromosomen sind daher nicht als erfindungsgemäß zu betrachten, sofern die natürliche Anzahl der homologen Gene nicht überschritten wird.

Als Genstruktur im Sinne der Erfindung ist auch eine Kombination oben genannter Genträger, wie beispielsweise Vektoren, Chromosomen und temperenter Phagen zu verstehen, auf die die erfindungsgemäßen Gene verteilt sind.

Beispielsweise können zwei Gene tal auf einem Vektor in die Zelle eingebracht werden oder zwei Gene tal in ein Chromosom inseriert werden. Zusätzlich kann z. B. noch ein weiteres Gen durch einen Phagen in die Zelle eingebracht werden. Dasselbe gilt für die anderen erfindungsgemäßen Gene. Andere Kombinationen von Genverteilungen sollen durch diese Beispiele nicht von der Erfindung ausgeschlossen werden. Entscheidend ist jedenfalls, daß die Anzahl der im erfindungsgemäßen Mikroorganismus enthaltenen Gene die natürliche Anzahl der entsprechenden Gene übersteigt. Vorzugsweise wird man z. B. für glf die Zahl der Gene um einen Faktor 2 bis 5 erhöhen, um die erfindungsgemäße Steigerung der Aktivität zu erreichen. Bei diesen Konzentrationen werden sich keine zelltoxischen Wirkungen einstellen. Jedoch ist es auch denkbar die erfindungsgemäßen Gene in höherer Kopienzahl bis 50 Genkopien einer gleichwirkenden Form in den Mikroorganismus einzubringen.

Im erfindungsgemäßen Verfahren zur Produktion von Substanzen werden bevorzugt Mikroorganismen eingesetzt, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

Dies sind insbesondere die Enzyme des aromatischen Aminosäurestoffwechsels und vor allem DAHP-Synthase, Shikimatkinase und Chorismatmutase/Prephenatdehydratase, sowie aber auch alle anderen Enzyme, die an der Synthese aromatischer Stoffwechselintermediate und deren Folgeprodukte beteiligt sind.

Für die Herstellung von Substanzen wie beispielsweise Adipinsäure, Gallensäure und Chinonverbindungen, sowie deren Derivate ist neben den erfindungsmäßigen Enzymen besonders die Deregulation und Überexpression der DAHP-Syntase von Bedeutung. Zur überhöhten Synthese von beispielsweise Tryptophan, Tyrosin, Indigo, Derivaten von Hydroxy- und Aminobenzoesäure und Naphto- und Anthroquinonen, sowie deren Folgeprodukten sollte zusätzlich die Shikimatkinase dereguliert und in ihrer Aktivität erhöht werden. Für eine effiziente Produktion von Phenylalanin, Phenylbrenztraubensäure und deren Derivaten ist zusätzlich eine deregulierte und überexprimierte Chorismatmutase/Prephenatdehydratase von besonderer Bedeutung. Jedoch sollen damit auch alle anderen Enzyme umfaßt sein, deren Aktivitäten zur biochemischen Synthese von Substanzen beitragen, das heißt Verbindungen deren Produktion durch die Bereitstellung von Erythrose-4-Phosphat begünstigt wird, z. B. Pyridoxin und seine Abkömmlinge. Es sei bemerkt, daß für die Herstellung von Indigo, Adipinsäure und anderen nicht natürlichen Folgeprodukten neben den erfindungsgemäßen Eingriffen weitere genetische Veränderungen an den die Substanzen produzierenden Mikroorganismen notwendig sind.

Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich insbesondere zur Herstellung von aromatischen Aminosäuren, insbesondere Phenylalanin. Im Falle von Phenylalanin wird dabei vorzugsweise die Genexpression und/oder die Enzymaktivität einer deregulierten DAHP-Synthase (z. B. in E. coli AroF oder AroH) und/oder einer ebenfalls deregulierten Chorismatmutase/ Prephenatdehydratase (PheA) erhöht.

Als Produktionsorganismen eignen sich Escherichia-Arten, sowie aber auch Mikroorganismen der Gattungen Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium und weitere aus klassischen Aminosäureverfahren bekannte Stämme. Besonders geeignet ist Escherichia coli.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von geeigneten Genstrukturen und diese Genstrukturen tragenden transformierten Zellen, welche eine besonders erfolgreiche Realisation des Verfahrens ermöglichen.

Im Rahmen der Erfindung werden jetzt neue Genstrukturen zur Verfügung gestellt, die in rekombinanter Form a) ein Gen kodierend für eine Transaldolase oder ein Gen kodierend für eine Transaldolase und ein Gen kodierend für eine Transketolase, und b) mindestens ein Gen kodierend für ein Transportprotein zur PEP-unabhängigen Aufnahme eines Zuckers oder für eine einen Zucker phosphorylierende Kinase enthalten. In diesen Genstrukturen wird bevorzugt, daß das Gen für das Transportprotein einen Facilitator kodiert und das Gen für die Kinase eine Hexosen-phosphorylierende Kinase kodiert. Insbesonders stammen die Gene für die Transaldolase und für die Transketolase aus Escherichia coli, und die Gene für das Transportprotein und für die Kinase aus Zymomonas mobilis.

Besonders vorteilhaft sind Genstrukturen, bei denen das Gen für die Transaldolase talB und für die Transketolase tktA aus Escherichia coli ist, und das Gen für das Transportprotein glf und für die Kinase glk aus Zymomonas mobilis ist.

