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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Abwasser der L-Glutaminsäurefermentation,
das als Ausgangsmaterial für
ein Düngemittel
eingesetzt werden kann, und ein dieses enthaltendes Düngemittel.
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L-Glutaminsäure wird
hauptsächlich
durch Fermentation unter Verwendung sogenannter L-Glutaminsäure produzierender
coryneformer Bakterien der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium
oder Microbacterium oder von Mutanten davon hergestellt (Amino Acid
Fermentation, Gakkai Shuppan Center, S. 195–215, 1986). Als Verfahren
zur Produktion von L-Glutaminsäure
durch Fermentation unter Verwendung anderer bakterieller Stämme kann
ein Verfahren unter Einsatz eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus,
Streptomyces, Penicillium oder dergleichen (U.S. Patent Nr. 3,220,929),
ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung
Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida oder dergleichen (U.S.
Patent Nr. 3,563,857), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus
der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes
(derzeit als Enterobacter aerogenes bezeichnet) oder dergleichen
(japanische Patentveröffentlichung
(Kokoku) Nr. 32-9393),
ein Verfahren unter Verwendung eines mutierten Stammes von Escherichia coli
(japanische offengelegte Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-244970) und
dergleichen bekannt. Zusätzlich
haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum
Produzieren von L-Glutaminsäure
unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Klebsiella, Erwinia
oder Pantoea vorgeschlagen (offengelegte japanische Patentanmeldung
Nr. 2000-106869).
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Außerdem sind
verschiedene Techniken zum Verbessern der Fähigkeit zur Produktion von
L-Glutaminsäure
durch Erhöhen
der Aktivitäten
der L-Glutaminsäurebiosyntheseenzyme
durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken offenbart worden. Beispielsweise
wurde berichtet, daß die
Einführung
eines Gens, das für
Citratsynthase aus Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum
codiert, für
die Erhöhung
der Fähigkeit zur L-Glutaminsäureproduktion
in Corynebacterium oder Brevibacterium wirksam ist (japanische Patentveröffentlichung
(Kokoku) Nr. 7-121228). Zudem offenbart die offengelegt japanische
Patentanmeldung 61-268185 eine Zelle, die rekombinante DNA trägt, die
ein Glutamatdehydrogenasegen aus Corynebacterium enthält. Außerdem offenbart
die offengelegt japanische Patentanmeldung Nr. 63-214189 ein Verfahren
zur Erhöhung
der Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
durch Amplifizieren eines Glutamatdehydrogenasegens, eines Isocitratdehydrogenasegens,
eines Aconitathydratasegens und eines Citratsynthasegens.
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Was
das vorstehend beschriebene Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure betrifft,
ist bislang eine Mutterlauge nach dem Gewinnen der L-Glutaminsäure als
Ausgangsmaterial für
einen Dünger
oder dergleichen eingesetzt worden (offengelegte japanische Patentanmeldung
Nr. 50-129363, japanische Patentveröffentlichung Nr. 35-16965,
offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 52-7872). Es ist deshalb
bei dem Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation wünschenswert,
daß nicht
nur die Produktion von L-Glutaminsäure erhöht wird, sondern auch eine
Mutterlauge erhalten wird, die als Ausgangsmaterial eines Düngers geeigneter
ist.
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Es
ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Fermentation durchgeführt wird,
während
die in der Kultur angehäufte
L-Aminosäure
kristallisiert (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 62-288).
In diesem Verfahren wird die L-Aminosäurekonzentration in der Kultur
durch Ausfällen
der angehäuften
L-Aminosäure
in der Kultur unter einem bestimmten Wert gehalten. Genauer gesagt
wird L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Leucin während der Fermentation durch
Einstellen der Temperatur und des pH-Wertes der Kultur oder durch
Zugeben eines oberflächenaktiven
Mittels zu dem Medium ausgefällt.
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Während ein
Verfahren zum Durchführen
einer Fermentation unter Ausfällung
einer L-Aminosäure
wie vorstehend beschrieben, bekannt ist, sind die Aminosäuren, die
für dieses
Verfahren geeignet sind, solche mit relativ geringer Wasserlöslichkeit, wobei
kein Beispiel einer Anwendung dieses Verfahrens auch hoch wasserlösliche Aminosäuren, wie
L-Glutaminsäure,
bekannt ist. Zudem muß das
Medium einen niedrigen pH-Wert haben, um L-Glutaminsäure auszufällen. L-Glutaminsäure produzierende
Bakterien, wie die vorstehend genannten, können jedoch unter sauren Bedingungen
nicht wachsen, so daß die
L-Glutaminsäurefermentation unter
neutralen Bedingungen durchgeführt
wird (U.S. Patent Nr. 3,220,929 und 3,032,474; K. C. Chao & J. W. Foster,
J. Bacteriol., 77, S. 715–725
(1959)).
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Somit
ist die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter
gleichzeitiger Ausfällung
nicht bekannt. Außerdem
ist bekannt, daß das
Wachstum der meisten acidophilen Bakterien durch organische Säuren, wie
Essigsäure,
Milchsäure
und Bernsteinsäure,
inhibiert wird (Yasuro Oshime, Herausgeber, "Extreme Environment Microorganism Handbook", S. 239, Science
Forum; R. M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, S. 597–599 (1967)
etc.). Deshalb wird angenommen, daß viele Mikroorganismen für L-Glutaminsäure, welche auch
eine organische Säure
ist, unter sauren Bedingungen zugänglich sind, und es gibt keinen
Bericht darüber, daß eine Suche
nach Mikroorganismen mit der Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
unter sauren Bedingungen versucht worden ist.
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Der
Abstract von
JP 50129363A offenbart
ein Düngemittel,
das ein auf die Fermentation von Glutaminsäure basiertes Medium umfaßt, wobei
Brevibacterium thiagenitalis als kultivierter Mikroorganismus eingesetzt
wird.
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EP 952 211 A und
EP 999 282 A offenbaren
die Verwendung von Enterobacter agglomerans für die Produktion von L-Glutaminsäure in Kulturmedien.
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ZUSAMMENFASSENDE DARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Unter
den vorstehend beschriebenen Umständen ist eine erfindungsgemäße Aufgabe,
eine Fermentationsmutterlösung
bereitzustellen, die für
die Verwendung als Ausgangsmaterial eines Düngemittels ohne Verringerung
der Produktion von L-Glutaminsäure
geeignet ist.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Fermentationsmutterlösung, die
erhalten wird durch Kultivieren eines Stamms von Enterobacter agglomerans,
der in der Lage ist, Glutaminsäure in
einem flüssigen
Medium zu produzieren, dessen pH auf 5,0 oder weniger eingestellt
ist, und wobei der Stamm von Enterobacter agglomerans in der Lage
ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, welches L-Glutaminsäure bei
einer Sättigungskonzentration
und die Kohlenstoffquelle enthält,
zu metabolisieren, und die Fähigkeit
aufweist, L-Glutaminsäure
in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration überschreitet,
so daß ermöglicht wird,
daß L-Glutaminsäure bei
diesem pH erzeugt und akkumuliert wird, was durch eine Ausfällung von
L-Glutaminsäure
während
der Kultivierung in dem Medium bei dem pH begleitet wird, eine große Menge
an organischem Stickstoff enthält
und als Ausgangsmaterial eines Düngemittels
geeignet ist. Somit wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
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Die
vorliegende Erfindung stellt folgendes bereit:
- 1.
Die Verwendung einer organischen Stickstoff enthaltenden Zusammensetzung
als Düngemittel,
wobei die organischen Stickstoff enthaltende Zusammensetzung eine
Fermentationsmutterlösung
umfaßt,
erhältlich
durch
Kultivieren eines Stamms von Enterobacter agglomerans,
der in der Lage ist, Glutaminsäure
in einem flüssigen
Medium zu produzieren, dessen pH auf 5,0 oder weniger eingestellt
ist, und wobei der Stamm von Enterobacter agglomerans in der Lage
ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, welches L-Glutaminsäure bei
einer Sättigungskonzentration
und die Kohlenstoffquelle enthält,
zu metabolisieren, und die Fähigkeit
aufweist, L-Glutaminsäure
in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration überschreitet,
so daß ermöglicht wird,
daß L-Glutaminsäure bei
diesem pH erzeugt und akkumuliert wird, was durch eine Ausfällung von
L-Glutaminsäure
während
der Kultivierung in dem Medium bei dem pH begleitet wird, und anschließend
Abtrennen
von L-Glutaminsäure
von dem Medium.
- 2. Die Verwendung nach 1, wobei der Mikroorganismus E. agglomerans
AJ13601 ist.
- 3. Ein Düngemittel,
umfassend eine organischen Stickstoff enthaltende Zusammensetzung,
umfassend eine Fermentationsmutterlösung, erhältlich durch
Kultivieren
eines Stamms von Enterobacter agglomerans, der in der Lage ist,
Glutaminsäure
in einem flüssigen
Medium zu produzieren, dessen pH auf 5,0 oder weniger eingestellt
ist, und wobei der Stamm von Enterobacter agglomerans in der Lage
ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, welches L-Glutaminsäure bei
einer Sättigungskonzentration
und die Kohlenstoffquelle enthält,
zu metabolisieren, und die Fähigkeit
aufweist, L-Glutaminsäure
in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration überschreitet,
so daß ermöglicht wird,
daß L-Glutaminsäure bei
diesem pH erzeugt und akkumuliert wird, was durch eine Ausfällung von
L-Glutaminsäure
während
der Kultivierung in dem Medium bei dem pH begleitet wird, und anschließend
Abtrennen
von L-Glutaminsäure
von dem Medium.
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Erfindungsgemäß kann die
Fermentationsmutterlösung,
die als Ausgangsmaterial eines Düngemittels oder
dergleichen geeignet ist, durch Fermentation effizient produziert
werden.
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KURZE ERKLÄRUNG DER
ZEICHNUNGEN
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1 ist
eine Restriktionsenzymkarte eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten
DNA-Fragments in pTWVEK101.
