ES2246356T3 - Procedimiento para la produccion de acido l-glutamico. - Google Patents
Procedimiento para la produccion de acido l-glutamico.Info
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Abstract
Procedimiento para la producción de ácido L-glutámico mediante fermentación, que comprende cultivar un microorganismo que posee la capacidad de producir ácido L-glutámico en un medio líquido del que se ajusta el pH dentro del intervalo comprendido entre 3 y 5 con el fin de permitir la producción y acumulación de ácido Lglutámico, acompañada de la precipitación del ácido L-glutámico, en el que se añaden cristales de nucleación de ácido L-glutámico al medio cuando la concentración de ácido L-glutámico en el medio es inferior a la concentración a la que se produce la cristalización espontánea.
Description
Procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación. El ácido
L-glutámico se utiliza ampliamente como materia
prima para aderezos y similares.
El ácido L-glutámico se produce
principalmente mediante fermentación utilizando las denominadas
bacterias corineformes productoras de ácido
L-glutámico, pertenecientes a los géneros
Brevibacterium, Corynebacterium o
Microbacterium o a cepas mutantes de las mismas (Amino Acid
Fermentation, Gakkai Shuppan Center, páginas
195-215, 1986). Como procedimientos para la
producción de ácido L-glutámico mediante
fermentación a través de la utilización de otras cepas bacterianas,
es conocido un procedimiento que utiliza un microorganismo
perteneciente a los géneros Bacillus, Streptomyces,
Penicillium o similares (patente U.S. nº 3.220.929), un
procedimiento que utiliza un microorganismo perteneciente a los
géneros Pseudomonas, Arthrobacter, Serratia, Candida o
similar (patente U.S. nº 3.563.857), un procedimiento que utiliza un
microorganismo perteneciente a los géneros Bacillus, Pseudomonas,
Serratia, Aerobacter aerogenes (en la actualidad denominado
Enterobacter aerogenes) o similar (publicación de patente
japonesa (Kokoku) nº 32-9393), un procedimiento que
utiliza una cepa mutante de Escherichia coli (solicitud de
patente japonesa abierta al público (Kokai) nº
5-244970), etc. Además, los inventores de la
presente invención han propuesto un procedimiento para la producción
de ácido L-glutámico mediante la utilización de un
microorganismo perteneciente a los géneros Klebsiella,
Erwinia o Pantoea (solicitud de patente japonesa abierta
al público nº 2000-106869).
Además, se han dado a conocer diversas técnicas
para mejorar la capacidad de producción de ácido
L-glutámico mediante la intensificación de las
actividades de los enzimas biosintéticos del ácido
L-glutámico a través de la utilización de técnicas
de ADN recombinante. Por ejemplo, se ha dado a conocer que la
introducción de un gen que codifica la citrato sintasa derivado de
Escherichia coli o de Corynebacterium glutamicum
resulta efectivo en la mejora de la capacidad de producción de
ácido L-glutámico en las bacterias
Corynebacterium o Brevibacterium (publicación de
patente japonesa (Kokoku) nº 7-121228). Además, la
solicitud de patente japonesa abierta al público nº
61-268185 da a conocer una célula que alberga ADN
recombinante que contiene un gen de glutamato deshidrogenasa
derivado de bacterias Corynebacterium. Además, la solicitud
de patente japonesa abierta al público nº 63-214189
da a conocer una técnica para incrementar la capacidad de producción
de ácido L-glutámico mediante la amplificación de un
gen de la glutamato deshidrogenasa, un gen de la isocitrato
deshidrogenasa, un gen de la aconitato hidratasa y un gen de la
citrato sintasa.
Aunque la productividad de ácido
L-glutámico ha sido considerablemente incrementada
mediante el cultivo de los microorganismos anteriormente indicados o
mediante la mejora de los procedimientos de producción, resulta
necesario desarrollar procedimientos para producir más
eficientemente ácido L-glutámico a menor coste con
el fin de satisfacer el incremento adicional de la demanda en el
futuro.
Es conocido un procedimiento en el que se lleva a
cabo la fermentación a medida que el L-aminoácido
acumulado en el cultivo se cristaliza (solicitud de patente japonesa
abierta al público nº 62-288). En este
procedimiento, la concentración de L-aminoácido en
el cultivo se mantiene por debajo de determinado nivel mediante la
precipitación del L-aminoácido acumulado en el
cultivo. Específicamente, se precipitan
L-triptófano, L-tirosina o
L-leucina durante la fermentación mediante el ajuste
de la temperatura y el pH del cultivo o mediante la adición de un
tensioactivo al medio.
Aunque es conocido un procedimiento para llevar a
cabo la fermentación acompañada por la precipitación de
L-aminoácido, los aminoácidos adecuados para este
procedimiento son aquéllos que muestran una solubilidad en agua
relativamente baja, y no se conoce ningún ejemplo de aplicación del
procedimiento a aminoácidos altamente solubles en agua, tales como
el ácido L-glutámico. Además, el medio debe
presentar un pH bajo para precipitar el ácido
L-glutámico. Sin embargo, las bacterias productoras
de ácido L-glutámico, tales como las indicadas
anteriormente, no pueden crecer bajo condiciones ácidas y, por lo
tanto, la fermentación de ácido L-glutámico se lleva
a cabo bajo condiciones neutras (patentes U.S. nº 3.220.929 y nº
3.032.474; K.C. Chao & J.W. Foster, J. Bacteriol., 77, páginas
715-725 (1959)). De esta manera, no se conoce la
producción de ácido L-glutámico mediante
fermentación acompañada de precipitación. Además, es conocido que el
crecimiento de la mayoría de bacterias acidófilas es inhibido por
ácidos orgánicos, tales como el ácido acético, ácido láctico y ácido
succínico (Yasuro Oshima Ed., "Extreme Environment Microorganism
Handbook", página 231, Science Forum; R.M. Borichewski, J.
Bacteriol., 93, páginas 597-599 (1967), etc.). Por
lo tanto, se considera que muchos microorganismos son susceptibles
al ácido L-glutámico, que también es un ácido
orgánico, bajo condiciones ácidas, y no se ha dado a conocer que se
haya intentado la búsqueda de microorganismos que muestren capacidad
de producción de ácido L-glutámico bajo condiciones
ácidas.
El documento
EP-A-952 221 da a conocer un
procedimiento de producción de ácido L-glutámico
mediante fermentación por un microorganismo Enterobacter.
El documento JP nº 51020488B (Resumen) da a
conocer un procedimiento en el que se añaden cristales de nucleación
a un caldo de fermentación tras el cultivo de un microorganismo.
El documento
EP-A-1 078 989 da a conocer un
procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación que comprende el
cultivo de un microorganismo en un medio líquido del que el pH se
ajusta a un valor al que el ácido L-glutámico
precipita, con el fin de producir y acumular ácido
L-glutámico y precipitar ácido
L-glutámico en el medio.
En las circunstancias descritas anteriormente, un
objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento
para la producción de ácido L-glutámico mediante
fermentación, que se ve acompañada de la precipitación del ácido
L-glutámico.
Los inventores de la presente invención han
encontrado que, en un procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que posee la capacidad de producir
ácido L-glutámico, para permitir la producción y
acumulación de ácido L-glutámico en un medio, que se
ve acompañada de la precipitación del ácido
L-glutámico, el rendimiento de ácido
L-glutámico cuando se provoca artificialmente la
existencia de cristales antes de producirse la cristalización
espontánea, es mejor que cuando se permite que se produzca la
cristalización espontánea del ácido L-glutámico. De
esta manera, han conseguido la presente invención.
La presente invención proporciona los elementos
siguientes.
(1) Un procedimiento para producir ácido
L-glutámico mediante fermentación, que comprende
cultivar un microorganismo que posee la capacidad de producir ácido
L-glutámico en un medio líquido en el que se ajusta
el pH a un valor dentro del intervalo comprendido entre 3 y 5, con
el fin de permitir que se produzca y acumule ácido
L-glutámico, acompañado de su precipitación, en el
que se añaden cristales de nucleación de ácido glutámico al medio
cuando la concentración de ácido L-glutámico en el
medio es inferior a la concentración a la que se produce la
cristalización espontánea.
(2) El procedimiento según (1), en el que los
cristales son cristales \alpha.
(3) El procedimiento según (2), en el que la
cantidad de cristales añadida al medio es de 0,2 g/l o más.
(4) El procedimiento según cualquiera de (1) a
(3), en el que el microorganismo pertenece al género
Enterobacter.
(5) El procedimiento según (4), en el que el
microorganismo es Enterobacter agglomerans.
(6) El procedimiento según cualquiera de (1) a
(5), en el que el microorganismo puede metabolizar una fuente de
carbono en un medio líquido que contiene la fuente de carbono y
ácido L-glutámico a la concentración de saturación y
en el que el medio presenta un pH dentro del intervalo comprendido
entre 3 y 5, y que presenta una capacidad para acumular ácido
L-glutámico en una capacidad que excede la
concentración de saturación del ácido L-glutámico en
el medio líquido a dicho pH.
De acuerdo con los procedimientos de la presente
invención, puede producirse eficientemente ácido
L-glutámico. Además, en una forma de realización
preferida, pueden producirse cristales \alpha que son preferibles
como producto.
La figura 1 es una mapa de restricción de un
fragmento de ADN derivado de Enterobacter agglomerans dentro
de pTWVEK101.
