KR101627095B1 - Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 - Google Patents

Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법 Download PDF

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Abstract

본래적으로 피롤로퀴놀린 퀴논을 조효소로서 사용하는 글루코스 탈수소효소의 활성을 갖지만, 당해 효소의 활성이 저하되도록 개변된 장내세균과에 속하는 세균으로서, L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시켜, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취함으로써 L-아미노산을 제조한다.

Description

Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 Ｌ-아미노산의 제조법{Microorganism capable of producing L-amino acid, and method for producing L-amino acid}
본 발명은 미생물을 사용한 L-아미노산의 제조법, 특히 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판 등의 L-아미노산의 제조법에 관한 것이다. L-글루탐산은 조미료로서, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판은 동물 사료용의 첨가물, 건강 식품의 성분, 또는, 아미노산 수액 등으로서, 산업상 유용한 L-아미노산이다.
L-아미노산은 다양한 미생물을 사용한 발효법에 의해 공업 생산되고 있다. 예를 들어, L-글루탐산은 주로 브레비박테리움(Brevibacterium)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 마이크로박테리움(Microbacterium)속에 속하는 소위 코리네형 세균의 L-글루탐산 생산균 또는 이들의 변이주를 사용한 발효법에 의해 제조되어 있다[참조: 비특허문헌 1]. 그 밖의 미생물을 사용한 발효법에 의한 L-글루탐산의 제조법으로서는 바실러스(Bacillus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 페니실리움(Penicillium)속 등의 미생물[참조: 특허문헌 1], 슈도모나스(Pseudomonas)속, 아스로박터(Arthrobacter)속, 세라티아(Serratia)속, 칸디다(candida)속 등의 미생물[참조: 특허문헌 2], 바실러스속, 슈도모나스속, 세라티아속, 에어로박터 아에로게네스(Aerobacter aerogenes)(현 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes)) 등의 미생물[참조: 특허문헌 3], 에세리키아 콜라이(Escherichia coli)의 변이주[참조: 특허문헌 1] 등을 사용하는 방법이 알려져 있다. 또한, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 에르위니아(Erwinia)속 또는 판토에아(Pantoea)속, 엔테로박터(Enterobacter)속에 속하는 미생물을 사용한 L-글루탐산의 제조법도 개시되어 있다[참조: 특허문헌 2 내지 4].
상기와 같은 미생물을 사용한 발효법에 의해서 L-아미노산 등의 목적 물질을 제조하기 위해서는 야생형 미생물(야생주)을 사용하는 방법, 야생주로부터 유도된 영양 요구주를 사용하는 방법, 야생주로부터 여러 가지 약제 내성 변이주로서 유도된 대사 조절 변이주를 사용하는 방법, 영양 요구주와 대사 조절 변이주의 양자의 성질을 가진 주를 사용하는 방법 등이 있다.
또한, 최근에는 목적 물질의 발효 생산에, 재조합 DNA 기술을 사용하는 것이 이루어지고 있다. 예를 들어, L-아미노산 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증강하는 것[참조: 특허문헌 5, 특허문헌 6], 또는 L-아미노산 생합성계로의 탄소원의 유입을 증강시키는 것[참조: 특허문헌 7]에 의해, 미생물의 L-아미노산 생산성을 향상시키는 것이 이루어지고 있다.
글루코스 탈수소효소에는 크게 분류하여 NAD(P) 의존형과 PQQ(피롤로퀴놀린 퀴논) 의존형이 알려져 있다. 또한, PQQ 의존형(EC1.1.5.2)에는 가용형과 막 결합형이 존재하고, 후자는 장내세균에서는 주변세포질 공간(외막, 내막간의 틈)에 존재하는 것이 알려져 있고, 장내세균에 널리 존재하는 것이 알려져 있다. 이하, 이러한 주변세포질 공간에 존재하고, PQQ를 조효소로서 사용하는 글루코스 탈수소효소를 "GCD"라고도 기재한다.
에세리키아 콜라이 등의 일부의 세균에서는 GCD의 조효소인 PQQ의 합성능이 없기 때문에, PQQ를 첨가함으로써 비로소 GCD 활성을 발현하는 것이 알려져 있다[참조: 비특허문헌 2]. 한편, 판토에아속 세균 등의 세균에서는 PQQ 합성능이 있고, GCD 전효소(holoenzyme)를 갖는다.
GCD에 관한 기술로서는 GCD를 암호화하는 유전자를 결손시킨 글루코노박터 크실리너스(Gluconobacter xylinus)를 사용하여 글루코스로부터 셀룰로스를 제조하는 방법이 알려져 있다[참조: J. Biosci. Bioeng. 99(4), 415-422, 2005]. 또한, 글루코스 탈수소효소 활성이 저하된 에세리키아속 세균, 또는 본래적으로 글루코스 탈수소효소 활성을 사용하여 [5S,6S]-5,6-디하이드록시사이클로헥사-1,3-디엔-1-카복실산을 제조하는 방법이 알려져 있다[참조: 특허문헌 8].
그러나, 세균의 GCD 활성의 저하가 L-아미노산 생산능에 미치는 영향에 대해서는 알려져 있지 않다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 일본 공개특허공보 제(평)5-244970호
(특허문헌 2) 미국특허 제3,563,857호 명세서
(특허문헌 3) 일본 특허공보 제(소)32-9393호
(특허문헌 4) 일본 공개특허공보 2000-189175호
(특허문헌 5) 미국특허 제5168056호 명세서
(특허문헌 6) 미국특허 제5776736호 명세서
(특허문헌 7) 미국특허 제5906925호 명세서
(특허문헌 8) 국제공개 제WO2006/133898호 팜플렛
[비특허문헌]
(비특허문헌 1) Kunihiko Akashi et al., 아미노산 발효, 학회출판센터, 195~215페이지, 1986년
(비특허문헌 2) FEMS Microbiol. Lett., 24, 329-333, 1984
본 발명은 L-아미노산을 효율적으로 생산할 수 있는 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하는 미생물을 제공하는 것, 및 당해 미생물을 사용하여 L-아미노산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해서 예의 검토를 거듭한 결과, 본래적인 GCD 활성을 갖는 장내세균을, GCD 활성이 저하되도록 개변함으로써, L-아미노산 생산능이 향상되는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하와 같다.
(1) 장내세균과에 속하고 L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하고, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시켜, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취하는 것을 특징으로 하는 L-아미노산의 제조법으로서, 상기 세균은 본래적으로 피롤로퀴놀린 퀴논을 조효소로서 사용하는 글루코스 탈수소효소(GCD)의 활성을 갖지만, 당해 효소의 활성이 저하되도록 개변된 세균인 것을 특징으로 하는 방법.
(2) 상기 효소를 암호화하는 gcd 유전자가 불활성화됨으로써, GCD 활성이 저하된, 상기 방법.
(3) 상기 gcd 유전자가, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 또는 이의 변이체인, 상기 방법.
(4) 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 상기 방법.
(5) 상기 L-아미노산이 L-글루탐산 또는 L-시스테인인, 상기 방법.
(6) 상기 L-아미노산이 L-글루탐산이고, 상기 세균이 시트르산 신타제, 메틸 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카복실라제, 및 글루탐산 데하이드로게나제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있는, 상기 방법.
(7) 상기 L-아미노산이 L-시스테인이고, 상기 세균이 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 황산염/티오황산염 수송계로부터 선택되는 적어도 1종 또는 2종 이상의 활성, 및/또는, yeaS 유전자의 발현이 증강되어 있는, 상기 방법.
(8) 상기 세균이, 판토에아(Pantoea)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 프로비덴시아(Providencia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 세라티아(Serratia)속, 모르가넬라(Morganella)속, 및 예르시니아(Yersinia)속으로부터 선택되는 속에 속하는 세균인, 상기 방법.
본 발명의 미생물을 사용함으로써, 효율적으로, L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-트레오닌, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 또는 L-시스테인 등의 L-아미노산을 발효 생산할 수 있다.
도 1은 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구조를 도시하는 도면이다.
도 2는 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축을 도시하는 도면이다.
도 3은 프로모터 Pnlp의 서열을 도시하는 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
<1> 본 발명에서 사용되는 장내세균과에 속하는 세균
본 발명에서 사용되는 세균은 본래적으로 GCD 활성을 갖고, L-아미노산 생산능을 갖는 장내세균과에 속하는 세균이며, GCD 활성이 저하되도록 개변된 세균이다. 본 발명의 세균은 본래적으로 GCD 활성을 갖고, L-아미노산 생산능을 갖는 장내세균과에 속하는 세균을, GCD 활성이 저하되도록 개변함으로써 취득할 수 있다. 또한, 본 발명의 세균은 본래적으로 GCD 활성을 갖지만, GCD 활성이 저하되도록 개변된 장내세균과에 속하는 세균에, L-아미노산 생산능을 부여하거나, 상기 세균의 L-아미노산 생산능을 증강함으로써도, 취득할 수 있다.
L-아미노산의 종류는 특별히 제한되지 않지만, L-리신, L-오르니틴, L-아르기닌, L-히스티딘, L-시트룰린과 같은 염기성 아미노산, L-이소류신, L-알라닌, L-발린, L-류신, L-글리신과 같은 지방족 아미노산, L-트레오닌, L-세린과 같은 하이드록시모노아미노카복실산인 아미노산, L-프롤린과 같은 사이클릭 아미노산, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판과 같은 방향족 아미노산, L-시스테인, L-시스틴, L-메티오닌과 같은 황 함유 아미노산, L-글루탐산, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-아스파라긴 등과 같은 산성 아미노산을 들 수 있고, 특히 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-트립토판이 바람직하다. 본 발명의 미생물은 2종류 이상의 아미노산의 생산능을 갖는 것이라도 좋다.
또한, 본 발명에 있어서 L-아미노산이란 유리 형태의 L-아미노산 및/또는 이의 염, 예를 들어 황산염, 염산염, 탄산염, 암모늄염, 나트륨염, 칼륨염을 포함한다.
본 발명에 있어서, L-아미노산 생산능을 갖는 세균이란 배지에 배양하였을 때, L-아미노산을 생산하고, 배지 중에 분비되는 능력을 갖는 세균을 말한다. 또한, 바람직하게는, 목적으로 하는 L-아미노산을 바람직하게는 0.5g/L 이상, 보다 바람직하게는 1.0g/L 이상의 양을 배지에 축적시킬 수 있는 세균을 말한다.
이하에, GCD 활성이 저하되도록 개변되는, 본 발명의 세균의 친주(親株)로서 사용되는 세균, 및 L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강의 방법을 이하에 예시한다.
<2-1> 본 발명의 세균
본 발명의 세균은 장내세균과에 속하는 세균이다.
장내세균이란 에세리키아, 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 판토에아, 포토하브더스(Photorhabdus), 프로비덴시아, 살모넬라, 세라티아, 시겔라, 모르가넬라, 예르시니아 등의 속에 속하는 세균을 포함한다. 특히, NCBI(National Center for Biotechnology Information)의 데이터베이스[참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=91347]에서 사용되고 있는 분류법에 의해 장내세균과로 분류되어 있는 세균이 바람직하다.
에세리키아속에 속하는 세균이란 특별히 제한되지 않지만, 당해 세균이 미생물학의 전문가에게 알려져 있는 분류에 의해, 에세리키아속에 분류되어 있는 것을 의미한다. 에세리키아속에 속하는 세균의 예로서는 에세리키아 콜라이(E. coli)를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
에세리키아속에 속하는 세균에는 예를 들어, Neidhardt 등의 저서[참조: Neidhardt, F. C. Ed. 1996. Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology/Second Edition pp. 2477-2483 Table 1. American Society for Microbiology Press, Washington, D. C.]에 기술되어 있는 계통인 것이 포함된다. 구체적으로는 프로토타입의 야생주 K12주 유래의 에세리키아 콜라이 W3110(ATCC 27325), 에세리키아 콜라이 MG1655(ATCC 47076) 등을 들 수 있다.
이들의 균주는 예를 들어 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(주소 P.0. Box 1549 Manassas, VA 20108, United States of America)으로부터 분양을 받을 수 있다. 즉, 각 균주에 대응하는 등록번호가 부여되어 있고, 이 등록번호를 이용하여 분양을 받을 수 있다. 각 균주에 대응하는 등록번호는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션의 카탈로그에 기재되어 있다.
엔테로박터속 세균으로서는 엔테로박터 아글로메란스(Enterobacter agglomerans), 엔테로박터 아에로게네스(Enterobacter aerogenes) 등을 들 수 있다. 구체적으로는, 유럽 특허출원 공개 952221호 명세서에 예시된 균주를 사용할 수 있다. 한편, 최근, 엔테로박터 아글로메란스는 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아글로메란스(Pantoea agglomerans) 또는 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis), 판토에아 스튜아르티(Pantoea stewartii)로 재분류되어 있는 것이 있다. 본 발명에 있어서는 장내세균과로 분류되는 것이라면, 엔테로박터속 또는 판토에아속의 어느 것에 속하는 것이라도 좋다.
엔테로박터속의 대표적인 주로서, 엔테로박터 아글로메란스 ATCC 12287주를 들 수 있다.
판토에아속 세균의 대표적인 세균으로서, 판토에아 아나나티스, 판토에아 스튜아르티, 판토에아 아글로메란스, 판토에아 시트레아(Pantoea citrea)를 들 수 있다. 구체적으로는 하기의 균주를 들 수 있다.