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2 zeigt
den Vergleich einer Aminosäuresequenz,
die von einer Nukleotidsequenz eines von Enterobacter agglomerans
abgeleiteten sucA-Gens und eines von Escherichia coli abgeleiteten
sucA-Gens abgeleitet ist (oben: Enterobacter agglomerans; unten:
Escherichia coli; dasselbe gilt im Folgenden).
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3 zeigt
einen Vergleich der Aminosäuresequenzen,
die von einer Nucleotidsequenz eines von Enterobacter agglomerans und
eines von Escherichia coli abgeleiteten sucB-Gens abgeleitet sind.
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4 zeigt
einen Vergleich der Aminosäuresequenzen,
die von einem von Enterobacter agglomerans und von Escherichia coli
abgeleiteten sucC-Gen abgeleitet sind.
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5 zeigt
den Vergleich von Aminosäuresequenzen,
die von Nukleotidsequenzen eines von Enterobacter agglomerans und
von Escherichia coli abgeleiteten sdhB-Gens abgeleitet sind.
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6 zeigt
die Konstruktion des Plasmids pMWCPG, das ein gltA-Gen, ein ppc-Gen
und ein gdhA-Gen enthält.
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7 zeigt
die Konstruktion des Plasmids RSF-Tet, das ein Replikationsursprung
des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich und ein tetracyclines
Resistenzgen enthält.
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8 zeigt
die Konstruktion des Plasmids RSFCPG, das einen Replikationsursprung
des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich, ein tetracyclines
Resistenzgen, ein gltA-Gen, ein ppc-Gen und ein gdhA-Gen enthält.
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9 zeigt
die Konstruktion des Plasmids pSTVCB, welches ein gltA-Gen enthält.
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EINGEHENDE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Im
Folgenden wird die Erfindung eingehend beschrieben.
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Der
organische Stickstoff bedeutet Stickstoff, der nicht Ammoniakstickstoff
ist. Im allgemeinen ist es Stickstoff, der in organischen Materialien
enthalten ist, die aus Aminosäuren,
Peptiden, Proteinen und Nukleinsäuren
bestehen.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
dir organischen Stickstoff enthält,
kann als Fermentationsmutterlösung
erhalten werden, die erhalten wird durch Kultivieren eines Stammes
von Enterobacter agglomerans, der in der Lage ist, Glutaminsäure in einem
flüssigen
Medium zu produzieren, dessen pH auf 5,0 oder weniger eingestellt
ist, und wobei der Stamm von Enterobacter agglomerans in der Lage
ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, welches L-Glutaminsäure bei
einer Sättigungskonzentration
und die Kohlenstoffquelle enthält,
zu metabolisieren, und die Fähigkeit
aufweist, L-Glutaminsäure
in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration überschreitet,
So daß ermöglicht wird,
daß L-Glutaminsäure bei diesem
pH erzeugt und akkumuliert wird, was durch eine Ausfällung von
L-Glutaminsäure
während
der Kultivierung in dem Medium bei dem pH begleitet wird, und anschließend
Abtrennen
von L-Glutaminsäure
von dem Medium.
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Der
in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus mit der
Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
ist Enterobacter agglomerans.
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Außerdem ist
der in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismus mit
der Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
ein Mikroorganismus, der eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das
L-Glutaminsäure
in einer Sättigungskonzentration
und die Kohlenstoffquelle enthält,
bei einem spezifischen pH-Wert von 5,0 oder weniger metabolisieren
kann und die Fähigkeit
hat, L-Glutaminsäure
in einer Länge
anzuhäufen,
welche die Sättigungskonzentration
von L-Glutaminsäure
in dem flüssigen
Medium bei dem vorstehend genannten pH-Wert übersteigt (im Folgenden auch
als "L-Glutaminsäure anhäufender
Mikroorganismus" bezeichnet).
Der vorstehend genannte spezifische pH-Wert ist ein pH-Wert, bei
dem L-Glutaminsäure in
dem Medium ausfällt,
und ist 5,0 oder weniger.
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Die "Sättigungskonzentration" bedeutet eine Konzentration
von L-Glutaminsäure,
die in dem flüssigen Medium
aufgelöst
ist, wenn das flüssige
Medium mit L-Glutaminsäure
gesättigt
ist.
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Wenn
ein L-Glutaminsäure
anhäufender
Organismus eingesetzt wird, ist der für die Produktion von L-Glutaminsäure geeignete
pH-Wert derjenige, bei dem L-Glutaminsäure in dem Medium ausfällt. Die
Durchführung
der Kultivierung bei diesem pH-Wert führt dazu, daß L-Glutaminsäure in dem
Medium hergestellt und angehäuft
wird und gleichzeitig eine Ausfällung
stattfindet.
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Der
L-Glutaminsäure
anhäufende
Mikroorganismus kann wie folgt erhalten werden. Eine Mikroorganismen
enthaltende Probe wird in ein flüssiges
Medium, das L-Glutaminsäure
in einer Sättigungskonzentration und
eine Kohlenstoffquelle enthält,
bei einem spezifischen pH-Wert eingeimpft, und der Stamm, der die Kohlenstoffquelle
metabolisiert, wird selektiert. Der spezifische pH-Wert ist 5,0
oder weniger, vorzugsweise 4,5 oder weniger, stärker bevorzugt 4,3 oder weniger.
Der L-Glutaminsäure
anhäufende
Mikroorganismus wird für die
Produktion von L-Glutaminsäure
durch Fermentation eingesetzt, wobei gleichzeitig die L-Glutaminsäure ausgefällt wird.
Wenn der pH-Wert
zu niedrig ist, wird es schwierig zu bewirken, daß der Mikroorganismus L-Glutaminsäure in einer
für die
Ausfällung
ausreichenden Menge zu produzieren. Deshalb ist der pH-Wert in dem
vorstehend genannten Bereich.
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Wenn
der pH-Wert einer wäßrigen Lösung, die
L-Glutaminsäure
enthält,
gesenkt wird, fällt
die Löslichkeit
der L-Glutaminsäure
um den pKA-Wert der γ-Carboxygruppe
deutlich ab (4,25, 25°C).
Die Löslichkeit
wird am isoelektrischen Punkt (pH 3,2) am niedrigsten, und L-Glutaminsäure, welche
die Menge übersteigt,
die der Sättigungskonzentration
entspricht, wird ausgefällt.
In Abhängigkeit
von der Zusammensetzung des Mediums wird L-Glutaminsäure in einer
Menge von 10–20
g/l bei pH 3,2, 30–40
g/l bei pH 4,0 und 50–60
g/l bei pH 4,7 bei etwa 30°C
gelöst. Üblicherweise
muß der
pH-Wert nicht auf 3,0 oder niedriger gesenkt werden, weil die L-Glutaminsäure ausfällende Wirkung
ihre Obergrenze erreicht, wenn der pH-Wert unter einen bestimmten Wert
fällt.
Der pH-Wert kann jedoch 3,0 oder niedriger sein.
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Zusätzlich bedeutet
der Ausdruck, daß ein
Mikroorganismus "eine
Kohlenstoffquelle metabolisieren kann", das er proliferieren kann oder eine
Kohlenstoffquelle nutzen kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann,
d.h. daß dies
darauf hinweist, daß er
eine Kohlenstoffquelle, wir Zucker oder organische Säuren, katabolisiert.
Genauer gesagt, kann, wenn beispielsweise ein Mikroorganismus proliferiert,
wenn er in einem flüssigen
Medium, das L-Glutaminsäure
in einer Sättigungskonzentration
enthält,
bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0,
insbesondere bevorzugt pH 4,0 bei einer geeigneten Temperatur, beispielsweise
bei 28°C,
37°C oder
50°C, während 2
bis 4 Tagen kultiviert wird, dieser Mikroorganismus die Kohlenstoffquelle
in dem Medium metabolisiert. Wenn außerdem beispielsweise ein Mikroorganismus
eine Kohlenstoffquelle nutzt, obwohl der Mikroorganismus nicht proliferieren
kann, wenn er in einem synthetischen flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei
einer Sättigungskonzentration
enthält,
bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0,
insbesondere bevorzugt bei pH 4,0, bei einer geeigneten Temperatur,
beispielsweise 28°C,
37°C oder
50°C, während 2
bis 4 Tagen kultiviert wird, ist der Mikroorganismus ein Mikroorganismus,
der die Kohlenstoffquelle in dem Medium metabolisieren kann.
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Der
Mikroorganismus, der eine Kohlenstoffquelle metabolisieren kann,
umfaßt
einen Mikroorganismus, der in dem vorstehend genannten flüssigen Medium
wachsen kann.
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Außerdem bedeutet
der Ausdruck, daß ein
Mikroorganismus "wachsen
kann", daß er proliferieren kann
oder L-Glutaminsäure
produzieren kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann. Wenn
beispielsweise ein Mikroorganismus proliferiert, wenn er in einem
flüssigen
Medium, das L-Glutaminsäure
bei einer Sättigungskonzentration
enthält,
bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0,
insbesondere bevorzugt bei pH 4,0, bei einer geeigneten Temperatur,
beispielsweise 28°C,
37°C oder
50°C, während 2
bis 4 Tagen kultiviert wird, kann dieser Mikroorganismus in dem
Medium wachsen. Wenn außerdem
beispielsweise ein Mikroorganismus die Menge an L-Glutaminsäure in einem
synthetischen flüssigen
Medium erhöht, selbst
wenn der Mikroorganismus nicht proliferieren kann, wenn der Mikroorganismus
in dem synthetischen flüssigen
Medium, das L-Glutaminsäure
bei einer Sättigungskonzentration
enthält,
bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt 4,3 bis 4,0,
insbesondere bevorzugt bei pH 4,0 bei einer geeigneten Temperatur,
beispielsweise 28°C,
37°C oder
50°C, während 2
bis 4 Tagen kultiviert wird, ist dieser Mikroorganismus ein Mikroorganismus,
der in dem Medium wachsen kann.