La figura 2 muestra una comparación entre una
secuencia de aminoácidos deducida de una secuencia de nucleótidos de
un gen sucA derivado de Enterobacter agglomerans (SEC
ID nº 1) y aquélla derivada de Escherichia coli (parte
superior: Enterobacter agglomerans, columna: Escherichia
coli (SEC ID nº 5), lo mismo es de aplicación en las siguientes
figuras).
La figura 3 muestra una comparación entre una
secuencia de aminoácidos deducida de una secuencia de nucleótidos de
un gen sucB derivado de Enterobacter agglomerans (SEC
ID nº 2) y aquélla derivada de Escherichia coli (SEC ID nº
6).
La figura 4 muestra una comparación entre una
secuencia de aminoácidos deducida de una secuencia de nucleótidos de
un gen sucC derivada de Enterobacter agglomerans (SEC
ID nº 3) y la derivada de Escherichia coli (SEC ID nº 7).
La figura 5 muestra una comparación entre una
secuencia de aminoácidos deducida de una secuencia de nucleótidos de
un gen sdhB derivado de Enterobacter agglomerans (SEC
ID nº 4) y aquélla derivada de Escherichia coli (SEC ID nº
8).
La figura 6 muestra la construcción de un
plásmido pMWCPG que contiene un gen gltA, un gen ppc y
un gen gdhA.
La figura 7 muestra la construcción de un
plásmido RSF-Tet que contiene un origen de
replicación de un plásmido de amplio rango de huésped RSF1010 y un
gen de resistencia a la tetraciclina.
La figura 8 muestra la construcción de un
plásmido RSFCPG que contiene un origen de replicación de un plásmido
de amplio rango de huésped RSF1010, un gen de resistencia a la
tetraciclina, un gen gltA, un gen ppc y un gen
gdhA.
La figura 9 muestra la construcción de un
plásmido pSTVCB que contiene un gen gltA.
A continuación, se explicará en detalle la
presente invención.
El procedimiento de producción de acuerdo con la
presente invención es un procedimiento para producir ácido
L-glutámico mediante fermentación, que comprende el
cultivo de un microorganismo que posee la capacidad de producir
ácido L-glutámico en un medio líquido en el que se
ajusta el pH a un valor dentro del intervalo comprendido entre 3 y
5, con el fin de permitir la producción y acumulación de ácido
L-glutámico, que se ve acompañada de la
precipitación del ácido L-glutámico, en el que se
añaden cristales de nucleación de ácido L-glutámico
al medio cuando la concentración de ácido
L-glutámico en el medio es inferior a la
concentración a la que se produce la cristalización
espontánea.
espontánea.
El término "cristalización espontánea"
utilizado en la presente memoria significa que, a causa de la
acumulación de ácido L-glutámico debida al
microorganismo que posee la capacidad de producir ácido
L-glutámico, la concentración de ácido
L-glutámico en el medio excede la concentración de
saturación y el ácido L-glutámico precipita
espontáneamente en el medio.
En la presente invención, se añaden cristales de
nucleación de ácido L-glutámico al medio
líquido.
La cantidad de cristales añadidos al medio
habitualmente está comprendida entre 0,01 y 10 g/l. El momento en el
que se añaden los cristales preferentemente es cuando la cantidad
acumulada de ácido L-glutámico en el medio se
incrementa hasta aproximadamente la concentración de saturación (por
ejemplo, 25 g/l o más a pH 4,5). La cantidad de cristales existentes
en el medio y la concentración de ácido L-glutámico
pueden determinarse mediante procedimientos conocidos por los
expertos en la materia. La cantidad existente de cristales de ácido
L-glutámico puede determinarse dejando reposar el
medio y aislando los cristales del medio mediante decantación. La
concentración de ácido L-glutámico en el medio se
refiere a la concentración de ácido L-glutámico
disuelto. Cuando los cristales precipitan en el medio, la
concentración es una concentración determinada en una solución
clarificada que se ha obtenido mediante la separación de los sólidos
por centrifugación (o filtración).
Respecto a los cristales de ácido
L-glutámico, existen cristales de forma \alpha y
de forma \beta (H. Takahashi, T. Takenishi, N. Nagashima, Bull.
Chem. Soc. Japan, 35, 923 (1962); J. D. Bernal, Z. Krist., 78, 363
(1931); S. Hirokawa, Acta Cryst., 8, 637 (1955)). Cuando se desee
obtener la forma \alpha de los cristales, los cristales añadidos
preferentemente serán de la forma \alpha.
La cantidad preferida de cristales varía
dependiendo de condiciones tales como la forma de cristalización de
los cristales. Si los cristales son de la forma \alpha,
habitualmente es de 0,2 g/l o más. Si es superior a esta
concentración, pueden obtenerse cristales de forma \alpha con
buena reproducibilidad. Debido a su forma, los cristales de forma
\alpha pueden ser más fácilmente manipulados en comparación con
los cristales de forma \beta.
El microorganismo que posee la capacidad de
producir ácido L-glutámico utilizado en el
procedimiento de producción de la presente invención es un
microorganismo que acumula una cantidad significativa de ácido
L-glutámico en un medio cuando se cultiva en dicho
medio. Entre los ejemplos del mismo se incluyen microorganismos que
pertenecen al género Enterobacter. Es preferido
Enterobacter agglomerans.
Además, el microorganismo que posee la capacidad
de producir ácido L-glutámico utilizado en el
procedimiento de producción de la presente invención preferentemente
es un microorganismo que puede metabolizar una fuente de carbono en
un medio líquido que contiene ácido L-glutámico a
una concentración de saturación y la fuente de carbono, al pH
específico, y que posee una capacidad de acumular ácido
L-glutámico en una cantidad superior a la
concentración de saturación de ácido L-glutámico en
el medio líquido al pH anteriormente indicado (en lo sucesivo
también denominado "microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico"). El pH específico anteriormente
indicado está comprendido entre 3 y 5, al que el ácido
L-glutámico precipita en el medio.
La "concentración de saturación" se refiere
a una concentración de ácido L-glutámico disuelta en
el medio líquido cuando el medio líquido se encuentra saturado con
ácido L-glutámico.
Cuando se utiliza un microorganismo acumulador de
ácido L-glutámico, el pH adecuado para la producción
de ácido L-glutámico preferentemente es un pH al que
el ácido L-glutámico precipita en el medio. Llevando
a cabo el cultivo a este pH, se produce y acumula ácido
L-glutámico en el medio, que se ve acompañado por su
precipi-
tación.
tación.
El microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico puede obtenerse de la manera siguiente.
Una muestra que contiene microorganismos se inocula en un medio
líquido que contiene ácido L-glutámico a una
concentración de saturación y una fuente de carbono, a un pH
específico, y se selecciona una cepa que metabolice la fuente de
carbono. Aunque el pH específico no está particularmente limitado,
habitualmente es de 5,0 o menos, preferentemente de aproximadamente
4,5 o menos, todavía más preferentemente aproximadamente 4,3 o
menos. El microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico se utiliza para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación, que se ve
acompañada de la precipitación del ácido
L-glutámico. Si el pH es demasiado elevado, se hace
difícil conseguir que el microorganismo produzca ácido
L-glutámico en una cantidad suficiente para la
precipitación. Por lo tanto, el pH preferentemente se encuentra
dentro del intervalo anteriormente indicado.
Si el pH de una solución acuosa que contiene
ácido L-glutámico se reduce, la solubilidad del
ácido L-glutámico cae significativamente hasta cerca
del pKa del grupo \gamma-carboxilo (4,25, 25ºC).
La solubilidad alcanza su mínimo en el punto isoeléctrico (pH 3,2) y
el ácido L-glutámico que excede la cantidad
correspondiente a la concentración de saturación, precipita. Aunque
depende de la composición del medio, el ácido
L-glutámico se disuelve en una cantidad comprendida
entre 10 y 20 g/l a pH 3,2, entre 30 y 40 g/l a pH 4,0 y entre 50 y
60 g/l a pH 4,7, a aproximadamente 30ºC. De acuerdo con la invención
el pH no se ajusta a valores inferiores a 3,0 debido a que el efecto
de precipitación del ácido L-glutámico alcanza su
límite superior cuando el pH es inferior a determinado
valor.
valor.
Además, la expresión de que un microorganismo
"puede metabolizar una fuente de carbono" significa que puede
proliferar o que puede consumir una fuente de carbono aunque no
pueda proliferar, es decir, indica que cataboliza una fuente de
carbono, tal como azúcares o ácidos orgánicos. Específicamente, por
ejemplo, si un microorganismo prolifera cuando se cultiva en un
medio líquido que contiene ácido L-glutámico a una
concentración de saturación a un pH comprendido entre 5,0 y 4,0,
preferentemente a un pH comprendido entre 4,5 y 4,0, más
preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y 4,0, particularmente
preferido pH 4,0, a una temperatura apropiada, por ejemplo 28ºC,
37ºC ó 50ºC, durante 2 a 4 días, este microorganismo puede
metabolizar la fuente de carbono presente en el medio. Además, por
ejemplo, si un microorganismo consume una fuente de carbono aunque
el microorganismo no prolifere, cuando se cultiva en un medio
líquido sintético que contiene ácido L-glutámico a
una concentración de saturación a un pH comprendido entre 5,0 y 4,0,
preferentemente a un pH comprendido entre 4,5 y 4,0, más
preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y 4,0, particularmente
preferentemente a un pH 4,0, a una temperatura apropiada, por
ejemplo 28ºC, 37ºC ó 50ºC, durante 2 a 4 días, el microorganismo es
un microorganismo que puede metabolizar la fuente de carbono
presente en el medio.
El microorganismo que puede metabolizar una
fuente de carbono incluye un microorganismo que puede crecer en el
medio líquido anteriormente indicado.