Die Isolierung der entsprechenden Gene und die Transformation der Zellen erfolgt nach gängigen Methoden: Im Falle des Gens talB und des Gens tktA aus Escherichia coli K-12 sind die vollständigen Nucleotidsequenzen bekannt (Yura T. et al., Nucl. Acid Res. 20 (1992) 3305-8; Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta 1216 (1993) 307-10; Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-9) und in Datenbanken wie beim EMBL in Heidelberg hinterlegt. Im Falle der Klonierung des talB-Gens aus Escherichia coli eignet sich beispielsweise die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur gerichteten Amplifikation des Gens mit chromosomaler DNS aus Escherichia coli K-12 Stämmen (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-9). Im Falle der Klonierung des tktA-Gens aus Escherichia coli eignet sich beispielsweise die homologe Komplementation einer Transketolase-defizienten Mutante (Sprenger G.A. in: Bisswanger H. et al., Biochemistry and physiology of thiamine diphosphate enzymes, VCH (1991) 322-6).

Im Falle z. B. der Klonierung des Transportgens glf oder des Glucokinasegens glk aus Zymomonas mobilis eignet sich beispielsweise PCR zur gerichteten Amplifikation des Gens mit chromosomaler DNS aus Zymomonas mobilis Stämmen ATCC 29191 oder ATCC 31821 und weiterhin die heterologe Komplementation von Escherichia coli-Mutanten, die in Funktionen des PTS defekt sind und die deshalb z. B. keine Glucose transportieren können (Snoep J.L. et al, J. Bacteriol. 174 (1994) 1707-8; Parker C. et al., Mol. Microbiol. 15 (1995) 795-82; Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4). Nach Isolierung der Gene und deren in vitro-Rekombination mit bekannten Vektoren mit niedriger Kopienzahl, wie z. B. pACYC184, pACYC177, pSC101 oder pZY507 (Weisser P. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-4) erfolgt die Transformation der Wirtszelle durch chemische Methoden, Elektroporation, Konjugation oder Transduktion.

Das isolierte Transaldolase-Gen kann mit einem oder mehreren der im Rahmen der Erfindung beschriebenen Gene in jeglicher Kombination in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen integriert werden. Ohne die genaue Verteilung auf Genstrukturen zu berücksichtigen, führt dies zu Kombinationen wie z. B. talB, talB + tktA, talB + glE, talB + glk, talB + glf + glk, talB + tktA + glf, talB + tktA + glk oder talB + tktA + glf + glk.

Vorteilhaft sind Genstrukturen, die mindestens eine, einem der Gene zugeordnete, regulatorische Gensequenz enthalten. So kann eine Verstärkung regulatorischer Elemente vorzugsweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem insbesondere die Transkriptionssignale verstärkt werden. Dies kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß durch Veränderung der den Strukturgenen vorgeschalteten Promotorsequenzen die Wirksamkeit des Promotors oder der Promotoren erhöht wird oder indem Promotoren komplett durch wirksamere Promotoren ersetzt werden. Auch kann eine Verstärkung der Transkription durch entsprechende Beeinflussung eines den Genen zugeordneten Regulatorgens erfolgen; daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der Boten-RNS (m-RNS) verbessert wird.

Am geeignetsten sind Genstrukturen, in denen mindestens eines der beschriebenen Gene so eingebaut ist, daß es unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.

Bei der Anordnung der Gene auf einer erfindungsgemäßen Genstruktur kann ein Promotor vor einem Gen oder als gemeinsamer Promotor vor mehreren Genen liegen oder es können zwei gegenläufige Promotoren verwendet werden, zwischen denen die Gene so angeordnet sind, daß sie gegenläufig abgelesen werden. Dabei kann beispielsweise das glf-Gen vor einem schwächeren Promotor (z. B. Ptet) und weitere Gene unter der Kontrolle des tac-Promotors liegen. Den in einer Genstruktur enthaltenen Genen, mit oder ohne vorgeschaltetem Promotor bzw. mit oder ohne zugeordnetem Regulatorgen, können ein oder mehrere DNS-Sequenzen vor- und/oder nachgeschaltet sein. Durch die Verwendung von induzierbaren Promotorelementen z. B. lacI^q/Ptac besteht die Möglichkeit der Zuschaltung neuer Funktionen (Induktion der Enzymsynthese) z. B. durch Zugabe von chemischen Induktoren wie Isopropylthiogalactosid (IPTG).

Die Aufgabe der Erfindung wird auch dadurch gelöst, daß transformierte Zellen bereitgestellt werden, die in replizierbarer Form eine erfindungsgemäße Genstruktur enthalten.

Als transformierte Zelle im Sinne der Erfindung ist jeder Mikroorganismus zu verstehen, der eine erfindungsgemäße Genstruktur trägt, die die verstärkte Bildung von Substanzen in der Zelle bewirkt. Die Transformation der Wirtszellen kann durch chemische Methoden (Hanahan D., J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580), sowie auch durch Elektroporation, Konjugation oder Transduktion erfolgen.

Es ist vorteilhaft für die Transformation Wirtszellen einzusetzen, in denen ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

Mit der die jeweiligen Gene enthaltenden Genstruktur wird ein, eine aromatische Aminosäure oder eine andere erfindungsgemäße Substanz produzierender Mikroorganismus- Stamm, insbesondere Escherichia coli, transformiert. Es ist von Vorteil für die Transformation mit den Genstrukturen Wirtszellen einzusetzen, in denen, sofern anwesend, das PEP-abhängige Zuckeraufnahmesystem in seiner Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.