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Die
vorstehend beschriebene Selektion kann zweimal oder mehrere Male
unter denselben Bedingungen oder unter Änderung des pH-Werts oder der
Konzentration der L-Glutaminsäure
wiederholt werden. Eine Selektion auf ein frühes Stadium kann in einem Medium,
das ... Glutaminsäure
in einer Konzentration unter der Sättigungskonzentration enthält, durchgeführt werden,
und danach kann die anschließende
Selektion in einem Medium durchgeführt werden, daß L-Glutaminsäure in einer
Sättigungskonzentration
enthält.
Außerdem
können
Stämme
mit gewünschten
Eigenschaften, wie vorteilhafter Proliferationsrate, selektiert
werden.
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Der
L-Glutaminsäure
anhäufende
Mikroorganismus ist ein Mikroorganismus, der die Fähigkeit
besitzt, L-Glutaminsäure
in einer Menge anzuhäufen,
welche die Menge übersteigt,
die der Sättigungskonzentration von
L-Glutaminsäure
in einem flüssigen
Medium entspricht, wobei diese Fähigkeit
zusätzlich
zu den vorstehend beschriebenen Eigenschaften auftritt. Der pH-Wert
des vorstehend genannten flüssigen
Mediums ist vorzugsweise derselbe oder ähnlich wie derjenige des Mediums,
das für
das Screenen eines Mikroorganismus mit den vorstehend genannten
Eigenschaften eingesetzt wird. Üblicherweise
wird ein Mikroorganismus für L-Glutaminsäure bei
einer hohen Konzentration mit abnehmenden pH-Wert anfälliger.
Deshalb ist es bevorzugt, daß der
pH-Wert im Hinblick auf die Unempfindlichkeit gegen L-Glutaminsäure nicht
niedrig ist, wobei jedoch ein niedriger pH-Wert im Hinblick auf
die Produktion von L-Glutaminsäure,
die von deren Ausfällung begleitet
wird, bevorzugt ist. Um diese Bedingungen zu erfüllen, kann der pH-Wert bereits
von 3 bis 5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker bevorzugt 4 bis 4,7, noch
stärker
bevorzugt 4 bis 4,5, insbesondere bevorzugt 4,0 bis 4,3 sein.
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Als
Mikroorganismus wird Enterobacter agglomerans eingesetzt, vorzugsweise
der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355. Dieser Stamm wurde aus
der Erde in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, als ein Stamm isoliert,
der in einem Medium, das L-Glutaminsäure und eine Kohlenstoffquelle
enthält,
bei niedrigem pH-Wert proliferieren kann.
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Die
physiologischen Eigenschaften von AJ13355 sind nachstehend genannt:
- (1) Gramfärbung:
negativ
- (2) Verhalten gegen Sauerstoff: fakultativ anaerob
- (3) Catalase: positiv
- (4) Oxidase: negativ
- (5) Fähigkeit
zur Nitratreduktion: negativ
- (6) Voges-Proskauer-Test: positiv
- (7) Methylrottest: negativ
- (8) Urease: negativ
- (9) Indolherstellung: positiv
- (10) Beweglichkeit: beweglich
- (11) H2S-Produktion in TSI-Medium: schwach
aktiv
- (12) β-Galactosidase:
positiv
- (13) Saccharid-assimilierende Eigenschaft:
Arabinose: positiv
Saccharose:
positiv
Lactose: positiv
Xylose: positiv
Sorbitol:
positiv
Inositol: positiv
Trehalose: positiv
Maltose:
positiv
Glucose: positiv
Adonitol: negativ
Raffinose:
positiv
Salicin: negativ
Melibiose: positiv
- (14) Glycerose-assimilierende Eigenschaft: positiv
- (15) Assimilation von organischen Säuren:
Zitronensäure: positiv
Weinsäure: negativ
Glycolsäure: positiv
Essigsäure: positiv
Äpfelsäure: negativ
- (16) Arginindehydratase: negativ
- (17) Ornithindecarboxylase: negativ
- (18) Lysindecarboxylase: negativ
- (19) Phenylalanindeaminase: negativ
- (20) Pigmentbildung: gelb
- (21) Fähigkeit
zur Verflüssigung
von Gelatine: positiv
- (22) Wachstums-pH-Wert: Wachstum möglich bei pH 4, gutes Wachstum
bei pH 4,5 bis 7
- (23) Wachstumstemperatur: gutes Wachstum bei 25°C, gutes
Wachstum bei 30°C,
gutes Wachstum bei 37°C,
Wachstum möglich
bei 42°C,
Wachstum unmöglich
bei 45°C.
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Auf
der Grundlage dieser bakteriologischen Eigenschaften wurde AJ13355
als Enterobacter agglomerans bestimmt.
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Enterobacter
agglomerans AJ13355 wurde beim National Institute of Bioscience
and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology,
Ministry of International Trade and Industry (derzeit International
Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial
Science and Technology) am 19. Februar 1998 hinterlegt und erhielt
die Hinterlegungsnummer FERM P-16644. Er wurde dann unter den Bestimmungen
des Budapester Abkommens am 11. Januar 1999 hinterlegt und erhielt
die Hinterlegungsnummer FERM BP-6614.
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Der
L-Glutaminsäure
anhäufende
Mikroorganismus kann ein Mikroorganismus mit der ursprünglichen Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
oder mit der Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
sein, die durch Züchtung
unter Verwendung einer Mutagenesebehandlung oder einer rekombinanten
DNA-Technologie übertragen
oder verstärkt
worden ist.
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Die
Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
kann beispielsweise durch Erhöhen
der Aktivität
eines Enzyms, das eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, übertragen
oder verstärkt werden.
Die Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
kann auch durch Verringern oder Ausschalten der Aktivität eines
Enzyms, das eine vom Biosyntheseweg für L-Glutaminsäure abzweigende
Reaktion katalysiert und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure erzeugt,
verstärkt
werden.
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Als
Beispiel für
ein Enzym, das eine Reaktion für
die Biosynthese von L-Glutaminsäure
katalysiert, kann Glutamatdehydrogenase (im Folgenden auch als "GDH" bezeichnet), Glutaminsynthetase,
Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase
(im Folgenden auch als "CS" bezeichnet), Phosphoenolpyruvatcarboxylase
(im Folgenden auch als "PEPC" bezeichnet), Pyruvatdehydrogenase,
Pyruvatkinase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase,
Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogense, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase,
Phosphofructokinase und Glucosephosphatisomerase genannt werden.
Unter diesen Enzymen sind eines, zwei oder drei unter CS, PEPC und
GDH bevorzugt. Außerdem
ist es bevorzugt, daß die
Aktivitäten
aller drei Enzyme, nämlich
CS, PEPC und GDH, in dem L-Glutaminsäure anhäufenden Mikroorganismus verstärkt sind.
Insbesondere ist CS von Brevibacterium lactofermentum bevorzugt,
da es keiner Inhibition durch α-Ketoglutarsäure, L-Glutaminsäure und
NADH unterworfen ist.
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Um
die Aktivität
von CS, PEPC oder GDH zu verstärken,
kann beispielsweise ein für
CS, PEPC oder GDH codierendes Gen auf ein geeignetes Plasmid kloniert
werden, und es kann ein Wirtsmikroorganismus mit dem erhaltenen
Plasmid transformiert werden. Die Kopienzahl des für CS, PEPC
oder GDH codierenden Gens (im Folgenden als "gltA-Gen", "ppc-Gen", bzw. "gdhA-Gen" bezeichnet) in dem
transformierten Stamm erhöht sich
dadurch, was zu einer Erhöhung
der Aktivität
von CS, PEPC oder GDH führt.
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Die
klonierten gltA-, ppc- und gdhA-Gene werden in den vorstehend genannten
Ausgangsstamm allein oder in willkürlicher Kombination von zwei
oder drei der Gene eingeführt.
Wenn zwei oder drei Arten der Gene eingeführt werden, können zwei
oder drei Arten der Gene auf ein Plasmid kloniert und in die Wirtszelle
eingeführt
werden, oder sie können
auch zwei oder drei unterschiedliche Plasmide, die coexistieren
können,
kloniert werden und in die Wirtszelle eingeführt werden.
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Zwei
oder mehr Arten von Genen, die für
dasselbe Enzym codieren, jedoch von unterschiedlichen Mikroorganismen
abgeleitet sind, können
in dieselbe Wirtszelle eingeführt
werden.
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Die
vorstehend beschriebenen Plasmide sind nicht besonders eingeschränkt, solange
sie in einer Zelle eines Mikroorganismus, der beispielsweise zur
Gattung Enterobacter gehört,
autonom replizierbar sind. Als Beispiele können pUC19, pUC18, pBR322,
pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219,
mMW218, pACYC177 und pACYC184 genannt werden. Daneben können auch
Vektoren von Phagen-DNA eingesetzt werden.
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Die
Transformation kann beispielsweise durch das Verfahren von D. M.
Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), durch das Verfahren,
bei dem die Durchlässigkeit
der Empfängerzellen
für DNA
durch Behandlung der Zellen mit Calciumchlorid erhöht wird
(Mandel M. und Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)), oder durch
Elektroporation (Miller J. H., "A
Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
U.S.A., 1992) durchgeführt
werden.
