DE60206204T2

DE60206204T2 - Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure

Info

Publication number: DE60206204T2
Application number: DE60206204T
Authority: DE
Inventors: Hiroshi Kawasaki-shi Ueda; Takayuki Kawasaki-shi Koda; Masakazu Kawasaki-shi Sato
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-02-20
Filing date: 2002-02-20
Publication date: 2006-07-13
Anticipated expiration: 2022-02-21
Also published as: US7319025B2; DE60206204D1; US20030190713A1; EP1233069A2; CN1408878A; USRE41800E1; PE20020886A1; RU2282662C2; AU1566002A; JP2002238593A; EP1233069A3; JP4599726B2; CN1295343C; ES2246356T3; KR20020068293A; AU783270B2; MY131468A; ATE305049T1; EP1233069B1; BR0200488A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation. L-Glutaminsäure wird als Ausgangsmaterial für Gewürze und dergleichen verbreitet eingesetzt.
L-Glutaminsäure wird hauptsächlich durch Fermentation unter Verwendung sogenannter L-Glutaminsäure produzierender coryneformer Bakterien der Gattung Brevibacterium, Corynebacterium oder Microbacterium oder von Mutantenstämmen davon produziert (Amino Acid Fermentation, Gakkai Shuppan Center, S.195-215, 1986). Als Verfahren zum Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter Verwendung anderer Bakterienstämme sind ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Streptomyces, Penicillium oder dergleichen (U.S. Patent Nr. 3,220,929), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida oder dergleichen (U.S. Patent Nr. 3,563,857), ein Verfahren unter Verwendung eines Mikroorganismus der Gattung Bacillus, Pseudomonas, Serratia, Aerobacter aerogenes (derzeit als Enterobacter aerogenes bezeichnet) oder dergleichen (Japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 32-9393), ein Verfahren unter Verwendung eines Mutantenstammes von Escherichia coli (offengelegte japanischen Patentanmeldung (Kokai) Nr. 5-244970) und dergleichen bekannt. Zusätzlich haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure unter Einsatz eines Mikroorganismus der Gattung Klebsiella, Erwinia oder Pantoea vorgeschlagen (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 2000-106869).
Außerdem sind verschiedene Techniken zur Verbesserung der L-Glutaminsäure produzierenden Fähigkeit durch Verstärken der Aktivitäten von Enzymen der L-Glutaminsäure-Biosynthese durch Einsatz rekombinanter DNA-Techniken offenbart worden. Beispielsweise wurde berichtet, daß die Einführung eines Gens, das für Citratsynthase aus Escherichia coli oder Corynebacterium glutamicum kodiert, für die Erhöhung der L-Glutaminsäure produzierenden Fähigkeit in Corynebacterium oder Brevibacterium wirksam war (japanische Patentveröffentlichung (Kokoku) Nr. 7-121228). Zusätzlich offenbart die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 61-268185 eine Zelle, die rekombinante DNA enthält, die ein Glutamatdehydrogenasegen aus Corynebacterium enthält. Außerdem offenbart die offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 63-214189 eine Technik zum Erhöhen der L-Glutaminsäure produzierenden Fähigkeit durch Amplifizieren eines Glutamatdehydrogenasegens, eines Isocitratdehydrogenasegens, eines Aconitatehydratasegens und eines Citratsynthasegens.
Obwohl die L-Glutaminsäureproduktivität durch das vorstehend genannte Züchten von Mikroorganismen oder durch Verbesserungen der Produktionsverfahren erheblich erhöht worden ist, besteht Bedarf an der Entwicklung von Verfahren zur effizienteren Produktion von L-Glutaminsäure zu geringeren Kosten, um den weiter steigenden zukünftigen Bedarf zu decken.
Es ist ein Verfahren bekannt, bei dem die Fermentation durchgeführt wird, wobei gleichzeitig eine in der Kultur angehäufte L-Aminosäure kristallisiert wird (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 62-288). In diesem Verfahren wird die L-Aminosäure-Konzentration in der Kultur durch Ausfällen der in der Kultur angehäuften L-Aminosäure unter einem bestimmten Niveau gehalten. Genauer gesagt wird L-Tryptophan, L-Tyrosin oder L-Leucin während der Fermentation durch Einstellen der Temperatur und des pH-Werts der Kultur oder Zugeben eines oberflächenaktiven Mittels zu dem Medium ausgefällt.
Während ein Verfahren zum Durchführen der Fermentation bei gleichzeitiger Ausfällung einer L-Aminosäure wie vorstehend beschrieben bekannt ist, sind Aminosäuren, die für dieses Verfahren geeignet sind, solche, die eine relativ geringe Wasserlöslichkeit zeigen, und es ist kein Beispiel einer Anwendung des Verfahrens auf hoch wasserlösliche Aminosäuren, wie L-Glutaminsäure, bekannt. Zusätzlich muß das Medium einen niedrigen pH-Wert haben, um L-Glutaminsäure auszufällen. L-Glutaminsäure produzierende Bakterien, wie die vorstehend genannten, können jedoch nicht unter sauren Bedingungen wachsen, und deshalb wird die L-Glutaminsäurefermentation unter neutralen Bedingungen durchgeführt (U.S. Patente Nr. 3,220,929 und 3,032,474; K.C. Chao & J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, S.715-725 (1959)). Somit ist die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation unter gleichzeitiger Ausfällung nicht bekannt. Außerdem ist bekannt, daß das Wachstum der meisten acidophilen Bakterien durch organische Säuren, wie Essigsäure, Milchsäure und Bernsteinsäure, gehemmt wird (Yasuro Oshima, Herausgeber, Extreme Environment Microorganism Handbook", 5.231, Science Forum; R.M. Borichewski, J. Bacteriol., 93, S.597-599 (1967) etc.). Deshalb geht man davon aus, daß viele Mikroorganismen für L-Glutaminsäure, die auch eine organische Säure ist, unter sauren Bedingungen zugänglich sind, und es gibt keinen Bericht darüber, daß eine Suche nach Mikroorganismen, welche L-Glutaminsäure produzierende Fähigkeit unter sauren Bedingungen zeigen, durchgeführt wurde.
EP-A-952 221 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation eines Enterobacter Mikroorganismus.
JP-51020488B (Abstract) offenbart ein Verfahren, bei dem Kristallkeime zu einer Fermentationsbrühe nach Kultivieren eines Mikroorganismus gegeben werden.
EP-A-1 078 989 offenbart ein Verfahren zum Herstellen von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus in einem flüssigen Medium umfaßt, dessen pH-Wert auf einen Wert eingestellt ist, bei dem L-Glutaminsäure ausgefällt wird, um L-Glutaminsäure zu produzieren und anzuhäufen und L-Glutaminsäure in dem Medium auszufällen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Angesichts der vorstehend beschriebenen Umstände ist ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, begleitet von einer Ausstellung der Glutaminsäure, bereitzustellen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß in einem Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure umfaßt, wobei L-Glutaminsäure in einem Medium produziert und angehäuft wird und gleichzeitig L-Glutaminsäure ausgefällt wird, die Ausbeute an L- Glutaminsäure, wenn das Vorhandensein von Kristallen künstlich hervorgerufen wird, bevor spontane Kristallisation auftritt, höher ist als wenn spontane Kristallisation von durch den Mikroorganismus produzierter L-Glutaminsäure auftritt. Somit wurde die vorliegende Erfindung gemacht.
Die vorliegende Erfindung stellt die folgenden Punkte bereit.

(1) Ein Verfahren von L-Glutaminsäure durch Fermentation, umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium, dessen pH in dem Bereich von 3 bis 5 eingestellt ist, um zu ermöglichen, daß L-Glutaminsäure produziert und akkumuliert wird, begleitet von einer Ausfällung von L-Glutaminsäure, wobei L-Glutaminsäure-Impfkristalle zu dem Medium gegeben werden, wenn die Konzentration von L-Glutaminsäure in dem Medium niedriger als die Konzentration ist, bei welcher eine spontane Kristallisation auftritt.
(2) Das Verfahren nach (1) wobei die Kristalle α-Kristalle sind.
(3) Das Verfahren nach (2), wobei die zu dem Medium gegebene Menge an Kristallen 0,2 g/l oder mehr beträgt.
(4). Das Verfahren nach (1) bis (3), wobei der Mikroorganismus zur Gattung Enterobacter gehört.
(5) Das Verfahren nach (4), wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans ist.
(6) Verfahren nach (1) bis (5), wobei der Mikroorganismus in der Lage ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das die Kohlenstoffquelle und L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration enthält, wobei das flüssige Medium einen pH im Bereich von pH 3 bis 5 aufweist, zu metabolisieren, und die Fähigkeit aufweist, L-Glutaminsäure in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in dem flüssigen Medium bei dem pH übersteigt.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren kann L-Glutaminsäure effizient produziert werden. In einer bevorzugte Ausführungsform können auch α-Kristalle, die als Produkt bevorzugt sind, produziert werden.
KURZE ERKLÄRUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Restriktionsenzymkarte eines DNA Fragments, abgeleitet von Enterobacter agglomerans, in pTWVEK101.