Insbesondere werden transformierte Zellen bereitgestellt, die in der Lage sind, eine aromatische Aminosäure zu produzieren, wobei die aromatische Aminosäure vorzugsweise L-Phenylalanin ist.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und dem nach der Lehre der Erfindung transformierten Mikroorganismus kann ein breites Substratspektrum für die Produktion von Substanzen eingesetzt werden. Im Rahmen der Erfindung wird somit auch ein Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen bereitgestellt, in dem erfindungsgemäße transformierte Zellen in denen eine Genstruktur vorliegt, die mindestens eine einem der Gene zugeordnete, regulatorische Gensequenz enthält, kultiviert werden und wobei die Induktion der Enzymsynthese in den Mikroorganismen nach mindestens 2 Zellteilungen (Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase) erfolgt. Die Produktion der Mikroorganismen kann somit unabhängig von deren Wachstum gesteigert werden.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden transformierte Zellen eingesetzt, die außer den Intermediaten des Pentosephosphat weges auch andere Zentralstoffwechselmetabolite in erhöhter Verfügbarkeit enthalten. Dazu zählen zum Beispiel Pyruvat aus der Glykolyse oder der Gluconeogenese, oder Oxalacetat aus dem Zitronensäurezyklus. Weiterhin kann die entsprechende Verbindung, oder ihre Vorläufer, also die des Pyruvats oder die von Metaboliten des Zitronensäurezyklus, wie z. B. Fumarat oder Malat, durch Zufütterung den wachsenden Zellen zur Verfügung gestellt werden.

Die Erfindung wird nachfolgend an einigen Ausführungsbeispielen näher erläutert. Bei DSMZ sind unter den Bedingungen des Budapester Vertrages die folgenden Stämme hinterlegt:

Der verwendete Wirtsorganismus AT2471 wurde von Taylor und Trotter (Bacteriol. Rev. 13 (1967) 332-353 bei der CGSC unter der Nummer 4510 hinterlegt und ist frei erhältlich.

Alle im Rahmen dieser Patentanmeldung verwendeten Mikroorganismen sind in Tabelle 1 bezüglich ihrer Charakteristika sowie ihrer Herkunft näher beschrieben.

Im Folgenden sollen die verwendeten Materialien und Methoden angegeben, sowie die Erfindung durch experimentelle Beispiele und Vergleichsbeispiele unterbaut werden.

Allgemeine Methoden

Im Rahmen der genetischen Arbeiten wurden Stämme von E. coli, sofern nicht anderweitig erwähnt, auf LB-Medium bestehend aus Difco Bacto Trypton (10 g.l^-1), Difco-Hefeextrakt (5 g.l^-1) und NaCl (10 g.l^-1) kultiviert. In Abhängigkeit von den Resistenzeigenschaften der verwendeten Stämme wurde, sofern nötig, dem Medium Carbenicillin (20-100 mg.l^-1) und/oder Chloramphenicol (17-34 mg.l^-1) zugesetzt. Carbenicillin wurde dabei zuvor in Wasser und Chloramphenicol in Ethanol gelöst und dem bereits autoklavierten Medium sterilfiltriert zugegeben. Zur Herstellung von Agarplatten wurde dem LB- Medium Difco Bacto Agar (1,5%) zugesetzt.

Plasmid-DNS aus E.coli wurde mittels alkalischer Lyse unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Systems (Quiagen, Hilden) isoliert. Die Isolation von chromosomaler DNS aus E. coli und z. mobilis erfolgte nach Chen und Kuo (Nucl. Acid Res. 21 (1993) 2260).

Die Verwendung von Restriktionsenzymen, DNS-Polymerase I, Alkalische Phosphatase, RNase und T4 DNS-Ligase erfolgte nach den Instruktionen der Produzenten (Boehringer, Mannheim, D oder Promega, Heidelberg, D). Zur Restriktionsanalyse wurden die DNS-Fragmente in Agarosegelen (0,8%) aufgetrennt und mittels Extraktion unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Systems (Jetsorb Genomed, Bad Oeynhausen, D) aus Agarose isoliert.

Für Southern Analysen wurde Chromosomale DNS (10 µg) mit Restriktionsenzymen verdaut, über Gelelektrophorese der Größe nach getrennt und mittels vakuumvermittelter Diffusion (VacuGene System, pharmacia, Freiburg, D) auf eine Nylonmembran transferiert (Nytran 13, Schleicher und Schuell, Dassel, D). Entsprechende DNS-Bruchstücke wurden isoliert, mit Digoxigenin-dUTP markiert und als Sonde verwendet. Markierung, Hybridisierung, Waschvorgänge, sowie die Detektion wurden unter Zuhilfenahme eines kommerziell erhältlichen Markierungs- und Detektionssystems (Boehringer, Mannheim, D) ausgeführt.

Zur Transformation der Zellen wurden diese für 2,5-3 h in LB- Medium (5 ml-Röhrchen) bei 37°C und 200 U.min^-1 inkubiert. Bei einer optischen Dichte (620 nm) von ca. 0,4 wurden die Zellen abzentrifugiert und in einem Zehntel des Volumens in TSS (LB-Medium mit 10% (w/v) PEG 8000, 5% (v/v) DMSO und 50 mM MgCl₂) aufgenommen. Nach 30-minütiger Inkubation bei 4°C mit 0,1 bis 100 ng DNS und anschließender Inkubation bei 37°C für 1 h wurden die Zellen auf LB-Medium mit entsprechendem Antibiotikum ausplattiert.