판토에아 아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614)[참조: 유럽 특허출원 공개 0952221호 명세서]
판토에아 아나나티스 AJ13356주(FERM BP-6615)[참조: 유럽 특허출원 공개0952221호 명세서]
판토에아 아나나티스 AJ13601주(FERM BP-7207)[참조: 유럽 특허출원 공개0952221호 명세서]
이들 주는 분리된 당시는 엔테로박터 아글로메란스로 동정되고, 엔테로박터 아글로메란스로서 기탁되었지만, 상기와 같이, 16S rRNA의 염기 서열 해석 등에 의해, 판토에아 아나나티스로 재분류되어 있다.
에르위니아속 세균으로서는 에르위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 에르위니아 카로토보라(Erwinia carotovora)를 들 수 있고, 클렙시엘라속 세균으로서는 클렙시엘라 플란티콜라(Klebsiella planticola)를 들 수 있다. 구체적으로는 하기의 균주를 들 수 있다.
에르위니아 아밀로보라 ATCC 15580주
에르위니아 카로토보라 ATCC 15713주
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13399주(FERM BP-6600)[참조: 유럽 특허출원 공개955368호 명세서]
클렙시엘라 플란티콜라 AJ13410주(FERM BP-6617)[참조: 유럽 특허출원 공개 955368호 명세서]
본 발명의 세균은 상기와 같은 장내세균이고, 본래적으로 GCD 활성을 갖고, L-아미노산 생산능을 갖는 장내세균과에 속하는 세균이다. 본래적으로 GCD 활성을 갖는 장내세균이란 야생주 또는 gcd 유전자 비개변주가 GCD 활성을 갖는 세균을 의미한다. 이러한 장내세균과에 속하는 세균으로서는 판토에아, 엔테로박터속, 에르위니아속, 클렙시엘라속, 프로비덴시아속, 살모넬라속, 세라티아속, 모르가넬라속, 및 예르시니아속, 시트로박터(Citrobacter)속, 프로테우스(Proteus)속 등의 속에 속하는 세균을 들 수 있다. 보다 구체적으로는, Int. J. Syst. Bacteriol., 39(1), 61-67, 1989에 기재된 세균을 들 수 있다.
에세리키아 콜라이는 gcd 유전자를 갖고, GCD 주효소(apoenzyme)를 생산하지만, PQQ 생산능을 갖지 않기 때문에, PQQ 비첨가 하에서는 GCD 활성을 갖지 않는다. 그러나, 어떤 외래 유전자를 발현시키면 PQQ를 대체하는 물질이 생성되고, GCD 활성을 발현하는 것이 알려져 있다[참조: W02006/133898]. 이렇게, 에세리키아속 세균과 같이 통상적으로는 GCD 활성을 갖지 않는 세균이라도, GCD 활성을 발현하는 상태에 있는 세균은 본 발명에 말하는 「본래적으로 GCD 활성을 갖는 장내세균」에 포함된다. GCD 활성에 대해서는 후술한다.
이하, 상기와 같은 세균에 L-아미노산 생산능을 부여하는 방법, 또는 상기와 같은 세균 L-아미노산 생산능을 증강하는 방법에 대하여 예시한다.
L-아미노산 생산능을 부여하기 위해서는 영양 요구성 변이주, L-아미노산의 유사체 내성주 또는 대사 제어 변이주의 취득이나, L-아미노산의 생합성계 효소의 발현이 증강된 재조합주의 창제 등, 종래, 코리네형 세균 또는 에세리키아속 세균 등의 아미노산 생산균의 육종(育種)에 채용되어 온 방법을 적용할 수 있다 [참조: 아미노산 발효, (주)학회출판센터, 1986년 5월 30일 초판 발행, 제77 내지 100페이지]. 여기에서, L-아미노산 생산균의 육종에 있어서, 부여되는 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질은 단독이라도 좋고, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, 발현이 증강되는 L-아미노산 생합성계 효소도, 단독이라도 좋고, 2종 또는 3종 이상이라도 좋다. 또한, 영양 요구성, 유사체 내성, 대사 제어 변이 등의 성질의 부여와, 생합성계 효소의 증강이 조합되어도 좋다.
L-아미노산 생산능을 갖는 영양 요구성 변이주, 유사체 내성주, 또는 대사 제어 변이주를 취득하기 위해서는 친주 또는 야생주를 통상적인 변이 처리, 즉 X선이나 자외선의 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 등의 변이제 처리 등에 의해 처리하고, 수득된 변이주 중에서, 영양 요구성, 유사체 내성, 또는 대사 제어 변이를 나타내고, L-아미노산 생산능을 갖는 것을 선택함으로써 수득할 수 있다.
또한, L-아미노산 생산능의 부여 또는 증강은 유전자 재조합에 의해, 효소 활성을 증강함으로써 실시할 수 있다. 효소 활성의 증강은 예를 들어, L-아미노산의 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현이 증강되도록 세균을 개변하는 방법을 들 수 있다. 유전자의 발현을 증강하기 위한 방법으로서는 유전자를 포함하는 DNA 단편을, 적당한 플라스미드, 예를 들어 미생물내에서 플라스미드의 복제 증식 기능을 담당하는 유전자를 적어도 포함하는 플라스미드 벡터에 도입한 증폭 플라스미드를 도입하는 것, 또는, 이들의 유전자를 염색체상에서 접합, 전이 등에 의해 카피수를 증가시키는 것, 또한 이들의 유전자의 프로모터 영역에 변이를 도입함으로써 달성할 수도 있다[참조: 국제공개 팜플렛 W095/34672호].
상기 증폭 플라스미드 또는 염색체상에 목적 유전자를 도입하는 경우, 이들의 유전자를 발현시키기 위한 프로모터는 목적으로 하는 세균에 있어서 기능하는 것이라면 어떠한 프로모터라도 상관없고, 사용하는 유전자 자체의 프로모터라도 좋으며, 개변한 것이라도 좋다. 코리네형 세균에서 강력하게 기능하는 프로모터를 적절하게 선택하는 것이나, 프로모터의 -35, -10 영역을 컨센서스 서열에 근접함으로써도 유전자의 발현량의 조절이 가능하다. 이상과 같은, 효소 유전자의 발현을 증강하는 방법은 WO00/18935호 팜플렛, 유럽 특허출원 공개1010755호 명세서 등에 기재되어 있다.
이하, 세균에 L-아미노산 생산능을 부여하는 구체적 방법, 및 L-아미노산 생산능이 부여된 세균에 대하여 예시한다. 한편, 이하의 기재는 주로 에세리키아속 세균에 관한 것이지만, 이하의 방법은 본 발명에 사용하는 장내세균에도 적용할 수 있다.
L-트레오닌 생산균
L-트레오닌 생산능을 갖는 미생물로서 바람직한 것은, L-트레오닌 생합성계 효소의 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강된 세균을 들 수 있다. L-트레오닌 생합성계 효소로서는 아스파르토키나제 III(lysC), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제(asd), thr 오페론에 암호화되는 아스파르토키나제 I(thrA), 호모세린 키나제(thrB), 트레오닌 신타제(thrC), 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제(아스파르테이트 트랜스아미나제)(aspC)를 들 수 있다. 괄호속은 이의 유전자의 약어 기호이다(이하의 기재에 있어서도 동일함). 이들 효소 중에서는 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 아스파르토키나제 I, 호모세린 키나제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 및 트레오닌 신타제가 특히 바람직하다. L-트레오닌 생합성계 유전자는 트레오닌 분해가 억제된 세균에 도입해도 좋다. 트레오닌 분해가 억제된 에세리키아속 세균으로서는 예를 들어, 트레오닌 데하이드로게나제 활성이 결손된 TDH6주[참조: 일본 공개특허공보 2001-346578호] 등을 들 수 있다.
L-트레오닌 생합성계 효소는 최종 산물의 L-트레오닌에 의해 효소 활성이 억제된다. 따라서, L-트레오닌 생산균을 구축하기 위해서는 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 L-트레오닌 생합성계 유전자를 개변하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 thrA, thrB, thrC 유전자는 트레오닌 오페론을 구성하고 있지만, 트레오닌 오페론은 어테뉴에이터(attenuator) 구조를 형성하고 있고, 트레오닌 오페론의 발현은 배양액 중의 이소류신, 트레오닌에 저해를 받고, 어테뉴에이션(attenuation)에 의해 발현이 억제된다. 이러한 개변은 어테뉴에이션 영역의 리더 서열 또는, 어테뉴에이터를 제거함으로써 달성할 수 있다[참조: Lynn, S. P., Burton, W. S., Donohue, T. J., Gould, R. M., Gumport, R. I., and Gardner, J. F. J. Mol. Biol. 194:59-69(1987); 국제공개 제02/26993호 팜플렛; 국제공개 제2005/049808호 팜플렛].
트레오닌 오페론의 상류에는 천연 프로모터가 존재하지만, 비천연의 프로모터로 치환하여도 좋고[참조: W098/04715호 팜플렛], 트레오닌 생합성 관여 유전자의 발현이 람다 파지의 리프레서 및 프로모터에 의해 지배되는 바와 같은 트레오닌 오페론을 구축해도 좋다[참조: 유럽 특허 제0593792호 명세서]. 또한, L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 세균을 개변하기 위해서, α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHV)에 내성인 균주를 선발할 수도 있다.
이렇게 L-트레오닌에 의한 피드백 저해를 받지 않도록 개변된 트레오닌 오페론은 숙주 내에서 카피수가 상승하고 있거나, 또는 강력한 프로모터에 연결되어, 발현량이 향상되고 있는 것이 바람직하다. 카피수의 상승은 플라스미드에 의한 증폭 외에, 트랜스포존, Mu-파지 등으로 게놈상에 트레오닌 오페론을 전이시킴으로써도 달성할 수 있다.
L-트레오닌 생합성계 효소 이외에도, 해당계(解糖系), TCA 회로, 호흡연쇄에 관한 유전자나 유전자의 발현을 제어하는 유전자, 당의 도입 유전자를 강화하는 것도 적합하다. 이들의 L-트레오닌 생산에 효과가 있는 유전자로서는 트랜스하이드로게나제(pntAB) 유전자[참조: 유럽 특허733712호 명세서], 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(pepC)[참조: 국제공개95/06114호 팜플렛], 포스포에놀피루브산 신타제 유전자(pps)[참조: 유럽 특허877090호 명세서], 코리네형 세균 또는 바실러스속 세균의 피루브산 카복실라제 유전자[참조: 국제공개99/18228호 팜플렛, 유럽출원공개1092776호 명세서]를 들 수 있다.
또한, L-트레오닌에 내성을 부여하는 유전자, L-호모세린에 내성을 부여하는 유전자의 발현을 강화하는 것이나, 숙주에 L-트레오닌 내성, L-호모세린 내성을 부여하는 것도 적합하다. 내성을 부여하는 유전자로서는 rhtA 유전자[참조: Res. Microbiol. 154: 123-135(2003)], rhtB 유전자[참조: 유럽 특허출원 공개 제0994190호 명세서], rhtC 유전자[참조: 유럽 특허출원 공개 제1013765호 명세서], yfiK, yeaS 유전자[참조: 유럽 특허출원 공개 제1016710호 명세서]를 들 수 있다. 또한 숙주에 L-트레오닌 내성을 부여하는 방법은 유럽 특허출원 공개 제0994190호 명세서나, 국제공개 제90/04636호 팜플렛에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
L-트레오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 이.콜라이 TDH-6/pVIC40(VKPM B-3996)[참조: 미국특허 제5,175,107호, 미국특허 제5,705,371호], 이.콜라이 472T23/pYN7(ATCC 98081)[참조: 미국특허 제5,631,157호], 이.콜라이 NRRL-21593[참조: 미국특허 제5,939,307호], 이.콜라이 FERM BP-3756[참조: 미국특허 제5,474,918호], 이.콜라이 FERM BP-3519 및 FERM BP-3520[참조: 미국특허 제5,376,538호], 이.콜라이 MG442[참조: Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 14, 947-956(1978)], 이.콜라이 VL643 및 VL2055[참조: EP 1149911 A] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
TDH-6주는 thrC 유전자를 결손하고, 수크로스 자화성이고, 또한, 이의 ilvA 유전자가 리키(leaky) 변이를 갖는다. 당해 주는 또한, rhtA 유전자에, 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대한 내성을 부여하는 변이를 갖는다. B-3996주는 RSF1010 유래 벡터에, 변이 thrA 유전자를 포함하는 thrA*BC 오페론을 삽입한 플라스미드 pVIC40을 보유한다. 당해 변이 thrA 유전자는 트레오닌에 의한 피드백 저해가 실질적으로 해제된 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화한다. B-3996주는 1987년 11월 19일, 올유니언 사이언티픽 센터 오브 안티비오틱스[All-Union Scientific Center of Antibiotics][Nagatinskaya Street 3-A, 117105 Moscow, Russia]에, 수탁번호 RIA 1867로 기탁되어 있다. 당해 주는 또한, 1987년 4월 7일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈[Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM)][1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia]에, 수탁번호 B-3996으로 국제기탁되어 있다.
이.콜라이 VKPM B-5318[참조: EP 0593792B]도, L-트레오닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주로서 사용할 수 있다. B-5318주는 이소류신 비요구성이고, 플라스미드 pVIC40 중의 트레오닌 오페론의 제어 영역이, 온도 감수성 람다 파지(lambda-phage) C1 리프레서 및 PR 프로모터에 의해 치환되어 있다. VKPM B-5318은 1990년 5월 3일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)[1 Dorozhny proezd, 1 Moscow 117545, Russia]에, 수탁번호 VKPM B-5318로 국제기탁되어 있다.