2 zeigt einen Vergleich einer Aminosäuresequenz, abgeleitet von einer Nukleotidsequenz eines sucA-Gens, das von Enterobacter agglomerans abgeleitet ist (Sequenz ID Nr. 1) mit der Sequenz, die von Escherichia coli abgeleitet ist (obere Sequenz: Enterobacter agglomerans, untere Sequenz: Escherichia coli (Sequenz ID Nr. 5); das gleiche gilt im folgenden).
3 zeigt einen Vergleich einer Aminosäuresequenz, abgeleitet von einer Nukleotidsequenz eines sucB-Gens, das von Enterobacter agglomerans abgeleitet ist (Sequenz ID Nr. 2), mit der von E. coli abgeleiteten Sequenz (Sequenz ID Nr. 6).
4 zeigt einen Vergleich einer Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz eines sucC-Gens abgeleitet ist, das von Enterobacter agglomerans abgeleitet ist (Sequenz IS Nr. 3) und der von Escherichia coli abgeleiteten Sequenz (Sequenz ID Nr. 7).
5 zeigt einen Vergleich einer Aminosäuresequenz, abgeleitet von einer Nukleotidsequenz eines sdhB-Gens, das von Enterobacter agglomerans abgeleitet ist (Sequenz ID Nr. 4), mit der von Escherichia coli abgeleiteten Sequenz (Sequenz ID Nr. 8).
6 zeigt die Konstruktion des Plasmids pMWCPG, das ein gltA Gen, ein ppc-Gen und ein gdhA-Gen enthält.
7 zeigt die Konstruktion des Plasmids RSF-Tet, das einen Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich und ein Tetracyclin-Resistenzgen enthält.
8 zeigt die Konstruktion des Plasmids RSFCPG, das einen Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich, ein Tetracyclinresistenzgen, ein gltA-Gen, ein ppc-Gen und ein gdhA-Gen enthält.
9 zeigt die Konstruktion des Plasmids pSTVCB, das ein gltA-Gen enthält.
EINGEHENDE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Im folgenden wird die vorliegende Erfindung eingehender beschrieben.
Das erfindungsgemäße Produktionsverfahren ist ein Verfahren zur Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation, welches das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Reproduktion von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium umfaßt, dessen pH-Wert innerhalb des Bereichs von 3 bis 5 eingestellt ist, um zu ermöglichen, daß L-Glutaminsäure produziert und angehäuft wird, begleitet von einer Ausfällung von L-Glutaminsäure, wobei L-Glutaminsäure-Impfkristalle zu dem Medium gegeben werden, wenn die Konzentration von L-Glutaminsäure in dem Medium niedriger ist als die Konzentration, bei der spontane Kristallisation auftritt.
Der hier verwendete Ausdruck "spontane Kristallisation" bedeutet, daß aufgrund der Anhäufung von L-Glutaminsäure durch den Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure die Konzentration an L-Glutaminsäure in dem Medium die Sättigungskonzentration übersteigt und L-Glutaminsäure in dem Medium spontan ausfällt. In der vorliegenden Erfindung werden L-Glutaminsäure-Impfkristalle zu dem flüssigen Medium gegeben.
Die Menge der zu dem Medium gegebenen Kristalle ist üblicherweise 0,01 bis 10 g/l. Der Zeitpunkt, an dem die Kristalle zugegeben werden, ist vorzugsweise, wenn die angehäufte Menge der L-Glutaminsäure in dem Medium auf etwa die Sättigungskonzentration steigt (beispielsweise 25 g/l oder mehr bei pH 4,5). Die Menge der in dem Medium vorhandenen Kristalle und die Konzentration an L-Glutaminsäure können durch bekannte Verfahren bestimmt werden. Die vorhandene Menge an Kristallen der L-Glutaminsäure kann dadurch bestimmt werden, daß das Medium stehengelassen wird und die Kristalle durch Dekantierung aus dem Medium isoliert werden. Die Konzentration an L-Glutaminsäure in dem Medium bedeutet die Konzentration gelöster L-Glutaminsäure. Wenn Kristalle in dem Medium ausfallen, ist die Konzentration die Konzentration, die für eine geklärte Lösung bestimmt wird, die durch Abtrennen von Feststoffen durch Zentrifugation (oder Filtration) erhalten wird.
Bei den L-Glutaminsäurekristallen gibt es die α-Form und die β-Form der Kristalle ((H. Takahashi, T. Takenishi, N. Nagashima, Bull. Chem. Soc. Japan, 35, 923 (1962); J. D. Bernal, Z. Krist., 78, 363 (1931); S. Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Wenn beabsichtigt ist, die α-Form der Kristalle zu erhalten, sind die zugegebenen Kristalle vorzugsweise in der α-Form.
Die bevorzugte Menge der Kristalle variiert in Abhängigkeit von den Bedingungen, wie der Kristallform der Kristalle. Wenn die Kristalle in der α-Form sind, ist die Menge üblicherweise 0,2 g/l oder mehr. Wenn die Konzentration höher ist, können Kristalle der α-Form mit guter Reproduzierbarkeit erhalten werden. Aufgrund ihrer Form können die Kristalle der α-Form im Vergleich zu Kristallen der β-Form leichter gehandhabt werden.
Der in dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren eingesetzte Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure ist ein Mikroorganismus, der eine signifikante Menge an L-Glutaminsäure in einem Medium anhäuft, wenn er in dem Medium kultiviert wird. Beispiele davon umfassen Mikroorganismen der Gattung Enterobacter. Bevorzugt ist Enterobacter agglomerans.
Außerdem ist der in dem erfindungsgemäßen Produktionsverfahren eingesetzte Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure vorzugsweise ein Mikroorganismus, der eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und eine Kohlenstoffquelle enthält, bei dem spezifischen pH-Wert metabolisieren kann und die Fähigkeit hat, L-Glutaminsäure in einer Menge anzuhäufen, die die Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in dem flüssigen Medium bei dem vorstehend genannten pH-Wert übersteigt (im folgenden wird dieser auch als "L-Glutaminsäure anhäufender Mikroorganismus" bezeichnet). Der vorstehend genannte spezifische pH-Wert ist 3 bis 5, bei dem L-Glutaminsäure in dem Medium ausfällt.
Die "Sättigungskonzentration" bedeutet eine Konzentration von in dem flüssigen Medium aufgelöster L-Glutaminsäure, wenn das flüssige Medium mit L-Glutaminsäure gesättigt ist.
Wenn ein L-Glutaminsäure anhäufender Mikroorganismus eingesetzt wird, ist der für die Produktion von L-Glutaminsäure geeignete pH-Wert vorzugsweise ein pH-Wert, bei dem L-Glutaminsäure in dem Medium ausfällt. Durch Kultivieren bei diesem pH-Wert wird L-Glutaminsäure in dem Medium, begleitet von einer Ausfällung, produziert und angehäuft.
Der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus kann wie folgt erhalten werden. Eine Mikroorganismen enthaltende Probe wird in ein flüssiges Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration und eine Kohlenstoffquelle enthält, bei einem spezifischen pH-Wert eingeimpft, und ein Stamm, der die Kohlenstoffquelle metabolisiert, wird selektiert. Obwohl der spezifische pH-Wert nicht besonders eingeschränkt ist, ist er üblicherweise 5,0 oder weniger, vorzugsweise etwa 4,5 oder weniger, stärker bevorzugt etwa 4,3 oder weniger. Der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus wird für die Produktion von L-Glutaminsäure durch Fermentation, begleitet von einer Ausfällung der L-Glutaminsäure eingesetzt. Wenn der pH-Wert zu hoch ist, wird es schwierig, dem Mikroorganismus zu ermöglichen, L-Glutaminsäure in einer Menge zu produzieren, die für die Ausfällung ausreicht. Deshalb ist der pH-Wert vorzugsweise in dem vorstehend genannten Bereich.
Wenn der pH-Wert einer wässerigen Lösung, die L-Glutaminsäure enthält, gesenkt wird, fällt die Löslichkeit von L-Glutaminsäure etwa bei dem pka-Wert der γ-Carboxygruppe (4,25, 25°C) deutlich ab. Die Löslichkeit wird am niedrigsten bei dem isoelektrischen Punkt (pH 3,2), und L-Glutaminsäure, welche die Menge übersteigt, die der Sättigungskonzentration entspricht, wird ausgefällt. In Abhängigkeit von der Mediumzusammensetzung wird L-Glutaminsäure in einer Menge von 10-20 g/l bei pH 3,2, 30-40 g/l bei pH 4,0 und 50-60 g/l bei pH 4,7, bei etwa 30°C gelöst. Erfindungsgemäß ist der PH-Wert nicht niedriger als 3,0, weil die L-Glutaminsäure ausfällende Wirkung ihre Obergrenze erreicht, wenn der pH-Wert einen bestimmten Wert unterschreitet.
Zusätzlich bedeutet der Ausdruck, daß ein Mikroorganismus "eine Kohlenstoffquelle metabolisieren kann", daß er proliferieren kann oder eine Kohlenstoffquelle verbrauchen kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann, was bedeutet, daß dies zeigt, daß er eine Kohlenstoffquelle, wie Zucker oder organische Säuren, katabolisieren kann. Genauer gesagt kann beispielsweise, wenn ein Mikroorganismus proliferiert, wenn er in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise pH 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt pH 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt pH 4,0 enthält, bei einer geeigneten Temperatur, wie 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, dieser Mikroorganismus die Kohlenstoffquelle in dem Medium metabolisieren. Außerdem ist beispielsweise, wenn ein Mikroorganismus eine Kohlenstoffquelle verbraucht, wo der Mikroorganismus nicht proliferiert, wenn er in einem synthetischen flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise pH 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt pH 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt pH 4,0 enthält, bei einer geeigneten Temperatur, wie 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, der Mikroorganismus ein Mikroorganismus, der die Kohlenstoffquelle in dem Medium metabolisieren kann.