Beispiel 1 Bereitung von pZY557tal, pBM20tal und pZY557tkttal als Vorbilder erfindungsgemäßer, plasmidbasierter Genstrukturen, sowie pZY557tkt

Plasmid pZY507 (Weisser et. al. 1995 J. Bacteriol 177: 3351-3345) wurde mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIIT geöffnet und das größere Fragment (10,1 kb DNS) wurde isoliert. Aus dem Vektor pUCBM20 (Boehringer, Mannheim, D) wurde mit Hilfe von BamHI und HindIII ein Teil der multiplen Klonierstelle mit dem großen pZY507BamHI/HindIII-Fragment ligiert, wobei der Vektor pZY557 entstand, der außer den anderen Restriktionsschnittstellen dem Vektor pZY507 gleicht. Aus dem Vektor pGSJ451 (Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-36) wurde das talB-Gen durch PCR amplifiziert. Dabei wurde Oligonucleotid I:

(die unterstrichenen Basenpaare entsprechen dabei den Bp 84 bis 101 der talB-Sequenz aus Sprenger G.A. et al., J. Bacteriol. 177 (1995) 5930-6), das mit einer Schnittstelle für das Reaktionssystem SphI versehen war, und als Oligonucleotid II der kommerziell erhältliche M13/pUC-Sequenzierungsprimer (Nr. 1010093, Boehringer Mannheim, D) eingesetzt. Das erhaltene amplifizierte DNS- Fragment enthält randständig jeweils eine Schnittstelle für SphI und wurde mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten. Dieses Fragment wurde anschließend mit den ebenfalls durch SphI linearisierten Vektoren pZY557 respektive pUCBM20 ligiert. Nach Transformation von E. coli mit beiden Ligationslösungen und Klonierung der Transformanden, wurden die rekombinierten Plasmide pZY557tal bzw. pBM20tal erhalten. Das tktA-Gen wurde aus dem Vektor pGSJ427 (Sprenger G.A. et al., Eur. J. Biochem. 230 (1995) 525-32) durch PCR amplifiziert, wobei am 5 Ende eine Schnittstelle für das Restriktionsenzym NotI und am 3'Ende eine Schnittstelle für das Enzym SphI eingeführt wurde. Dabei wurden Oligonucleotide III:

(die unterstrichenen Basenpaare entsprechen dabei den Bp 126 bis 146 der tktA- Sequenz aus Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta, 1216 (1993) 307-10), das mit einer Schnittstelle für das Restriktionsenzym NotI versehen war, und als Oligonucleotid IV:

(die unterstrichenen Basenpaare entsprechen dabei den Bp 2018 bis 2036 der tktA- Sequenz aus Sprenger G.A., Biochim. Biophys. Acta, 1216 (1993) 307-10), das mit einer Schnittstelle für SphI versehen war, eingesetzt. Das erhaltene PCR-Fragment wurde mit NotI und SphI gespaltet und in den gleichermaßen behandelten Vektor pZY557 ligiert, so daß der Vektor pZY557tkt entstand. pZY557tkt wurde anschließend mit SphI geöffnet und mit dem SphI-geschnittenen PCR-Fragment mit talB ligiert. Nach Transformation von E. coli und Klonierung der Transformanden (s. oben), wurden Plasmide erhalten, die das tktA-Gen und das talB-Gen in gleichläufiger Richtung hinter dem tac-Promotor enthielten, wurden als Genstruktur pZY557tkttal weiterverwendet.

Die Aufbewahrung der erhaltenen Transformanden erfolgte auf LB-Medium in Form von Glycerinkulturen (30%) bei -80°C. Bei Bedarf wurden die Glycerinkulturen direkt vor dem Gebrauch aufgetaut.

Beispiel 2 Effekt der erhöhten Aktivität einer Transaldolase auf das Wachstum von Stämmen mit ebenfalls erhöhter Transketolaseaktivität

Das Wachstum der E. coli Stämme AT2471, AT2471/pZY557tkt, AT2471/pZT557tal, sowie AT2471/pZY557tkttal auf Glucose wurde in mineralischem Medium untersucht. Dies bestand aus Na-ci trat.3H₂O (1,0 g.l^-1), MgSO₄.7H₂O (0,3 g.l^-1), KH₂PO₄ (3,0 g.l^-1), K₂HPO₄ (12,0 g.l^-1), NaCl 0,1 (g.l^-1), (NH₄)₂SO₄ (5,0 g.l^-1), CaCl₂2H₂O (15,0 mg.l^-1), FeSO₄.7H₂O (0,75 g.l^-1) und L-Tyrosin (0,04 g.l^-1). Die Zugabe weiterer Minerale erfolgte über eine Spurenelementlösung (1 ml.l^-1) zusammengesetzt aus Al₂(SO₄)₃.18H₂O (2,0 g.l^-1), CoSO₄6H₂O (0,7 g.l^-1), CuSO₄.5H₂O (2,5 g.l^-1), H₃BO₃ (0,5 g.l^-1), MnCl₂4H₂O (20,0 g.l^-1), Na₂MoO₄.2H₂O (3,0 g.l^-1), NiSO₄.3H₂O (2,0 g.l^-1) und ZnSO₄.7H₂O (15,0 g.l^-1). Vitamin B1 (5,0 mg.l^-1) wurde in Wasser gelöst und dem Medium nach dem Autoklavieren sterilfiltriert zugegeben, ebenso wie bei Bedarf Carbenicillin bzw. Carbenicillin und Chloramphenicol. Glucose (30 g.l^-1) wurde separat autoklaviert und dem Medium ebenfalls nach dem Autoklavieren zugefügt.