에세리키아 콜라이의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 thrA 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 337 내지 2799, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrA 유전자는 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrL 유전자와 thrB 유전자 사이에 위치한다. 이.콜라이의 호모세린 키나제를 암호화하는 thrB 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 2801 내지 3733, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrB 유전자는 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrA 유전자와 thrC 유전자 사이에 위치한다. 이.콜라이의 트레오닌 신타제를 암호화하는 thrC 유전자는 밝혀져 있다(뉴클레오타이드 번호 3734 내지 5020, GenBank accession NC_000913.2, gi: 49175990). thrC 유전자는 이.콜라이 K-12의 염색체에 있어서, thrB 유전자와 yaaX 개방 판독 프레임 사이에 위치한다. 이들 3가지 유전자는 모두 단일의 트레오닌 오페론으로서 기능한다. 트레오닌 오페론의 발현을 증대시키기 위해서는, 전사에 영향을 주는 어테뉴에이터 영역을, 바람직하게는 오페론으로부터 제거한다[참조: W02005/049808, W02003/097839].
트레오닌에 의한 피드백 저해에 내성의 아스파르토키나제 호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 변이 thrA 유전자, 및, thrB 유전자 및 thrC 유전자는 트레오닌 생산주 이.콜라이 VKPM B-3996에 존재하는 주지의 플라스미드 pVIC40으로부터 하나의 오페론으로서 취득할 수 있다. 플라스미드 pVIC40의 상세한 것은 미국특허 제5,705,371호에 기재되어 있다.
rhtA 유전자는 글루타민 수송계의 요소를 암호화하는 glnHPQ 오페론에 가까운 이.콜라이 염색체의 18분에 존재한다. rhtA 유전자는 0RF1(ybiF 유전자, 뉴클레오타이드 번호 764 내지 1651, GenBank accession number AAA218541, gi: 440181)과 동일하고, pexB 유전자와 ompX 유전자 사이에 위치한다. ORF1에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 유닛은 rhtA 유전자라고 불린다(rht: 호모세린 및 트레오닌에 내성). 또한, rhtA23 변이가 ATG 개시 코돈에 대하여 -1 위치의 G→A 치환인 것이 판명되어 있다[참조: ABSTRACTS of the 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Moleular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457, EP 1013765 A].
이.콜라이의 asd 유전자는 이미 밝혀져 있고(뉴클레오타이드 번호 3572511 내지 3571408, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16131307), 이의 유전자의 염기 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득할 수 있다[참조: White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)]. 다른 미생물의 asd 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.
또한, 이.콜라이의 aspC 유전자도 이미 밝혀져 있고(뉴클레오타이드 번호 983742 내지 984932, GenBank accession NC_000913.1, gi: 16128895), PCR에 의해 수득할 수 있다. 다른 미생물의 aspC 유전자도 동일하게 수득할 수 있다.
L-리신 생산균
에세리키아속에 속하는 L-리신 생산균의 예로서는 L-리신 유사체에 내성을 갖는 변이주를 들 수 있다. L-리신 유사체는 에세리키아속에 속하는 세균의 생육을 저해하지만, 이러한 저해는 L-리신이 배지에 공존할 때에는 완전히 또는 부분적으로 해제된다. L-리신 유사체의 예로서는 옥사리신, 리신 하이드록사메이트, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), γ-메틸리신, α-클로로카프로락탐 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 리신 유사체에 대하여 내성을 갖는 변이주는 에세리키아속에 속하는 세균을 통상의 인공 변이 처리로 처리함으로써 수득할 수 있다. L-리신의 생산에 유용한 세균주의 구체예로서는 에세리키아 콜라이 AJ11442[참조: FERM BP-1543, NRRL B-12185: 미국특허 제4,346,170호] 및 에세리키아 콜라이 VL611을 들 수 있다. 이들의 미생물에서는 아스파르토키나제의 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제되어 있다.
L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-리신 생합성계 효소의 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강되어 있는 주도 들 수 있다. 이러한 효소의 예로서는 디하이드로디피콜린산 신타제(dapA), 아스파르토키나제(lysC), 디하이드로디피콜린산 리덕타제(dapB), 디아미노피멜산 데카복실라제(lysA), 디아미노피멜산 데하이드로게나제(ddh)[참조: 미국특허 제6,040,160호], 포스포에놀피루브산 카복실라제(ppc), 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제 유전자(asd), 디아미노피멜산 에피머라제(dapF), 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제(dapD), 석시닐 디아미노피멜산 데아실라제(dapE) 및 아스파르타제(aspA)[참조: EP 1253195 A]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들의 효소 중에서는 디하이드로디피콜린산 리덕타제, 디아미노피멜산 데카복실라제, 디아미노피멜산 데하이드로게나제, 포스포에놀피루브산 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제, 디아미노피멜산 에피머라제, 아스파르테이트 세미알데히드 데하이드로게나제, 테트라하이드로디피콜린산 석시닐라제, 및, 석시닐 디아미노피멜산 데아실라제가 특히 바람직하다. 또한, 친주는 에너지 효율에 관여하는 유전자(cyo)[참조: EP1170376 A], 니코틴아미드 뉴클레오타이드 트랜스하이드로게나제를 암호화하는 유전자(pntAB)[참조: 미국특허 제5,830,716호], ybjE 유전자[참조: W02005/073390], 또는, 이들의 조합의 발현 수준이 증대하고 있어도 좋다.
L-리신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 주도 들 수 있다. L-리신의 생합성 경로로부터 분기하여 L-리신 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는 효소의 예로서는 호모세린 데하이드로게나제, 리신 데카복실라제[참조: 미국특허 제5,827,698호], 및, 말산 효소[참조: W02005/010175]를 들 수 있다.
바람직한 L-리신 생산균으로서, 에세리키아 콜라이 WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2를 들 수 있다[참조: WO2006/078039]. 이 균주는 리신데카복실라제를 암호화하는 cadA 및 ldcC 유전자가 파괴된 WC196주에, 미국특허 제6040160에 기재된 플라스미드 pCABD2가 도입됨으로써 수득된 주이다. WC196주는 이.콜라이 K-12에 유래하는 W3110주로부터 취득된 주이며, 352번째의 트레오닌을 이소류신으로 치환함으로써 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 아스파르토키나제 III를 암호화하는 변이형 lysC 유전자[참조: 미국특허 제5,661,012호]로 W3110주의 염색체상의 야생형 lysC 유전자를 치환한 후, AEC 내성을 부여함으로써 육종된[참조: 미국특허 제5,827,698호]. WC196주는 에세리키아 콜라이 AJ13069로 명명되고, 1994년 12월 6일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-14690으로서 기탁되고, 1995년 9월 29일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-5252가 부여되어 있다[참조: 미국특허 제5,827,698호]. WC196ΔcadAΔldc 자체도, 바람직한 L-리신 생산균이다. pCABD2는 L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에세리키아 콜라이 유래의 디하이드로디피콜린산 합성효소(DDPS)를 암호화하는 변이형 dapA 유전자와, L-리신에 의한 피드백 저해가 해제된 변이를 갖는 에세리키아 콜라이 유래의 아스파르토키나제 III을 암호화하는 변이형 lysC 유전자와, 에세리키아 콜라이 유래의 디하이드로디피콜린산 리덕타제를 암호화하는 dapB 유전자와, 브레비박테리움 락토퍼멘텀(Brevibacterium lactofermentum) 유래 디아미노피멜산 데하이드로게나제를 암호화하는 ddh 유전자를 포함하고 있다.
L-시스테인 생산균
세균의 L-시스테인 생산능은 L-시스테인 생합성 경로의 효소, 또는 L-세린 등, 동일 경로의 기질이 되는 화합물의 생성에 관여하는 효소, 예를 들어, 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제, 또는 세린 아세틸트랜스퍼라제 등의 활성을 증강함으로써, 향상시킬 수 있다. 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 세린에 의한 피드백 저해를 받지만, 이 피드백 저해가 저감 또는 해제된 변이형 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이형 serA 유전자를 세균에 보유시킴으로써, 당해 효소 활성을 증강할 수 있다.
또한, 세린 아세틸트랜스퍼라제는 L-시스테인에 의한 피드백 저해를 받는다. 따라서, 이 피드백 저해가 저감 또는 해제된 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 변이형 cysE 유전자를 세균에 보유시킴으로써, 당해 효소 활성을 증강할 수 있다. 에세리키아 콜라이의 SAT를 암호화하는 유전자로서, cysE가 야생주 및 L-시스테인 분비 변이주에 의해 클로닝되고, 염기 서열이 밝혀져 있다[참조: Denk, D. and Boeck, A., J. General Microbiol., 133, 515-525(1987)]. 이의 염기 서열 및 당해 염기 서열이 암호화하는 아미노산 서열을, 서열번호 37 및 38에 나타낸다.
또한, 황산염/티오황산염 수송계의 활성을 증강함으로써도, L-시스테인 생산능을 향상시킬 수 있다. 황산염/티오황산염 수송계 단백질군은 cysPTWA 유전자 클러스터로 암호화되어 있다[참조: 일본 공개특허공보 2005-137369호, EP 1528108호 명세서].
또한, 세균의 L-시스테인 생산능은 yeaS 유전자[참조: 유럽 특허출원 공개 제1016710호 명세서]의 발현을 상승시킴으로써도, 향상시킬 수 있다. yeaS 유전자의 염기 서열 및 당해 유전자가 암호화되는 아미노산 서열을, 서열번호 39 및 40에 나타낸다. 세균에서는 ATG 이외에도 GTG 등의 여러 가지 코돈이 개시 코돈으로서 사용되고 있는 것이 알려져 있다[참조: http//depts.washington.edu/agro/genomes/students/stanstart.htm]. 서열번호 39 및 4O에 있어서, 최초의 코돈 gtg에 상당하는 아미노산을 Val로 표기하고 있지만, 실제는 Met일 가능성이 높다.
L-시스테인 생산능을 갖는 에세리키아속 세균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 피드백 저해 내성의 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 다른 cysE 대립유전자로 형질전환된 이.콜라이 JM15[참조: 미국특허 제6,218,168호, 러시아 특허출원 제2003121601호], 세포에 독성 물질을 배출하는 데 적합한 단백질을 암호화하는 과잉 발현 유전자를 갖는 이.콜라이 W3110[참조: 미국특허 제5,972,663호], 시스테인 데설프하이드라제 활성이 저하된 이.콜라이주[참조: JP11155571A2], cysB 유전자에 의해 암호화되는 양의 시스테인 레귤론(regulon)의 전사 제어 인자의 활성이 상승된 이.콜라이 W3110[참조: WO0127307A1] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
세균의 L-시스테인 생산능은 yhaM 유전자에 의해 암호화되는 단백질(이하, 「YhaM」이라고 기재하는 경우가 있다)의 활성이 저하되도록 개변함으로써, 향상시킬 수 있다. yhaM 유전자는 ECK3099, b4470, yhaN 유전자와 동의이며, 이전에는 b3109, 또는 b3108이라고도 불리고 있었다.
L-시스테인 생산능을 갖는 판토에아속 세균으로서는 시스테인 데설프하이드라제 활성이 저하되도록 개변된 판토에아 아나나티스 균주, 및, 또한 L-시스테인에 의한 피드백 저해가 저감된 변이형 세린 아세틸트랜스퍼라제를 암호화하는 유전자를 갖는 판토에아 아나나티스 균주를 들 수 있다. 이러한 L-시스테인 생산균을 육종하기 위한 친주로서는 판토에아 아나나티스 AJ13355주, SC17주, 및 SC17(0)주를 들 수 있다. AJ13355주는 시즈오카현 이와타시의 토양으로부터, 저pH로 L-글루탐산 및 탄소원을 포함하는 배지에서 증식할 수 있는 주로서 분리된 주이며, 동일주로부터 점액질 저생산 변이주로서 선택된 주가, SC17주이다[참조: 미국특허 제6,596,517호]. AJ13355주는 1998년 2월 19일에, 통산성 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현명칭, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 주소 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 츄오 다이6)에, 수탁번호 FERM P-16644로서 기탁되고, 1999년 1월 11일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되고, 수탁번호 FERM BP-6614가 부여되어 있다. SC17(0)주는 판토에아 아나나티스에 있어서 유전자를 파괴하기 위해서, λ Red 유전자 산물에 내성인 균주로서 구축된 주이다[참조: 참고예 1].
SC17주는 개별 번호 AJ416이 부여되고, 2009년 2월 4일에, 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(주소 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 츄오 다이6)에 국제기탁되고, 수탁번호 FERM BP-11091이 부여되어 있다. 또한, SC17(0)주는 2005년 9월 21일에 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of lndustrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(주소: Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)에 수탁번호 VKPM B-9246 하에 국제기탁되어 있다.