Además, la expresión de que un microorganismo
"puede crecer" significa que puede proliferar o que puede
producir ácido L-glutámico aunque no pueda
proliferar. Específicamente, por ejemplo, si un microorganismo
prolifera cuando se cultiva en un medio líquido que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación a un
pH comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH comprendido
entre 4,5 y 4,0, más preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y
4,0, particularmente preferido a un pH de 4,0, a una temperatura
apropiada, por ejemplo 28ºC, 37ºC ó 50ºC, durante 2 a 4 días, este
microorganismo puede crecer en el medio. Además, por ejemplo, si un
microorganismo incrementa la cantidad de ácido
L-glutámico en un medio líquido sintético aunque el
microorganismo no prolifere, cuando el microorganismo se cultiva en
el medio líquido sintético que contiene ácido
L-glutámico a una concentración de saturación a un
pH comprendido entre 5,0 y 4,0, preferentemente a un pH comprendido
entre 4,5 y 4,0, más preferentemente a un pH comprendido entre 4,3 y
4,0, particularmente preferentemente a pH 4,0, a una temperatura
apropiada, por ejemplo 28ºC, 37ºC o 50ºC, durante 2 a 4 días, este
microorganismo es un microorganismo que puede crecer en el
medio.
La selección descrita anteriormente puede
repetirse dos o más veces bajo las mismas condiciones o cambiando el
pH o la concentración del ácido L-glutámico. Puede
llevarse a cabo una selección para una etapa temprana en un medio
que contenga ácido L-glutámico a una concentración
inferior a la de saturación y seguidamente llevarse a cabo una
selección posterior en un medio que contenga ácido
L-glutámico a una concentración de saturación.
Además, pueden seleccionarse cepas con propiedades favorables, tales
como una tasa de proliferación superior.
El microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico es un microorganismo que posee una
capacidad de acumular ácido L-glutámico en una
cantidad que excede la cantidad correspondiente a la concentración
de saturación de ácido L-glutámico en un medio
líquido, además de las propiedades indicadas anteriormente. El pH
del medio líquido anteriormente indicado preferentemente es el mismo
o similar al del medio utilizado para seleccionar un microorganismo
que posea las propiedades anteriormente indicadas. Habitualmente, un
microorganismo se hace susceptible al ácido
L-glutámico a una concentración elevada a medida que
el pH es más bajo. Por lo tanto, se prefiere que el pH no sea
excesivamente bajo en vista de la resistencia al ácido
L-glutámico, aunque se prefiere un pH bajo en vista
de la producción de ácido L-glutámico acompañada de
su precipitación. Con el fin de satisfacer estas condiciones, el pH
puede estar en el intervalo comprendido entre 3 y 5, preferentemente
entre 4 y 5, más preferentemente entre 4 y 4,7, todavía más
preferentemente entre 4 y 4,5, particularmente preferentemente entre
4,0
y 4,3.
y 4,3.
Como microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico o como materiales de cultivo del mismo,
pueden indicarse, por ejemplo, los microorganismos que pertenecen a
los géneros Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Pantoea, Erwinia,
Escherichia, Corynebacterium, Alicyclobacillus, Bacillus,
Saccharomyces o similar. Entre estos, los microorganismos que
pertenecen al género Enterobacter son preferidos. En lo
sucesivo, el microorganismo de la presente invención se explicará
principalmente para los microorganismos que pertenecen al género
Enterobacter. Sin embargo, el microorganismo no está limitado
a los que pertenecen al género Enterobacter y de manera
similar pueden utilizarse los que pertenecen a otros géneros.
Como microorganismo perteneciente a
Enterobacter, puede indicarse específicamente Enterobacter
agglomerans, preferentemente la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans. Esta cepa ha sido aislada del suelo en
Iwata-shi, Shizuoka, Japón, como cepa que puede
proliferar en un medio que contiene ácido
L-glutámico y una fuente de carbono a pH bajo.
A continuación se indican las propiedades
fisiológicas de AJ13355:
- (1)
- Tinción Gram: negativa
- (2)
- Comportamiento frente al oxígeno: anaeróbico facultativa
- (3)
- Catalasa: positiva
- (4)
- Oxidasa: negativa
- (5)
- Capacidad de reducción del nitrato: negativa
- (6)
- Prueba de Voges-Proskauer: positiva
- (7)
- Prueba del rojo de metilo: negativa
- (8)
- Ureasa: negativa
- (9)
- Producción de indol: positiva
- (10)
- Motilidad: mótil
- (11)
- Producción de H_{2}S en medio TSI: débilmente activa
- (12)
- \beta-Galactosidasa: positiva
- (13)
- Propiedad de asimilación de sacáridos:
- Arabinosa: positiva
- Sacarosa: positiva
- Lactosa: positiva
- Xilosa: positiva
- Sorbitol: positiva
- Inositol: positiva
- Trehalosa: positiva
- Maltosa: positiva
- Glucosa: positiva
- Adonitol: negativa
- Rafinosa: positiva
- Salicina: negativa
- Melibiosa: positiva
- (14)
- Propiedad de asimilación de la glicerosa: positiva
- (15)
- Propiedad de asimilación de ácidos orgánicos:
- Ácido cítrico: positiva
- Ácido tartárico: positiva
- Ácido glucónico: positiva
- Ácido acético: positiva
- Ácido malónico: positiva
- (16)
- Arginina deshidratasa: negativa
- (17)
- Ornitina descarboxilasa: negativa
- (18)
- Lisina descarboxilasa: negativa
- (19)
- Fenilalanina desaminasa: negativa
- (20)
- Formación de pigmento: amarillo
- (21)
- Capacidad de licuefacción de la gelatina: positiva
- (22)
- pH de crecimiento: crecimiento posible a pH 4, crecimiento bueno a pH comprendido entre 4,5 y 7.
- (23)
- Temperatura de crecimiento: crecimiento bueno a 25ºC, crecimiento bueno a 30ºC, crecimiento bueno a 37ºC, crecimiento posible a 42ºC, crecimiento imposible a 45ºC.
A partir de estas propiedades bacteriológicas, se
determinó que AJ13355 era Enterobacter agglomerans.
Se depositó la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans en el National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (en la
actualidad International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology) el 19 de
febrero de 1998 y recibió el número de acceso FERM
P-16644. A continuación se transfirió a un depósito
internacional bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, el 11
de enero de 1999, recibiendo el número de acceso FERM
BP-6614.
El microorganismo acumulador de ácido
L-glutámico puede ser un microorganismo que
originariamente presente la capacidad de producción de ácido
L-glutámico o uno que posea una capacidad de
producción de ácido L-glutámico conferida o
intensificada mediante cultivo a través de la utilización de un
tratamiento de mutagénesis, de técnicas de ADN recombinante o
similar.
La capacidad de producción de ácido
L-glutámico puede ser conferida o intensificada
mediante, por ejemplo, el incremento de la actividad de un enzima
que cataliza una reacción para la biosíntesis del ácido
L-glutámico. La capacidad de producción del ácido
L-glutámico también puede ser intensificada mediante
la reducción o eliminación de la actividad de un enzima que cataliza
una reacción que se separa de la ruta biosintética del ácido
L-glutámico y genera un compuesto diferente del
mismo.
Como ejemplos de enzimas que catalizan la
reacción para la biosíntesis del ácido L-glutámico,
pueden indicarse: glutamato deshidrogenasa (en lo sucesivo también
denominada "GDH"), glutamina sintetasa, glutamato sintasa,
isocitrato deshidrogenasa, aconitato hidratasa, citrato sintasa (en
lo sucesivo también denominada "CS"), foesfoenolpiruvato
carboxilasa (en lo sucesivo también denominada "PEPC"),
piruvato deshidrogenasa, piruvato quinasa, enolasa,
fosfogliceromutasa, fosfoglicerato quinasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, triosafosfato isomerasa, fructosa bifosfato
aldolasa, fosfofructoquinasa, glucosa fosfato isomerasa, y
similares. Entre estos enzimas, uno, dos o tres de entre CS, PEPC y
GDH son preferidos. Además, se prefiere que se intensifiquen las
actividades de la totalidad de los tres enzimas, CS, PEPC y GDH, en
el microorganismo acumulador de ácido L-glutámico.
En particular, se prefiere la CS de Brevibacterium
lactofermentum, debido a que no adolece de la inhibición por
parte del ácido \alpha-cetoglutárico, del ácido
L-glutámico y del NADH.
Con el fin de intensificar las actividades de CS,
PEPC o GDH, por ejemplo puede clonarse un gen que codifique CS, PEPC
o GDH en un plásmido apropiado y puede transformarse un
microorganismo huésped con el plásmido obtenido. Se incrementa el
número de copias del gen que codifica CS, PEPC o GDH (en lo sucesivo
abreviado como "gen gltA", "gen ppc" y
"gen gdhA", respectivamente) en las células
transformadas de la cepa, resultando en el incremento de las
actividades de CS, PEPC o GDH.
Se introducen los genes clonados gltA,
ppc y gdhA en la cepa madre inicial anteriormente
indicada, solos o en combinación con dos o tres tipos arbitrarios de
los mismos. Cuando se introducen dos o tres tipos de los genes,
pueden clonarse dos o tres tipos de los genes en un tipo de plásmido
e introducirse en el huésped, o clonarse separadamente en dos o tres
tipos de plásmido que pueden coexistir e introducirse en el
huésped.
Pueden introducirse en el mismo huésped dos o más
tipos de genes que codifiquen un enzima del mismo tipo pero
derivados de diferentes microorganismos.