Für die Experimente wurden Schüttelkolben (1000 ml mit 100 ml mineralischem Medium) mit 2 ml Glycerinkultur angeimpft und bei 37°C und 150 U.min^-1 für 72 h auf einem Kreisschüttler inkubiert. Die Induktion der Zellen durch Zugabe von 15-100 mM IPTG erfolgte nach Erreichen einer optischen Dichte (620 nm) von ≈ 1. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde die optische Dichte der Kultur in regelmäßigen Abständen gemessen. Der Wirtsorganismus E. coli AT2471 erreichte unter den oben beschriebenen Bedingungen nach 7,25 h eine optische Dichte von 1,2. Die Erhöhung der Aktivität der Transketolase in der Mutante AT2471/pZY557tkt führte zu einer starken Reduktion der Wachstumsgeschwindigkeit; dabei wurde, bei identischer optischer Dichte zu Beginn des Experimentes, nach 7,25 h lediglich eine optische Dichte von 0,49 erreicht. Der wachstumshemmende Effekt ist wahrscheinlich auf die Synthese inhibierender Konzentrationen von Stoffwechselintermediaten des Pentosephosphatweges zurückzuführen.

Auch die Erhöhung der Aktivität der Transaldolase in der Mutante AT2471/pZY557tal führte zu einer starken Reduktion (nahezu ebenso stark wie im Falle der Transketolase) der Wachstumsgeschwindigkeit; es wurde nach 7,25 h eine optische Dichte von 0,52 erreicht. Durch Erhöhung der Aktivität der Transaldolase zusätzlich zu der der Transketolase, wie in E. coli AT2471/pZy557tkttal realisiert, konnte nach 7,25 h eine optische Dichte von 1.1 erreicht werden. Dieses Resultat verdeutlicht, daß die zusätzliche Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase in einem Stamm mit erhöhter Transketolaseaktivität die negativen Auswirkungen einer alleinigen Erhöhung der Aktivität der Transketolase aufhebt und nahezu ungehemmtes Wachstum zuläßt.

Beispiel 3 Bestimmung der Enzymaktivitäten der Transaldolase

Zur Bestimmung der Aktivität der Transaldolase wurden die Zellen von E. coli AT2471, AT2471/pZY507, AT2471/pZY557tal, sowie AT2471/pZY557tkttal wie oben beschrieben kultiviert, wobei dem Medium jedoch 3-Morpholinpropansulfonsäure (MOPS, 16,7 gl.^-1) zugesetzt und die Phosphatkonzentration auf ein Zehntel der in den Versuchen zum Wachstum eingesetzten Konzentration gesenkt wurde. Zur Kontrolle der Induktion der Zellen wurden parallele Versuchsansätze durchgeführt, von denen ein Ansatz durch Zugabe von IPTG (20 µM) nach 7 Zellteilungen (OD ≈ 1) induziert wurde. Direkt vor der Zugabe des Induktors in die entsprechendenden Kolben, sowie 3 h nach dem Zeitpunkt der Induktion wurden aus allen Ansätzen 20 ml Kulturbrühe entnommen und die Zellen bei 4°C für 10 min bei 6000 g sedimentiert.

Die geernteten Zellen wurden in 50 mM Glycylglycinpuffer, PH 8,5, mit 1 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Thiamindiphosphat gewaschen. Die Zellen des Sediments wurden mittels Ultraschall (Branson Sonifier 250 mit Microtip) in einem Beschallungszyklus von 25% und mit einer Intensität von 40 Watt für 4 min pro ml Zellsuspension aufgeschlossen. Nach Zentrifugation für 30 min bei 18000 g und 4°C wurde der Überstand (Rohextrakt) für die Messung der Aktivität der Transaldolase verwendet.

Die Transaldolaseaktivität im Rohextrakt wurde über einen enzymatischen, optisch an die Bildung von NAD gekoppelten Test bestimmt. Dazu wurde der Rohextrakt in einem Gesamtvolumen von 1 ml mit 0,8 mM Fructose-6-Phosphat, 4 mM Erythrose-4-phosphat und 0,3 mM NADH in Puffer (50 mM Glycylglycin, pH 8,5, 1 mM Dithiothreitol, 10 mM MgCl₂ und 0,5 mM Thiamindiphosphat) inkubiert. Das entstehende Glycerinaldehyd-3-Phosphat wurde durch die ebenfalls zugegebenen Enzyme Triosephosphatisomerase (9 U) und Glycerin-3-Phosphatdehydrogenase (3 U) unter Bildung von NAD umgesetzt. Die Oxidation von NADH wurde spektrophotometrisch bei 340 nm verfolgt (ε = 6,3.10³ l.mol^-1.cm^-1), wobei die Umsetzung von 1 µmol NADH mit dem Verbrauch von 1 µmol Fructose-6-Phosphat gleichzusetzten ist. Der Umsatz von 1 µmol NADH pro min wurde als 1 U definiert.