Der Mikroorganismus, der eine Kohlenstoffquelle metabolisieren kann, umfaßt einen Mikroorganismus, der in dem vorstehend genannten flüssigen Medium wachsen kann.
Außerdem bedeutet der Ausdruck, daß ein Mikroorganismus "wachsen kann", daß er proliferieren kann oder L-Glutaminsäure produzieren kann, selbst wenn er nicht proliferieren kann. Genauer gesagt kann beispielsweise, wenn ein Mikroorganismus proliferiert, wenn er in einem flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration bei pH 5,0 bis 4,0. vorzugsweise pH 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt pH 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt pH 4,0 enthält, bei einer geeigneten Temperatur, die 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, dieser Mikroorganismus in dem Medium wachsen. Außerdem ist beispielsweise, wenn ein Mikroorganismus die Menge an L-Glutaminsäure in einem synthetischen flüssigen Medium erhöht, obwohl der Mikroorganismus nicht proliferiert, wenn der Mikroorganismus in dem synthetischen flüssigen Medium, das L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration bei pH 5,0 bis 4,0, vorzugsweise pH 4,5 bis 4,0, stärker bevorzugt pH 4,3 bis 4,0, insbesondere bevorzugt pH 4,0 enthält, bei einer geeigneten Temperatur, wie 28°C, 37°C oder 50°C, während 2 bis 4 Tagen kultiviert wird, dieser Mikroorganismus ein Mikroorganismus, der in dem Medium wachsen kann.
Die vorstehend beschriebene Selektion kann 2 mal oder mehrmals unter denselben Bedingungen oder bei geändertem pH-Wert oder bei geänderter Konzentration von L-Glutaminsäure wiederholt werden. Eine Selektion auf eine frühe Stufe kann in einem Medium, das L-Glutaminsäure in einer Konzentration unter der Sättigungskonzentration enthält, durchgeführt werden, und dann kann die Selektion in einem Medium, das L-Glutaminsäure in einer Sättigungskonzentration enthält, durchgeführt werden. Außerdem können Stämme mit günstigen Eigenschaften, wie höherer Proliferationsrate, selektiert werden.
Der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus ist ein Mikroorganismus, der L-Glutaminsäure in einer Menge anhäufen kann, welche die Menge, die der Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in dem flüssigen Medium entspricht, übersteigt, wobei diese Eigenschaft zusätzlich zu den vorstehend genannten Eigenschaften vorhanden ist. Der pH-Wert des vorstehend genannten flüssigen Mediums ist vorzugsweise derselbe oder nahezu derselbe wie derjenige des Mediums, das für das Screenen eines Mikroorganismus mit den vorstehend genannten Eigenschaften eingesetzt wird. Üblicherweise wird ein Mikroorganismus für L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration mit fallendem pH-Wert zugänglich. Deshalb ist es bevorzugt, daß der pH-Wert im Hinblick auf die Resistenz gegenüber L-Glutaminsäure nicht niedrig ist, ein niedriger pH-Wert ist jedoch im Hinblick auf die Produktion von L-Glutaminsäure bei gleichzeitiger Ausfällung bevorzugt. Um diese Bedingungen zu erfüllen, kann der pH-Wert in dem Bereich von 3 bis 5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker bevorzugt 4 bis 4,7, noch stärker bevorzugt 4 bis 4,5, insbesondere bevorzugt 4,0 bis 4,3 sein.
Als der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus oder Züchtungsmaterial dafür können beispielsweise Mikroorganismen der Gattung Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia, Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus, Saccharomyces oder dergleichen genannt werden. Unter diesen sind Mikroorganismen der Gattung Enterobacter bevorzugt. Im folgenden wird der erfindungsgemäße Mikroorganismus hauptsächlich für Mikroorganismen der Gattung Enterobacter erklärt. Der Mikroorganismus ist jedoch nicht auf solche der Gattung Enterobacter beschränkt, wobei solche Mikroorganismen anderer Gattungen gleichermaßen eingesetzt werden können.
Als Mikroorganismus der Gattung Enterobacter kann Enterobacter agglomerans genannt werden, vorzugsweise Enterobacter agglomerans AJ13355. Dieser Stamm wurde aus dem Boden in Iwata-shi, Shizuoka, Japan als Stamm isoliert, der in einem Medium, das L-Glutaminsäure und eine Kohlenstoffquelle enthält, bei niedrigem pH-Wert proliferieren kann.
Die physiologischen Eigenschaften von AJ13355 sind nachstehend gezeigt:

(1) Gramfärbung: negativ
(2) Verhalten gegen Sauerstoff: fakultativ anaerob
(3) Catalase: positiv
(4) Oxidase: negativ
(5) Fähigkeit zur Nitratreduktion: negativ
(6) Voges-Proskauer-Test positiv
(7) Methylrot-Test: negativ
(8) Urease: negativ
(9) Indolproduktion: positiv
(10) Beweglichkeit: beweglich
(11) H₂S Produktion in TSI Medium: schwach aktiv
(12) β-Galactosidase: positiv
(13) Saccharid-assimilierende Eigenschaft: Arabinose: positiv Sucrose: positiv Lactose: positiv Xylose: positiv Sorbitol: positiv Inositol: positiv Trehalose: positiv Maltose: positiv Glucose: positiv Adonitol: negativ Raffinose: positiv Salicin: negativ Melibiose: positiv
(14) Glycerose-assimilierende Eigenschaft: positiv
(15) Assimilation von organischen Säuren: Zitronensäure: positiv Leinsäure: negativ Gluconsäure: positiv Essigsäure: positiv Malonsäure: negativ
(16) Arginindehydratase: negativ
(17) Ornithindecarboxylase: negativ
(18) Lysindecarboxylase: negativ
(19) Phenylalanindeaminase: negativ
(20) Pigmentbildung: gelb
(21) Fähigkeit zur Verflüssigung von Gelatine: positiv
(22) Wachstums-pH: Wachstum möglich bei pH 4, gutes Wachstum bei pH 4, 5 bis 7
(23) Wachstumstemperatur: gutes Wachstum bei 25°C, gutes Wachstum bei 30°C, gutes Wachstum bei 37°C, Wachstum möglich bei 42°C, Wachstum unmöglich bei 45°C Auf Grundlage dieser bakteriologischen Eigenschaften wurde AJ13355 als Enterobacter agglomerans bestimmt.

Dieser Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (derzeit International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) am 19. Februar 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16644 hinterlegt. Er wurde dann am 11. Januar 1999 unter den Vorschriften des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-6614.
Der L-Glutaminsäure anhäufende Mikroorganismus kann ein Mikroorganismus mit der ursprünglichen Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure oder mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure sein, die durch Einsatz einer Mutagenesebehandlung, rekombinanter DNA-Techniken oder dergleichen durch Züchten verliehen oder verstärkt wird.
Die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure kann beispielsweise durch Erhöhen der Aktivität eines Enzyms verstärkt oder erhöht werden, welches eine Reaktion für die Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert. Die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure kann auch durch Senken oder Ausschalten der Aktivität eines Enzyms erhöht werden, welches eine Reaktion katalysiert, die von dem Biosyntheseweg von L-Glutaminsäure abzweigt und eine Verbindung erzeugt, die nicht L-Glutaminsäure ist.
Als Beispiele des Enzyms, welches die Reaktion für die B Biosynthese von L-Glutaminsäure katalysiert, können Glutamatdehydrogenase (im folgenden auch als "GDH" bezeichnet), Glutaminsynthetase, Glutamatsynthase, Isocitratdehydrogenase, Aconitathydratase, Citratsynthase (im folgenden auch als "CS" bezeichnet), Phosphoenolpyruvatcarboxylase (im folgenden auch als "PEPC" bezeichnet), Pyruvatdehydrogenase, Pyruvatkinase, Enolase, Phosphoglyceromutase, Phosphoglyceratkinase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Fructosebisphosphataldolase, Phosphofructokinase, Glucosephosphatisomerase und dergleichen genannte werden. Unter diesen Enzymen sind eines, zwei oder drei der Enzyme CS, PEPC und GDH bevorzugt. Außerdem ist es bevorzugt, daß die Aktivitäten aller drei Enzyme CS, PEPC und GDH in dem L-Glutaminsäure anhäufenden Mikroorganismus verstärkt sind. Insbesondere ist CS aus Brevibacterium lactofermentum bevorzugt, weil es nicht der Hemmung durch α-Ketoglutarsäure, L-Glutaminsäure und NADH unterliegt.
Um die Aktivität von CS, PEPC oder GDH zu erhöhen, kann beispielsweise ein Gen, das für CS, PEPC oder GDH kodiert, auf ein geeignetes Plasmid kloniert werden, und ein Wirtsmikroorganismus kann mit dem erhaltenen Plasmid transformiert werden. Die Kopienzahl des Gens, das für CS, PEPC oder GDH (im folgenden als "gltA-Gen", "ppc-Gen" bzw. "gdhA-Gen" abgekürzt) in dem transformierten Stamm kodiert, steigt, was zu einer Erhöhung der Aktivität von CS, PEPC oder GDH führt.