세균이 생산한 L-시스테인은 배지 중에서, 디설파이드 결합에 의해 일부가 L-시스틴으로 변환하는 것이 있다. 또한, 후술하는 바와 같이, L-시스테인과 배지에 포함되는 티오황산의 반응에 의해 S-설포시스테인이 생성되는 경우가 있다[참조: Szczepkowski T.W., Naturer vol. 182(1958)]. 또한, 세균의 세포내에서 생성된 L-시스테인은 세포 중에 존재하는 케톤 또는 알데히드, 예를 들어 피루브산과 축합하고, 헤미티오케탈을 중간체로서 티아졸리딘 유도체가 생성되는 경우가 있다[참조: 특허 제2992010 참조]. 이들의 티아졸리딘 유도체 및 헤미티오케탈은 평형 혼합물로서 존재하는 경우가 있다. 따라서, 본 발명에서 L-시스테인 생산능이란 L-시스테인만을 배지 중 또는 균체내에 축적하는 능력에 한정되지 않고, L-시스테인에 더하여, L-시스틴, 또는 이들의 유도체, 예를 들어 S-설포시스테인, 티아졸리딘 유도체, 또는 헤미티오케탈, 또는 이들의 혼합물을 배지 중에 축적하는 능력도 포함된다.
L-류신 생산균
L-류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 류신 내성의 이.콜라이 주[참조: 57주(VKPM B-7386, 미국특허 제6,124,121호)] 또는 β-2-티에닐알라닌, 3-하이드록시류신, 4-아자류신, 5,5,5-트리플루오로류신 등의 류신 유사체 내성의 이.콜라이주[참조: 일본 특허공보 제(소)62-34397호 및 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호], W096/06926에 기재된 유전자 공학적 방법으로 수득된 이.콜라이주, 이.콜라이 H-9068[참조: 일본 공개특허공보 제(평)8-70879호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용하는 세균은 L-류신 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 좋다. 이러한 유전자의 예로서는 바람직하게는 L-류신에 의한 피드백 저해가 해제된 이소프로필 말레이트 신타제를 암호화하는 변이 leuA 유전자[참조: 미국특허 제6,403,342호]로 대표된다, leuABCD 오페론의 유전자를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하는 세균은 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량되어 있어도 좋다. 이러한 유전자의 예로서는 b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: EP1239041 A2]를 들 수 있다.
L-히스티딘 생산균
L-히스티딘 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 이.콜라이 24주(VKPM B-5945, RU2003677), 이.콜라이 80주(VKPM B-7270, RU2119536), 이.콜라이 NRRL B-12116 - B12121[참조: 미국특허 제4,388,405호], 이.콜라이 H-9342(FERM BP-6675) 및 H-9343(FERM BP-6676)[참조: 미국특허 제6,344,347호], 이.콜라이 H-9341(FERM BP-6674)[참조: EP1085087], 이.콜라이 AI80/pFM201[참조: 미국특허 제6,258,554호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
L-히스티딘 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-히스티딘 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는 ATP 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(hisG), 포스포리보실 AMP 사이클로하이드롤라제 유전자(hisI), 포스포리보실-ATP 피로포스포하이드롤라제 유전자(hisIE), 포스포리보실포름이미노-5-아미노이미다졸 카르복사미드 리보타이드 이소머라제 유전자(hisA), 아미도트랜스퍼라제 유전자(hisH), 히스티디놀 포스페이트 아미노트랜스퍼라제 유전자(hisC), 히스티디놀 포스파타제 유전자(hisB), 히스티디놀 데하이드로게나제 유전자(hisD) 등을 들 수 있다.
hisG 및 hisBHAFI에 암호화되는 L-히스티딘 생합성계 효소는 L-히스티딘에 의해 저해되는 것이 알려져 있고, 따라서, L-히스티딘 생산능은 ATP 포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자(hisG)에 피드백 저해에 대한 내성을 부여하는 변이를 도입함으로써 효율적으로 증가시킬 수 있다[참조: 러시아특허 제2003677호 및 제2119536호].
L-히스티딘 생산능을 갖는 주의 구체예로서는 L-히스티딘 생합성계 효소를 암호화하는 DNA를 보유하는 벡터를 도입한 이.콜라이 FERM-P 5038 및 5048[참조: 일본 공개특허공보 제(소)56-005099호], 아미노산 수송의 유전자를 도입한 이.콜라이주[참조: EP1016710A], 설파구아니딘, DL-1,2,4-트리아졸-3-알라닌 및 스트렙토마이신에 대한 내성을 부여한 이.콜라이 80주[참조: VKPM B-7270, 러시아 특허 제2119536호] 등을 들 수 있다.
L-글루탐산 생산균
L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 이.콜라이 VL334thrC+(EP 1172433) 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이.콜라이 VL334(VKPM B-1641)는 thrC 유전자 및 ilvA 유전자에 변이를 갖는 L-이소류신 및 L-트레오닌 요구성 주이다[참조: 미국특허 제4,278,765호]. thrC 유전자의 야생형 대립유전자는 야생형 이.콜라이 K12주(VKPM B-7)의 세포에서 증식한 박테리오파지 P1을 사용하는 일반적 형질도입법에 의해 도입되었다. 이 결과, L-이소류신 요구성의 L-글루탐산 생산균 VL334thrC+(VKPM B-8961)가 수득되었다.
L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-글루탐산 생합성계 효소 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강된 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이러한 유전자의 예로서는 글루탐산 데하이드로게나제(gdhA), 글루타민 신테타제(glnA), 글루탐산 신테타제(gltAB), 이소시트르산 데하이드로게나제(icdA), 아코니트산 하이드라타제(acnA, acnB), 시트르산 신타제(gltA), 메틸 시트르산 신타제(prpC), 포스포에놀피루브산 카복실라제(ppc), 피루브산 데하이드로게나제(aceEF, lpdA), 피루브산 키나제(pykA, pykF), 포스포에놀피루브산 신타제(ppsA), 에놀라제(eno), 포스포글리세로뮤타제(pgmA, pgmI), 포스포글리세린산 키나제(pgk), 글리세르알데히드-3-인산 데하이드로게나제(gapA), 트리오스 인산 이소머라제(tpiA), 프럭토스 비스인산 알돌라제(fbp), 포스포프럭토키나제(pfkA, pfkB), 글루코스 인산 이소머라제(pgi) 등을 들 수 있다. 이들의 효소 중에서는 글루탐산 데하이드로게나제, 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카복실라제, 및 메틸 시트르산 신타제가 바람직하다.
시트르산 신테타제 유전자, 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자, 및/또는 글루탐산 데하이드로게나제 유전자의 발현이 증대되도록 개변된 주의 예로서는 EP1078989A, EP955368A 및 EP952221A에 개시된 것을 들 수 있다.
세균의 L-글루탐산 합성능은 호흡연쇄에 관여하는 효소, 예를 들어 시안 내성 호흡 말단 산화효소(cioA, cioB)의 활성을 높임으로써, 향상시킬 수 있다.
L-글루탐산 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기하여 L-글루탐산 이외의 화합물의 합성을 촉매하는 효소, 또는 L-글루탐산을 분해 또는 소비하는 반응을 촉매하는 효소의 활성이 저하 또는 결손되어 있는 주도 들 수 있다. 이러한 효소의 예로서는 이소시트르산 리아제(aceA), α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(sucA), 포스포트랜스아세틸라제(pta), 아세트산 키나제(ack), 아세토하이드록시산 신타제(ilvG), 아세토락트산 신타제(ilvI), 포름산 아세틸트랜스퍼라제(pfl), 락트산 데하이드로게나제(ldh), 글루탐산 데카복실라제(gadAB), γ-글루타밀 전이효소(ggt), γ-글루탐산시스테인 합성효소(gshA), γ-글루탐산푸트레신 합성효소(ycjK) 등을 들 수 있다. α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 결손되거나, 또는, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 활성이 저하된 에세리키아속에 속하는 세균, 및, 이들의 취득 방법은 미국특허 제5,378,616호 및 제5,573,945호에 기재되어 있다.
구체예로서는 하기의 것을 들 수 있다.
이.콜라이 W3110sucA::Kmr
이.콜라이 AJ12624(FERM BP-3853)
이.콜라이 AJ12628(FERM BP-3854)
이.콜라이 AJ12949(FERM BP-4881)
이.콜라이 W3110sucA::Kmr은 이.콜라이 W3110의 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제 유전자(이하,「sucA 유전자」라고도 함)를 파괴함으로써 수득된 주이다. 이 주는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 완전히 결손하고 있다.
L-글루탐산 생산균의 다른 예로서는 에세리키아속에 속하고, 아스파라긴산 대사 길항 물질에 내성을 갖는 것을 들 수 있다. 이들의 주는 α-케토글루타레이트 데하이드로게나제를 결손하고 있어도 좋고, 예를 들어, 이.콜라이 AJ13199(FERM BP-5807)[참조: 미국특허 제5,908,768호], 또한 L-글루탐산 분해능이 저하된 FERM P-12379[참조: 미국특허 제5,393,671호]; AJ13138(FERM BP-5565)[참조: 미국특허 제6,110,714호] 등을 들 수 있다.
판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균의 예로서는 상기 판토에아 아나나티스 AJ13355주를 들 수 있다.
또한, 판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균으로서, α-케토글루타레이트 데하이드로게나제(αKGDH) 활성이 결손되거나, 또는, αKGDH 활성이 저하된 판토에아속에 속하는 세균을 들 수 있다. 이러한 주로서는 AJ13355주의 αKGDH-E1 서브유닛 유전자(sucA)를 결손시킨 AJ13356[참조: 미국특허 제6,331,419호], 및 AJ13355주로부터 점액질 저생산 변이주로서 선택된 SC17주 유래의 sucA 유전자 결손 주인 SC17sucA[참조: 미국특허 제6,596,517호]가 있다. AJ13356은 1998년 2월 19일, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(현명칭 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-16645로서 기탁되었고, 1999년 1월 11일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-6616이 부여되어 있다. AJ13355 및 AJ13356은 상기 기탁 기관에 엔테로박터 아글로메란스로서 기탁되어 있지만, 본 명세서에서는 판토에아 아나나티스로서 기재한다. 또한, SC17sucA주는 개별 번호 AJ417주가 부여되어, 2004년 2월 26일에 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 수탁번호 FERM BP-08646으로서 기탁되어 있다.
또한, 판토에아 아나나티스의 L-글루탐산 생산균으로서, SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주, AJ13601주, NP106주, 및 NA1주를 들 수 있다. SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주는 SC17sucA주에, 에세리키아 콜라이 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA), 포스포에놀피루브산 카복실라제 유전자(ppsA), 및 글루타메이트 데하이드로게나제 유전자(gdhA)를 포함하는 플라스미드 RSFCPG, 및, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 유래의 시트르산 신타제 유전자(gltA)를 포함하는 플라스미드 pSTVCB를 도입하여 수득한 주이다. AJ13601주는 이 SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB주로부터 저pH하에서 고농도의 L-글루탐산에 내성을 나타내는 주로서 선택된 주이다. 또한, NP106주는 실시예에 기재한 바와 같이, AJ13601주로부터 플라스미드 RSFCPG+pSTVCB를 탈락시킨 주이다. AJ13601주는 1999년 8월 18일에, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(우편번호 305-8566 일본국 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반치 츄오 다이6)에 수탁번호 FERM P-17516으로서 기탁되었고, 2000년 7월 6일에 부다페스트 조약에 기초하는 국제기탁으로 이관되어, 수탁번호 FERM BP-7207이 부여되어 있다. 또한, 상기 RSFCPG의 gltA 유전자를 prpC로 치환한 RSFPPG[참조: WO2008/020654, 하기 실시예]를 갖는 NP106주도, 바람직한 L-글루탐산 생산균이다.
L-페닐알라닌 생산균
L-페닐알라닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드로게나제 및 티로신 리프레서를 결손한 이.콜라이AJ12739(tyrA::Tn10, tyrR)(VKPM B-8197)(WO03/044191), 피드백 저해가 해제된 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드라타제를 암호화하는 변이형 pheA34 유전자를 보유하는 이.콜라이 HW1089(ATCC 55371)[참조: 미국특허 제5,354,672호], 이.콜라이MWEC101-b[참조: KR8903681], [이.콜라이 NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 및 NRRL B-12147[참조: 미국특허 제4,407,952호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 친주로서, 피드백 저해가 해제된 코리슴산 뮤타제-프레펜산 데하이드라제를 암호화하는 유전자를 보유하는 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHAB](FERM BP-3566), 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659), 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662) 및 AJ 12604라고 명명된 이.콜라이 K-12[W3110(tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB](FERM BP-3579)도 사용할 수 있다[참조: EP 488424 B1]. 또한, yedA 유전자 또는 yddG 유전자에 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-페닐알라닌 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원 공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1, WO03/044192].
L-트립토판 생산균
L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 변이 trpS 유전자에 의해 암호화되는 트립토파닐-tRNA 신테타제가 결손된 이.콜라이 JP4735/pMU3028(DSM10122) 및 JP6015/pMU91(DSM10123)[참조: 미국특허 제5,756,345호], 세린에 의한 피드백 저해를 받지 않는 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 serA 대립유전자 및 트립토판에 의한 피드백 저해를 받지 않는 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 trpE 대립유전자를 갖는 이.콜라이 SV164(pGH5)[참조: 미국특허 제6,180,373호], 트립토파나제가 결손된 이.콜라이AGX17(pGX44)(NRRL B-12263) 및 AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)[참조: 미국특허 제4,371,614호], 포스포에놀피루브산 생산능이 증대된 이.콜라이 AGX17/pGX50, pACKG4-pps[참조: W09708333, 미국특허 제6,319,696호] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. yedA 유전자 또는 yddG 유전자로 암호화되는 단백질의 활성이 증대된 에세리키아속에 속하는 L-트립토판 생산균도 사용할 수 있다[참조: 미국특허출원공개 2003/0148473 A1 및 2003/0157667 A1].