Die Bestimmung der Proteinkonzentration in Rohextrakten erfolgte nach Bradford (Anal. Biochem. 72 (1976) 248-254) unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen Farbreagenzes. Als Standard wurde Rinderserumalbumin verwendet.

Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Enzymmessungen bei der Verwendung des Wirtsstammes E. coli AT2471, sowie dessen Mutanten die eines der Plasmide pZY557, pZY557tal oder pZY557tkttal enthalten. Zum Zeitpunkt der Induktion konnte für den Wirtsstamm, sowie für den den Vektor pZY557 tragenden Stamm eine Transketolaseaktivität um 0,65 U.(mg Protein)^-1 detektiert werden. Wie für E. coli AT2471/pZY557 gezeigt erhöhte sich dieser Wert durch physiologisches Wachstum in drei Stunden auf 0,8 U.(mg Protein)^-1. Ein Einfluß der in diesem Experiment ausgeführten Induktion war durch das Fehlen des tal-Genes auf dem verwendeten Vektor nicht zu erwarten. In parallelen Versuchsansätzen wurden für E. coli AT2471/pZY557tal zum Zeitpunkt der Induktion Transketolaseaktivitäten von 0,53 bzw. 0,61 U.(mg Protein)^-1 ermittelt. Während sich der Wert der Transaldolaseaktivität ohne Induktion der Kultur in 3 h auf nur 0,6 U.(mg Protein)^-1 steigerte, erreichte die Transaldolaseaktivität durch Induktion einen Wert von 1,06 U.(mg Protein)^-1. In weiteren Versuchsansätzen wurde in ansonsten identischen Experimenten E. coli AT2471/pZY557tkttal verwendet; dabei wurde die Transaldolaseaktivität in den ersten 3 h nach der Induktion der Zellen von 0,8 auf 1,16 U.(mg Protein)^-1 gesteigert, was einer Verdopplung der Aktivität im Vergleich zu entsprechenden Experimenten mit dem Wirtsstamm entsprach.

Beispiel 3 Produktion von Substanzen unter Verwendung von Stämmen, die zusätzlich zur erhöhten Transaldolaseaktivität eine erhöhte Transketolaseaktivität aufweisen

Für die Bestimmung der Syntheseleistung wurde das für die Wachstumsversuche eingesetzte Medium verwendet. Die Kulturen von E. coli AT2471 und AT2471/pZY557tkttal wurden bei einer optischen Dichte von 1 induziert und die Kultivierungszeit auf 72 h verlängert. Nach 24 und 48 h wurde der pH-Wert der Kulturen gemessen und bei Bedarf durch Zugabe von KOH (45%) auf den Startwert von 7.2 zurückgebracht. Des weiteren wurden nach 24, 48 und 72 h Proben (2 ml) zur Bestimmung der optischen Dichte, sowie der Glucose- und der L- Phenylalaninkonzentrationen genommen.

Die Phenylalaninkonzentration wurde mittels Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC, Hewlett Packard, München, D) in Verbindung mit Fluoreszenzdetektion (Extinktion 335 nm, Emission 570 nm) ermittelt. Als feste Phase wurde eine Nucleosil-120-8-C18-Säule (250.4,6 mm) verwendet; die Elution erfolgte unter Verwendung eines Gradienten (Eluent A: 90% 50 mM Phosphorsäure, 10% Methanol, PH 2,5; Eluent B: 20% 50 mM Phosphorsäure, 80% Methanol, pH 2,5; Gradient: 0-8 min 100% A, 8-13 min 0% A, 13-19 min 100% A). Die Elutionsgeschwindigkeit wurde auf 1,0 ml.min^-1 festgesetzt; die Säulentemperatur auf 40°C. Die Nachsäulenderivatisierung erfolgte unter Verwendung von o- Phtaldialdehyd in einer Reaktionskapillare (14 m.0.35 mm) bei Raumtemperatur. Für L-Phenylalanin wurde unter den beschriebenen Bedingungen eine Retentionszeit von 6,7 min ermittelt.

Durch die Messung der Glucosekonzentration mittels enzymatischer Teststreifen (Diabur, Boehringer Mannheim, D) und, abhängig von den Resultaten, Nachdosieren von 2 ml einer konzentrierten Glucoselösung (500 g.l^-1) wurde sichergestellt, daß keine Glucoselimitierung in den Versuchsansätzen auftrat. Nach einer Inkubationszeit von 48 h wurde im Vergleich zu einem (Phenylalanin)-Indexwert von 100 für den nicht induzierten Wirtsstamm E. coli AT2471, durch Induktion des Wirtsstammes ein Phenylalaninwert von 119 ermöglicht. Das alleinige Einbringen des Plasmides pZY557tkttal in den Wirtsstamm erlaubte sogar ohne Induktion der Zellen eine Erhöhung dieses, die Phenylalaninkonzentration beschreibenden Indexwertes auf 167. Aus den Experimenten ergab sich, daß die Induktion des Stammes E. coli AT2471/pZY557tkttal eine weitere Erhöhung auf einen Wert von 204 ermöglichte. Dies entsprach einer Erhöhung von 71% im Vergleich zum induzierten Wirtsstamm.

Dieses Ergebnis zeigt den erfindungsgemäßen, die Synthese aromatischer Verbindungen erhöhenden, positiven Effekt der zusätzlichen Erhöhung der Aktivität einer Transketolase in Stämmen mit bereits erhöhter Transaldolaseaktivität, bzw. der zusätzlichen Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase in Stämmen mit bereits erhöhter Transketolaseaktivität.