Die klonierten gltA, ppc und gdhA-Gene werden in den vorstehend genannten Ausgangsstamm einzeln oder in willkürlicher Kombination von zwei oder drei Arten davon eingeführt. Wenn zwei oder drei Arten der Gene eingeführt werden, können zwei oder drei Arten der Gene auf ein Plasmid kloniert und in die Wirtszelle eingeführt werden, oder sie können getrennt voneinander auf zwei oder drei Arten von Plasmiden kloniert werden, die in der Wirtszelle pur existieren können und in die Wirtszelle eingeführt werden.
Zwei oder drei Arten von Genen, die für ein Enzym derselben Art kodieren, jedoch von unterschiedlichen Mikroorganismen abgeleitet sind, können in denselben Wirtsstamm eingeführt werden.
Die vorstehend beschriebenen Plasmide sind nicht besonders eingeschränkt, solange sie mit einer Zelle eines Mikroorganismus beispielsweise der Gattung Enterobacter autonom replizierbar sind. Es können jedoch beispielsweise pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218, pACYCl77 und pACYC184 genannt werden. Daneben können auch Vektoren aus Phasen DNA eingesetzt werden.
Die Transformation kann beispielsweise durch das Verfahren von D.M. Morrison (Methods in Enzymology, 68, 326 (1979)), bei dem die Permeabilität der Empfängerbakterienzelle für die DNA durch Behandlung der Zellen mit Calciumchlorid erhöht wird (Mandel M. und Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) oder durch Elektroporation durchgeführt werden (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992).
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch dadurch erhöht werden, daß mehrere Kopien des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens auf der chromosomalen DNA des vorstehend genannten Ausgangsstammes als Wirtszelle vorhanden sind. Um mehrfache Kopien des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens auf die chromosomale DNA eines Mikroorganismus der Gattung Enterobacter oder dergleichen einzuführen, kann eine Sequenz, die mehrfach auf der chromosomalen DNA vorhanden ist, wie repetitive DNA und umgekehrte Wiederholungssequenzen, die an einem Ende eines transformierbaren Elements vorhanden sind, eingesetzt werden.
Alternativ dazu können mehrere Kopien der Gene auf chromosomale DNA dadurch eingeführt werden, daß der Transfer eines Transposons, welches das gltA Gen, das ppc Gen oder das gdhA Gen enthält, eingesetzt wird. Als Ergebnis wird die Kopienzahl des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens in einer transformierten Zelle erhöht, und somit wird die Aktivität von CS, PEPC oder GDH erhöht.
Als Organismen, die als Quelle des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens eingesetzt werden, deren Kopienzahl erhöht werden soll, kann jeder Organismus eingesetzt werden, solange er die Aktivität von CS, PEPC oder GDH hat. Unter anderem sind Bakterien, die Prokaryoten sind, bevorzugt, beispielsweise solche der Gattung Enterobacter, Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia, Corynebacterium, Brevibacterium oder Bacillus: Als spezifische Beispiele können Escherichia coli und Brevibacterium lactofermentum genannt werden. Das gltA Gen, das ppc Gen und das gdhA Gen können aus der chromosomalen DNA der vorstehend beschriebenen Mikroorganismen erhalten werden.
Das gltA Gen, das ppc Gen und das gdhA Gen können durch Einsatz eines Mutantenstammes, der hinsichtlich seiner Aktivität von CS, PEPC oder GDH schadhaft ist, zur Isolierung eines DNA-Fragments, das seine Auxotrophie supplementiert, aus der chromosomalen DNA des vorstehend genannten Mikroorganismus erhalten werden. Da außerdem die Nucleotidsequenzen dieser Gene von Escherichia- und Corynebacterium-Bakterien bereits aufgeklärt worden sind (Biochemistry, 22, S. 5243-5249, (1983); J. Biochem., 95, S. 909-916, (1984); Gen, 27, S. 193-199, (1984); Microbiology, 140, S. 1817-1828, (1999); Mol. Gen. Genet., 218, S. 330-339, (1989); Molecular Microbiology, 6, S. 317-326, (1992)), können sie auch durch PCR unter Verwendung von Primern, die auf Grundlage der jeweiligen Nucleotidsequenz synthetisiert worden sind, und der chromosomalen DNA als Matrize erhalten werden.
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch durch Erhöhen der Expression des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens, zusätzlich zu der vorstehend genannten Amplifizierung der Gene erhöht werden. Beispielsweise kann die Expression durch Ersetzen eines Promotors für das gltA Gen, das ppc Gen oder das gdhA Gen durch einen anderen, stärkeren Promotor erhöht werden. Beispielsweise sind der lac Promotor, trp Promotor, trc Promotor, tac Promotor, PR Promotor und PL Promotor des Phagen λ als starke Promotoren bekannt. Das gltA Gen, das ppc Gen und das gdhA Gen, deren Promotor ersetzt wird, werden auf ein Plasmid kloniert und in den Wirtsmikroorganismus eingeführt, oder sie werden auf die chromosomale DNA des Wirtsmikroorganismus durch Verwendung repetitiver DNA, umgekehrter Wiederholungssequenzen, Transposons oder dergleichen eingeführt.
Die Aktivität von CS, PEPC oder GDH kann auch durch Ersetzen des Promotors des gltA Gens, des ppc Gens oder des gdhA Gens auf dem Chromosom durch einen anderen, stärkeren Promotor (vgl.
WO87/03006 und die offengelegte japanischen Patentanmeldung Nr. 61-268183) oder durch Einfügen eines starken Promotors stromaufwärts der kodierenden Sequenz jedes Gens erhöht werden (vgl. Gene, 29, S.231-241 (1984)). Genauer gesagt kann eine homologe Rekombination zwischen dem gltA Gen, dem ppc Gen oder dem gdhA Gen, dessen Promotor durch einen stärkeren Promotor ersetzt worden ist, oder einer DNA, die einen Teil davon enthält, und dem korrespondierenden Gen auf dem Chromosom durchgeführt werden.
Beispiele des Enzyms, welches die Reaktion katalysiert, die von dem biosynthetischen Weg der L-Glutaminsäure abzweigt und eine Verbindung erzeugt, die nicht L-Glutaminsäure ist, umfassen α-Ketoglutaratdehydrogenase (im folgenden auch als "αKGDH" bezeichnet), Isocitratlyase, Phosphatacetyltransferase, Acetatkinase, Acetohydroxysäuresynthase, Acetolactatsynthase, Formiatacetyltransferase, Lactatdehydrogenase, Glutamatdecarboxylase und 1-Pyrrolindehydrogenase. Unter diesen ist αKGDH bevorzugt.
Um die Aktivitäten der vorstehend genannten Enzyme in einem Mikroorganismus der Gattung Enterobacter oder dergleichen zu senken oder auszuschalten, können Mutationen zum Senken oder Ausschalten der intrazellulären Aktivität der Enzyme in Gene der vorstehend genannten Enzyme durch übliche Mutagenesebehandlungsverfahren oder gentechnische Verfahren eingeführt werden. Beispiele des Mutagenesebehandlungsverfahrens umfassen Verfahren unter Einsatz von Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV Strahlen und Verfahren unter Einsatz einer Behandlung mit einem Mutagenisierungsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Die Stelle eines Gens, wo die Mutation eingeführt wird, kann in einer kodierenden Region, die für ein Enzymprotein kodiert, oder einer Region zur Regulation der Expression, wie ein Promotor, eingeführt werden.
Beispiele der gentechnischen Verfahren umfassen Verfahren unter Einsatz von Genrekombination, Transduktion und Zellfusion. Beispielsweise wird ein Arzneimittelresistenzgen in ein kloniertes Zielgen eingeführt, um ein Gen herzustellen, das seine Funktion verloren hat (schadhaftes Gen). Danach wird dieses schadhafte Gen in eine Zelle eines Wirtsmikroorganismus eingeführt, und das Zielgen auf dem Chromosom wird durch das vorstehend genannte schadhafte Gen unter Einsatz der homologen Rekombination ersetzt (Genzerstörung).
Das Senken oder Ausschalten der intrazellulären Aktivität des Zielenzyms und der Grad des Ausschaltens der Aktivität kann durch Messen der Enzymaktivität eines Zellextrakts oder einer gereinigten Fraktion davon, die von einem Kandidatenstamm erhalten wird, und Vergleichen mit den Werten eines Wildtypstamms bestätigt werden. Beispielsweise kann die αKGDH-Aktivität mit einem Verfahren von Reed et al. (Reed L.J. und Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, S.55-61 (1969)) gemessen werden.