L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 안트라닐레이트 신타제(trpE), 포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA), 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-인산 신타제(aroG), 3-데하이드로퀴네이트 신타제(aroB), 시킴산 데하이드로게나제(aroE), 시킴산 키나제(aroL), 5-에놀산피루빌시킴산-3-인산 신타제(aroA), 코리슴산 신타제(aroC), 프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제 및, 트립토판 신타제(trpAB)로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강된 주도 들 수 있다. 프레펜산 데하이드라타제 및 코리슴산 뮤타제는 2기능 효소(CM-PD)로서 pheA 유전자에 의해 암호화되어 있다. 이들의 효소 중에서는 포스포글리세레이트 데하이드로게나제, 3-데옥시-D-아라비노헵툴로소네이트-7-인산 신타제, 3-데하이드로퀴네이트 신타제, 시킴산 데하이드라타제, 시킴산 키나제, 5-에놀산피루빌시킴산-3-인산 신타제, 코리슴산 신타제, 프레펜산 데하이드라타제, 코리슴산 뮤타제 프레펜산 데하이드로게나제가 특히 바람직하다. 안트라닐레이트 신타제 및 포스포글리세레이트 데하이드로게나제는 모두 L-트립토판 및 L-세린에 의한 피드백 저해를 받기 때문에, 피드백 저해를 해제하는 변이를 이들의 효소에 도입해도 좋다. 이러한 변이를 갖는 주의 구체예로서는 탈감작형(脫感作型) 안트라닐레이트 신타제를 보유하는 이.콜라이 SV164, 및, 피드백 저해가 해제된 포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 변이 serA 유전자를 포함하는 플라스미드 pGH5[참조: WO 94/08031]를 이.콜라이 SV164에 도입함으로써 수득된 형질전환주를 들 수 있다.
L-트립토판 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 저해 해제형 안트라닐레이트 신타제를 암호화하는 유전자를 포함하는 트립토판 오페론이 도입된 주[참조: 일본 공개특허공보 제(소)57-71397호, 일본 공개특허공보 제(소)62-244382호, 미국특허 제4,371,614호]도 들 수 있다. 또한, 트립토판 오페론(trpBA) 중의 트립토판 신타제를 암호화하는 유전자의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 부여해도 좋다. 트립토판 신타제는 각각 trpA 및 trpB 유전자에 의해 암호화되는 α 및 β 서브유닛으로 이루어진다. 또한, 이소시트레이트 리아제-말레이트 신타제 오페론의 발현을 증대시킴으로써 L-트립토판 생산능을 개량해도 좋다[참조: WO2005/103275].
L-프롤린 생산균
L-프롤린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 ilvA 유전자가 결손되고, L-프롤린을 생산할 수 있는 이.콜라이 702ilvA(VKPM B-8012)[참조: EP 1172433] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용하는 세균은 L-프롤린 생합성에 관여하는 유전자의 1종 이상의 발현을 증대시킴으로써 개량해도 좋다. L-프롤린 생산균에 바람직한 유전자의 예로서는 L-프롤린에 의한 피드백 저해가 해제된 글루타메이트 키나제를 암호화하는 proB 유전자[참조: 독일특허 제3127361호]를 들 수 있다. 또한, 본 발명에 사용하는 세균은 세균의 세포로부터 L-아미노산을 배출하는 단백질을 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대됨으로써 개량해도 좋다. 이러한 유전자로서는 b2682 유전자 및 b2683 유전자(ygaZH 유전자)[참조: EP1239041 A2]를 들 수 있다.
L-프롤린 생산능을 갖는 에세리키아속에 속하는 세균의 예로서는 NRRL B-12403 및 NRRL B-12404[참조: 영국특허 제2075056호], VKPM B-8012[참조: 러시아특허출원 2000124295], 독일특허 제3127361호에 기재된 플라스미드 변이체, Bloom F. R. et al[참조: The 15th Miami winter symposium, 1983, p.34]에 기재된 플라스미드 변이체 등의 이.콜라이 주를 들 수 있다.
L-아르기닌 생산균
L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 이.콜라이 237주(VKPM B-7925)[참조: 미국특허출원공개 2002/058315 A1], 및, 변이 N-아세틸글루타메이트 신타제를 보유하는 이의 유도주[참조: 러시아특허출원 제2001112869호), 이.콜라이 382주(VKPM B-7926)[참조: EP1170358 A1], N-아세틸글루타메이트 신테타제를 암호화하는 argA 유전자가 도입된 아르기닌 생산주[참조: EP1170361 A1] 등의 에세리키아속에 속하는 주를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
L-아르기닌 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 L-아르기닌 생합성계 효소를 암호화하는 유전자의 1종 이상의 발현이 증대된 주도 들 수 있다. 이러한 유전자의 예로서는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제 유전자(argC), 오르니틴 아세틸트랜스퍼라제 유전자(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제 유전자(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제 유전자(argD), 오르니틴 카르바모일 트랜스퍼라제 유전자(argF), 아르기니노석신산 신테타제 유전자(argG), 아르기니노석신산 리아제 유전자(argH), 카르바모일 포스페이트 신테타제 유전자(carAB)를 들 수 있다.
L-발린 생산균
L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 ilvGMEDA 오페론을 과잉 발현하도록 개변된 주[참조: 미국특허 제5,998,178호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 어테뉴에이션에 필요한 ilvGMEDA 오페론의 영역을 제거하여, 생산되는 L-발린에 의해 오페론의 발현이 감쇠하지 않도록 하는 것이 바람직하다. 또한, 오페론의 ilvA 유전자가 파괴되고, 트레오닌 데아미나제 활성이 감소되는 것이 바람직하다.
L-발린 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 아미노아실 t-RNA 신테타제의 변이를 갖는 변이주[참조: 미국특허 제5,658,766호]도 들 수 있다. 예를 들어, 이소류신 tRNA 신테타제를 암호화하는 ileS 유전자에 변이를 갖는 이.콜라이 VL1970을 사용할 수 있다. 이.콜라이 VL1970은 1988년 6월 24일, 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM)[참조: 1 Dorozhny proezd., 1 Moscow 117545, Russia]에, 수탁번호 VKPM B-4411로 기탁되어 있다.
또한, 생육에 리포산을 요구하는, 및/또는, H+-ATPase를 결실하고 있는 변이주[참조: W096/06926]를 친주로서 사용할 수 있다.
L-이소류신 생산균
L-이소류신 생산균 또는 이를 유도하기 위한 친주의 예로서는 6-디메틸아미노퓨린에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-304969호], 티아이소류신, 이소류신 하이드록사메이트 등의 이소류신 유사체에 내성을 갖는 변이주, 또한 DL-에티오닌 및/또는 아르기닌 하이드록사메이트에 내성을 갖는 변이주[참조: 일본 공개특허공보 제(평)5-130882호]를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 트레오닌 데아미나제, 아세토하이드록시산 신타제 등의 L-이소류신 생합성에 관여하는 단백질을 암호화하는 유전자로 형질전환된 재조합주도 또한 친주로서 사용할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 제(평)2-458호, FR 0356739, 및 미국특허 제5,998,178호].
L-티로신 생산균
티로신 생산균으로서는 티로신에 의한 저해를 받지 않는 탈감작형의 프레펜산 데하이드라타제 유전자(tyrA)를 갖는 에세리키아속 세균[참조: 유럽특허출원 공개1616940호]을 들 수 있다.
유전자 재조합에 의해, 상기의 L-아미노산 생산균을 육종하는 경우, 사용하는 유전자는 상기한 유전자 정보를 갖는 유전자나, 공지의 서열을 갖는 유전자에 한정되지 않고, 이들의 유전자의 변이, 즉, 암호화되는 단백질의 기능이 손상되지 않는 한, 이들의 유전자의 동족체나 인위적인 개변체 등, 보존적 변이를 갖는 유전자도 사용할 수 있다. 즉, 공지의 단백질의 아미노산 서열에 있어서, 1 또는 수개의 위치에서의 1 또는 수개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입 또는 부가 등을 포함하는 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 좋다.
여기서, 「1 또는 수개」란 아미노산 잔기의 단백질의 입체 구조에 있어서의 위치나 아미노산 잔기의 종류에 따라서도 상이하지만, 구체적으로는 바람직하게는 1 내지 20개, 보다 바람직하게는 1 내지 10개, 보다 더 바람직하게는 1 내지 5개를 의미한다. 또한, 보존적 변이란 치환 부위가 방향족 아미노산인 경우에는 Phe, Trp, Tyr 간에, 치환 부위가 소수성 아미노산인 경우에는 Leu, Ile, Val 간에, 극성 아미노산인 경우에는 Gln, Asn 간에, 염기성 아미노산인 경우에는 Lys, Arg, His 간에, 산성 아미노산인 경우에는 Asp, Glu 간에, 하이드록실기를 갖는 아미노산인 경우에는 Ser, Thr 간에 서로 치환하는 변이이다. 보존적 변이의 대표적인 것은 보존적 치환이며, 보존적 치환으로 보여지는 치환으로서는, 구체적으로는 Ala에서 Ser 또는 Thr로의 치환, Arg에서 Gln, His 또는 Lys로의 치환, Asn에서 Glu, Gln, Lys, His 또는 Asp로의 치환, Asp에서 Asn, Glu 또는 Gln로의 치환, Cys에서 Ser 또는 Ala로의 치환, Gln에서 Asn, Glu, Lys, His, Asp 또는 Arg로의 치환, Glu에서 Gly, Asn, Gln, Lys 또는 Asp로의 치환, Gly에서 Pro로의 치환, His에서 Asn, Lys, Gln, Arg 또는 Tyr로의 치환, Ile에서 Leu, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Leu에서 Ile, Met, Val 또는 Phe로의 치환, Lys에서 Asn, Glu, Gln, His 또는 Arg로의 치환, Met에서 Ile, Leu, Val 또는 Phe로의 치환, Phe에서 Trp, Tyr, Met, Ile 또는 Leu로의 치환, Ser에서 Thr 또는 Ala로의 치환, Thr에서 Ser 또는 Ala로의 치환, Trp에서 Phe 또는 Tyr로의 치환, Tyr에서 His, Phe 또는 Trp로의 치환, 및, Val에서 Met, Ile 또는 Leu로의 치환을 들 수 있다. 또한, 상기와 같은 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가, 또는 역위 등에는 유전자가 유래하는 미생물의 개체차, 종의 차이에 근거하는 경우 등의 천연적으로 발생하는 변이(mutant 또는 variant)에 의해서 발생하는 것도 포함된다. 이러한 유전자는 예를 들어, 부위특이적 변이법에 의해, 암호화되는 단백질의 특정한 부위의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입 또는 부가를 포함하도록 공지의 유전자의 염기 서열을 개변함으로써 취득할 수 있다.
또한, 상기와 같은 보존적 변이를 갖는 유전자는 암호화되는 아미노산 서열 전체에 대하여, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖고, 야생형 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자라도 좋다. 또한, 본 명세서에서, 「상동성」(homology)은 「동일성」(identity)을 가리키는 경우가 있다.
또한, 유전자의 서열에 있어서의 각각의 코돈은 유전자가 도입되는 숙주에서 사용하기 쉬운 코돈으로 치환된 것이라도 좋다.
보존적 변이를 갖는 유전자는 변이제 처리 등, 통상 변이 처리에 사용되는 방법에 의해 취득된 것이라도 좋다.
또한, 유전자는 공지의 유전자 서열의 상보 서열 또는 이의 상보 서열로부터 조제될 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하고, 공지의 유전자 산물과 동등한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA라도 좋다. 여기에서, 「엄격한 조건」이란 소위 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건을 말한다. 일 예를 나타내면, 상동성이 높은 DNA끼리, 예를 들어 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상의 상동성을 갖는 DNA끼리가 하이브리드화하고, 이것보다 상동성이 낮은 DNA끼리가 하이브리드화하지 않는 조건, 또는 통상의 서던 하이브리드화의 세정 조건인 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS, 더욱 바람직하게는, 68℃, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도, 온도에서, 1회, 보다 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
프로브로서는 유전자의 상보 서열의 일부를 사용할 수도 있다. 이러한 프로브는 공지의 유전자 서열에 기초하여 제작한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 이들의 염기 서열을 포함하는 DNA 단편을 주형으로 하는 PCR에 의해 제작할 수 있다. 예를 들어, 프로브로서, 300bp 정도의 길이의 DNA 단편을 사용하는 경우에는 하이브리드화의 세정 조건은 50℃, 2×SSC, 0.1% SDS를 들 수 있다.
상기한 유전자의 변이에 관한 기재는 하기의 gcd 유전자에 대하여도 동일하게 적용된다.
<2-2> GCD 활성의 저하
다음에, 장내세균과가 속하는 세균의 GCD의 활성을 저하시키는 개변에 대해 설명한다.
GCD 활성이란 하기 반응을 촉매하는 활성을 말한다.
β-D-글루코스 + 산화형 PQQ → D-δ-글루코노락톤 + 환원형 PQQ
GCD 활성은 예를 들어, 이하의 반응에 의한 환원형 DCPIP의 생성을 600nm의 흡광도 측정으로 검출함으로써, 측정할 수 있다[참조: 일본 공개특허공보 2007-129965].