Beispiel 4 Produktion von Substanzen unter Verwendung von Stämmen mit erhöhter Transaldolaseaktivität

In einem ansonsten, mit Beispiel 3 identischen Experiment wurde die Mutante E. coli AT2471/pZY557tal kultiviert. Nach 48 h wurde bei einem (Phenylalanin)-Indexwert von 100 für den nicht induzierten Stamm durch dessen Induktion ein Phenylalaninwert von 131 ermöglicht.

Dieses Ergebnis zeigt deutlich den positiven Effekt der Erhöhung der Aktivität einer Transaldolase auf die Synthese aromatischer Substanzen, insbesondere nach erfolgter erfindungsgemäßer Induktion.

Beispiel 5 Produktion von Substanzen unter Verwendung von PTS⁻-Mutanten, in denen zusätzlich zu einer erhöhten Transaldolaseaktivität ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnahmesystem exprimiert ist

Das glf-Gen wurde, wie durch Weisser P. et al. (J. Bacteriol. 177 (1995) 3351-54) beschrieben über PCR (Mullis K.B. et al., Meth. Enzymol. 155 (1987) 335-50) erhalten. Die Nucleotidsequenz dieses Gens liegt vollständig vor (Barnell W.O. et al., J. Bacteriol. 172 (1990) 7227-40). Das glf-Gen wurde unter Verwendung des Plasmids pZY600 als Matrize amplifiziert (Weisser P. et. al., J. Bacteriol 177 (1995) 3351-4).

Zur Integration des glf-Gens in die Gene, die für Komponenten des PTS-Systems von E. coli kodieren, wurde das Plasmid pPTS1 (siehe Tabelle 1) mit BglII verdaut und mit Klenow-Fragment behandelt. Die singuläre Schnittstelle liegt im ptsI-Gen. Das glf-Gen wurde als BamHI-KpnI-Fragment aus dem Plasmid pBM20glfglk isoliert und ebenfalls mit Klenow-Fragment behandelt. Durch blunt-end-Ligation wurden Klone erhalten, die das glf in gleicher Orientierung wie die Gene ptsHI tragen. Aus dem resultierenden Plasmid pPTSglf konnte ein 4,6 kb PstI-Fragment erhalten werden, welches den 3'-Bereich des ptsH-Gens sowie ptsI mit integriertem glf und crr trägt. Dieses Fragment wurde in die EcoRV-Schnittstelle des Vektors pGP704 ligiert. Da dieser Vektor nur in λpir-Stämmen repliziert werden kann, haben Transformanden, die diesen Phagen nicht tragen, den Vektor ins Chromosom integriert, wenn sie auf Carbenicillin wachsen können. Die Integration wurde mittels Southern Analyse überprüft (Miller V.L. et al., J. Bacteriol. 170 (1988) 2575-83). Die erhaltenen Transformanden enthielten neben dem glf-Gen auch die vollständigen PTS-Gene.

Bei einem zweiten homologen crossover kann der Vektoranteil herausrekombinieren, was zum Verlust der Carbenicillin- Resistenz führt. Da in diesem Falle die pts-Gene durch die Insertion des glf-Gens unterbrochen vorliegen, wird das PTS in diesen Mutanten nicht funktionell exprimiert. Die gewünschten PTS⁻-Mutanten wurden wie folgt selektioniert: Nach mehrmaligem Überimpfen der noch PTS⁺-Transformanden auf LB-Medium ohne Antibiotika wurden Aliquots der Zellsuspension auf LB-Platten mit 100 µg.l^-1 Phosphomycin ausplattiert. PTS⁻- Mutanten können auf diesen Platten wachsen. Wachsende Klone wurden auf LB-Platten mit entweder Phosphomycin oder mit 20 µg.l^-1 Carbenicillin ausgestrichen. Von Klonen, die erneutes Wachstum auf den Phosphomycin-Platten, nicht aber auf den Carbenicillin Platten zeigten, wurde chromosomale DNS isoliert. Die Integration des glf-Gens in die Gene, die für das PTS-System kodieren, wurde durch Southern-Analyse bestätigt. Entsprechende Mutanten wurden als phänotypisch PTS-defizient identifiziert. Ein Klon wurde als Wirtsorganismus E. coli AT2471glfintPTS⁻ ausgewählt und für die Transformationen (s. oben) mit Plasmid pZY557tal eingesetzt. Den für Beispiel 3 und 4 beschriebenen experimentellen Bedingungen folgend, wurden die PTS-negative Mutante E. coli AT2471glfintPTS⁻/pZY557tal, sowie der korrespondierende Wirtsstamm AT2471glfintPTS⁻ in je zwei Parallelansätzen kultiviert und die Zellen je eines Ansatzes nach ca. 7 Teilungen induziert.

Durch die Induktion reduzierte sich die Syntheseleistung des Wirtstammes, ausgehend von einem Indexwert von 100 im Falle nicht vorhandener Induktion, auf einen Wert von 56. Im Vergleich dazu konnte in Kulturen des transformierten Stammes AT2471glfintPTS⁻/pZY557tal durch Induktion der Phenylalanin- Indexwert von 73 auf 103 und damit über das Ausgangsniveau des Wirtstammes erhöht werden.