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Die
Aktivität
von CS, PEPC oder GDH kann auch dadurch erhöht werden, daß die Anwesenheit
mehrerer Kopien des gltA-Gens,
des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf der chromosomalen DNA des vorstehen genannten
Ausgangsstammes, der als Wirt vorgesehen ist, zugelassen wird. Um
mehrere Kopien des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf
die chromosomale DNA eines Mikroorganismus der Gattung Enterobacter
einzuführen,
kann eine Sequenz, von der mehrere Kopien auf der chromosomalen
DNA vorhanden sind, wie repetitive DNA und umgekehrte Wiederholungen,
die an einem Ende eines transponierbaren Elements vorhanden sind,
eingesetzt werden. Alternativ dazu können mehrere Kopien des Gens
in die chromosomale DNA dadurch eingeführt werden, daß der Transfer
eines Transposons, welches das gltA-Gen, das ppc-Gen oder das gdhA-Gen
enthält,
ausgenutzt wird. Als Ergebnis wird die Kopienzahl eines gltA-Gens, ppc- Gens oder gdhA-Gens
in einer transformierten Zelle erhöht, so daß die Aktivität von CS,
PEPC oder GDH erhöht
wird.
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Als
Organismen, die als Quelle des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des
gdhA-Gens, deren Kopienzahl erhöht
werden soll, dienen, können
beliebige Organismen eingesetzt werden, solange sie die Aktivität von CS, PEPC
oder GDH haben. Unter anderem sind Bakterien, welche Prokaryoten
sind, beispielsweise solche der Gattung Enterobacter, Klebsiella,
Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium oder
Bacillus bevorzugt. Spezifische Beispiele sind Escherichia coli
und Brevibacterium lactofermentum. Das gltA-Gen, das ppc-Gen und
das gdhA-Gen können
aus der chromosomalen DNA der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen
erhalten werden.
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Das
gltA-Gen, da ppc-Gen und das gdhA-Gen können unter Verwendung eines
mutierten Stammes, dem die Aktivität von CS, PEPC oder GDH fehlt,
zur Isolierung eines DNA-Fragments, das die Auxotrophie supplementiert,
von der chromosomalen DNA des vorstehend genannten Mikroorganismus
erhalten werden. Da außerdem
die Nucleotidsequenzen dieser Gene aus Escherichia und Corynebacterium
bereits bekannt sind (Biochemistry, 22, S. 5243–5249, (1983); J. Biochem.,
95, S. 909–916,
(1984); Gene, 27, S. 193–199, (1984);
Microbiology, 140, S. 1818–1828,
(1994); Mol. Gen. Genet., 218, S. 330–339, (1989), Molecular Microbiology,
6, S. 317–326,
(1992)), können
sie durch PCR unter Einsatz von Primern, die auf der Grundlage jeder
Nukleotidsequenz synthetisiert worden sind, und der chromosomalen
DNA als Matrize erhalten werden.
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Die
Aktivität
von CS, PEPC oder GDH kann auch durch Verstärken der Expression des gltA-Gens,
des ppc-Gens oder des gdhA-Gens neben der vorstehend genannten Amplifikation
der Gene erhöht
werden. Beispielsweise kann die Expression durch Ersetzen eines
Promotors für
das gltA-Gen, das ppc-Gen oder das gdhA-Gen durch einen stärkeren Promotor
verstärkt
werden. Beispielsweise sind als stärkere Promotoren der lac-Promotor,
trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, Pr-Promotor
und PL-Promotor
des Phagen lamda bekannt. Das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen,
deren Promotor ersetzt wird, werden auf ein Plasmid kloniert und
in den Wirtsmikroorganismus eingeführt, oder sie werden in die
chromosomale DNA des Wirtsmikroorganismus unter Einsatz repetitiver
DNA, umgekehrter Wiederholungen oder Transposons eingeführt.
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Die
Aktivität
von CS, PEPC oder GDH kann auch dadurch erhöht werden, daß der Promotor
des gltA-Gens, des ppc-Gens oder des gdhA-Gens auf dem Chromoson
durch einen stärkeren
Promotor ersetzt wird (vergl. WO87/03006 und die offengelegte japanische
Patentanmeldung Nr. 61-268183), oder das ein stärkerer Promotor stromaufwärts der
codierenden Sequenz jedes Gens eingeführt wird (vergl. Gene, 29,
S. 231–241 (1984)).
Im Speziellen kann die homologe Rekombination zwischen dem gltA-Gen, dem ppc-Gen
oder dem gdhA-Gen, deren Promotor durch einen stärkeren Promotor ersetzt ist,
oder der DNA, die einen Teil davon enthält, und dem korrespondierenden
Gen auf dem Chromosom durchgeführt
werden.
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Beispiele
des Enzyms, das die Reaktion katalysiert, die von dem Bisyntheseweg
für L-Glutaminsäure abzweigt
und eine andere Verbindung als L-Glutaminsäure erzeugt, umfassen α-Ketoglutaratdehydrogenase (im
folgenden auch als "αKGDH"), Isocitratlyase,
Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase,
Acetolactatsynthase, Formatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase,
Glutamatdecarboxylase und 1-Pyrrolindehydrogenase. Unter diesen
ist αKGDH
bevorzugt.
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Um
die Aktivitäten
der vorstehend genannten Enzyme in Enterobacter agglomerans zu senken
oder zu eliminieren, können
Mutationen zum Senken oder Eliminieren der intrazellulären Aktivität der Enzyme
in die Gene der vorstehend genannten Enzyme durch übliche Mutageneseverfahren
oder gentechnisches Verfahren eingeführt werden.
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Beispiele
der Mutagenesebehandlung umfassen Verfahren unter Einsatz von Bestrahlung
mit Röntgenstrahlung
oder UV-Strahlung
und Verfahren unter Einsatz der Behandlung mit einem Mutagenesemittel, wie
N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.
Die Stelle des Gens, an der die Mutation eingeführt wird, kann in der für ein Enzym
codierenden Region oder in einer Region für die Regulation der Expression,
wie in einem Promotor, eingeführt
werden.
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Beispiele
der gentechnischen Verfahren umfassen Verfahren unter Einsatz der
Genrekombination, Transduktion und Zellfusion. Beispielsweise wird
ein Arzneimittelresistenzgen in ein kloniertes Zielgen eingeführt, um
ein Gen herzustellen, das seine Funktion verloren hat (defektives
Gen). Danach wird das defektive Gen in eine Zelle eines Wirtsmikroorganismus
eingeführt,
und das Zielgen auf dem Chromosom wird durch das vorstehend genannte
defektive Gen unter Einsatz der homologen Rekombination ersetzt
(Genzerstörung).
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Die
Senkung oder Ausschaltung der intrazellulären Aktivität des Zielenzyms und das Ausmaß der Absenkung
der Aktivität
können
durch Messen der Enzymaktivität
eines Zellextrakts oder einer gereinigten Fraktion davon, die von
dem Stamm erhalten wird, und Vergleichen mit der Aktivität eines
Wildtypstamms bestätigt werden.
Beispielsweise kann die αKGDH-Aktivität durch
das Verfahren von Reed et al. (Reed L. J. und Mukherjee B. B., Methods
in Enzymology, 13, S. 55–61
(1969)) gemessen werden.
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In
Abhängigkeit
von dem Zielenzym kann der mutierte Zielstamm auf der Grundlage
des Phänotyps des
mutierten Stammes ausgewählt
werden. Beispielsweise kann ein mutierter Stamm, in dem die α-KGDH-Aktivität verringert
oder ausgeschaltet ist, nicht wachsen oder zeigt unter aeroben Kulturbedingungen eine
deutlich verringerte Proliferationsrate in einem Minimalmedium,
das Glycose enthält,
oder in einem Minimalmedium, das Essigsäure oder L-Glutaminsäure als
die einzige Kohlenstoffquelle enthält. Eine normale Proliferation
wird jedoch sogar unter denselben Bedingungen ermöglicht,
indem Bernsteinsäure
oder Lysin, Methionin und Diaminopimelinsäure zu einem Glucose enthaltenden
Minimalmedium gegeben werden. Unter Ausnutzung dieser Phänomene als
Indikatoren kann ein mutierter Stamm mit verringerter oder ausgeschalteter α-KGDH-Aktivität selektiert
werden.
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Außerdem werden
Verfahren, wie das Klonieren von Genen und das Verdauen und Ligieren
von DNA, Transformation und dergleichen, eingehend in Molecular
Cloning, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben.
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Als
spezifisches Beispiel eines mutierten Stammes, dem die αKDGH-Aktivität fehlt
oder der eine verringerte αKDGH-Aktivität hat, erhalten
wie vorstehend beschrieben, kann Enterobacter agglomerans AJ13356 genannt
werden. Enterobacter agglomerans AJ13356 wurde beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology,
Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry (derzeit International Patent Organism Depositary,
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology)
am 19. Februar 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16645 hinterlegt.
Er wurde dann unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens am
11. Januar 1999 in eine internationale Hinterlegung unter der Hinterlegungsnummer
FERM BP-6615 hinterlegt. Enterobacter agglomerans AJ13356 hat als
Ergebnis der Zerstörung
des Gens für
die αKGDH-E1-Untereinheit
(sucA) keine αKGDH-Aktivität.
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Wenn
Enterobacter agglomerans, welcher der in der vorliegenden Erfindung
eingesetzte Mikroorganismus ist, in einem Medium kultiviert wird,
das ein Saccharid enthält,
wird Schleim ausgeschieden, der gelegentlich zu einer geringen Kultivierungseffizienz
führt.
Wenn Enterobacter agglomerans mit einer solchen Eigenschaft eingesetzt
wird, ist es daher bevorzugt, einen mutierten Stamm zu verwenden,
der im Vergleich zu einem Wildtypstamm weniger Schleim ausscheidet.
Beispiele für
Mutagenesebehandlungen umfassen Verfahren unter Einsatz der Bestrahlung
mit Röntgenstrahlen
oder UV-Strahlen und Verfahren unter Einsatz eines Mutagenesemittels,
wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.
Ein mutierter Stamm mit verringerter Ausscheidung von Schleim kann
durch Einimpfen von mutagenisierten Bakterienzellen in ein Medium,
das ein Saccharid enthält,
beispielsweise eine LB-Mediumplatte, die 5 g/l Glucose enthält, Kultivieren
der Zellen unter Neigung der Platte um etwa 45 Grad und Auswählen einer
Kolonie, die nicht auf dem Schleim nach unten fließt, selektiert
werden.