D-글루코스 + 산화형 PMS → D-글루코노-1,5-락톤 + 환원형 PMS
환원형 PMS + 산화형 DCPIP → 산화형 PMS + 환원형 DCPIP
PMS: 페나진 메토설페이트
DCPIP: 2,6-디클로로페놀인도페놀
「GDC 활성이 저하되도록 개변되었다」란, 세균의 세포당의 GCD 활성이, 비개변주, 예를 들어 야생형의 장내세균과에 속하는 균주보다도 낮아진 것을 말한다. 예를 들어, 세포당의 GCD의 분자수가 저하된 경우나, 분자당의 GCD 활성이 저하된 경우 등이 해당한다. 세포당의 GCD 활성의 비교는 예를 들어, 동일한 조건으로 배양한 세균의 세포 추출액에 포함되는 GCD 활성을 비교함으로써 실시할 수 있다. 또한, 활성의 「저하」에는 활성이 완전히 소실된 경우도 포함된다. 비교의 대조가 되는 야생형의 판토에아속 세균으로서는 예를 들어, 판토에아 아나나티스 AJ13355주(FERM BP-6614) 등을 들 수 있다.
GCD의 활성의 저하는 GCD를 암호화하는 유전자(gcd)를 불활성화함으로써 달성된다. gcd 유전자의 「불활성화」란 당해 유전자에 의해 암호화되는 GCD의 활성이 저하 또는 소실되도록, 당해 유전자를 유전자 재조합에 의해 개변하거나, 또는, 당해 유전자에 변이를 도입하는 것을 말한다.
gcd 유전자로서는 서열번호 1에 나타낸 염기 서열을 갖는 판토에아 아나나티스의 gcd 유전자를 들 수 있다. 이 gcd 유전자가 암호화되는 GCD의 아미노산 서열을 서열번호 2에 나타낸다. gcd 유전자는 이들의 서열에 기초하여, 합성 올리고뉴클레오타이드를 합성하고, 판토에아 아나나티스의 염색체를 주형으로서 PCR 반응을 실시함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 상동 재조합에 의해 gcd 유전자를 결손시키는 경우에는 염색체상의 gcd 유전자와 일정 이상의 상동성, 예를 들어, 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 유전자를 사용할 수도 있다. 또한, 염색체상의 gcd 유전자와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 유전자를 사용할 수도 있다. 엄격한 조건으로서는 예를 들어, 60℃, 1×SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1×SSC, 0.1% SDS에 상당하는 염 농도로, 1회 더욱 바람직하게는 2 내지 3회 세정하는 조건을 들 수 있다.
gcd 유전자의 불활성화는 구체적으로는 예를 들어, 염색체상의 gcd 유전자의 암호화 영역의 일부 또는 전부를 결손시키거나, 암호화 영역중에 다른 서열을 삽입함으로써 달성된다. 이러한 수법은 유전자 파괴라고도 불린다.
또한, gcd 유전자의 프로모터나 샤인-달가노(SD) 서열 등의 발현 조절 서열을 개변함으로써도, gcd 유전자의 발현을 저하시킴으로써도, gcd 유전자를 불활성화할 수 있다. 발현의 저하에는 전사의 저하와 번역의 저하가 포함된다. 또한, 발현 조절 서열 이외의 비번역 영역의 개변에 의해서도, 유전자의 발현을 저하시킬 수 있다.
또한, 염색체상의 표적 유전자의 전후의 서열을 포함시키고, 표적 유전자 전체를 결손시켜도 좋다. 또한, gcd 유전자의 불활성화는 염색체상의 gcd 유전자의 암호화 영역에 아미노산 치환(미스센스 변이)을 도입하는 것, 또한 종결 코돈을 도입하는 것(난센스 변이), 또는 1 내지 2염기 부가·결손된 프레임 시프트 변이를 도입함으로써도 달성할 수 있다[참조: Journal of Biological Chemistry 272:8611-8617(1997) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 95 5511-5515(1998), Journal of Biological Chemistry 266, 20833-20839(1991)].
각 유전자의 개변은 유전자 재조합에 의해 실시되는 것이 바람직하다. 유전자 재조합에 의한 방법으로서 구체적으로는 상동 재조합을 이용하여, 염색체상의 표적 유전자의 발현 조절 서열, 예를 들어 프로모터 영역, 또는 암호화 영역, 또는 비암호화 영역의 일부 또는 전부를 결손시키는 것, 또는 이들 영역에 다른 서열을 삽입하는 것을 들 수 있다.
발현 조절 서열의 개변은 바람직하게는 1 염기 이상, 보다 바람직하게는 2 염기 이상, 특히 바람직하게는 3 염기 이상이다. 또한, 암호화 영역을 결실시키는 경우는 각 유전자가 생산하는 단백질의 기능이 저하 또는 결실되는 것이라면, 결실시키는 영역은 N 말단 영역, 내부 영역, C 말단 영역의 어느 영역이라도 좋고, 암호화 영역 전체라도 좋다. 통상적으로, 결실시키는 영역은 긴 쪽이 확실하게 표적 유전자를 불활성화할 수 있다. 또한, 결실시키는 영역의 상류와 하류의 판독 프레임은 일치하지 않는 것이 바람직하다.
암호화 영역에 다른 서열을 삽입하는 경우도, 삽입하는 위치는 표적 유전자의 어느 영역이라도 좋지만, 삽입하는 서열은 긴 쪽이, 확실하게 표적 유전자를 불활성화할 수 있다. 삽입 부위의 전후의 서열은 판독 프레임이 일치하지 않는 것이 바람직하다. 다른 서열로서는 표적 유전자가 암호화되는 단백질의 기능을 저하 또는 결손시키는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 항생 물질 내성 유전자나 L-아미노산 생산에 유용한 유전자를 탑재한 트랜스포존 등을 들 수 있다.
염색체상의 표적 유전자를 상기한 바와 같이 개변하기 위해서는 예를 들어, 표적 유전자의 부분 서열을 결실하고, 정상으로 기능하는 단백질을 생산하지 않도록 개변한 결실형 유전자를 제작하여, 당해 유전자를 포함하는 DNA로 세균을 형질전환하고, 결실형 유전자와 염색체상의 표적 유전자에서 상동 재조합을 발생시킴으로써, 염색체상의 표적 유전자를 결실형 유전자로 치환함으로써 달성할 수 있다. 결실형 표적 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 생성되었다고 해도, 야생형 단백질과는 상이한 입체구조를 갖고, 기능이 저하 또는 소실된다. 이러한 상동 재조합을 이용한 유전자 치환에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있고, 「Red 드리븐 통합(Red-driven integration)」이라고 불리는 방법[참조: Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645(2000)], 또는, Red 드리븐 통합법과 λ 파지 유래의 추출 시스템[참조: Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203(2002)]을 조합한 방법[참조: W02005/010175호] 등의 직쇄상 DNA를 사용하는 방법이나, 온도 감수성 복제 기점을 포함하는 플라스미드, 접합 전달 가능한 플라스미드를 사용하는 방법, 숙주 내에서 복제 기점을 갖지 않는 자살 벡터(suicide vector)를 이용하는 방법 등이 있다[참조: 미국특허 제6303383호 명세서, 또는 일본 공개특허공보 제(평)05-007491호].
표적 유전자의 전사량이 저하된 것의 확인은 표적 유전자로부터 전사되는 mRNA의 양을 야생주, 또는 비개변주와 비교함으로써 실시할 수 있다. mRNA의 양을 평가하는 방법으로서는 노던 하이브리드화, RT-PCR 등을 들 수 있다[참조: Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor(USA), 2001)]. 전사량의 저하는 야생주 또는 비개변주와 비교하여 저하되고 있으면, 어느 것이라도 좋지만, 예를 들어 야생주, 비개변주와 비교하여 적어도 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하로 저하되고 있는 것이 바람직하고, 전혀 발현되고 있지 않는 것이 특히 바람직하다.
표적 유전자가 암호화되는 단백질의 양이 저하된 것의 확인은 당해 단백질에 결합하는 항체를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해 실시할 수 있다[참조: Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor(USA), 2001)]. 단백질량의 저하는 야생주 또는 비개변주와 비교하여, 저하되고 있으면 어느 것이라도 좋지만, 예를 들어 야생주, 비개변주와 비교하여, 야생주 또는 비개변주와 비교하여 적어도 75% 이하, 50% 이하, 25% 이하, 또는 10% 이하로 감소하고 있는 것이 바람직하고, 전혀 단백질을 생산하고 있지 않는(완전히 활성이 소실되고 있는) 것이 특히 바람직하다.
GCD의 활성을 저하시키 위해서는 상기의 유전자 조작법 이외에, 예를 들어, 판토에아속 세균 등의 장내세균을 자외선 조사 또는, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(NTG) 또는 아질산 등의 통상 변이 처리에 사용되고 있는 변이제에 의해 처리하고, GCD의 활성이 저하된 균주를 선택하는 방법을 들 수 있다.
GCD의 활성의 저하는 PQQ의 합성능을 저하시킴으로써도, 실시할 수 있다. PQQ의 합성능은 예를 들어, PQQ 생합성에 필요한 오페론인 pqqABCDEF의 일부 또는 전부를 결실시킴으로써, 저하시킬 수 있다[참조: J.S.Velterop, P.W. Postma, J. Bacteriology 177(17): 5088-5098(1995)] .
에세리키아 콜라이 또는 코리네형 세균과 같은 GCD 활성을 갖지 않는 미생물에서는 글루코스는 글루코스 PTS(당 포스포트랜스퍼라제 시스템) 또는 글루코스 퍼미아제라고 불리는 트랜스포터를 이용하여 받아들인다. PTS는 PEP(포스포에놀피루브산)이 Pyr(피루브산)로 변환되는 반응과 공역하여, 글루코스 6-인산의 형태로 세포내에 받아들인다. 글루코스 6-인산은 프럭토스 6-인산으로 되고, 소위 해당계(EMP: 엠덴 마이어호프 경로(Embden-Myerhof pathway))에 의해 대사되어 피루브산이 생성된다.
한편, GCD 활성을 갖는 미생물에서는 글루코스는 주변세포질 공간에서 일단 글루콘산으로 변환된 후에, 글루콘산 퍼미아제에 의해 받아들여지고, 인산화 반응에 의해 6-포스포글루콘산이 생성된다.
6-포스포글루콘산은 펜토오스 인산 사이클, 또는 엔트너 도도로프(Entner Doudoroff)(ED) 경로에 의해 대사되어 글리세르알데히드 3-인산이나 피루브산 등이 생성된다.
아세트산균 등의 GCD를 갖는 미생물은 글루코스의 일부를 주변세포질에서 일단 글루콘산으로 변환하고 나서 받아들인다는 특유의 당대사 특성을 갖는 것이 알려져 있다. 미생물에 따라 세포내의 EMP 경로, ED 경로, 펜토오스 인산 사이클의 수용능력이 상이하기 때문에, GCD를 결손하여 당대사를 변환하면, 이것보다 하류의 대사 패턴이 변화되는 것이 예상된다.
판토에아 아나나티스에 대해서는 통상의 배양 온도, 예를 들어 34℃에서는 모든 글루코스를 GCD 경유로 자화(資化)하고 있는 것은 아니고, PTS 경유로 자화되는 것도 상당량 존재하고 있다고 생각된다. 한편, 고온, 예를 들어 38℃에서 배양하면, GCD는 최적 온도가 높기 때문에, GCD 활성이 상승되고, 이로써 GCD 경유의 당 소비가 늘어난다고 예상된다. 판토에아 아나나티스에는 ED 경로가 존재하지 않기 때문에, 6-포스포글루콘산은 6-포스포글루콘산 데하이드로게나제에 의해 탈수소화되고, 펜토오스 인산 사이클로 대사된다. 6-포스포글루콘산 데하이드로게나제에 의한 탈수소화시, 1분자의 6-포스포글루콘산으로부터, 1분자의 이산화탄소가 방출되기 때문에, GCD 경유의 당 소비가 늘어나면, 아미노산 생성량이 저하된다고 예상된다. 또한, 고온에서의 배양으로 GCD 경유의 당 소비가 늘어나면, 펜토오스 인산 사이클의 수용능력에 부족이 생겨, 오버플로우한 대사물이 부생물 쪽으로 흘러, 결과적으로 L-아미노산 수율이 저하되는 것도 추정된다. 본 발명에서는 GCD 활성을 저하시킴으로써, 특히 고온에서 배양하였을 때, 이산화탄소의 방출과 펜토오스 인산 사이클로의 오버플로우가 해소됨으로써, L-아미노산 생산성이 향상된다고 생각된다.
또한, ED 경로를 도입한 바와 같은 판토에아 아나나티스[참조: 일본 공개특허공보 2003-274988]에 있어서도, GCD 경유의 당 소비가 늘어나면, 6-포스포글루콘산 데하이드로게나제에 의한 6-포스포글루콘산의 탈수소 반응에서의 이산화탄소의 방출과, ED 경로나 펜토오스 인산 사이클의 수용능력 부족에 의해서, L-아미노산 수율이 저하된다고 추정된다. 따라서, ED 경로를 도입한 판토에아 아나나티스에서도, GCD 활성을 저하시킴으로써, L-아미노산 생산성이 향상된다고 생각된다.