In Abhängigkeit von dem Zielenzym kann ein Zielmutantenstamm auf der Grundlage eines Phänotyps des Mutantenstammes selektiert werden. Beispielsweise kann ein Mutantenstamm, dessen αKGDH-Aktivität ausgeschaltet oder verringert ist, nicht proliferieren, oder er zeigt eine deutlich verringerte Proliferationsrate in einem Minimalmedium, das Glucose enthält, oder einem Minimalmedium, das Essigsäure oder L-Glutaminsäure als alleinige Kohlenstoffquelle enthält, unter aeroben Kulturbedingungen. Die normale Proliferation wird jedoch selbst unter denselben Bedingungen durch Zugeben von Bernsteinsäure oder Lysin, Methionin und Diaminopimellinsäure zu einem Minimalmedium, das Glucose enthält, ermöglicht. Durch Ausnutzen dieser Phänomene als Indikatoren kann ein Mutantenstamm mit verringerter αKGDH-Aktivität oder ausgeschalteter Aktivität selektiert werden.
Ein Verfahren zum Herstellen eines αKGDH gendefizienten Stammes von Brevibacterium lactofermentum durch Einsatz einer homologen Rekombination ist eingehend in WO 95/34672 beschrieben. Ähnliche Verfahren können auf anderen Mikroorganismen übertragen werden.
Außerdem sind Verfahren, wie das Klonieren von Genen und die Verdauung und Ligation von DNA und die Transformation in Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) und dergleichen eingehend beschrieben.
Als spezifisches Beispiel eines Mutantenstammes mit defizienter αKGDH-Aktivität oder mit verringerter αKGDH-Aktivität, der wie vorstehend beschrieben erhalten wurde, kann Enterobacter agglomerans AJ13356 genannt werden.
Enterobacter agglomerans AJ13356 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (jetzt International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) am 19. Februar 1998 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-16645 hinterlegt. Er wurde dann gemäß den Vorschriften des Budapester Abkommens am 11. Januar 1999 in eine internationale Hinterlegung überführt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-6615. Enterobacter agglomerans AJ13356 ist als Ergebnis der Zerstörung des Gens der αKGDH-E1-Untereinheit (sucA) hinsichtlich der α KGDH-Aktivität defizient.
Wenn Enterobacter agglomerans, der ein Beispiel des in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismus ist, in einem Medium kultiviert wird, das ein Saccharid enthält, wird Schleim aus der Zelle sekretiert, was gelegentlich zu einer geringen Verfahrenseffizienz führt. Deshalb ist es, wenn Enterobacter agglomerans mit einer solchen Eigenschaft der Schleimsekretion eingesetzt wird, bevorzugt, einen Mutantenstamm einzusetzen, der im Vergleich zu einem Wildtyp-Stamm weniger Schleim sekretiert. Beispiele für Mutagenesebehandlungen umfassen Verfahren unter Einsatz von Bestrahlung mit Röntgenstrahlen oder UV Strahlen und Verfahren unter Einsatz einer Behandlung mit einem Mutagenisierungsmittel, wie N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Ein Mutantenstamm mit verringerter Schleimsekretion kann durch Impfen von mutagenisierten Bakterienzellen in ein Medium, das ein Saccharid enthält, beispielsweise eine LB-Mediumplatte, die 5 g/l Glucose enthält, Kultivieren der Platte bei einer Neigung von etwa 45° und Selektieren einer Kolonie, bei der kein Schleim nach unten fließt, selektiert werden.
In der vorliegenden Erfindung kann die Verleihung oder Verstärkung der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure und die Verleihung anderer bevorzugter Eigenschaften, wie eine Mutation für geringere Schleimsekretion wie vorstehend beschrieben, in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden.
Durch Kultivieren des Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium, das auf pH-Bedingungen eingestellt ist, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglichen, kann L-Glutaminsäure produziert und angehäuft werden, wobei sie gleichzeitig in dem Medium ausgefällt wird.
Außerdem ist es möglich, daß die Kultur bei einem neutralen pH-Wert gestaltet wird und der pH-Wert, sobald die Kultivierung beendet ist, eine Bedingung erfüllt, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht.
Die "Bedingung, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht", bedeutet eine Bedingung, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht, wenn der vorstehend genannte Mikroorganismus L-Glutaminsäure produziert und anhäuft. Beispielsweise ist der pH-Wert 3 bis 5, wenn der Mikroorganismus ein Enterobacter Bacterium ist.
Der Mikroorganismus kann bei einem pH-Wert, der für das Wachstum geeignet ist, zu Beginn kultiviert werden und dann unter der Bedingung, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht, kultiviert werden. Wenn beispielsweise das Medium eine Zuckerquelle enthält, welche der Mikroorganismus unter der Bedingung, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht, nicht assimilieren kann, oder eine organische Säure enthält, welche das Wachstum des Mikroorganismus unter der Bedingung, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure erlaubt, hemmt, kann der Mikroorganismus unter einer Bedingung, bei der der Mikroorganismus die Zuckerquelle assimilieren kann oder das Wachstum des Mikroorganismus durch die organische Säure nicht inhibiert wird, um dem Mikroorganismus zu ermöglichen, die Zuckerquelle oder die organische Säure zu verbrauchen, und dann wird unter der Bedingung kultiviert, welche die Ausfällung von L-Glutaminsäure ermöglicht.
Als Medien, die für die Kultur eingesetzt werden, kann ein übliches Nährmedium, das eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, Mineralsalze und andere Spurennährstoffe, wie Aminosäuren und Vitamine, nach Bedarf enthält, eingesetzt werden, solange der pH-Wert so eingestellt ist, daß die vorbestimmten Bedingungen erfüllt sind. Es kann entweder ein synthetisches Medium oder ein natürliches Medium verwendet werden. Die Kohlenstoffquelle und Stickstoffquelle, die in dem Medium verwendet werden, können beliebige sein, solange sie von dem zu kultivierenden Stamm verwendet werden können. Als Kohlenstoffquelle werden Saccharide, wie Glucose, Glycerin, Fructose, Saccharose, Maltose, Mannose, Galactose, Stärkehydrolysat und Melasse verwendet. Zusätzlich können organische Säuren, wie Essigsäure und Zitronensäure, jeweils allein oder in Kombination mit einer anderen Kohlenstoffquelle eingesetzt werden.
Als Stickstoffquelle werden Ammoniak, Ammoniumsalze, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumcarbonat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat und Ammoniumacetat, Nitrate und dergleichen eingesetzt.
Als organische Spurennährstoffe werden Aminosäuren, Vitamine, Fettsäuren, Nukleinsäuren, solche, die diese Substanzen enthalten, wie Pepton, Casaminosäure, Hefeextrakt und Sojabohnenproteinzersetzungsprodukte eingesetzt.
Wenn ein auxotropher Mutantenstamm, der eine Aminosäure und dergleichen für die Metabolisierung oder das Wachstum verwendet, muß der erforderliche Nährstoff zugesetzt werden.
Als Mineralsalze werden Phosphate, Magnesiumsalze, Calciumsalze, Eisensalze, Mangansalze und dergleichen eingesetzt.
Die Kultivierung wird üblicherweise mit Belüftung unter den Bedingungen einer Kultivierungstemperatur von 20 bis 42°C und einem pH-Wert von 3 bis 5, vorzugsweise 4 bis 5, stärker bevorzugt 4 bis 4,7, insbesondere bevorzugt 4 bis 4,5 durchgeführt. Eine beträchtliche Menge an L-Glutaminsäure wird üblicherweise nach Kultivierung während etwa 10 Stunden bis etwa 4 Tagen angehäuft. Ein Teil der angehäuften L-Glutaminsäure, welche die Sättigungskonzentration übersteigt, fällt in dem Medium aus.
Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung kann die in der Kultur ausgefallene L-Glutaminsäure durch Zentrifugation, Filtration oder dergleichen gewonnen werden. In dem Medium gelöste L-Glutaminsäure kann durch bekannte Verfahren gewonnen werden. Beispielsweise kann die L-Glutaminsäure durch Konzentrieren der Kulturbrühe, um sie zu kristallisieren, oder durch Ionenaustauscherchromatographie oder dergleichen isoliert werden. Es ist auch möglich, die in dem Medium gelöste L-Glutaminsäure zu kristallisieren und dann die in der Kulturbrühe ausgefallene L-Glutaminsäure zusammen mit der kristallisierten L-Glutaminsäure zu sammeln.
Wenn L-Glutaminsäure, welche die Sättigungskonzentration übersteigt, ausfällt, wird die Konzentration der in dem Medium gelösten L-Glutaminsäure bei einem konstanten Wert gehalten. Deshalb kann der Einfluß der L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration auf die Mikroorganismen verringert werden. Dementsprechend wird es auch möglich, einen Mikroorganismus mit weiter verbesserter Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure zu züchten. Außerdem wird, da L-Glutaminsäure als Kristalle ausgefällt wird, die Ansäuerung der Kulturbrühe durch Anhäufung von L-Glutaminsäure unterdrückt, und deshalb kann die Menge der Base, die für die Aufrechterhaltung des pH-Wertes der Kultur eingesetzt wird, deutlich reduziert werden. Unter der Voraussetzung, daß die vorliegende Erfindung nicht auf bestimmte Theorien beschränkt sein soll, wird als Grund dafür, daß die Ausbeute an L-Glutaminsäure durch Durchführen eines Verfahrens, das das Vorhandensein von L-Glutaminsäure-Kristallen in dem Medium hervorruft, wenn eine Konzentration der L-Glutaminsäure in dem Medium niedriger ist als die Konzentration, bei der spontane Kristallisation auftritt, in dem Fall, daß L-Glutaminsäure wie vorstehend beschrieben ausfällt, folgender angenommen.