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In
der vorliegenden Erfindung kann die Übertragung der Verstärkung der
Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
und die Übertragung
anderer vorteilhafter Eigenschaften, wie eine Mutation zu weniger Schleimausscheidung,
in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
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Durch
Kultivierung des Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von
L-Glutaminsäure
in einem flüssigen
Medium, das auf eine pH-Bedingung eingestellt ist, welche die Ausfällung von
L-Glutaminsäure erlaubt,
kann L-Glutaminsäure
unter gleichzeitiger Ausfällung
in das Medium produziert und angehäuft werden.
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Durch
die Kultivierung des L-Glutaminsäure
anhäufenden
Mikroorganismus in einem flüssigen
Medium, das auf eine pH-Bedingung eingestellt ist, welche die Ausfällung von
L-Glutaminsäure
erlaubt, kann L-Glutaminsäure
durch gleichzeitige Ausfällung
in das Medium hergestellt und angehäuft werden. Außerdem ist
es möglich,
daß die
Kultur bei einem neutralen pH begonnen wird, und der pH-Wert dann
die Bedingung wird, die zur Ausfällung
von L-Glutaminsäure
führt,
wenn die Kultivierung abgeschlossen ist.
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Die "Bedingungen, welche
die Ausfällung
von L-Glutaminsäure
erlaubt" bedeutet
eine Bedingung, welche die Ausfällung
von L-Glutaminsäure
erlaubt, wenn der vorstehend genannte Mikroorganismus L-Glutaminsäure produziert
und akkumuliert. Beispielsweise ist der pH-Wert üblicherweise 3 bis 5, wenn
der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans ist.
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Der
Mikroorganismus kann bei einem pH-Wert kultiviert werden, der für das Wachstum
des Mikroorganismus zu Beginn der Kultivierung geeignet ist, und
er kann dann unter einer Bedingung kultiviert werden, welche die
Ausfällung
von L-Glutaminsäure
erlaubt. Wenn das Medium beispielsweise eine Zuckerquelle, welche
der Mikroorganismus unter der Bedingung, welche die Ausfällung von
L-Glutaminsäure
erlaubt, nicht assimilieren kann, oder eine organische Säure enthält, welche
das Wachstum des Mikroorganismus unter der Bedingung inhibiert,
welche die Ausfällung
von L-Glutaminsäure
erlaubt, kann der Mikroorganismus unter einer Bedingung kultiviert
werden, unter der der Mikroorganismus die Zuckerquelle assimilieren
kann oder unter der das Wachstum des Mikroorganismus durch die organische
Säure nicht
inhibiert, so daß der
Mikroorganismus die Zuckerquelle oder die organische Säure nutzen
kann, und anschließend
wird der Mikroorganismus unter der Bedingung kultiviert, welche
die Ausfällung
von L-Glutaminsäure
erlaubt.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird während der Kultivierung ein Verfahren
durchgeführt,
das zum Vorhandensein von L-Glutaminsäurekristallen in dem Medium
führt,
wenn die Konzentration von L-Glutaminsäure in dem Medium niedriger
ist als die Konzentration, bei der eine spontane Kristallisation
auftritt.
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Der
hier verwendete Ausdruck "spontane
Kristallisation" bedeutet,
daß aufgrund
der Anhäufung
von L-Glutaminsäure
durch den Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von
L-Glutaminsäure
eine Konzentration von L-Glutaminsäure in dem Medium die Sättigungskonzentration übersteigt
und L-Glutaminsäure spontan
in dem Medium ausgefällt
wird.
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Das
Verfahren, das das Vorhandensein von L-Glutaminsäurekristallen in dem Medium
bewirkt, bedeutet ein Verfahren, bei dem das Vorhandensein der Kristalle
künstlich
verursacht wird. Beispiele dafür
umfassen die Zugabe der Kristalle zu dem Medium und die erzwungene
Ausfällung
durch Senken des pH-Werts eines Mediums, worin eine bestimmte Menge
L-Glutaminsäure
zu Beginn der Kultivierung aufgelöst worden ist, während der
Kultivierung.
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Die
Menge der Kristalle, die in dem Medium vorhanden sein sollen, ist üblicherweise
0,01 bis 10 g/L. Der Zeitpunkt, an dem die Kristalle vorhanden sein
sollen, ist vorzugsweise dann, wenn die angehäufte Menge an L-Glutaminsäure in dem
Medium auf etwa die Sättigungskonzentration
steigt (beispielsweise 25 g/l oder mehr bei pH 4,5). Die Menge der
Kristalle, die in dem Medium vorhanden sind, und die Konzentration
von L-Glutaminsäure
kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren bestimmt werden. Die
vorhandene Menge der Kristalle von L-Glutaminsäure kann dadurch bestimmt werden,
daß das
Medium stehengelassen wird und die Kristalle aus dem Medium durch
Dekantierung isoliert werden. Die Konzentration von L-Glutaminsäure in dem
Medium bedeutet eine Konzentration der gelösten L-Glutaminsäure. Wenn
Kristalle in dem Medium ausfallen, ist die Konzentration eine ermittelte
Konzentration einer klaren Lösung,
die durch Abtrennen der Feststoffe durch Zentrifugation (oder Filtration)
erhalten wird.
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Das
Verfahren, das das Vorhandensein von L-Glutaminsäurekristallen bewirkt, ist
vorzugsweise die Zugabe von L-Glutaminsäurekristallen.
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Was
die L-Glutaminsäurekristalle
betrifft, gibt es die α-Form und die β-Form der
Kristalle (H. Takahashi, T. Takenishi, N. Nagashima, Bull. Chem.
Soc. Japan, 35, 923 (1962); J. D. Bernal, Z. Krist., 78, 363 (1931); S.
Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Wenn die α-Form der Kristalle erhalten
werden soll, sind die zuzugebenden Kristall vorzugsweise in der α-Form.
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Eine
bevorzugte Menge der Kristalle variiert in der Abhängigkeit
von den Bedingungen, wie der Kristallform der Kristalle. Wenn die
Kristalle in der α-Form
vorliegen, ist die Menge üblicherweise
0,2 g/l oder mehr. Wenn die Menge über dieser Konzentration liegt,
können
Kristalle der α-Form
mit guter Reproduzierbarkeit erhalten werden. Aufgrund ihrer Form
können
die Kristalle der α-Form
im Vergleich zu den Kristallen der β-Form leichter gehandhabt werden.
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Als
Medium für
die Kultivierung kann ein übliches
Nährmedium,
das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralsalze
und organische Spurenelemente, wie Aminosäuren und Vitamine, nach Bedarf
enthält,
eingesetzt werden, solange der pH-Wert so eingestellt wird, daß er die
vorbestimmten Bedingungen erfüllt.
Es kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches
Medium eingesetzt werden. Die Kohlenstoffquelle und die Stickstoffquelle,
die in dem Medium eingesetzt werden, können beliebig sein, solange sie
von dem zu kultivierenden Stamm genutzt werden können.
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Als
Kohlenstoffquelle werden Saccharide, wie Glucose, Glycerin, Fructose,
Saccharose, Maltose, Mannose, Glactose, Stärkehydrolysat und Melasse verwendet.
Zusätzlich
können
organische Säuren,
wie Essigsäure
und Zitronensäure,
entweder allein oder in Kombination mit einer anderen Kohlenstoffquelle
eingesetzt werden.
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Als
Stickstoffquelle werden Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat,
Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat,
und Nitrate eingesetzt.
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Als
organische Spurenelemente werden Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren, Nucleinsäuren, solche, die
diese Substanzen enthalten wie Pepton, Casaminosäure, Hefeextrakt und Sojabohnenproteinzersetzungsprodukte
verwendet. Wenn ein auxotropher Mutantenstamm, der eine Aminosäure für die Metabolisierung oder
das Wachstum benötigt,
verwendet wird, muß der
erforderliche Mehrstoff supplementiert werden.
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Als
Mineralsalze werden Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze
oder Mangansalze verwendet.
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Die
Kultivierung wird üblicherweise
unter Belüftung
bei einer Kultivierungstemperatur von 20 bis 42°C und einem pH-Wert von 3 bis
5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker
bevorzugt 4 bis 4,7, insbesondere bevorzugt 4 bis 4,5, durchgeführt. Eine
deutliche Menge der L-Glutaminsäure
wird üblicherweise
nach der Kultivierung während
etwa 10 Stunden bis etwa 4 Tage angehäuft. Eine Portion der angehäuften L-Glutaminsäure, welche die
Sättigungskonzentration übersteigt,
fällt in
dem Medium aus.
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Nach
dem Abschluß der
Kultivierung kann die in der Kultur ausgefällte L-Glutaminsäure durch
Zentrifugation oder Filtration gewonnen werden. In dem Medium aufgelöste L-Glutaminsäure kann
auch durch bekannte Verfahren gewonnen werden.
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Beispielsweise
kann die L-Glutaminsäure
durch Konzentration der Kulturbrühe
unter Kristallisation der L-Glutaminsäure oder durch Ionenaustauschchromatographie
isoliert werden. Es ist auch möglich,
die in dem Medium aufgelöste
L-Glutaminsäure
zu kristallisieren und dann die in der Kulturbrühe ausgefällte L-Glutaminsäure zusammen
mit der kristallisierten L-Glutaminsäure zu gewinnen.
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Die
durch Abtrennen der L-Glutaminsäure
erhaltene Fermentationsmutterlösung
kann als Zusammensetzung, die organischen Stickstoff enthält, eingesetzt
werden.
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In
der erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält,
ist der Anteil an organischem Stickstoff im Verhältnis zum Gesamtstickstoff
hoch. Der Massenprozentsatz des organischen Stickstoffs, bezogen
auf den Gesamtstickstoff, ist vorzugsweise 35% oder mehr.