본 발명에 사용하는 세균은 GCD 활성이 저하하고, 또한 당의 수용 활성이 강화된 것이라도 좋다. 당의 수용 활성을 상승시키기 위해서는 예를 들어, 글루코스 PTS나 글루코스 퍼미아제의 활성을 상승시키면 좋다. 또한, 갈락토스 퍼미아제[참조: Flores et al. J Mol Microbiol Biotechnol 2007;13:105-116], 크실로스 퍼미아제[참조: EP1807445A1], 아라비노스 퍼미아제 등의 메이저 퍼실리테이터 슈퍼패밀리(Major Facilitator Superfamily(MFS)[참조: Griffith, J. K. et al, Curr. Opin. Cell Biol. 4(4); 684-95(1992)]의 멤버로 되는 트랜스포터도 글루코스 등을 받아들이는 활성을 갖는 것이 알려져 있다. 따라서, GCD 활성이 저하된 세균에 있어서, 이들의 트랜스포터의 활성을 강화시킴으로써도, 글루코스 등의 당의 수용이 상승되어, L-아미노산 생산성이 향상된다.
<2> 본 발명의 L-아미노산의 제조법
본 발명의 미생물을 배지에서 배양하고, L-아미노산을 당해 배지 중에 생성 축적시켜, 당해 배지로부터 L-아미노산을 채취함으로써, L-아미노산을 제조할 수 있다.
배양에 사용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기염류, 기타 필요에 따라서 아미노산, 비타민 등의 유기 미량 영양소를 함유하는 통상의 배지를 사용할 수 있다. 합성 배지 또는 천연 배지의 어느 것이든 사용 가능하다. 배지에 사용되는 탄소원 및 질소원은 배양되는 균주가 이용 가능한 것이라면 어느 종류를 사용해도 좋다.
탄소원으로서는 글루코스, 글리세롤, 프럭토스, 수크로스, 말토오스, 만노스, 갈락토오스, 전분 가수 분해물, 당밀 등의 당류를 사용할 수 있고, 그 외, 아세트산, 시트르산 등의 유기산, 에탄올 등의 알코올류도 단독 또는 다른 탄소원과 병용하여 사용할 수 있다. 질소원으로서는 암모니아, 황산 암모늄, 탄산 암모늄, 염화암모늄, 인산 암모늄, 아세트산 암모늄 등의 암모늄염 또는 질산염 등을 사용할 수 있다. 유기 미량 영양소로서는 아미노산, 비타민, 지방산, 핵산, 또한 이러한 것을 함유하는 펩톤, 카사미노산, 효모 추출물, 대두 단백 분해물 등을 사용할 수 있고, 생육에 아미노산 등을 요구하는 영양 요구성 변이주를 사용하는 경우에는 요구되는 영양소를 보첨(補添)하는 것이 바람직하다.
특히 L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하는 경우, 배지 중에 판토텐산을 첨가하면, 보다 효율적으로 결정 석출할 수 있다[참조: W02004/111258호 팜플렛]. 무기염류로서는 인산염, 마그네슘염, 칼슘염, 철염, 망간염 등을 사용할 수 있다.
배양은 바람직하게는 발효 온도 20 내지 45℃, pH를 3 내지 9로 제어하여, 통기 배양을 실시한다. 배양 중에 pH가 저하되는 경우에는 예를 들어, 탄산 칼슘을 첨가하거나, 암모니아 가스 등의 알칼리로 중화한다. 이러한 조건하에서, 바람직하게는 10시간 내지 120시간 정도 배양함으로써, 배양액 중에 목적 아미노산이 축적된다.
본 발명에서는 세균의 생육에 적합한 온도에서의 배양으로, 효율적으로 L-아미노산을 생산할 수 있지만, 특히 고온에서 배양한 경우에, 효과가 현저하다. 예를 들어, 판토에아 아나나티스 등의 판토에아 세균에서는 통상 34℃ 전후가 생육에 바람직한 온도이며, GCD 활성을 저하시킨 세균은 비개변주보다도 이 배양 온도에서 L-아미노산 생산능이 높지만, 예를 들어 36℃, 또는 38℃에서는 L-아미노산 생산능이 한층 향상된다.
또한, L-글루탐산이 석출되는 조건으로 조정된 액체 배지를 사용하여, 배지 중에 L-글루탐산을 석출시키면서 배양을 실시할 수도 있다. L-글루탐산이 석출되는 조건으로서는 예를 들어, pH 5.0 내지 4.0, 바람직하게는 pH 4.5 내지 4.0, 또한 바람직하게는 pH 4.3 내지 4.0, 특히 바람직하게는 pH 4.0을 들 수 있다.
또한, L-글루탐산을 배지 중에 석출시키는 경우에는 미리 L-글루탐산, L-리신의 결정을 종정(種晶)으로 하여 첨가해 두면 보다 효율적으로 결정 석출할 수 있다[참조: 유럽특허 1233069호, 유럽특허출원공개 1624069호].
배양 종료후의 배양액으로부터 L-아미노산을 채취하는 방법은 공지의 회수 방법에 따라서 실시하면 좋다. 예를 들어, 배양액으로부터 균체를 제거한 후에 농축 결정 석출하는 방법 또는 이온 교환 크로마토그래피 등에 의해 채취된다. L-글루탐산이 석출되는 조건하에서 배양한 경우, 배양액 중에 석출된 L-글루탐산은 원심분리 또는 여과 등에 의해 채취할 수 있다. 이 경우, 배지 중에 용해되어 있는 L-글루탐산을 결정 석출한 후에, 더불어 분리해도 좋다.
또한, 염기성 아미노산을 제조할 때는 배양 중의 pH가 6.5 내지 9.0, 배양 종료시의 배지의 pH가 7.2 내지 9.0이 되도록 제어하여, 발효 중의 발효조 내압력이 양으로 되도록 제어하거나, 또는, 탄산 가스 또는 탄산 가스를 포함하는 혼합 가스를 배지에 공급하여, 배지 중의 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온이 적어도 2g/L 이상 존재하는 배양기가 있도록 하여, 상기 중탄산 이온 및/또는 탄산 이온을 염기성 아미노산을 주로 하는 양이온의 카운터이온으로 하는 방법으로 발효하여, 목적의 염기성 아미노산을 회수하는 방법으로 제조를 실시해도 좋다[참조: 일본 공개특허공보 2002-065287호, 미국특허출원공개 제2002025564호].
본 발명에서 채취되는 L-아미노산은 목적으로 하는 L-아미노산 이외에 미생물 균체, 배지 성분, 수분, 및 미생물의 대사 부산물을 포함하고 있어도 좋다. 채취된 L-아미노산의 순도는 50% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상이다[참조: US5,431,933, JP1214636B, US4,956,471, US4,777,051, US4946654, US5,840358, US6,238,714, US2005/0025878].
본 발명의 방법에 의해 L-시스테인을 제조하는 경우는 수득되는 L-시스테인은 L-시스테인 유도체의 제조에 사용할 수 있다. L-시스테인 유도체로서는 메틸시스테인, 에틸시스테인, 카르보시스테인, 설포시스테인, 아세틸시스테인 등이 포함된다.
또한, L-시스테인의 티아졸리딘 유도체가 배지에 축적된 경우는 배지로부터 티아졸리딘 유도체를 채취하고, 티아졸리딘 유도체와 L-시스테인 사이의 반응 평형을 L-시스테인측으로 이동시킴으로써, L-시스테인을 제조할 수 있다. 또한, 배지에 S-설포시스테인이 축적된 경우, 예를 들어 디티오트레이톨 등의 환원제를 사용하여 환원함으로써 L-시스테인으로 변환할 수 있다.
실시예
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다.
〔참고예 1〕λ Red 유전자 산물에 내성인 판토에아 아나나티스 균주의 구축
판토에아 아나나티스에 있어서 유전자 결손을 실시하기 위해서, 「Red-driven integration」 또는 「Red-mediated integration」이라고 불리는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 6640-6645(2000)]을 고효율로 실시하기 위한 수용균을 구축하였다.
우선, λ의 gam, bet 및 exo의 각 유전자(이하, 「λ Red 유전자」)를 발현하는 신규 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER를 구축하였다(도 1). 상세한 것은 참고예 2에 기재한다.
당해 플라스미드는 다른 유전자 배경을 갖는 넓은 범위의 숙주에 사용할 수 있다. 그 이유는 1) 이것은 많은 그람 음성균 및 그람 양성균, 및 식물에 있어서조차도 안정적으로 유지될 수 있는 RSF1010 광숙주역 플라스미드의 레플리콘을 가지고 있고[참조: Scholz, et al., 1989; Buchanan-Wollaston et al., 1987], 2) λ Red 유전자, gam, bet 및 exo 유전자는 많은 세균의 RNA 폴리머라제에 의해서 인식되는, PlacUV5 프로모터의 조절하에 있고[참조: Brunschwig, E. and Darzins, A., Gene, 111, 1, 35-41(1992); Dehio, M. et al, Gene, 215, 2, 223-229(1998)], 3) 자기 조절 인자 PlacUV5-lacI, 및 에세리키아 콜라이의 rrnB 오페론의 ρ 비의존성 전사 터미네이터(TrrnB)는 λ Red 유전자의 기저 발현 수준을 낮게 하기[참조: Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya(Rus), 5, 3-21(2004)] 때문이다. 또한, RSF-Red-TER 플라스미드는 레반수크라제(levansucrase) 유전자(sacB)를 포함하고 있고, 이러한 유전자에 의해, 수크로스를 포함하는 배지에서 세포로부터 플라스미드를 회수할 수 있다.
에세리키아 콜라이에서는 RSF-Red-TER 플라스미드에 의해 제공되는 짧은 플랭킹 영역과 함께, PCR에서 생성된 DNA 단편이 통합하는 빈도는 pKD46 헬퍼 플라스미드[참조: Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645,(2000)]를 사용한 경우와 같은 정도로 높다. 그러나, λ Red 유전자의 발현은 판토에아 아나나티스에 있어서 독성을 나타낸다. RSF-Red-TER 헬퍼 플라스미드로 형질전환된 세포는 IPTG(이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드, 1mM) 및 적당한 항생 물질(클로람페니콜 25μg/ml 또는 카나마이신 40μg/ml)을 포함하는 LB 배지에서 매우 낮은 생육 속도를 나타내고, λ Red 개재 재조합(λ Red-mediated recombination)의 효율은 관찰되었다고 해도 극단적으로 낮다(10-8).
λ Red 유전자의 3개의 유전자 모든 발현에 내성인 판토에아 아나나티스의 변이주를 선택하였다. 이로 인해, 판토에아 아나나티스 SC17주[참조: 미국특허 제6,596,517호]를, RSF-Red-TER 플라스미드로 전기천공에 의해 도입하였다. 18시간 배양후, 약 106개의 형질전환주가 수득되고, 10 클론까지는 콜로니가 큰 사이즈이고, 나머지는 전부 매우 작았다. 18시간 배양후, 큰 콜로니는 약 2mm이고, 작은 콜로니는 약 0.2mm이었다. 배양을 24시간까지 연장하더라도, 작은 콜로니는 그 이상 생육되지 않았지만, 큰 콜로니는 생육을 계속하였다. λ Red 유전자의 3개 유전자 전부(gam, bet 및 exo)의 발현에 내성인, 큰 콜로니의 판토에아 아나나티스 변이주의 하나를, 또 다른 분석에 사용하였다.
RSF-Red-TER 플라스미드 DNA를, 큰 콜로니의 클론 1개, 및 몇개의 작은 콜로니의 클론으로부터 분리하여, 에세리키아 콜라이 MG1655를 재형질전환하여, Red 유전자의 활성인 산물을 합성하는 플라스미드의 능력을 조사하였다. 수득된 형질전환체에 있어서의 Red 의존적 통합의 컨트롤 실험에 의해, 큰 콜로니의 클론으로부터 분리된 플라스미드만이, Red 의존적 통합에 필요한 λ Red 유전자의 발현을 가져오는 것이 나타났다. 선택된 큰 콜로니의 클론에 있어서, Red 매개 통합이 일어나는지를 조사하기 위해서, KmR 마커 및 hisD 유전자에 상동인 40bp의 플랭킹 영역을 포함하고, 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 SmaI 인식 부위에 통합하도록 디자인된, PCR에서 생성된 직쇄상의 DNA 단편을 사용하여, 전기천공을 실시하였다. 2개의 작은 콜로니의 클론을 컨트롤로서 사용하였다. 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 염기 서열을 서열번호 3에 나타낸다. PCR에는 서열번호 4 및 5의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하여, pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드를 주형으로서 사용하였다. λ Red 유전자에 내성이 아닌 2개의 작은 콜로니의 클론을 컨트롤로서 사용하였다. pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드의 구축은 참고예 3에서 상세하게 기술한다.
RSF-Red-TER 플라스미드는 당해 플라스미드상에 있는 lacI 유전자에 의해, Red 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 2개의 유도 조건에 관하여 조사하였다. 제1 그룹에서는 IPTG(1mM)를 전기천공의 1시간 전에 첨가하고, 제2 그룹에서는 IPTG는 전기천공 가능한 세포의 조제를 위한 배양 개시시에 첨가하였다. 큰 콜로니의 클론으로부터의 RSF-Red-TER을 보유하는 세포의 후대의 생육 속도는 당해 플라스미드를 갖지 않는 균주보다도 유의적으로 낮지는 않았다. IPTG의 첨가에 의해, 이러한 배양물의 생육 속도는 약간 저하되었을 뿐이었다. 한편, 작은 콜로니의 클론의 후대는 IPTG 비첨가에서 매우 천천히 생육되고, 유도하면 생육은 사실상 정지하였다. 큰 콜로니의 클론의 후대의 세포를 전기천공한 후, 많은 KmR 클론(짧은 유도 시간에서 18 클론, 유도 시간을 연장하면 약 100 클론)이 생육되었다. 조사한 10O 클론의 전체는 His- 표현형을 가지며, 20 클론에 관해서 PCR로 확인한 결과, 이들 세포의 염색체의 구조가 기대한 대로인 것이 확인되었다. 한편, 작은 콜로니의 클론의 후대의 세포를 전기천공하여도, 통합된 주는 수득되지 않았다.