Bei der Fermentation von L-Glutaminsäure, begleitet von einer Ausfällung, neigt die Produktion von L-Glutaminsäure dazu, ihre Grenzen zu erreichen, wenn spontane Kristallisation auftritt. Es wird angenommen, daß dies daran liegt, daß die Konzentration von L-Glutaminsäure auf der Oberfläche von Zellen am höchsten ist, wenn die spontane Kristallisation auftritt, und die Ausfällung tritt auf den Oberflächen auf, wodurch verhindert wird, daß Substanzen sich um die Membran bewegen, so daß die Aktivität eines Bakterium verringert wird. Wenn das Vorhandensein von Kristallen künstlich hervorgerufen wird, bevor spontane Kristallisation auftritt, dienen die Kristalle als Kristallkeime, um die Ausfällung auf den Oberflächen der Kristalle zu verursachen, wodurch verhindert wird, daß die Aktivität des Bakteriums reduziert wird.
BEISPIELE
Im folgenden wird die folgende Erfindung unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele eingehender beschrieben. In den Beispielen sind Aminosäuren L-Aminosäuren, wenn nichts anderes angegeben ist.
Referenzbeispiel 1
(1) Screenen eines Mikroorganismus mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung
Das Screenen eines Mikroorganismus mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung wurde wie folgt durchgeführt. Jeweils 1 g von etwa 500 Proben, die in der Natur erhalten wurden, einschließlich im Boden, in Früchten, Pflanzenkörpern, Flußwasser und dergleichen, wurde in 5 ml sterilisiertem Wasser suspendiert, und 200 μl davon wurden auf 20 ml eines festen Mediums, das mit HCl auf pH 4,0 eingestellt war, gegeben. Die Zusammensetzung des Mediums war wie folgt: 3 g/l Glucose, 1 g/l Ammoniumsulfat, 0,2 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 0,5 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,2 g/l Natriumchlorid, 0,1 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,01 g/l Eisensulfatheptahydrat, 0,01 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Kobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 50 μg/l Biotin, 50 μg/l Calciumpantothenat, 50 μg/l Folsäure, 50 μg/l Inositol, 50 μg/l Niacin, 50 μg/l p-Aminobenzoesäure, 50 μg/l Pyridoxinhydrochlorid, 50 μg/l Riboflavin, 50 μg/l Thiaminhydrochlorid, 50 mg/l Cycloheximid und 20 g/l Agar.
Die mit den vorstehenden Proben plattierten Medien wurden bei 28°C, 37°C oder 50°C während 2 bis 4 Tagen inkubiert und 378 Kolonie bildende Stämme wurden erhalten.
Danach wurde jeder der wie vorstehend beschrieben erhaltenen Stämme in einem Teströhrchen mit 16,5 cm Länge und 15 mm Durchmesser, das 3 ml flüssiges Medium (eingestellt mit HCl auf pH 4,0), enthielt, das eine Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure enthielt, geimpft und bei 28°C, 37°C oder 50°C während 24 Stunden bis 3 Tagen unter Schütteln kultiviert. Dann wurden die gewachsenen Stämme selektiert. Die Zusammensetzung des vorstehend genannten Mediums war wie folgt: 40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisensulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0.64 mg/ Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Kobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat und 2 g/l Hefeextrakt.
Somit wurden 78 Stämme von Mikroorganismen erhalten, die in einer sauren Umgebung Resistenz gegen L-Glutaminsäure zeigen.
(2) Selektion von Stämmen mit erhöhter Wachstumsrate unter Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung
Die vorstehend erhaltenen verschiedenen Mikroorganismen mit Resistenz gegen L-Glutaminsäure in saurer Umgebung wurden jeweils in ein Teströhrchen mit 16,5 cm Länge und 14 mm Durchmesser geimpft, das 3 ml eines Mediums (mit HCl auf pH 4,0 eingestellt) enthielt, das durch Zugeben von 20 g/l Glutaminsäure und 2 g/l Glucose zu einem M9 Medium erhalten wurde (Sambrook, J., Fritsh, E.F. und Maniatis, T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1989), und die Trübung des Mediums wurde zeitabhängig gemessen, um Stämme zu selektieren, die eine günstige Wachstumsrate zeigen. Als Ergebnis wurde als Stamm mit günstigem Wachstum der Stamm AJ13355 aus dem Boden in Iwata-shi, Shizuoka, Japan, erhalten. Dieser Stamm wurde auf der Grundlage seiner vorstehend beschriebenen bakteriologischen Eigenschaften als Enterobacter agglomerans bestimmt.
(3) Bereitstellung eines Stammes mit geringerer Schleimsekretion aus dem Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355
Da der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 Schleim aus der Zelle sekretiert, wenn er in einem Medium kultiviert wird, das ein Saccharid enthält, ist die Verfahrenseffizienz nicht günstig. Deshalb wurde ein Stamm mit geringerer Schleimsekretion durch UV Bestrahlung erhalten (Miller, J.H. et al., "A Short Course in Bacterial Genetics; Laboratory Manual", S.150, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde 2 Minuten in 60 cm Entfernung von einer 60 W UV-Lampe mit UV-Strahlen bestrahlt und über Nacht in LB Medium kultiviert, um die Mutation zu festigen. Der mutagenisierte Stamm wurde verdünnt und in LB Medium geimpft, das 5 g/l Glucose und 20 g/l Agar enthielt, so daß etwa 100 Kolonien pro Platte erscheinen würden, und über Nacht bei 30°C bei einer Neigung der Platte von etwa 45° kultiviert und dann wurden 20 Kolonien selektiert, die kein Abfließen von Schleim zeigten.
Als ein Stamm, der die Bedingungen erfüllte, das selbst nach 5-maliger Subkultivierung in einem LB Medium, das 5 g/l Glucose und 120 g/l Agar enthielt, keine Revertanten auftraten und das Wachstum überwacht werden sollte, das dem Wachstum des Ausgangsstammes im LB Medium, LB Medium, das 5 g/l Glucose enthielt, und M9 Medium (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press, U.S.A., 1989), das mit 20 g/l L-Glutaminsäure und 2 g/l Glucose supplementiert war und mit HCl auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt war, entsprach, wurde der Stamm SC17 unter den vorstehend selektierten Stämmen selektiert.
(4) Konstruktion von L-Glutaminsäure produzierenden Bakterien auf dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17
(1) Herstellung eines αKGDH defizienten Stammes aus Enterobacter agglomerans SC17
Ein Stamm mit αKGDH Defizienz und einem verstärkten L-Glutaminsäure Biosynthesesystem wurde aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 hergestellt.
(i) Klonierung des αKGDH Gens mit folgenden (als "sucAB" bezeichnet) des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355
Das sucAB Gen des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde durch Selektieren eines DNA Fragments, das die fehlende Fähigkeit des αKGDH E1 Untereinheit-Gens (im folgenden als "sucA" bezeichnet) defizienten Stammes von Escherichia coli zur Assimilation von Essigsäure komplementiert, aus der chromosomalen DNA des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 kloniert.
Die chromosomale DNA des Stammes Enterobacter agglomerans AJ13355 wurde durch ein Verfahren isoliert, das üblicherweise zum Extrahieren von chromosomaler DNA aus Escherichia coli eingesetzt wird (Text for Bioengineering Experiments, Edited by the Society for Bioscience and Bioengineering, Japan, S. 97-98, Baifukan, 1992). Das Plasmid pTWV228 (resistent gegen Ampicillin), das als Vektor eingesetzt wurde, war ein kommerzielles Produkt von Takara Shuzo Co., Ltd.
Die chromosomale DNA von AJ13355, verdaut mit EcoT221, und pTWV228, verdaut mit PstI, wurden unter Einsatz von T4-Ligase ligiert und zur Transformation des sucA-defizienten Stammes Escherichia coli JRG465 eingesetzt (Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Ein Stamm, der in Acetatminomal wuchs, wurde unter den vorstehend erhaltenen Transformantenstämmen selektiert, und ein Plasmid wurde daraus extrahiert und pTWVEK101 genannt. Der Stamm Escherichia coli JRG465, der pTWVEK101 enthielt, hatte die Auxotrophie für Bernsteinsäure oder L-Lysin und L-Methionin neben der fehlenden Fähigkeit zur Assimilation von Essigsäure wiedergewonnen. Dies deutet an, daß pTWVEK101 das sucA Gen von Enterobacter agglomerans enthielt.
1 zeigt eine Restriktionsenzymkarte eines von Enterobacter agglomerans abgeleiteten DNA Fragments in pTWVEK101.