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Weil
L-Glutaminsäure
bei einem niedrigen pH produziert wird, wird zudem gemäß der vorliegenden
Erfindung die eingesetzte Menge an Ammoniak zur Kontrolle des pH-Werts
des Mediums gering, und die Menge der für die Kristallisation von L-Glutaminsäure wird
dementsprechend ebenfalls gering, was zu einer Verringerung der
Menge an Anionen in der Fermentationsmutterlösung führt. Im allgemeinen ist die
dafür eingesetzte Säure eine
anorganische Säure,
wie Chlorwasserstoffsäure
und Schwefelsäure.
Wenn beispielsweise Schwefelsäure
für die
Kristallisation von L-Glutaminsäure
eingesetzt wird, wird die Menge der Sulfatgruppen in der Fermentationsmutterlösung gering.
Der Massenprozentsatz der Sulfatgruppen, bezogen auf den Gesamtstickstoff,
ist vorzugsweise 500 oder weniger. Im Bezug auf das Düngemittel
ist es bevorzugt, daß die
Menge der Anionen, beispielsweise der Sulfatgruppen, gering ist.
Deshalb ist die erfindungsgemäße Zusammensetzung, die
organischen Stickstoff enthält
aus Ausgangsmaterial für
einen Dünger
geeignet.
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Die
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält,
kann wie die Fermentationsmutterlösung flüssig sein, oder sie kann in
neutrale trockene Granulate dadurch überführt werden, daß sie neutralisiert
und getrocknet wird (vergleiche offengelegte japanische Patentanmeldung
Nr. 52-7872).
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Die
Herstellung des Düngemittels,
welches die erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält,
umfaßt,
kann auf ähnliche
Weise wie die Herstellung eines Düngemittels unter Verwendung
einer herkömmlichen
Fermentationsmutterlösung
aus Ausgangsmaterial durchgeführt
werden. Während
der Herstellung kann ein weiterer Düngemittelbestandteil zugefügt werden.
Da der erfindungsgemäße Dünger die
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält,
als Ausgangsmaterial verwendet, kann der Dünger einen hohen Gehalt an
organischem Stickstoff (insbesondere organischer Stickstoff, der
kein Stickstoff von L-Glutaminsäure
ist) und einen niedrigen Gehalt an Anionen, wie Sulfatgruppen, aufweisen.
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BEISPIELE
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Im
folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme der folgenden
Beispiele genauer erklärt.
In den Beispielen sind die Aminosäuren L-Aminosäuren, wenn
nichts anderes angegeben ist.
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Referenzbeispiel 1
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(1) Screening eines Mikroorganismus
mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure
in saurer Umgebung.
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Das
Screenen eines Mikroorganismus mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer
Umgebung wurde wie folgt durchgeführt. Jeweils 1 g von etwa 500
Proben, die aus der Natur erhalten wurden, einschließlich aus
Erde, Früchten,
Pflanzenkörpern,
Flusswasser und dergleichen, wurde in 5 ml sterilisiertem Wasser suspendiert,
und 200 ml davon wurden auf 20 ml festes Medium, das mit HCl auf
pH 4,0 eingestellt war, gegeben. Die Zusammensetzung des Mediums
war wie folgt: 3 g/l Glucose, 1 g/l Ammoniumsulfat, 0,2 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat,
0,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 g/l Natriumchlorid, 0,1 g/l
Calciumchloriddihydat, 0,01 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,01
g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l
Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat, 0,4
mg/l Borsäure,
1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 50 μg/l Biotin, 50 μm/l Calciumpantothenat,
50 μg/l
Folsäure,
50 μg/l
Inositol, 50 μg/l
Niacin, 50 μg/l
p-Aminobenzoesäure, 50 μg/l Pyridoxinhydrochlorid,
50 μg/l
Riboflavin, 50 μg/l
Thiaminhydrochlorid, 50 mg/l Cycloheximid und 20 g/l Agar.
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Die
Medien mit den darauf pattierten Proben wurden bei 28°C, 37°C oder 50°C während 2
bis 4 Tagen inkubiert, wobei 378 Kolonie bildende Stämme erhalten
wurden.
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Danach
wurde jeder der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Stämme in ein
Teströhrchen
von 16,5 cm Länge
und 14 mm Durchmesser, das 3 ml flüssiges Medium (eingestellt
mit HCl auf pH 4,0) enthielt, welches eine Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure aufwies,
eingeimpft und bei 28°C,
37°C oder
50°C während 24
Stunden bis 3 Tage unter Schütteln
kultiviert. Dann wurden die gewachsenen Stämme selektiert. Die Zusammensetzung
des vorstehend genannten Mediums war wie folgt: 40 g/l Glucose,
20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l
Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat,
0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat,
0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat,
0,72 mg/l Kobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat
und 2 g/l Hefeextrakt.
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Auf
diese Weise wurden 78 Stämme
von Mikroorganismen erhalten, die Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer
Umgebung zeigen.
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(2) Selektion von Stämmen mit
verbesserter Wachstumsrate unter Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer
Umgebung
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Die
verschiedenen Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer
Umgebung, die vorstehend erhalten wurden, wurden jeweils in ein
Teströhrchen
mit einer Länge
von 16,5 cm und einem Durchmesser von 14 mm, die 3 ml Medium (eingestellt
mit HCl auf pH 4,0), erhalten durch Zugeben von 20 g/l Glutaminsäure und
2 g/l Glucose zu M9 Medium (Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis,
T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor
Laboratory Press, U.S.A., 1989) enthielt, eingeimpft und die Trübung des
Mediums wurde über
die Zeit gemessen, um Stämme
mit einer vorteilhaften Wachstumsrate zu selektieren. Als Ergebnis wurde
als Stamm mit einem vorteilhaften Wachstum der Stamm AJ13355 aus
dem Boden in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, erhalten. Dieser Stamm
wurde auf der Grundlage der vorstehend beschriebenen bakteriologischen
Eigenschaften als Enterobacter agglomerans bestimmt.
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(3) Bereitstellung eines
Stammes mit geringerer Schleimausscheidung aus Enterobacter agglomerans AJ13355.
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Da
der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 extrazellulär Schleim
ausscheidet, wenn er in einem Medium, das ein Saccharid enthält, kultiviert
wird, ist die Kultivierungseffizienz nicht zufriedenstellen. Deshalb
wurde ein Stamm mit geringerer Schleimausscheidung durch UV-Bestrahlung
erhalten (Miller, J. H. et al., "A
Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", S. 150, 1992, Cold
Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
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Der
Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde 2 Minuten in einem
Abstand von 60 cm von einer 60-W UV-Lampe mit UV-Strahlen bestrahlt und über Nacht
in LB-Medium kultiviert, um die Mutation zu fixieren. Der mutagenisierte
Stamm wurde verdünnt
und in LB-Medium, das 5 g/l Glucose und 20 g/l Agar enthielt, eingeimpft,
so daß etwa
100 Kolonien pro Platte erscheinen würden, und bei 30°C über Nacht
kultiviert, wobei die Platte etwa 45° geneigt wurde, und dann wurden
20 Kolonien selektiert, die auf dem Schleim nicht nach unten geflossen
waren.
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Als
ein Stamm, der die Bedingungen erfüllte, daß, selbst nach fünfmaliger
Subkultivierung in LB-Medium, das 5 g/l Glucose und 20 g/l Agar
enthielt, keine Revertanten auftraten, und daß ein Wachstum beobachtet werden
sollte, das demjenigen des Ausgangsstammes in LB-Medium, 5 g/l Glucose-enthaltendem LB-Medium
und M9-Medium (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2. Auflage,
Cold Spring Harbor Press, USA, 1989), das mit 20 g/l L-Glutaminsäure und
2 g/l Glucose supplementiert und mit HCl auf pH 4,5 eingestellt war,
entsprach, wurde der Stamm SC17 aus den vorstehend ausgewählten Stämmen selektiert.
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(4) Konstruktion eines
Glutaminsäure-produzierenden
Bakteriums aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17
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(1) Präparation eines αKGDH defizienten
Stammes aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17
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Ein αKGDH defizienter
Stamm mit einem verstärkten
L-Glutaminsäurebiosynthesesystem
wurde aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 präpariert.
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(i) Klonierung des αKGDH-Gens
(im Folgenden als "sucAB" bezeichnet) des
Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355.
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Das
sucAB-Gen des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde durch
Selektieren eines DNA-Fragments, das die fehlende Fähigkeit
zur Assimilation von Essigsäure
des αKGDH-E1-Untereinheitengen
(im Folgenden als "sucA" bezeichnet)-defizienten
Stammes von E.coli komplementierte, aus der chromosomalen DNA des
Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 kloniert.
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Die
chromosomale DNA des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde
durch ein Verfahren isoliert, das üblicherweise zum Extrahieren
von chromosomaler DNA aus Escherichia coli eingesetzt wird (Text
for Bioengineering Experiments, herausgegeben von der Society for
Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97–98, Baifukan, 1992). Das Plasmid
pTWV228 (resistent gegen Ampicillin), das als Vektor eingesetzt wurde,
war ein kommerzielles Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd..
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Die
chromosomale DNA des Stammes AJ13355, die mit EcoT221 verdaut worden
war, und pTWV228, das mit PstI verdaut worden war, wurden unter
Einsatz von T4-Ligase legiert und eingesetzt, um den sucA-defizienten
Stamm Escherichia coli JRG465 zu transformieren (Herbert, J. et
al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Ein Stamm, der in einem
Acetatminimalmedium wuchs, wurde unter den Transformantenstämmen, die vorstehend
erhalten wurden, selektiert, und es wurde ein Plasmid daraus extrahiert
und als pTWVEK101 bezeichnet. Der Stamm Escherichia coli JRG465,
der pTWVEK101 enthielt, konnte die Auxotrophie für Bernsteinsäure oder
L-Lysin und L-Methionin zusätzlich
zur Beseitigung der fehlenden Fähigkeit
zur Assimilation von Essigsäure
beheben. Dies deutet an, daß pTWVEK101
das sucA-Gen von Enterobacter agglomerans enthielt.