Los plásmidos descritos anteriormente no están
particularmente limitados, con la condición de que sean
autónomamente replicables en una célula de un microorganismo
perteneciente a, por ejemplo, el género Enterobacter. Sin
embargo, pueden indicarse, por ejemplo, pUC19, pUC18, pBR322,
pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219,
pMW218, pACYC177 y pACYC184. Aparte de estos, también pueden
utilizarse vectores de ADN fágico.
La transformación puede llevarse a cabo mediante,
por ejemplo, el procedimiento de D.M. Morrison (Methods in
Enzymology, 68, 326 (1979)), procedimiento en el que se incrementa
la permeabilidad de las células bacterianas receptoras del ADN
mediante el tratamiento de las células con cloruro de calcio (Mandel
M. e Higa A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)) o mediante
electroporación (Miller J.H., "A Short Course in Bacterial
Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
1992).
La actividad de CS, PEPC o GDH también puede
incrementarse permitiendo la presencia de copias múltiples de los
genes gltA, ppc o gdhA en el ADN cromosómico de
la cepa madre inicial anteriormente indicada que será huésped. Con
el fin de introducir copias múltiples de los genes gltA,
ppc o gdhA en el ADN cromosómico de un microorganismo
perteneciente al género Enterobacter o similar, puede
utilizarse una secuencia del cual esté presente en copias múltiples
en el ADN cromosómico, tal como ADN repetitivo y repeticiones
invertidas presentes en el extremo terminal de un elemento
transponible. Alternativamente, pueden introducirse copias múltiples
de los genes en el ADN cromosómico mediante la utilización de la
transferencia de un trasposón que contiene los genes gltA,
ppc o gdhA. Como resultado, se incrementa el número de
copias de los genes gltA, ppc o gdhA en una
célula de una cepa transformada y de esta manera se incrementa la
actividad de CS, PEPC o GDH.
Como organismos utilizados como fuente de los
genes gltA, ppc o gdhA, de los que se
incrementará el número de copias, puede utilizarse cualquier
organismo con la condición de que presente actividad de CS, PEPC o
GDH. Entre otros, las bacterias, que son procariotas, por ejemplo se
prefieren los pertenecientes a los géneros Enterobacter,
Klebsiella, Erwinia, Pantoea, Serratia, Escherichia,
Corynebacterium, Brevibacterium o Bacillus. Como ejemplos
específicos, pueden indicarse Escherichia coli y
Brevibacterium lactofermentum. Los genes gltA,
ppc y gdhA pueden obtenerse a partir de ADN
cromosómico de los microorganismos indicados anteriormente.
Los genes gltA, ppc y gdhA
pueden obtenerse mediante la utilización de una cepa mutante que sea
deficiente en la actividad de CS, PEPC o GDH para aislar un
fragmento de ADN que suplemente su auxotrofia a partir del ADN
cromosómico del microorganismo anteriormente indicado. Además,
debido a que las secuencias de nucleótidos de estos genes
procedentes de las bacterias Escherichia y Corynebacterium
ya han sido elucidadas (Biochemistry, 22, páginas
5243-5249 (1983); J. Biochem., 95, páginas
909-916 (1984); Gene, 27, páginas
193-199 (1984); Microbiology, 140, páginas
1817-1828 (1994); Mol. Gen. Genet., 218, páginas
330-339 (1989); Molecular Microbiology, 6, páginas
317-326 (1992)), también pueden obtenerse mediante
PCR utilizando cebadores sintetizados a partir de cada secuencia de
nucleótidos y el ADN cromosómico como molde.
La actividad de CS, PEPC o GDH también puede
incrementarse intensificando la expresión de los genes gltA,
ppc o gdhA, además de la amplificación anteriormente
indicada de los genes. Por ejemplo, puede intensificarse la
expresión sustituyendo un promotor para los genes gltA,
ppc o gdhA con otro promotor más fuerte. Por ejemplo,
son conocidos como promotores fuertes, los promotores lac,
trp, trc, tac, y P_{R} y P_{L} del fago
lambda. Los genes gltA, ppc y gdhA, de los que
se sustituye el promotor, se clonan en un plásmido y se introducen
en el ADN cromosómico del microorganismo huésped mediante la
utilización de ADN repetitivo, repeticiones invertidas, trasposones
o similar.
Las actividades de CS, PEPC o GDH también pueden
incrementarse mediante la sustitución del promotor del gen
gltA, ppc o gdhA en el cromosoma con otro
promotor más fuerte (ver el documento WO nº 87/03006 y la solicitud
de patente japonesa abierta al público nº
61-268183), o mediante la inserción de un promotor
fuerte corriente arriba de la secuencia codificante de cada gen (ver
Gene, 29, páginas 231-241 (1984)). Específicamente,
puede llevarse a cabo la recombinación homóloga entre el gen
gltA, ppc o gdhA, del que se sustituye su
promotor por uno más fuerte o con ADN que contiene una parte del
mismo y el gen cromosómico correspondiente.
Entre los ejemplos del enzima que cataliza la
reacción que se separa de la ruta biosintética del ácido
L-glutámico y genera un compuesto diferente del
ácido L-glutámico se incluyen:
\alpha-cetoglutarato deshidrogenasa (en lo
sucesivo también denominada "\alphaKGDH"), isocitrato liasa,
fosfato acetiltransferasa, acetato quinasa, ácido acetohidroxi
sintasa, acetolactato sintasa, formato acetiltransferasa, lactato
deshidrogenasa, glutamato descarboxilasa y
L-pirrolina deshidrogenasa. Entre estos enzimas, se
prefiere la \alphaKGDH.
Con el fin de reducir o eliminar las actividades
de los enzimas anteriormente indicados en un microorganismo
perteneciente al género Enterobacter o similar, para reducir
o eliminar la actividad intracelular de los enzimas pueden
introducirse mutaciones en los genes de los enzimas anteriormente
indicados mediante un procedimiento habitual de tratamiento de
mutagénesis o mediante un procedimiento de ingeniería genética.
Entre los ejemplos del procedimiento de
tratamiento de mutagénesis se incluyen, por ejemplo, procedimientos
que utilizan la irradiación con rayos X o con rayos ultravioleta y
los procedimientos que utilizan el tratamiento con un agente
mutagénico, tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
El sitio de un gen en el que se introduce una mutación puede estar
situado en una región codificante que codifique una proteína
enzimática o una región de regulación de la expresión, tal como un
promotor.
Entre los ejemplos de los procedimientos de
ingeniería genética se incluyen, por ejemplo, procedimientos que
utilizan la recombinación genética, la transducción y la fusión
celular. Por ejemplo, se inserta un gen de resistencia a un fármaco
en un gen diana clonado para preparar un gen que ha perdido su
función (un gen defectivo). Posteriormente, este gen defectivo se
introduce en una célula de un microorganismo huésped y el gen diana
en el cromosoma se sustituye con el gen defectivo anteriormente
indicado utilizando recombinación homóloga (disrupción del gen).
La reducción o deficiencia de la actividad
intracelular del enzima diana y el grado de reducción de la
actividad pueden confirmarse midiendo la actividad enzimática de un
extracto celular o de una fracción purificada del mismo obtenida a
partir de una cepa candidata y comparándola con la obtenida con una
cepa salvaje. Por ejemplo, puede medirse la actividad de
\alphaKGDH mediante el procedimiento de Reed et al. (Reed
L.J. y Mukherjee B.B., Methods in Enzymology, 13, páginas
55-61 (1969)).
Dependiendo del enzima diana, puede seleccionarse
una cepa mutante diana a partir de un fenotipo de la cepa mutante.
Por ejemplo, una cepa mutante en la que la actividad \alphaKGDH ha
sido eliminada o reducida no puede proliferar y muestra una
proliferación marcadamente reducida en un medio mínimo que contiene
glucosa o en un medio mínimo que contiene ácido acético o ácido
L-glutámico como única fuente de carbono bajo
condiciones de cultivo aeróbicas. Sin embargo, se consigue la
proliferación normal incluso bajo las mismas condiciones mediante la
adición de ácido succínico o lisina, metionina y ácido
diaminopimélico a un medio mínimo que contiene glucosa. Mediante la
utilización de estos fenómenos como indicadores, puede seleccionarse
una cepa mutante con actividad reducida o actividad deficiente de
\alphaKGDH.
En el documento WO nº 95/34672 se da a conocer en
detalle un procedimiento para la preparación de una cepa deficiente
en el gen \alphaKGDH de Brevibacterium lactofermentum
mediante la utilización de recombinación homóloga. Pueden aplicarse
procedimientos similares a otros microorganismos.
Además, técnicas tales como el clonado de genes y
la digestión y ligación de ADN, y la transformación se describen en
detalle en Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring Harbor
Press (1989), etc.
Como ejemplo específico de una cepa mutante
deficiente en actividad \alphaKGDH o con actividad reducida de
\alphaKGDH obtenida tal como se ha descrito anteriormente, puede
indicarse la cepa Enterobacter agglomerans AJ13356. Se ha
depositado Enterobacter agglomerans AJ13356 en el National
Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency
of Industrial Science and Technology, Ministry of International
Trade and Industry (en la actualidad, International Patent Organism
Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology) el 19 de febrero de 1998, recibiendo el número de acceso
FERM-P16645. A continuación, se transfirió a un
depósito internacional bajo las disposiciones del Tratado de
Budapest, el 11 de enero de 1999, recibiendo el número de acceso
FERM BP-6615. La cepa AJ13356 de Enterobacter
agglomerans es deficiente en actividad de \alphaKGDH como
resultado de la disrupción del gen de la subunidad
\alphaKGDH-E1 (sucA).