In der Nucleotidsequenz des schraffierten Bereichs in 1 wurden Nucleotidsequenzen gefunden, von denen angenommen wurde, daß sie zwei vollständige ORFs sind und zwei Nucleotidsequenzen, von denen angenommen wurde, daß sie Teilsequenzen von ORFs sind. Die Homologiesuche für diese Sequenzen zeigte, daß die Bereiche, deren Nucleotidsequenzen bestimmt wurden, eine 3'-terminale Teilsequenz des Succinatdehydrogenase-Eisenschwefelproteingens (sdhB), vollständiges sucA und αKGDH-E2 Untereinheiten-Gen (sucB Gen), und eine 5'-terminale Teilsequenz des Succinyl CoA Synthetase β-Einheiten Gens (sucC Gen). Die Ergebnisse des Vergleichs der Aminosäuresequenzen, die von diesen Nucleotidsequenzen abgeleitet sind, mit denjenigen aus Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, S.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, S.361-374 (1984); Biochemistry, 24, S.6245-6252 (1985)) sind in den 2 bis 5 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen, die von sucA, sucB und sucC kodiert werden, oder Teile davon, die von Enterobacter agglomerans abgeleitet sind, sind in den Sequenzen ID Nummern 1 bis 4 gezeigt, und solche, die von Escherichia coli abgeleitet sind, sind in den Sequenzen ID Nummern 5 bis 8 gezeigt. Die Aminosäuresequenzen zeigten sehr hohe Homologie zueinander. Zusätzlich wurde gefunden, daß wie in Escherichia coli eine Gruppe der Gene sghB-sucA-sucB-sucC auf dem Chromosom von Enterobacter agglomerans vorhanden war (Eur. J. Biochem., 141, S.351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, S.361-374 (1984); Biochemistry, 24, S.6245-6252 (1985)).
(ii) Herstellen eines αKGDH defizienten Stammes, der von dem Stamm Enterobacter agglomerans Enterobacter agglomerans SC17 abgeleitet ist
Die homologe Rekombination wurde unter Verwendung des sucAB Gens von dem vorstehend beschriebenen Enterobacter agglomerans durchgeführt, um einen αKGDH defizienten Stamm von Enterobacter agglomerans zu erhalten.
Nachdem pTWVEK101 mit SphI verdaut worden war, um das sucA enthaltende Fragment auszuschneiden, wurde das Fragment mit dem Klenow Fragment abgestumpft (Takara Shuzo Co., Ltd.) und mit pBR322, das mit EcoRI verdaut worden war und mit dem Klenow Fragment abgestumpft wurde, unter Verwendung von T4 DNA Ligase ligiert (Takara Shuzo Co., Ltd.). Das erhaltene Plasmid wurde an der Schnittstelle des Restriktionsenzyms BglII, die sich in der Nähe des Zentrums von sucA befindet, unter Verwendung des Enzyms verdaut, mit Klenow Fragment abgestumpft und dann erneut unter Verwendung von T4 DNA Ligase ligiert. Man geht davon aus, daß das sucA Gen dadurch seine Funktion verlor, daß in sucA des Plasmids, das durch das vorstehend genannte Verfahren neu konstruiert wurde, eine Leserahmenmutation eingeführt.
Das wie vorstehend beschrieben hergestellte Plasmid wurde mit einem Restriktionsenzym ApaLI verdaut und einer Agarosegelelektrophorese zur Gewinnung eines DNA Fragments, das sucA, in das eine Leserahmenmutation eingeführt wurde, und ein Tetracyclinresistenzgen, abgeleitet von pBR322 enthielt, zu gewinnen. Das gewonnene DNA Fragment wurde unter Verwendung von T4 DNA Ligase erneut ligiert, um ein Plasmid für die Zerstörung des α KGDH Gens zu konstruieren.
Das Plasmid für die Zerstörung des αKGDH Gens, das vorstehend erhalten wurde, wurde eingesetzt, um dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17 durch Elektroporation zu transformieren (Miller, J.H., "A Short Course in Bacterial Genetics; Handbook", 5.279, Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992), und ein Stamm, in dem das sucA Gen auf dem Chromosom durch eine Mutante des Plasmids durch homologe Rekombination ersetzt war, wurde unter Verwendung der Tetracyclinresistenz als Marker erhalten. Der erhaltene Stamm wurde SC17sucA genannt.
Um zu bestätigen, daß der Stamm SC17sucA αKGDH defizient war, wurde die Enzymaktivität durch das Verfahren von Reed et al. (Reed, L.J. and Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, S.55-61, (1969)) unter Verwendung von Zellen des Stammes, der im LB Medium bis zur logarithmischen Wachstumsphase kultiviert wurde, gemessen. Es wurde eine αKGDH Aktivität von 0,073 (δ ABS/min/mg Protein) für den Stamm SC17 nachgewiesen, während für den Stamm SC17sucA keine αKGDH Aktivität nachgewiesen wurde, und somit wurde bestätigt, daß sucA wie gewünscht ausgeschaltete worden war.
(2) Stärkung des L-Glutaminsäure Biosynthese-Systems des Stammes Enterobacter agglomerans SC17sucA
Danach wurden das Citratsynthase-Gen, das Phosphoenolpyruvatcarboxylase-Gen und das Glutamatdehydrogenase-Gen, abgeleitet von Escherichia coli, in den Stamm SC17sucA eingeführt.
(i) Herstellung eines Plasmids mit dem gltA Gen, dem ppc Gen und dem gdhA Gen, abgeleitet von Escherichia coli
Die Verfahren zum Herstellen eines Plasmids mit dem gltA Gen, dem ppc Gen und dem gdhA Gen werden unter Bezugnahme auf die 6 und 7 erklärt.
Das Plasmid mit dem gdhA Gen, abgeleitet von Escherichia coli, pBRGDH (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 7-203980), wurde mit HindIII und SphI verdaut, und beide Enden wurden durch T4 DNA Polymerasebehandlung abgestumpft, und dann wurde das DNA Fragment mit dem gdhA Gen gereinigt und gewonnen. Getrennt davon wurde ein Plasmid mit dem gltA Gen und dem ppc Gen, abgeleitet von Escherichia coli, pMWCP (WO97/08294), mit XbaI verdaut, und dann wurden beide Enden unter Einsatz von T4 DNA Polymerase abgestumpft. Dieses wurde dann mit dem vorstehend gereinigten DNA Fragment mit dem gdhA Gen gemischt und mit T4, Ligase ligiert, wobei das Plasmid pMWCPG erhalten wurde, das dem Plasmid pMWCP entspricht, das zusätzlich das gdhA Gen enthält (6).
Gleichzeitig wurde das Plasmid pVIC40 (offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 8-047397) mit dem Replikationsursprung des Plasmids RSF1010 mit breitem Wirtsbereich mit NotI verdaut, mit T4 DNR Polymerase behandelt und mit PstI verdaut. Das Plasmid pBR322 wurde mit EcoT14I verdaut, mit T4 DNA Polymerase behandelt und mit PstI verdaut. Beide Produkte wurden gemischt und unter Verwendung von T4 Ligase ligiert, wobei das Plasmid RSF-Tet mit dem Replikationsursprung von RSF1010 und dem Tetracyclinresistenzgen erhalten wurde (7).
Danach wurde pMWCPG mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA Fragment mit dem gltA Gen, dem ppc Gen und dem gdhA Gen wurde gereinigt und gewonnen. RSF-Tet wurde auf ähnliche Weise mit EcoRI und PstI verdaut, und ein DNA Fragment mit dem Replikationsursprung von RSF1010 wurde gereinigt und gewonnen. Beide Produkte wurden gemischt und unter Verwendung von T4 Ligase ligiert, wobei das Plasmid RSFCPG erhalten wurde, welches RSF-Tet entspricht, das zusätzlich das gltA Gen, das ppc Gen und das gdhA Gen enthält (8). Es wurde bestätigt, daß das erhaltene Plasmid RSFCPG das gltA Gen, das ppc Gen und das gdhA Gen exprimiert, in dem gezeigt, daß die Auxotrophie des gltA Gen-, ppc Gen- oder gdhA Gen-defizienten Stammes, abgeleitet von Escherichia coli, supplementiert wurde und jede Enzymaktivität gemessen wurde.
(ii) Herstellung eines Plasmids mit dem gltA Gen, abgeleitet von Brevibacterium lactofermentum
Ein Plasmid mit dem von Brevibacterium lactofermentum abgeleiteten gltA Gen wurde wie folgt konstruiert. Eine PCR wurde unter Verwendung der Primer DNAs, die auf der Grundlage der Nucleotidsequenz des Corynebacterium glutamicum gltA Gens (Microbiology, 140, S.1817-1828 (1994)) hergestellt wurde, und einer chromosomalen DNA von Brevibacterium lactofermentum ATCC13869 als Matrize durchgeführt, wobei ein gltA Gen Fragment von etwa 3 kb erhalten wurde. Dieses Fragment wurde in ein Plasmid pHSG399 (erworben von Takara Shuzo Co., Ltd.), verdaut mit SmaI, eingeführt, wobei ein Plasmid pHSGCB erhalten wurde (9). Danach wurde pHSGCB mit HindIII verdaut, und das ausgeschnittene gltA Gen Fragment von etwa 3 kb wurde in das Plasmid pSTV29 (erworben von Takara Shuzo Co., Ltd.), verdaut mit HindIII, eingeführt, wobei das Plasmid pSTVCB erhalten wurde (9). Es wurde bestätigt, daß das erhaltene Plasmid pSTVCB das gltA Gen exprimiert, indem die Enzymaktivität in dem Stamm Enterobacter agglomerans AJ13355 gemessen wurde.
(iii) Einführen von RSFCPG und pSTVCB in den Stamm SC17sucA
Der Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA wurde durch Elektroporation mit RSFCPG transformiert, wobei ein transformierter Stamm SC17sucA/RSFCPG, der Tetracyclinresistenz zeigt, erhalten wurde. Außerdem wurde der Stamm SC17sucA/RSFCPG durch Elektroporation mit pSTVCB transformiert, wobei ein Transformantenstamm SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB mit Chloramphenicolresistenz erhalten wurde.