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1 zeigt
eine Restriktionsenzymkarte eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten DNA-Fragments
in pTWVEK101. In der Nukleotidsequenz des schraffierten Teils in 1 wurden
Nukleotidsequenzen, die als zwei vollständige offene Leserahmen angenommen
wurden, und zwei Nukleotidsequenzen gefunden, die als Teilsequenzen
der offenen Leserahmen angenommen wurden. Als Ergebnis der Homologiesuche
für diese
Sequenzen zeigte sich, daß die
Teile, deren Nukleotidsequenzen bestimmt wurden, eine 3'-Endteilsequenz des
Succinatdehydrogenase-Eisenschwefelproteingens (sdhB), vollständiges sucA
und α-KGDH-E2-Untereinheitengens
(sucB-Gen) und eine 5'-Endteilsequenz
des Succinyl-CoA-Synthetase-β-Untereinheitengens
(sucC-Gens) enthielt. Die Ergebnisse eines Vergleichs der Aminosäuresequenzen,
die von diesen Nukleotidsequenzen abgeleitet sind, mit den Sequenzen,
die von Escherichia coli abgeleitet sind (Eur. J. Biochem., 141,
S. 351–359
(1984); Eur. J. Biochem. 141, S. 361–374 (1984); Biochemistry,
24, S. 6245–6252
(1985)) sind in den 2 bis 5 gezeigt.
Die Aminosäuresequenzen
zeigten sehr hohe Homologie zueinander. Außerdem wurde gefunden, daß ein Cluster
von sdhB-sucA-sucB-sucC auf dem Chromosom von Enterobacter sowie
in Escherichia coli vorhanden war (Eur. J. Biochem., 141, S. 351–359 (1984),
Eur. J. Biochem., 141, S. 361–374
(1984); Biochemistry, 24, S. 6245–6252 (1985)).
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(ii) Bereitstellung eines α-KGDH-defizienten
Stammes, der von dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 abgeleitet
ist.
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Die
homologe Rekombination wurde unter Einsatz des sucAB-Gens von Enterobacter
agglomerans erhalten, wie vorstehend be schrieben, durchgeführt, wobei
ein α-KGDH-defizienter
Stamm von Enterobacter agglomerans erhalten wurde.
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Nachdem
das Plasmid pTWVEK101 mit SphI verdaut worden war, um ein sucA-enthaltendes
Fragment auszuschneiden, wurde das Fragment mit dem Klenow-Fragment
abgestumpft (Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit pBR322, verdaut mit
EcoRI und abgestumpft mit dem Klenow-Fragment, unter Einsatz von
T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. Das erhaltene Plasmid
wurde an der Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms BglII, die
in der Nähe
des Zentrums von sucA liegt, unter Verwendung dieses Enzyms verdaut,
mit Klenow-Fragment abgestumpft und dann erneut unter Verwendung
von T4-DNA-Ligase ligiert. Es wird angenommen, daß das sucA-Gen
seine Funktion verlor, weil eine Leserahmenmutation in sucA des
Plasmids, das durch das vorstehende Verfahren neu konstruiert wurde,
eingeführt
worden war.
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Das
wie vorstehend beschrieben konstruierte Plasmid wurde mit einem
Restriktionsenzym ApaLI verdaut und einer Agarosegel-Elektrophorese unterworfen,
um ein sucA-enthaltendes DNA-Fragment, in das eine Leserahmenmutation
eingeführt
worden war, und ein von pBR322 abgeleitetes Tetracyclinresistenzgen
zu gewinnen. Das gewonnene DNA-Fragment wurde erneut unter T4-DNA-Ligase ligiert, wobei
ein Plasmid zur Ausschaltung des α-KGDH-Gens erhalten wurde.
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Das
Plasmid zum Ausschalten des α-KGDH-Gens,
das wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, wurde eingesetzt,
um den Stamm Enterobacter agglomerans SC17 durch Elektroporation
zu transformieren (Miller, J. H., " A Short Course in Bacterial Genetics;
Handbook", S. 279,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992), und ein Stamm,
bei dem das sucA auf dem Chromosom durch eine Mutante des Plasmids
durch homologe Rekombination ersetzt worden war, wurde unter Verwendung
der Tetracyclinresistenz als Marker erhalten. Der erhaltene Stamm
wurde SC17 sucA genannt. Um zu bestätigen, daß der Stamm SC17sucA keine αKGDH-Aktivität aufwies,
wurde die Enzymaktivität
durch das Verfahren von Reed et al. (Reed, L. J. and Mukherjee,
B. B., Methods in Enzymology, 13, S. 55–61, (1969)) unter Einsatz
von Zellen des Stammes, der im LB-Medium bis zur logarithmischen
Wachstumsphase gezüchtet
worden war, gemessen. Es wurde eine α-KGDH-Aktivität von 0,073
(ΔABS/min/mg
Protein) für
den Stamm SC17 nachgewiesen, während
keine α-KGDH-Aktivität für den Stamm
SC17sucA nachgewiesen wurde, wodurch bestätigt worden war, daß das sucA-Gen
wie vorgesehen ausgeschaltet worden war.
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(2) Verstärkung des
L-Glutaminsäurebiosynthesesystems
des Stammes Enterobacter agglomerans SC17sucA
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Danach
wurden das Citratsynthasegen, das Phosphoenolpyruvatcarboxylasegen
und das Glutamatdehydrogenasegen, abgeleitet von E. coli in den
Stamm SC17sucA eingeführt.
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(i) Präparation eines Plasmids mit
dem von Escherichia coli abgeleiteten gltA-Gen, ppc-Gen und gdhA-Gen
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Die
Verfahren zur Präparation
eines Plasmids mit dem gltA-Gen,
dem ppc-Gen und dem gdhA-Gen werden im Folgenden unter Bezugnahme
auf die 6 und 7 erklärt.
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Ein
Plasmid mit dem von Escherichia coli abgeleiteten gdhA-Gen, pBRGDH
(offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 7-203980), wurde mit
HindIII und SphI verdaut, beide Enden wurden durch T4-DNA-Polymerasebehandlung
abgestumpft, und dann wurde das DNA-Fragment mit dem gdhA-Gen gereinigt
und gewonnen. Getrennt davon wurde ein Plasmid mit dem von Escherichia
coli abgeleiteten gltA-Gen und ppc-Gen, pMWCP (WO97/08294), mit
XbaI verdaut, dann wurden beide Enden unter Einsatz von T4-DNA-Polymerase abgestumpft.
Dieses Fragment wurde dann mit dem vorstehend gereinigten DNA-Fragment
mit dem gdhA-Gen gemischt und unter Einsatz von T4-DNA-Ligase ligiert,
wobei ein Plasmid pMWCPG erhalten wurde, welches dem Plasmid pMWCP
entspricht, das zusätzlich
das gdhA-Gen enthält
(6).
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Gleichzeitig
wurde das Plasmid pVIC40 (offengelegte japanische Patentanmeldung
Nr. 8-047397) mit dem Replikationsursprung des Plasmids RSF1010
mit breitem Wirtsbereich unter Einsatz von NotI verdaut, mit T4-DNA- Polymerase behandelt
und mit PstI verdaut. Das Plasmid pBR322 wurde mit EcoT14I verdaut,
mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit PstI verdaut. Beide Produkte
wurden gemischt und unter Einsatz von T4-Ligase ligiert, wobei ein
Plasmid RSF-Tat mit dem Replikationsursprung von RSF1010 und dem
Tetracyclinresistenzgen erhalten wurde (7).
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Danach
wurde pMWCPG mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA-Fragment mit
dem gltA-Gen, dem ppc-Gen und dem gdhA-Gen wurde gereinigt und gewonnen.
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RSF-Tet
wurde auf ähnliche
Weise mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA-Fragment mit dem Replikationsursprung
von RSF1010 wurde gereinigt und gewonnen. Beide Produkte wurden
gemischt und unter Einsatz von T4-Ligase ligiert, wobei ein Plasmid
RSFCPG erhalten wurde, welches RSF-Tet entspricht, welches das gltA-Gen,
das ppc-Gen und das gdhA-Gen enthält (8). Es wurde
bestätigt,
daß das
erhaltene Plasmid RSFCPG das gltA-Gen, das ppc-Gen und das gdhA-Gen
expremierte, indem die Supplementierung der Auxotrophie des von
Escherichia coli abgeleiteten gltA-Gen-, ppc-Gen-, oder gdhA-Gen-defizienten
Stammes durchgeführt
wurde und die jeweilige Enzymaktivität gemessen wurde.
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(ii) Präparation
eines Plasmids mit dem von Brevibacterium lactofermentum abgeleiteten
gltA-Gen
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Ein
Plasmid mit dem von Brevibacterium lactofermentum abgeleiteten gltA-Gen
wurde wie folgt konstruiert. Es wurde unter Verwendung der Primer-DNAs,
die auf der Grundlage der Nukleotidsequenz des gltA-Gens von Corynebacterium
glutamicum (Microbiology, 140, S. 1817–1828 (1994)) präpariert
worden waren, und der chromosomalen DNA von Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869 als Matrize eine PCR durchgeführt, wobei ein gltA-Genfragment
von etwa 3 kb erhalten wurde. Dieses Fragment wurde in das Plasmid pHSG399
(Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut mit SmaI, unter Bildung des Plasmids
pHSGCB eingeführt
(9). Danach wurde pHSGCB mit HindIII verdaut, und
das ausgeschnittene gltA-Gen-Fragment von etwa 3 kb wurde in das Plasmid
pSTV29 (Takara Shuzo Co., Ltd.), verdaut mit HindIII, unter Bildung
des Plasmids pSTVCB eingeführt
(9). Es wurde bestätigt, daß das erhaltene Plasmid pSTVCB
das gltA-Gen expremierte, indem die Enzymaktivität in dem Stamm Enterobacter
agglomerans AJ13355 gemessen wurde.