Cuando Enterobacter agglomerans, que
constituye un ejemplo del microorganismo utilizado en la presente
invención, se cultiva en un medio que contiene un sacárido, se
secreta moco extracelularmente, resultando ocasionalmente en una
baja eficiencia operativa. Por lo tanto, cuando se utiliza
Enterobacter agglomerans que posee dicha propiedad de
secreción de moco, es preferible utilizar una cepa mutante que
secrete menos moco en comparación con una cepa salvaje. Entre los
ejemplos de tratamiento de mutagénesis se incluyen, por ejemplo,
procedimientos que utilizan irradiación con rayos X o con rayos
ultravioleta y procedimientos que utilizan el tratamiento con un
agente mutagénico, tal como
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina.
Puede seleccionarse una cepa mutante con secreción de moco reducida
mediante la inoculación de células bacterianas mutagenizadas en un
medio que contenga un sacárido, por ejemplo, una placa con medio LB
que contenga 5 g/l de glucosa, cultivándolas con inclinación de la
placa de aproximadamente 45 grados y seleccionando una colonia que
no muestre un flujo de moco.
En la presente invención, la producción o
intensificación de la capacidad de producir ácido
L-glutámico y la producción de otras propiedades
favorables, tales como la mutación para una menor secreción de moco,
descrita anteriormente, pueden llevarse a cabo en un orden
arbitrario.
Mediante el cultivo del microorganismo que posee
la capacidad de producir ácido L-glutámico en un
medio líquido que se ajusta a una condición de pH que permita la
precipitación del ácido L-glutámico, puede
producirse ácido L-glutámico y acumularse,
acompañado de su precipitación en el medio.
Además, resulta posible que el cultivo se inicie
a un pH neutro y el pH alcance una condición que permita la
precipitación del ácido L-glutámico cuando se haya
completado el cultivo.
La "condición que permite la precipitación de
ácido L-glutámico" a la que se hace referencia en
la presente memoria se refiere a una condición que permite la
precipitación del ácido L-glutámico cuando el
microorganismo anteriormente indicado produce y acumula ácido
L-glutámico. Por ejemplo, el pH está comprendido
entre 3 y 5 cuando el microorganismo es una bacteria
Enterobacter.
El microorganismo puede cultivarse inicialmente a
un pH adecuado para el crecimiento del mismo y después cultivarse
bajo condiciones que permitan la precipitación del ácido
L-glutámico. Por ejemplo, cuando el medio contenga
una fuente de sacárido que el microorganismo no pueda asimilar bajo
las condiciones que permiten la precipitación del ácido
L-glutámico, o contenga un ácido orgánico que inhibe
el crecimiento del microorganismo bajo las condiciones que permiten
la precipitación del ácido L-glutámico, el
microorganismo puede cultivarse en unas condiciones bajo las que
pueda asimilar el sacárido o bajo las que el crecimiento del
microorganismo no se vea inhibido por el ácido orgánico, permitiendo
que el microorganismo consuma el sacárido o el ácido orgánico, y
después cultivarse bajo las condiciones que permiten la
precipitación del ácido L-glutámico.
Como medios utilizados para el cultivo, puede
utilizarse el medio nutritivo habitual que contiene una fuente de
carbono, una fuente de nitrógeno, sales minerales y nutrientes traza
orgánicos, tales como aminoácidos y vitaminas según resulte
necesario, con la condición de que se ajuste el pH de manera que se
satisfagan las condiciones predeterminadas. Puede utilizarse un
medio sintético o un medio natural. La fuente de carbono y la fuente
de nitrógeno utilizadas en el medio pueden ser cualesquiera, con la
condición de que puedan ser utilizadas por la cepa a cultivar.
Como fuente de carbono, se utilizan sacáridos,
tales como glucosa, glicerol, fructosa, sacarosa, maltosa, manosa,
galactosa, hidrolisado de almidón y melaza. Además, pueden
utilizarse ácidos orgánicos, tales como ácido acético y ácido
cítrico, cada uno por sí solo o en combinación con otra fuente de
carbono.
Como fuente de nitrógeno, se utilizan amonio,
sales amónicas, tales como sulfato amónico, carbonato amónico,
cloruro amónico, fosfato amónico y acetato amónico, nitratos y
similares.
Como nutrientes traza orgánicos, se utilizan
aminoácidos, vitaminas, ácidos grasos, ácidos nucleicos, aquéllos
que contiene estas sustancias, tales como peptona, ácido casamino,
extracto de levadura y productos de descomposición de la proteína de
soja. Cuando se utilice una cepa auxotrófica mutante que requiera un
aminoácido o similar para el metabolismo o para el crecimiento, debe
suplementarse con el nutriente requerido.
Como sales minerales, se utilizan fosfatos, sales
de magnesio, sales de calcio, sales de hierro, sales de manganeso,
etc.
El cultivo habitualmente se lleva a cabo con
aireación bajo las condiciones de una temperatura de cultivo
comprendida entre 20ºC y 42ºC y a un pH comprendido entre 3 y 5,
preferentemente entre 4 y 5, más preferentemente entre 4 y 4,7,
particularmente preferentemente entre 4 y 4,5. Habitualmente se
acumula una cantidad considerable de ácido
L-glutámico tras un cultivo de duración aproximada
entre 10 horas y 4 días. Una parte del ácido
L-glutámico acumulado que excede la concentración de
saturación precipita en el medio.
Tras completar el cultivo, el ácido
L-glutámico precipitado en el cultivo puede
recolectarse mediante centrifugación, filtración o similar. El ácido
L-glutámico disuelto en el medio también puede
recolectarse mediante procedimientos conocidos. Por ejemplo, el
ácido L-glutámico puede aislarse concentrando el
caldo de cultivo con el fin de cristalizarlo o aislarse mediante
cromatografía de intercambio iónico o similar. También resulta
posible cristalizar el ácido L-glutámico disuelto en
el medio y después recolectar el ácido L-glutámico
precipitado en el caldo de cultivo junto con el ácido
L-glutámico cristalizado.
Cuando precipita el ácido
L-glutámico que excede la concentración de
saturación, la concentración de ácido L-glutámico
disuelto en el medio se mantiene a un nivel constante. Por lo tanto,
puede reducirse la influencia sobre los microorganismos del ácido
L-glutámico a concentración elevada. De acuerdo con
lo anterior, también resulta posible cultivar un microorganismo que
posea una capacidad adicionalmente mejorada de producir ácido
L-glutámico. Además, debido a que el ácido
L-glutámico se precipita en forma de cristales, la
acidificación del caldo de cultivo por la acumulación del ácido
L-glutámico queda suprimida y, por lo tanto, la
cantidad de álcali utilizada para mantener el pH del cultivo puede
reducirse significativamente. Partiendo de la premisa de que la
presente invención no pretende estar respaldada teóricamente, el
motivo por el que el rendimiento de ácido
L-glutámico se mejora llevando a cabo una operación
que provoca que existan cristales de ácido
L-glutámico en el medio cuando la concentración de
ácido L-glutámico en el medio es inferior a la
concentración a la que se produce la cristalización espontánea, en
el caso de que el ácido L-glutámico precipite tal
como se ha descrito anteriormente, se considera de la manera
siguiente.
En la fermentación del ácido
L-glutámico acompañada por su precipitación, la
producción del ácido L-glutámico tiende a alcanzar
su límite cuando se produce la cristalización espontánea. Se supone
que esto es debido a que la concentración de ácido
L-glutámico es máxima sobre la superficie de las
células cuando ocurre la cristalización espontánea y se produce la
precipitación sobre las superficies, dificultando de esta manera el
movimiento de las sustancias alrededor de la membrana, reduciendo la
actividad de las bacterias. Si la existencia de cristales se provoca
artificialmente antes de que se produzca la cristalización
espontánea, los cristales sirven de cristales de nucleación que
provocan la precipitación sobre la superficie de los cristales,
evitando de esta manera que se reduzca la actividad de las
bacterias.
A continuación, la presente invención se
explicará con mayor detalle haciendo referencia a los ejemplos
siguientes. En los ejemplos, los aminoácidos son
L-aminoácidos a menos que se indique lo
contrario.
Ejemplo de referencia
1
La selección de un microorganismo que presentase
resistencia al ácido L-glutámico en ambiente ácido
se llevó a cabo de la manera siguiente. Se suspendió un (1) g de
cada una de aproximadamente 500 muestras obtenidas del medio
natural, incluyendo de suelo, frutas, cuerpos de plantas, agua de
río, etc., en 5 ml de agua esterilizada y se recubrieron 200 \mul
de la misma sobre 20 ml de medio sólido con el pH ajustado a 4,0 con
HCl. La composición del medio era la siguiente: 3 g/l de glucosa, 1
g/l de sulfato amónico, 0,2 g/l de sulfato de magnesio heptahidrato,
0,5 g/l de dihidrogenofosfato de potasio, 0,2 g/l de cloruro sódico,
0,1 g/l de cloruro de calcio dihidrato, 0,01 g/l de sulfato ferroso
heptahidrato, 0,01 g/l de sulfato de manganeso tetrahidrato, 0,72
mg/l de sulfato de cinc dihidrato, 0,64 mg/l de sulfato de cobre
pentahidrato, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto hexahidrato, 0,4 mg/l
de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato sódico dihidrato, 50 \mug/l
de biotina, 50 \mug/l de pantotenato de calcio, 50 \mug/l de
ácido fólico, 50 \mug/l de inositol, 50 \mug/l de niacina, 50
\mug/l de ácido p-aminobenzoico, 50 \mug/l de
hidrocloruro de piridoxina, 50 \mug/l de riboflavina, 50 \mug/l
de hidrocloruro de tiamina, 50 mg/l de cicloheximida y 20 g/l de
ágar.