(5) Herstellen eines Stammes mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure in einer Umgebung mit einem niedrigen pH-Wert
Ein Stamm mit verbesserter Resistenz gegen L-Glutaminsäure bei einer hohen Konzentration in einer Umgebung mit einem niedrigen pH-Wert (im folgenden auch als "Stamm mit Resistenz bei hoher Glu-Konzentration und niedrigem pH" bezeichnet) wurde aus dem Stamm Enterobacter agglomerans SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB isoliert.
Der Stamm SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB wurde über Nacht bei 30°C in LBG Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl, 5 g/l Glucose) kultiviert, und die mit Natriumchlorid gewaschenen Zellen wurden in geeigneter Weise verdünnt und auf M9-E Medium plattiert (4 g/l Glucose, 17 g/l Na₂HPO₄ 12H₂O, 3 g/l KH₂PO₄, 0,5 g/l NaCl, 1 g/l NH₄Cl, 10 mM MgSO₄, 10 μM CaCl₂, 50 mg/L-Lysin, 50 mg/l L-Methionin, 50 mg/l DL-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclin, 25 mg/l Chloramphenicol, 30 g/l L-Glutaminsäure, mit wässerigem Ammoniak auf pH 4,5 eingestellt. Eine Kolonie, die nach Kultivierung bei 32°C während 2 Tagen auftrat, wurde als Stamm mit Resistenz gegen hohe Glu-Konzentration bei niedrigem pH erhalten.
Das Wachstumsniveau des erhaltenen Stammes wurde in flüssigem M9-E Medium gemessen und die Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure wurde in einem Teströhrchen mit 50 ml Volumen getestet, das 5 ml L-Glutaminsäureproduktionstestmedium enthielt (40 g/l Glucose, 20 g/l Ammoniumsulfat, 0,5 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Kaliumdihydrogenphosphat, 0,5 g/l Natriumchlorid, 0,25 g/l Calciumchloriddihydrat, 0,02 g/l Eisensulfatheptahydrat, 0,02 g/l Mangansulfattetrahydrat, 0,72 mg/l Zinksulfatdihydrat, 0,64 mg/l Kupfersulfatpentahydrat, 0,72 mg/l Kobaltchloridhexahydrat, 0,4 mg/l Borsäure, 1,2 mg/l Natriummolybdatdihydrat, 2 g/l Hefeextrakt, 200 mg/l L-Lysinhydrochlorid, 200 mg/l L-Methionin, 200 mg/l DL-α,ε-Diamino pimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol). Ein Stamm, der das beste Wachstumsniveau zeigte und die gleiche Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure wie der Ausgangsstamm zeigte, nämlich der Stamm SC17/RSFCPG+pSTVCB, wurde als Enterobacter agglomerans AJ13601 bezeichnet. Der Stamm AJ13601 wurde beim National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (jetzt International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566, Japan) am 18. August 1999 unter der Hinterlegungsnummer FERM P-17516 hinterlegt. Er wurde am 6. Juli 2000 unter den Vorschriften des Budapester Abkommens in eine internationale Hinterlegung mit der Hinterlegungsnummer FERM BP-7207 überführt.
Beispiel 1
Der Stamm Enterobacter agglomerans AJ13601 wurde auf LBG Agarmedium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 10 g/l NaCl und 15 g/l Agar), das 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, 14 Stunden bei 30°C kultiviert, und die Zellen auf einer Platte (Durchmesser: 8,5 cm) wurden gewonnen und in 300 ml eines Kulturmediums, das 50 g/l Glucose, 4 g/l Ammoniumsulfat, 0,4 g/l Magnesiumsulfatheptahydrat, 2 g/l Monokaliumdihydrogenphosphat, 10 mg/l Eisensulfatheptahydrat, 10 mg/l Mangansulfatpentahydrat, 4 g/l Hefeextrakt, 400 mg/l l-Lysinhydrochlorid, 400 mg/l DL-Methionin, 400 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, in einem 1 lStoßfermenter geimpft, um die Kultivierung bei 34°C bei pH 6,0 durchzuführen. Der pH-Wert der Kultur wurde durch Zugeben von Ammoniakgas kontrolliert. Die Kultur wurde etwa 16 Stunden nach Beginn der Kultivierung in einer Phase, in der die Glucose in dem Kulturmedium verbraucht war, beendet.
60 ml der wie vorstehend beschrieben kultivierten Kulturbrühe wurden in 300 ml eines Hauptkulturmediums, das 50 g/l Glucose, 5 g/l Ammoniumsulfat, 0,4 g/l Magnesiumsulfat heptahydrat, 5 g/l Monokaliumdihydrogenphosphat, 20 mg/l Eisensulfatheptahydrat, 20 mg/l Mangansulfatpentahydrat, 6 g/l Hefeextrakt, 800 mg/l l-Lysinhydrochlorid, 600 mg/l DL-Methionin, 600 mg/l DL-α,ε-Diaminopimelinsäure, 1,5 g/l Natriumchlorid, 0,75 g/l Calciumchloriddihydrat, 25 mg/l Tetracyclinhydrochlorid und 25 mg/l Chloramphenicol enthielt, in einem 1 l-Stoßfermenter geimpft, um die Kultivierung bei 34°C bei pH 6,0 durchzuführen. Mit der Anhäufung von L-Glutaminsäure sank der pH-Wert etwa eine oder zwei Stunden nach Beginn der Kultivierung auf 4,5. Danach wurde der pH-Wert der Kultur durch Zugeben von Ammoniakgas auf 4,5 eingestellt. Nachdem die ursprünglich zugegebene Glucose verbraucht war, wurden 700 g/l einer wässerigen Lösung von Glucose kontinuierlich bei einer Rate von 6 ml/h zugegeben.
Wenn die fermentative Produktion von L-Glutaminsäure wie vorstehend beschrieben fortgesetzt wurde, war die Konzentration der angehäuften L-Glutaminsäure in der Kulturbrühe etwa 14 Stunden nach Beginn der Kultivierung etwa 45 bis 55 g/l.
Zu diesem Zeitpunkt wurden L-Glutaminsäurekristalle der α-Form oder β-Form als trockene Kristalle von dem oberen Teil des Stoßfermenters in einer Menge im Bereich von 0,008 bis 1,0 g (0,022 bis 2,778 g/l bezogen auf die Menge des Mediums zu Beginn der Kultivierung) gegeben, und die Kultivierung wurde fortgesetzt und 36 Stunden nach Beginn der Kultivierung beendet. Es wurde eine erhebliche Menge von L-Glutaminsäurekristallen in dem Stoßfermenter ausgefällt. Die Kristalle wurden durch Dekantierung abgetrennt und über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Die Kristallform (Kristallgitterform) der erhaltenen getrockneten Kristalle wurde mittels Röntgenstrahlpulverbeugung untersucht. Die Ergebnisses sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse eines Kontrollexperiments, bei dem keine Kristalle während der Kultivierung zugegeben wurden, sind ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
Tabelle 1 zeigt, daß die Anhäufung von L-Glutaminsäure zum Zeitpunkt der Beendigung der Kultivierung, wenn Kristalle zugegeben worden waren, im Vergleich zu der Kultivierung, bei der keine Kristalle zugegeben wurden, erhöht war.
Es wurde auch gefunden, daß wenn L-Glutaminsäurekristalle der α-Form zugegebene werden, der Anteil der ausgefällten L-Glutaminsäurekristalle der α-Form erhöht wird. Insbesondere wurde gefunden, daß wenn die Kristalle in einer Menge von 0,2 g/l oder mehr zugegeben werden, L-Glutaminsäurekristalle der -Form in dem Medium mit guter Reproduzierbarkeit ausgefällt werden können. SEQUENZLISTE

Claims

Verfahren zur Herstellung von L-Glutaminsäure durch Fermentation, umfassend das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Produktion von L-Glutaminsäure in einem flüssigen Medium, dessen pH in dem Bereich von 3 bis 5 eingestellt ist, um zu ermöglichen, daß L-Glutaminsäure produziert und akkumuliert wird, begleitet von einer Ausfällung von L-Glutaminsäure, wobei L-Glutaminsäure-Impfkristalle zu dem Medium gegeben werden, wenn die Konzentration von L-Glutaminsäure in dem Medium niedriger als die Konzentration ist, bei welcher eine spontane Kristallisation auftritt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kristalle α-Kristalle sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die zu dem Medium gegebene Menge an Kristallen 0,2 g/l oder mehr beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Mikroorganismus zur Gattung Enterobacter gehört.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Mikroorganismus Enterobacter agglomerans ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Mikroorganismus in der Lage ist, eine Kohlenstoffquelle in einem flüssigen Medium, das die Kohlenstoffquelle und L-Glutaminsäure bei einer Sättigungskonzentration enthält, wobei das flüssige Medium einen pH im Bereich von pH 3 bis 5 aufweist, zu metabolisieren, und die Fähigkeit aufweist, L-Glutaminsäure in einer Menge zu akkumulieren, welche die Sättigungskonzentration von L-Glutaminsäure in dem flüssigen Medium bei dem pH übersteigt.