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(iii) Einführung von
RSFCPG und pSTVCB in den Stamm SC17sucA
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Der
Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA wurde durch Elektroporation
mit RSFCPG transformiert, wobei ein transformierter Stamm JSC17sucA/RSFCPG
mit Tetracyclinresistenz erhalten wurde. Außerdem wurde der Stamm SC17sucA/RSFCPG
mit pSTVCB durch Elektroporation transformiert, wobei der transformierte
Stamm SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB mit Chloramphenicolresistenz erhalten
wurde.
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(5) Bereitstellung eines
Stammes mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure in einer
Umgebung mit niedrigem pH-Wert.
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Ein
Stamm mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure bei
einer hohen Konzentration in einer Umgebung mit niedrigem pH-Wert
(im Folgenden auch als "Stamm
mit Resistenz gegen hohe Glu-Konzentration bei niedrigem pH" bezeichnet) wurde
aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB
isoliert.
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Der
Stamm SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB wurde über Nacht bei 30°C in LBG-Medium
(10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 5 g/l Glucose)
kultiviert, und die mit Natriumchloridlösung gewaschenen Zellen wurden
in geeigneter Weise verdünnt
und auf M9-E-Medium platiert (4 g/l Glucose, 17 g/l Na2HPO4·12H2O, 3 g/l KH2PO4, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH4Cl,
10 mM MgSO4, 10 μM CaCl2,
50 mg/l L-Lysin, 50 mg/l L-Methionin, 50 mg/l DL-Diaminopimelinsäure, 25
mg/l Tetracyclin, 25 mg/l Chloramphenicol, 30 g/l L-Glutaminsäure, mit
wäßrigem Ammoniak
auf pH 4,5 eingestellt). Eine Nachkultivierung bei 32°C während 2
Tagen auftretende Kultur wurde als ein Stamm mit Resistenz gegen
eine hohe Glu-Konzentration bei niedrigem pH erhalten.
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Für den erhaltenen
Stamm wurde das Wachstum in M9-E-Flüssigmedium
gemessen, und die Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure wurde
in einem 50 ml-Teströhrchen,
das 5 ml L-Glutaminsäureproduktionstestmedium
enthielt (40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat,
2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l
Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 0,02
g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64
mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Cobaltchloridhexahydrat,
0,4 mg/l Borsäure,
1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 2 g/l Hefeextrakt, 200 mg/l L-Lysinhydrochlorid,
200 mg/l L-Methionin, 200 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25
mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol) enthielt,
getestet. Ein Stamm, der das beste Wachstum und dieselbe Fähigkeit
zur Produktion von L-Glutaminsäure
wie der Ausgangsstamm zeigte, nämlich
der Stamm SC17/RSFCPG + pSTVCB, wurde als Enterobacter agglomerans
AJ13601 bezeichnet. Der Stamm AJ13601 wurde beim National Institute
of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science
and Technology, Ministry of International Trade and Industry (jetzt
International Patent Organism Depositary, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology, Central 6, Higashi 1-1-1,
Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan) am 18. August 1999 unter der
Hinterlegungsnummer FERM P-17516 hinterlegt. Er wurde dann am 6.
Juli 2000 unter den Bestimmungen des Budapester Abkommens in eine
internationale Hinterlegung überführt und
erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-7207.
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Beispiel 1
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Der
Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 wurde auf LBG-Agarmedium (10 g/l
Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 5 g/l Glucose und 15 g/l
Agar), welches 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol
enthielt, bei 30°C
während
14 Stunden kultiviert, und die Zellen auf einer Platte (8,5 cm Durchmesser)
wurden gewonnen und in 300 ml Kulturmedium, das 50 g/l Glucose,
4 g/l Ammoniumsulfat, 0,4 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l
Monokaliumdihydrogenphosphat, 10 mg/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat,
10 mg/l Mangansulfatpentahydrat, 4 g/l Hefeextrakt, 400 mg/l L-Lysinhydrochlorid,
400 mg/l DL-Methionin, 400 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25
mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt,
in einem 1-Liter-Rüttelfermenter
eingeimpft, um die Kultivierung bei 34°C und pH 6,0 zu starten. Der
pH-Wert der Kultur wurde durch Zugabe von Ammoniakgas kontrolliert.
Die Kultur wurde etwa 16 Stunden nach Beginn der Kultivierung in
einer Phase, in der die in dem Kulturmedium vorhandene Glucose verbraucht
worden war, abgebrochen.
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15
ml Kulturbrühe,
die wie vorstehend beschrieben kultiviert wurde, wurden in 15 l
Kulturmedium, das 50 g/l Glucose, 4 g/l Ammoniumsulfat, 0,4 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Monokaliumdihydrogenphosphat,
10 mg/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 10 mg/l Mangansulfatpentahydrat,
4 g/l Hefeextrakt, 400 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 400 mg/l DL-Methionin,
400 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25
mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt,
in einem 30-Liter-Rüttelfermenter
geimpft, um die Kultivierung bei 34°C und pH 6,0 zu starten. Der
pH-Wert der Kultur wurde durch Zugabe von Ammoniakgas kontrolliert.
Die Kultivierung wurde etwa 16 Stunden nach Beginn in einer Phase
abgebrochen, in der die Glycose in dem Kulturmedium verbraucht worden
war.
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2,8
l der wie vorstehend beschrieben kultivierten Kulturbrühe wurden
in 14 l Kulturmedium, das 50 g/l Glucose, 5 g/l Ammoniumsulfat,
0,4 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 5 g/l Monokaliumdihydrogenphosphat, 20
mg/l Eisen(II)-sulfatheptahydrat, 20 mg/l Mangansulfatpentahydrat,
6 g/l Hefeextrakt, 800 mg/l L-Lysinhydrochlorid,
600 mg/l DL-Methionin, 600 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 1,5
g/l Natriumchlorid, 0,75 g/l Calciumchloriddihydrat, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid
und 25 mg/l Chloramphemicol enthielt, in einem 30-Liter-Rüttelfermenter
eingeimpft, um die Kultivierung bei 34°C und pH 6,0 zu starten. Im
Verlauf der Kultivierung wurde mit der Anhäufung von L-Glutaminsäure der
pH-Wert spontan bis auf 4,5 verringert.
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Danach
wurde der pH-Wert der Kultur durch Zugabe von Ammoniakgas auf 4,5
kontrolliert. Nach dem Verbrauch der anfänglich zugegebenen Glucose
wurde eine 700 g/l wäßrige Lösung von
Glucose kontinuierlich zugegeben.
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Die
fermentative Produktion von L-Glutaminsäure wurde wie vorstehend beschrieben
fortgesetzt. Nachdem die Konzentration der in der Kulturbrühe angehäuften L-Glutaminsäure 45 g/l
erreicht hatte, wurden 30 g L-Glutaminsäurekristalle der α-Form zu
der Kulturbrühe
als eine Suspension von Kristallen in 100 ml Wasser von dem oberen
Teil des Rüttelfermenters
aus zugegeben, und die Kultivierung wurde weiter fortgesetzt. Die
Kultivierung wurde in einer Phase, in der die Summe der Konzentration
von L-Glutaminsäure,
die sich als Kristalle in dem Medium angehäuft hatte, und der Konzentration
von L-Glutaminsäure,
die in dem Medium gelöst
war, 100 g/l erreicht hatte. Eine merkliche Menge von L-Glutaminsäurekristallen
der α-Form
fiel in dem Rüttelfermenter
aus. Durch Zugabe von Schwefelsäure
zu dem Medium wurde der pH-Wert auf 3,2 eingestellt, bei dem die
Löslichkeit
von L-Glutaminsäure
geregelt wurde. Außerdem
wurde die Kristallisation von in der Lösung gelöster L-Glutaminsäure durch
Kühlen
erleichtert, wobei eine Kristallaufschlämmung erhalten wurde. Kristalle von
L-Glutaminsäure,
die in der Kristallaufschlämmung
ausfielen, wurden durch einen Dekanter abgetrennt, wobei die gewünschte Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthielt, erhalten wurde.
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Der
analytische Anteil jedes Bestandteils, bezogen auf die gesamten
festen Bestandteile in der erhaltenen Zusammensetzung, die organischen
Stickstoff enthält,
ist in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle
1 Analytische
Werte der Zusammensetzung, die organischen Stickstoff enthält
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Vergleichsbeispiel 1
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Die
Kultivierung wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, mit
der Ausnahme, daß die Kultivierungsbedingung
in dem 30-Liter-Rüttelfermenter,
der 300 ml Medium enthielt, in Beispiel 1 wie folgt geändert wurden:
Die Kultivierung wurde bei 34°C
und pH 6,0 gestartet, und dann wurde der pH-Wert der Kultur durch
Zugabe von Ammoniakgas bei pH 6,0 kontrolliert. Aus dem erhaltenen
Medium wurde eine Zusammensetzung, die organischen Stickstoff enthielt,
auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 erhalten.
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Der
Anteil jedes Bestandteils, bezogen auf das gesamte feste Material
in der Zusammensetzung, die organischen Stickstoff enthält, ist
in Tabelle 2 gezeigt.
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Tabelle
2 Analytische
Werte der Kontrollzusammensetzung, die organischen Stickstoff enthält
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Die
Tabellen 1 und 2 zeigen, daß die
erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält,
einen hohen Gehalt an organischem Stickstoff, der als Düngemittel
wirksam ist, einen hohen Anteil an organischem Stickstoff, bezogen
auf den Gesamtstickstoff, und insbesondere einen hohen Anteil an
organischem Stickstoff, der nicht Glutaminsäurestickstoff ist, aufweist.
Ebenso zeigt sich, daß die
Menge der Sulfatgruppen gering ist, wodurch die erfindungsgemäße Zusammensetzung,
die organischen Stickstoff enthält, als
Ausgangsmaterial für
ein Düngemittel
geeignet ist.