Los medios en placa con las muestras
anteriormente indicadas se incubaron a 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 2 a
4 días y se obtuvieron 378 cepas formadoras de colonias.
Posteriormente, cada una de las cepas obtenidas
tal como se ha descrito anteriormente se inocularon en una probeta
de ensayo de 16,5 cm de longitud y 14 mm de diámetro que contenía 3
ml de medio líquido (ajustado a pH 4,0 con HCl) que contenía una
concentración de saturación de ácido L-glutámico y
se cultivaron a 28ºC, 37ºC o 50ºC durante 24 horas a 3 días bajo
agitación. A continuación, se seleccionaron las cepas que habían
crecido. La composición del medio anteriormente indicado era la
siguiente: 40 g/l de glucosa, 20 g/l de sulfato amónico, 0,5 g/l de
sulfato de magnesio heptahidrato, 2 g/l de dihidrogenofosfato de
potasio, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25 g/l de cloruro de calcio
dihidrato, 0,02 g/l de sulfato ferroso heptahidrato, 0,02 g/l de
sulfato de manganeso tetrahidrato, 0,72 mg/l de sulfato de cinc
dihidrato, 0,64 mg/l de sulfato de cobre pentahidrato, 0,72 mg/l de
cloruro de cobalto hexahidrato, 0,4 mg/l de ácido bórico, 1,2 mg/l
de molibdato sódico dihidrato y 2 g/l de extracto de levadura.
De esta manera, se obtuvieron con éxito 78 cepas
de microorganismos que mostraban resistencia al ácido
L-glutámico en ambiente ácido.
Los diversos microorganismos que presentaban
resistencia al ácido L-glutámico en ambiente ácido
obtenidas tal como se ha descrito anteriormente se inocularon, cada
una de ellas, en una probeta de ensayo de 16,5 cm de longitud y 14
mm de diámetro que contenía 3 ml de medio (ajustado a pH 4,0 con
HCl) obtenido mediante la adición de 20 g/l de ácido glutámico y 2
g/l de glucosa a medio M9 (Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis,
T., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory Press,
U.S.A., 1989) y la turbidez del medio se midió durante el curso
temporal con el fin de seleccionar las cepas que mostraban una tasa
de crecimiento favorable. Como resultado, como cepa que mostraba un
crecimiento favorable, se obtuvo la cepa AJ13355, procedente de
suelo en Iwata-shi, Shizuoka, Japón. Esta cepa se
determinó que era Enterobacter agglomerans a partir de sus
propiedades bacteriológicas, descritas anteriormente.
Debido a que la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans secreta extracelularmente moco cuando se cultiva en
un medio que contiene un sacárido, la eficiencia operativa no es
favorable. Por lo tanto, se obtuvo una cepa con menos secreción de
moco mediante el procedimiento de la irradiación ultravioleta
(Miller, J.H. et al., "A Short Course in Bacterial
Genetics; Laboratory Manual", página 150, 1992, Cold Spring
Harbor Laboratory Press, U.S.A.).
Se irradió la cepa AJ13355 de Enterobacter
agglomerans con rayos ultravioleta durante 2 minutos situada a
60 cm de una lámpara de ultravioleta de 60 W y se cultivó en medio
LB durante la noche con el fin de fijar la mutación. La cepa
mutagenizada se diluyó y se inoculó en medio LB que contenía 5 g/l
de glucosa y 20 g/l de ágar de manera que emergiesen aproximadamente
100 colonias por placa y se cultivaron a 30ºC durante la noche con
inclinación de la placa de aproximadamente 45 grados, seleccionando
posteriormente 20 colonias que no mostraban flujo de moco.
Como cepa que satisfacía las condiciones de que
no surgía ningún revertiente incluso tras 5 subcultivos en medio LB
que contenía 5 g/l de glucosa y 20 g/l de ágar, y de que debería
observarse crecimiento equivalente al de la cepa madre en medio LB,
en medio LB que contenía 5 g/l de glucosa y en medio M9 (Sambrook,
J. et al., Molecular Cloning, segunda edición, Cold Spring
Harbor Press, U.S.A., 1989) suplementado con 20 g/l de ácido
L-glutámico y 2 g/l de glucosa y ajustado a pH 4,5
con HCl, se seleccionó la cepa SC17 de entre las cepas seleccionadas
anteriormente.
Se preparó una cepa que era deficiente en
\alphaKGDH y que presentaba un sistema mejorado de biosíntesis de
ácido L-glutámico a partir de la cepa SC17 de
Enterobacter agglomerans.
El gen sucAB de la cepa AJ13355 de
Enterobacter agglomerans se clonó mediante la selección de un
fragmento de ADN que complementaba la propiedad de no asimilación de
ácido acético de una cepa de Escherichia coli deficiente en
el gen de la subunidad E1 de \alphaKGDH (en lo sucesivo denominada
"sucA"), procedente del ADN cromosómico de la cepa
AJ13355 de Enterobacter agglomerans.
El ADN cromosómico de la cepa AJ13355 de
Enterobacter agglomerans se aisló mediante un procedimiento
utilizado habitualmente para extraer el ADN cromosómico de
Escherichia coli (Text for Bioengineering Experiments,
editado por la Society for Bioscience and Bioengineering, Japón,
páginas 97-98, Baifukan, 1992). El pTWV228
(resistente a la ampicilina) utilizado como vector era un producto
comercial de Takara Shuzo Co., Ltd.
El ADN cromosómico de la cepa AJ13355 digerido
con EcoT221 y el pTWV228 digerido con PstI se ligaron
utilizando ligasa de T4 y se utilizaron para transformar la cepa
JRG465 de Escherichia coli deficiente en sucA
(Herbert, J. et al., Mol. Gen. Genetics, 105, 182 (1969)). Se
seleccionó una cepa que crecía en un medio mínimo con acetato de
entre las cepas transformadas obtenidas anteriormente y se extrajo
un plásmido de la misma, denominándose pTWVEK101. La cepa JRG465 de
Escherichia coli que portaba pTWVEK101 recuperó la auxotrofia
para ácido succínico o para L-lisina y
L-metionina, aparte del carácter de no asimilación
del ácido acético. Esto sugiere que pTWVEK101 contenía el gen
sucA de Enterobacter agglomerans.
La figura 1 muestra un mapa de restricción de un
fragmento de ADN derivado de Enterobacter agglomerans en
pTWVEK101. En la secuencia de nucleótidos de la parte rayada en la
figura 1, se encontraron secuencias de nucleótidos que se
consideraron que eran dos ORFs de longitud completa y dos secuencias
de nucleótidos que se consideraron ORFs de secuencia parcial. Como
resultado de la búsqueda de homología para dichas secuencias, se
descubrió que las partes de los nucleótidos que se determinaron
contenían una secuencia parcial en el extremo 3' del gen de la
proteína hierro-azufre succinato deshidrogenasa
(sdhB), sucA de longitud completa y gen de la
subunidad E2 de \alphaKGDH (gen sucB) y una secuencia
parcial en el extremo 5' del gen de la subunidad \beta de la
succinil CoA sintetasa (gen sucC). En las figuras 2 a 5 se
muestran los resultados de la comparación de las secuencias de
aminoácidos deducidas de estas secuencias de nucleótidos con las
derivadas de Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, páginas
351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, páginas
361-374 (1984); Biochemistry, 24, páginas
6245-6252 (1985)). Se muestran en las SEC ID nº 1 a
4 las secuencias de aminoácidos codificadas por sucA,
sucB y sucC o por partes de las mismas, derivadas de
Enterobacter agglomerans, mientras que en las SEC ID nº 5 a 8
se muestran aquéllas derivadas de Escherichia coli. De esta
manera, las secuencias de aminoácidos mostraban una homología muy
elevada entre sí. Además, se descubrió que se había constituido una
agrupación de sdhB- sucA -sucB-sucC en
el cromosoma de Enterobacter agglomerans de la misma manera
que en Escherichia coli (Eur. J. Biochem., 141, páginas
351-359 (1984); Eur. J. Biochem., 141, páginas
361-374 (1984); Biochemistry, 24, páginas
6245-6252 (1985)).
La recombinación homóloga se llevó a cabo
mediante la utilización del gen sucAB de Enterobacter
agglomerans obtenido tal como se ha descrito anteriormente con
el fin de obtener una cepa deficiente en \alphaKGDH de
Enterobacter agglomerans.
Tras digerir pTWVEK101 con SphI para
extraer un fragmento que contenía sucA, se crearon extremos
romos en el fragmento con un fragmento Klenow (Takara Shuzo Co.,
Ltd.) y se ligaron con pBR322 digerido con EcoRI y con
extremos romos creados con fragmento Klenow, mediante la utilización
de la ADN ligasa de T4 (Takara Shuzo Co., Ltd.). El plásmido
obtenido se digirió en el sitio de reconocimiento del enzima de
restricción BglII localizado aproximadamente en el centro de
sucA mediante la utilización del enzima, se crearon extremos
romos con un fragmento Klenow y después se ligaron nuevamente
utilizando la ADN ligasa de T4. Se considero que el gen sucA
había dejado de ser funcional debido a que se había introducido una
mutación por desplazamiento de marco en sucA del plásmido
nuevamente construido mediante el procedimiento anterior.