Dieses Ergebnis zeigt, daß die alleinige Erhöhung der Transaldolaseaktivität die Synthese von Phenylalanin auch in jenen Mikroorganismem positiv beeinflußt, die sich durch ein in seiner Aktivität vermindert es oder gänzlich ausgeschaltetes PTS-System auszeichnen und in denen gleichzeitig ein PEP-unabhängiges Zuckeraufnahmesystem integriert ist.

Tabelle 1

Tabelle 2

Claims

1. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen, bei dem die Aktivität einer Transaldolase in einem diese Substanzen produzierenden Mikroorganismus erhöht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Substanzen hergestellt werden an deren Synthese mindestens ein Intermediat des Pentosephosphatweges beteiligt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Intermediat Erythrose-4-Phosphat (Ery4P) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Transaldolase aus Escherichia coli erhöht wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Transaldolase B (TalB) aus Escherichia coli erhöht wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität einer Transketolase erhöht wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität einer Transketolase aus Escherichia coli erhöht wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität der Transketolase A (TktA) aus Escherichia coli erhöht wird.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines Transportproteins zur Phosphoenolpyruvat(PEP)-unabhängigen Aufnahme eines Zuckers und/oder die Aktivität einer den entsprechenden Zucker phosphorylierenden Kinase erhöht wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Transportprotein ein Facilitator ist.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Facilitator das Glucosefacilitator-Protein (Glf) aus Zymomonas mobilis ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase eine Hexosen-phosphorylierende Kinase ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase aus Zymomonas mobilis stammt.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Kinase Glucokinase (Glk) aus Zymomonas mobilis ist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich die Aktivität eines PEP-abhängigen Zuckeraufnahmesystems, sofern anwesend, vermindert oder ausgeschaltet wird.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Aktivität mindestens einer der folgenden Komponenten, Transaldolase, Transketolase, Transportprotein, Kinase, gesteigert wird,

a) durch Einführung der Gene
b) und/oder durch Erhöhen der Genkopienzahl
c) und/oder durch Erhöhung der Genexpression
d) und/oder durch Erhöhung der endogenen Aktivität der genannten Enzyme
e) und/oder durch Strukturveränderung an den Enzymen
f) und/oder durch Verwendung von deregulierten Enzymen
g) und/oder durch Einführen von Genen, die für deregulierte Enzyme kodieren.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Steigerung der Aktivität dadurch erreicht wird, daß eine Integration des Gens oder der Gene in eine Genstruktur oder in mehrere Genstrukturen erfolgt, wobei das Gen oder die Gene als einzelne Kopie oder in erhöhter Kopienzahl in die Genstruktur eingebracht wird.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus eingesetzt wird, in dem ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

19. Verfahren nach der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die hergestellte Substanz eine aromatische Aminosäure ist.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der eingesetzte Mikroorganismus der Gattung Escherichia, Serratia, Bacillus, Corynebacterium oder Brevibacterium zugeordnet ist.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Escherichia coli ist.

23. Genstruktur enthaltend in rekombinanter Form

a) ein Gen kodierend für eine Transaldolase oder ein Gen kodierend für eine Transaldolase und ein Gen kodierend für eine Transketolase, und
b) mindestens ein Gen kodierend für ein Transportprotein zur PEP-unabhängigen Aufnahme eines Zuckers oder für eine einen Zucker phosphorylierende Kinase.

24. Genstruktur nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das Transportprotein einen Facilitator kodiert und das Gen für die Kinase eine Hexosen phosphorylierende Kinase kodiert.

25. Genstruktur nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene für die Transaldolase und für die Transketolase aus Escherichia coli stammen, und die Gene für das Transportprotein und für die Kinase aus Zymomonas mobilis stammen.

26. Genstruktur nach einem der Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für die Transaldolase talB und für die Transketolase tktA aus Escherichia coli ist, und das Gen für das Transportprotein glf und für die Kinase glk aus Zymomonas mobilis ist.

27. Genstruktur nach einem der Ansprüche 23 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die Genstruktur mindestens eine, einem der Gene zugeordnete, regulatorische Gensequenz enthält.

28. Genstruktur nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens eines der Gene in der Genstruktur so eingebaut ist, daß es unter Kontrolle eines induzierbaren Promotors steht.

29. Transformierte Zelle, enthaltend in replizierbarer Form eine Genstruktur nach den Ansprüchen 23 bis 28.

30. Transformierte Zelle nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß in der Zelle ein oder mehrere Enzyme, die zusätzlich an der Synthese der Substanzen beteiligt sind, dereguliert und/oder in ihrer Aktivität erhöht sind.

31. Transformierte Zelle nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Zelle eine Escherichia coli-Zelle ist.

32. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 29 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß zusätzlich das PEP-abhängige Zuckeraufnahmesystem, sofern anwesend, in seiner Aktivität vermindert oder ausgeschaltet ist.

33. Transformierte Zelle nach einem der Ansprüche 29 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß sie in der Lage ist, eine aromatische Aminosäure zu produzieren.

34. Transformierte Zelle nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, daß die aromatische Aminosäure L-Phenylalanin ist.

35. Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von Substanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß transformierte Zellen nach einem der Ansprüche 29 bis 34, in denen eine Genstruktur nach Anspruch 28 vorliegt, kultiviert werden und wobei die Induktion frühestens nach 2 Zellteilungen erfolgt.

36. Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß die transformierte Zelle außer den Intermediaten des Pentosephosphatweges auch andere Zentralstoffwechsel metabolite in erhöhter Verfügbarkeit enthält.