El plásmido construido tal como se ha descrito
anteriormente se digirió con un enzima de restricción ApaLI y se
sometió a electroforesis en gel de agarosa con el fin de recuperar
un fragmento de ADN que contuviera sucA en el que se había
introducido la mutación por desplazamiento de marco y un gen de
resistencia a la tetraciclina derivado de pBR322. El fragmento de
ADN recuperado se ligó nuevamente utilizando ADN ligasa de T4 con el
fin de construir un plásmido para interrumpir el gen
\alphaKGDH.
El plásmido para interrumpir el gen \alphaKGDH
obtenido tal como se ha descrito anteriormente se utilizó para
transformar la cepa SC17 de Enterobacter agglomerans mediante
electroporación (Miller, J.H., "A Short Course in Bacterial
Genetics; Handbook", página 279, Cold Spring Harbor Laboratory
Press, U.S.A., 1992) y se obtuvo una cepa en la que sucA en
el cromosoma había sido sustituido con un gen de tipo mutante
procedente del plásmido, mediante recombinación homóloga utilizando
la resistencia a la tetraciclina como marcador. La cepa obtenida se
denominó cepa SC17 sucA.
Con el fin de confirmar que la cepa SC17
sucA era deficiente en actividad \alphaKGDH, se midió la
actividad enzimática mediante el procedimiento de Reed et al.
(Reed, L.J. y Mukherjee, B.B., Methods in Enzymology, 13, páginas
55-61 (1969)) utilizando células de la cepa
cultivada en medio LB hasta la etapa de crecimiento logarítmico.
Como resultado, se midió una actividad \alphaKGDH de 0,073
(\DeltaABS/min/mg proteína) en la cepa SC17, mientras que no se
midió actividad \alphaKGDH en la cepa SC17 sucA y de esta
manera se confirmó que se había eliminado sucA, tal como se
deseaba.
Posteriormente, se introdujeron el gen de la
citrato sintasa, el gen de la fosfoenolpiruvato carboxilasa y el gen
de la glutamato deshidrogenasa derivados de Escherichia coli
en la cepa SC17 sucA.
Los procedimientos de preparación de un plásmido
que posee los genes gltA, ppc y gdhA se
explicarán con referencia a las figuras 6 y 7.
Se digirió un plásmido que poseía el gen
gdhA derivado de Escherichia coli, pBRGDH (solicitud
de patente japonesa abierta al público nº 7-203980)
con HindIII y SphI, ambos extremos se hicieron romos mediante
tratamiento con la ADN polimerasa de T4 y después el fragmento de
ADN que poseía el gen gdhA se purificó y se recuperó.
Separadamente, se digirió con XbaI un plásmido que poseía los genes
gltA y ppc derivados de Escherichia coli, pMWCP
(WO97/08294), y después ambos extremos se hicieron romos utilizando
ADN polimerasa de T4. Lo anterior se mezcló con el fragmento
anteriormente indicado de ADN purificado que poseía el gen
gdhA y se ligó mediante la utilización de ligasa de T4 con el
fin de obtener un plásmido pMWCPG, correspondiente a pMWCP que
además contenía el gen gdhA (figura 6).
Simultáneamente, el plásmido pVIC40 (solicitud de
patente japonesa abierta al público nº 8-047397),
que presentaba el origen de replicación del plásmido de amplio rango
de huésped RSF1010, se digirió con NotI, se trató con ADN polimerasa
de T4 y se digirió con PstI. El plásmido pBR322 se digirió
con EcoT14I, se trató con ADN polimerasa de T4 y se digirió
con PstI. Ambos productos se mezclaron y se ligaron mediante
la utilización de ligasa de T4 con el fin de obtener un plásmido
RSF-Tet que presentaba el origen de replicación de
RSF1010 y el gen de la resistencia a la tetraciclina (figura 7).
Posteriormente, pMWCPG se digirió con
EcoRI y PstI y se purificó y se recuperó un fragmento
de ADN que poseía los genes gltA, ppc y gdhA.
De manera similar, se digirió RSF-Tet con
EcoRI y PstI y se purificó y se recuperó un fragmento
de ADN que poseía el origen de replicación de RSF1010. Ambos
productos se mezclaron y se ligaron mediante la utilización de
ligasa de T4 con el fin de obtener un plásmido RSFCPG, que
correspondiese a RSF-Tet y que contuviese los genes
gltA, ppc y gdhA (figura 8). Se confirmó que el
plásmido RSFCPG obtenido expresaba los genes gltA, ppc
y gdhA, basándose en la suplementación de la auxotrofia de la
cepa derivada de Escherichia coli deficiente en los genes
gltA, ppc o gdhA y en la medición de cada una
de las actividades enzimáticas.
Se construyó un plásmido que poseía el gen
gltA derivado de Brevibacterium lactofermentum de la
manera siguiente. Se llevó a cabo un PCR mediante la utilización de
los cebadores de ADN que se habían preparado a partir de la
secuencia de nucleótidos del gen gltA de Corynebacterium
glutamicum (Microbiology, 140, páginas 1817-1828
(1994)) y el ADN cromosómico de Brevibacterium lactofermentum
ATCC13869 como molde, con el fin de obtener un fragmento del gen
gltA de aproximadamente 3 kb. Este fragmento se insertó en un
plásmido pHSG399 (adquirido en Takara Shuzo Co., Ltd.) digerido con
SmaI con el fin de obtener un plásmido pHSGCB (figura 9).
Posteriormente, se digirió pHSGCB con HindIII y el fragmento
extraído de aproximadamente 3 kb del gen gltA se insertó en
un plásmido pSTV29 (adquirido en Takaro Shuzo Co., Ltd.) digerido
con HindIII con el fin de obtener un plásmido pSTVCB (figura 9). Se
confirmó que el plásmido pSTVCB obtenido expresaba el gen
gltA midiendo la actividad enzimática en la cepa AJ13355 de
Enterobacter agglomerans.
Se transformó la cepa SC17 sucA de
Enterobacter agglomerans con RSFCPG mediante electroporación
con el fin de obtener una cepa transformante SC17 sucA/RSFCPG
que mostrase resistencia a la tetraciclina. Además, la cepa SC17
sucA/RSFCPG se transformó con pSTVCB mediante electroporación
con el fin de obtener una cepa transformante SC17
sucA/RSFCPG+pSTVCB que mostrase resistencia al
cloranfenicol.
Se aisló a partir de la cepa SC17
sucA/RSFCPG+pSTVCB de Enterobacter agglomerans, una cepa
con mayor resistencia a concentraciones elevadas de ácido
L-glutámico a bajo pH (en lo sucesivo denominada
"cepa con resistencia a concentración elevadas de Glu a pH
bajo").
La cepa SC17 sucA/RSFCPG+pSTVCB se cultivó
durante la noche a 30ºC en medio LBG (10 g/l de triptón, 5 g/l de
extracto de levadura, 10 g/l de NaCl, 5 g/l de glucosa) y las
células, lavadas con solución salina, se diluyeron y se sembraron
apropiadamente en una placa con medio M9-E (4 g/l de
glucosa, 17 g/l de Na_{2}HPO_{4}\cdot12H_{2}O, 3 g/l de
KH_{2}PO_{4}, 0,5 g/l de NaCl, 1 g/l de NH_{4}Cl, 10 mM de
MgSO_{4}, 10 \muM de CaCl_{2}, 50 mg/l de
L-lisina, 50 mg/l de L-metionina, 50
mg/l de ácido DL-diaminopimélico, 25 mg/l de
tetraciclina, 25 mg/l de cloranfenicol, 30 g/l de ácido
L-glutámico, ajustada a pH 4,5 con amonio acuoso).
Surgió una colonia tras cultivar a 32ºC durante 2 días, obtenida
como cepa con resistencia a concentraciones elevadas de Glu a pH
bajo.
Para la cepa obtenida, se midió el nivel de
crecimiento en medio líquido M9-E y se sometió a
ensayo la capacidad de producción de ácido
L-glutámico en una probeta de ensayo grande de 50 ml
de volumen que contenía 5 ml de medio de ensayo de producción de
ácido L-glutámico (40 g/l de glucosa, 20 g/l de
sulfato amónico, 0,5 g/l de sulfato de magnesio heptahidrato, 2 g/l
de dihidrogenofosfato de potasio, 0,5 g/l de cloruro sódico, 0,25
g/l de cloruro de calcio dihidrato, 0,02 g/l de sulfato ferroso
heptahidrato, 0,02 g/l de sulfato de manganeso tetrahidrato, 0,72
mg/l de sulfato de cinc dihidrato, 0,64 mg/l de sulfato de cobre
pentahidrato, 0,72 mg/l de cloruro de cobalto hexahidrato, 0,4 mg/l
de ácido bórico, 1,2 mg/l de molibdato sódico dihidrato, 2 g/l de
extracto de levadura, 200 mg/l de hidrocloruro de
L-lisina, 200 mg/l de L-metionina,
200 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol).
Se denominó Enterobacter agglomerans AJ13601 a una cepa que
mostraba el nivel más elevado de crecimiento y la misma capacidad de
producción de ácido L-glutámico que la de la cepa
madre, la cepa SC17/RSFCPG+pSTVCB. La cepa AJ13601 se depositó en el
National Institute of Bioscience and
Human-Technology, Agency of Industrial Science and
Technology, Ministry of International Trade and Industry (en la
actualidad, International Patent Organism Depositary, National
Institute of Advanced Industrial Science and Technology; Central 6,
Highashi 1-1-1,
Tsukuba-shi, Ibaraki 305-8566,
Japón) el 18 de agosto de 1999, recibiendo el número de acceso FERM
P-17516. A continuación, se transfirió a un depósito
internacional bajo las disposiciones del Tratado de Budapest, el 6
de julio de 2000, recibiendo el número de acceso FERM
BP-7207.
La cepa AJ13601 de Enterobacter agglomerans
se cultivó en medio ágar LBG (10 g/l de triptón, 5 g/l de
extracto de levadura, 10 g/l de NaCl y 15 g/l de ágar) que contenía
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol a
30ºC durante 14 horas y se recogieron las células en una placa
(diámetro: 8,5 cm) y se inocularon en 300 ml de medio de cultivo que
contenía 50 g/l de glucosa, 4 g/l de sulfato de amonio, 0,4 g/l de
sulfato de magnesio heptahidrato, 2 g/l de dihidrogenofosfato
monopotásico, 10 mg/l de sulfato ferroso heptahidrato, 10 mg/l de
sulfato de manganeso pentahidrato, 4 g/l de extracto de levadura,
400 mg/l de hidrocloruro de L-lisina, 400 mg/l de
DL-metionina, 400 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol,
en un fermentador de volumen 1 litro con el fin de llevar a cabo el
cultivo a 34ºC a pH 6,0. El pH del cultivo se controló mediante la
adición de gas amoníaco. El cultivo se terminó aproximadamente 16
horas tras iniciarlo, en una etapa en la que la glucosa en el medio
de cultivo se había agotado.
Se inocularon 60 ml del caldo de cultivo
cultivado tal como se ha descrito anteriormente, en 300 ml de un
medio de cultivo principal que contenía 50 g/l de glucosa, 5 g/l de
sulfato de amonio, 0,4 g/l de sulfato de magnesio heptahidrato, 5
g/l de dihidrogenofosfato monopotásico, 20 mg/l de sulfato ferroso
heptahidrato, 20 mg/l de sulfato de manganeso pentahidrato, 6 g/l de
extracto de levadura, 800 mg/l de hidrocloruro de
L-lisina, 600 mg/l de DL-metionina,
600 mg/l de ácido
DL-\alpha,\varepsilon-diaminopimélico,
1,5 g/l de cloruro sódico, 0,75 g/l de cloruro de calcio dihidrato,
25 mg/l de hidrocloruro de tetraciclina y 25 mg/l de cloranfenicol,
en un recipiente de volumen 1 litro con el fin de llevar a cabo el
cultivo a 34ºC a pH 6,0. A medida que se acumulaba ácido
L-glutámico, el pH se redujo espontáneamente hasta
alcanzar pH 4,5 aproximadamente una o dos horas después de iniciar
el cultivo. A continuación, el pH del cultivo se ajustó a pH 4,5
mediante la adición de gas amoníaco. Tras agotar la glucosa añadida
inicialmente, se añadieron en continuo 700 g/l de una solución
acuosa de glucosa a una tasa de 6 ml/hora.
Al continuar la producción fermentativa de ácido
L-glutámico tal como se ha descrito anteriormente,
la concentración de ácido L-glutámico acumulada en
el caldo de cultivo aproximadamente 14 horas tras iniciar el cultivo
estaba comprendida entre aproximadamente 45 y 55 g/l.
En este momento, se añadieron los cristales de
ácido L-glutámico de forma \alpha ó \beta al
caldo de cultivo en forma de cristales secos desde la parte superior
del recipiente fermentador, en una cantidad comprendida entre 0,008
y 1,0 g (entre 0,022 y 2,778 g/l con respecto a la cantidad de medio
al iniciar el cultivo), y se continuó con el cultivo y se terminó 36
horas tras iniciarlo. Precipitó una cantidad considerable de
cristales de ácido L-glutámico en el recipiente
fermentador. Los cristales se separaron mediante decantación y se
secaron durante la noche a temperatura ambiente. La forma cristalina
(forma de la red cristalina) de los cristales secos resultantes se
investigó mediante el procedimiento de difracción de rayos X para
polvos. En la tabla 1 se muestran los resultados. En la tabla 1
también se muestra el resultado de un experimento de control en el
que no se había añadido ningún cristal durante el cultivo.
| Experimento | Condición de adición de los cristales | Resultado del cultivo | |||||
| nº | Forma del | Peso | Concentra- | Acumula- | Forma cristalina | Acumula- | Del total, |
| cristal | añadido | ción añadida | ción de Glu | de los cristales | ción total de | cristales | |
| (g) | (g/l) | al iniciar | precipitados | Glu (g/l) | precipita- | ||
| la adición | dos (g/l) | ||||||
| (g/l) | |||||||
| 1 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 44,5 | cristal \alpha | 145,0 | 98,0 |
| 2 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 47,0 | cristal \alpha | 118,0 | 72,0 |
| 3 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 46,5 | cristal \alpha | 132,0 | 73,0 |
| 4 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 47,0 | cristal \alpha | 131,0 | 86,0 |
| 5 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 46,0 | cristal \alpha | 104,0 | 58,0 |
| 6 | cristal \alpha | 1,000 | 2,778 | 45,5 | cristal \alpha | 142,0 | 90,0 |
| 7 | cristal \alpha | 0,400 | 1,111 | 41,5 | cristal \alpha | 102,0 | 60,0 |
| 8 | cristal \alpha | 0,400 | 1,111 | 30,5 | cristal \alpha | 92,0 | 50,0 |
| 9 | cristal \alpha | 0,400 | 1,111 | 55,5 | cristal \alpha | 94,0 | 50,0 |
| 10 | cristal \alpha | 0,400 | 1,111 | 59,5 | cristal \alpha | 93,0 | 56,0 |
| 11 | cristal \alpha | 0,400 | 1,111 | 61,0 | cristal \alpha | 110,0 | 67,0 |
| 12 | cristal \alpha | 0,080 | 0,222 | 44,5 | cristal \alpha | 118,0 | 77,5 |
| 13 | cristal \alpha | 0,080 | 0,222 | 46,5 | cristal \alpha | 132,0 | 91,0 |
| 14 | cristal \alpha | 0,080 | 0,222 | 46,0 | cristal \alpha | 104,0 | 63,0 |
| 15 | cristal \alpha | 0,080 | 0,222 | 41,5 | cristal \alpha | 142,0 | 101,0 |
| 16 | cristal \alpha | 0,080 | 0,222 | 55,5 | cristal \alpha | 102,0 | 62,0 |
| 17 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 50,0 | cristal \alpha | 129,0 | 52,0 |
| 18 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 55,0 | cristal \alpha | 122,0 | 81,0 |
| 19 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 47,5 | cristal \alpha | 123,0 | 81,0 |
| 20 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 49,5 | cristal \alpha | 122,0 | 88,0 |
| 21 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 49,0 | cristal \beta | 101,0 | 67,0 |
| 22 | cristal \alpha | 0,040 | 0,111 | 48,0 | cristal \beta | 100,0 | 65,0 |
| 23 | cristal \alpha | 0,008 | 0,022 | 52,5 | cristal \beta | 113,0 | 72,0 |
| 24 | cristal \alpha | 0,008 | 0,022 | 54,0 | cristal \beta | 91,0 | 50,0 |
| 25 | cristal \beta | 1,000 | 2,778 | 44,5 | cristal \beta | 113,0 | 71,0 |
| Control | Ninguna | - | - | - | cristal \beta | 82,0 | 39,5 |
\newpage
A partir de los resultados mostrados en la tabla
1, se ha descubierto que la acumulación de ácido
L-glutámico en el momento de terminar el cultivo, al
añadir cristales, se había incrementado en comparación con el
resultado sin añadir ningún cristal en absoluto.
Además, se ha descubierto que si se añaden los
cristales de ácido L-glutámico de forma \alpha, se
incrementa la proporción de precipitación de cristales de ácido
L-glutámico. En particular, se ha descubierto que si
los cristales se añaden en una cantidad de 0,2 g/l o más, los
cristales de ácido L-glutámico de forma \alpha
pueden precipitar en el medio con buena reproducibilidad.
<110> Ajinomoto Co., Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTO PARA LA PRODUCCIÓN DE
ÁCIDO L-GLUTÁMICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> EPA-53849
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> JP 2001-44136
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-02-20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 935
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 407
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 39
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Enterobacter agglomerans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 933
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 405
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 60
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Escherichia coli
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (6)
1. Procedimiento para la producción de ácido
L-glutámico mediante fermentación, que comprende
cultivar un microorganismo que posee la capacidad de producir ácido
L-glutámico en un medio líquido del que se ajusta el
pH dentro del intervalo comprendido entre 3 y 5 con el fin de
permitir la producción y acumulación de ácido
L-glutámico, acompañada de la precipitación del
ácido L-glutámico, en el que se añaden cristales de
nucleación de ácido L-glutámico al medio cuando la
concentración de ácido L-glutámico en el medio es
inferior a la concentración a la que se produce la cristalización
espontánea.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el
que los cristales son cristales \alpha.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el
que la cantidad de cristales añadida al medio es de 0,2 g/l o
superior.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el microorganismo pertenece al
género Enterobacter.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el
que el microorganismo es Enterobacter agglomerans.
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el microorganismo puede
metabolizar una fuente de carbono en un medio líquido que contiene
la fuente de carbono y ácido L-glutámico a una
concentración de saturación y el medio líquido presenta un pH dentro
del intervalo comprendido entre 3 y 5, y posee una capacidad de
acumular ácido L-glutámico en una cantidad que
excede la concentración de saturación del ácido
L-glutámico en el medio líquido a dicho pH.
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