수득된 큰 콜로니의 클론을, 7% 수크로스를 포함하는 플레이트에서 생육시켜 플라스미드를 탈락시키고, RSF-Red-TER로 재형질전환하였다. 플라스미드를 갖지 않는 주를 SC17(0)이라고 명명하였다.
상기 재형질전환 후에 생육된 모든 클론은 친주 클론 SC17(0)과 동일하게 큰 콜로니 사이즈를 갖고 있었다. RSF-Red-TER 플라스미드로 재형질전환한 SC17(0)주에 있어서의 Red 매개 통합의 실험을 실시하였다. 수득된 3개의 독립된 형질전환주에 관해서, 앞의 실험에 사용한 것과 동일한 DNA 단편을 사용하여 조사하였다. 짧은 유도 시간(전기천공 1시간 전)을 채용하였다. 각각의 실험에서, 10개를 초과하는 KmR 클론이 생육되었다. 시험한 모든 클론은 His- 표현형을 갖고 있었다. 이렇게 해서, λ Red 유전자의 발현에 내성인 SC17(0)로 명명한 변이주가 선택되었다. 이러한 균주는 판토에아 아나나티스 염색체로의 Red 의존적 통합을 위한 적합한 수용균으로서 사용할 수 있다.
〔참고예 2〕헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축
헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER의 구축 도식을 도 2에 도시한다.
구축의 최초의 공정으로서, RSFsacBPlacMCS 벡터를 디자인하였다. 이로 인해, pACYC184 플라스미드의 cat 유전자, 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)의 sacB 유전자의 구조 부분을 포함하는 DNA 단편을, 각각 서열번호 6, 7, 8, 9의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여, PCR에 의해 증폭시켰다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 각각 새로운 클로닝에 필요한, 적절한 BglII, SacI, XbaI, 및 BamHI 제한 효소 부위를 5' 말단에 포함하고 있다. 수득된 1.5kb의 sacB 단편을, 앞서 수득한 pMW119-PlaclacI 벡터의 XbaI-BamHI 부위에 클로닝하였다. 당해 벡터는 pMW118-PlaclacI 벡터에 관한 기재[참조: Skorokhodova, A. Yu et al, Biotekhnologiya(Rus), 5, 3-21(2004)]와 동일하게 하여 구축하였다. 단, 당해 벡터는 pMW218 플라스미드 대신에 pMW219로부터의 폴리링커 부위를 포함하고 있다.
다음에, 상기의 1.0kb의 cat 단편을 BglII 및 SacI로 처리하여, 앞서의 공정에서 수득한 RSF-PlaclacIsacB 플라스미드의 BamHI-SacI 부위에 클로닝하였다. 수득된 플라스미드 pMW-PlaclacIsacBcat는 PlacUV5-lacI-sacB-cat 단편을 포함하고 있다. 당해 단편을 RSF1010 벡터에 서브클론하기 위해서, pMW-PlaclacIsacBcat를 BglII로 소화하고, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하여 평활말단화하고, 이어서 SacI로 절단하였다. pMWPlaclacIsacBcat 플라스미드의 3.8kb의 BglII-SacI 단편을 1% 아가로스겔로부터 용출시켜, PstI, 및 SacI로 처리한 RSF1010 벡터에 연결하였다. 연결 혼합액으로 에세리키아 콜라이 TG1을 형질전환하여, 클로람페니콜(50mg/L)을 포함하는 L 배지(박토 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수(純水) 1L에 포함하는 배지, pH 7.0)에서 플레이트하였다. 생육한 클론으로부터 분리한 플라스미드의 제한 효소 해석을 실시하여, RSFsacB 플라스미드를 수득하였다. RSFsacBPlacMCS 벡터를 구축하기 위해서, 서열번호 10 및 11의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, pMW119-PlaclacI 플라스미드를 주형으로서 사용하여, PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 PCR에 의해 증폭하였다. 수득된 146bp의 단편을 SacI 및 NotI로 소화하여, RSFsacB 플라스미드의 SacI-NotI 대단편과 연결하였다. 그 후, 서열번호 12 및 13의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, pKD46 플라스미드[참조: Datsenko, K. A., Wanner, B. L., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 97, 6640-6645, (2000)]를 주형으로 하여 사용한 PCR에 의해, λRedαβγ 유전자, 및 전사 터미네이터 tL3을 포함하는 2.3kb의 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득된 단편을 RSFsacBPlacMCS 벡터의 PvuI-NotI 부위에 클로닝하였다. 이렇게 해서, RSFRed 플라스미드를 디자인하였다.
Red 유전자의 리드스루(read through) 전사를 배제하기 위해서, 에세리키아 콜라이의 rrnB 오페론의 ρ-의존성 전사 터미네이터를, cat 유전자와 PlacUV5 프로모터간에 삽입하였다. 이로 인해, 서열번호 14 및 11의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하여, 에세리키아 콜라이 BW3350의 염색체를 주형으로서 사용한 PCR에 의해, PlacUV5 프로모터와 TrrnB 터미네이터를 포함하는 DNA 단편을 증폭시켰다. 수득된 이들의 단편을 KpnI로 처리하여, 연결하였다. 그 후, 서열번호 11 및 15의 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하는 올리고뉴클레오타이드를 사용한 PCR에 의해, PlacUV5 및 TrrnB의 양쪽을 포함하는 0.5kb 단편을, 증폭시켰다. 수득된 DNA 단편을 EcoRI로 소화하여, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하여 평활말단화하여, BamHI로 절단하여, RSFsacBPlacMCS 벡터의 Ecl136II-BamHI 대단편과 연결하였다. 수득된 플라스미드를 RSF-Red-TER라고 명명하였다.
〔참고예 3〕pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드의 구축
pMW118-(λattL-Kmr-λattR) 플라스미드는 pMW118-attL-Tc-attR[참조: W02005/010175] 플라스미드로부터, 테트라사이클린 내성 마커 유전자를 pUC4K 플라스미드의 카나마이신 내성 유전자로 치환함으로써 구축하였다. 이로 인해, pMW118-attL-Tc-attR 플라스미드의 EcoRI-HindIII 대단편을, pUC4K 플라스미드의 HindIII-PstI(676bp) 및 EcoRI-HindIII(585bp)의 2개의 단편에 연결하였다. 기본이 되는 pMW118-attL-Tc-attR은 이하의 4개의 단편을 연결함으로써 수득하였다.
1) 에세리키아 콜라이 W3350(λ 프로파지를 포함한다)의 염색체의 attL에 상당하는 영역으로부터, 프라이머 P1(서열번호 16) 및 P2(서열번호 17)를 사용한 PCR 증폭에 의해 수득한 attL(서열번호 18)을 갖는 BglII-EcoRI 단편(114bp). 이들의 프라이머는 BglII 및 EcoRI을 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
2) 에세리키아 콜라이 W3350(λ 프로파지를 포함한다)의 염색체의 attR에 상당하는 영역으로부터, 프라이머 P3(서열번호 19) 및 P2(서열번호 20)를 사용한 PCR 증폭에 의해 수득한 attR(서열번호 21)을 갖는 PstI-HindIII 단편(182bp). 이들의 프라이머는 PstI 및 HindIII를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
3) pMW118-ter_rrnB의 BglII-HindIII 대단편(3916 bp). 플라스미드 pMW118-ter_rrnB는 다음 3개의 DNA 단편을 연결함으로써 수득하였다.
·pMW118의 AatII-EcoRI 단편을 갖는 대단편(2359 bp). 당해 단편은 pMW118을 EcoRI로 소화하여, DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하고, 이어서 AatII로 소화함으로써 수득하였다.
·암피실린 내성(ApR)의 유전자 bla를 갖는 pUC19의 AatII-BglII 소단편(1194bp). 당해 단편은 pUC19 플라스미드의 상당하는 영역을 프라이머 P5 및 P6(서열번호 22 및 23)을 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 수득하였다. 이들 프라이머는 PstI 및 AatII 및 BglII를 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
·전사 터미네이터 ter_rrnB의 BglII-PstI 소단편(363bp). 당해 단편은 에세리키아 콜라이 MG1655 염색체의 상당하는 영역을 프라이머 P7 및 P8(서열번호 24 및 25)을 사용하여 PCR 증폭시킴으로써 수득하였다. 이들 프라이머는 PstI 및 BglII 및 PstI을 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
4) 테트라사이클린 내성 유전자 및 ter_thrL 전사 터미네이터를 갖는 pML-Tc-ter_thrL의 EcoRI-PstI 소단편(1388bp)(서열번호 26). pML-Tc-ter_thrL 플라스미드는 다음 2공정에서 수득하였다.
·pML-MCS 플라스미드[참조: Mashko, S. V et al., Biotekhnologiya(in Russian), 2001, no. 5, 3-20]를 XbaI 및 BamHI로 소화하고, 이어서 대단편(3342bp)을, ter_thrL 터미네이터를 포함하는 XbaI-BamHI 단편(68bp)과 연결하였다. 당해 ter_thrL 터미네이터를 포함하는 단편은 에세리키아 콜라이 MG1655 염색체의 상당하는 영역을, 프라이머 P9 및 P10(서열번호 27 및 28)을 사용한 PCR에 의해 수득하였다. 이렇게 해서 pML-ter_thrL 플라스미드를 수득하였다. 이들 프라이머는 PstI 및 XbaI 및 BamHI을 위한 부차적인 인식 부위를 포함하고 있다.
·pML-ter_thrL 플라스미드를 KpnI 및 XbaI로 소화하고, 이어서 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하여, 테트라사이클린 내성 유전자를 갖는 pBR322의 EcoRI-Van91I 소단편(1317bp)과 연결하여, pML-Tc-ter_thrL 플라스미드를 수득하였다. 한편, pBR322는 EcoRI 및 Van91I로 소화하고, 이어서 DNA 폴리머라제 I 클레노우 단편으로 처리하였다.
〔참고예 4〕글루탐산 생산 플라스미드 RSFPPG의 구축
L-글루탐산 생합성계 유전자, prpC 유전자[참조: 국제공개 2006/051660호 팜플렛], ppc 유전자, gdhA[참조: 유럽출원공개 0999282호 명세서] 유전자를 증폭시킨 플라스미드 RSFPPG를 구축하였다[참조: WO2008/020654].
RSFCPG[참조: 유럽출원공개 1233068호 명세서]의 gltA 유전자의 0RF 이외의 부분을 증폭시키는 프라이머 1(서열번호 29)과 프라이머 2(서열번호 30)를 설계하였다. 당해 프라이머를 사용하여, RSFCPG를 주형으로 PCR을 실시하여, 약 14.9kb의 단편을 취득하였다. 한편, prpC에 관해서는 프라이머 3(서열번호 31)과 프라이머 4(서열번호 32)를 사용하여, 이.콜라이 W3110주의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 실시하고, 약 1.2kb의 단편을 취득하였다. 양 PCR 산물을 각각 BglII, KpnI로 처리하고, 연결 후, 이.콜라이 JM109주를 형질전환하였다. 출현한 콜로니를 모두 집균하여, 혼합물로 하여 플라스미드를 추출하였다. 당해 플라스미드 혼합물로 시트르산 신타제(CS) 결손주인 이.콜라이 ME8330주를 형질전환하여, 50mg/L 우라실, 5mg/L 티아민-HCl을 함유하는 M9 최소 배지(글루코스 5g, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g, 염화나트륨 0.5g, 염화암모늄 1g 인산2나트륨 6g을 순수 1L에 포함하는 배지)에 도포하였다. 출현한 콜로니를 모두 집균하고, 혼합물로서 플라스미드를 추출하고, 이 플라스미드 혼합물로 피.아나나티스(P. ananatis)의 L-글루탐산 생산균인 NP106주를 형질전환하였다. 출현한 클론에 대하여 중성 조건으로 시험관 배양을 실시하고, G106S주와 동등한 L-글루탐산 수율을 나타내는 주를 NA1로 하였다. 또한 본 균주로부터 플라스미드를 추출하여 이것을 prpC, gdh, ppc 강화용 플라스미드 RSFPPG로 하였다. L-글루탐산 생산균인 판토에아 아나나티스 NP106주에 상기 플라스미드 RSFPPG를 도입하여, L-글루탐산 생산균 NP106/RSFPPG(본 균주를 「NA1주」라고 부른다)를 구축하였다.
NP106주는 이하와 같이 하여 수득되었다. 앞서 예시한 판토에아 아나나티스 AJ13601주를, L 배지(박토 트립톤 10g/L, 효모 추출물 5g/L, NaCl 5g/L, PH 7.0)에, 최소 배지 성분(글루코스 5g/L, 황산마그네슘 2mM, 인산1칼륨 3g/L, 염화나트륨 0.5g/L, 염화암모늄 1g/L, 인산2나트륨 6g/L)을 첨가한 액체 배지(이하, 「LBGM9 배지」라고 기재한다)에서 34℃에서 밤새 진탕 배양을 실시하여, 1 플레이트당 100 내지 200 콜로니가 되도록 희석하고, 테트라사이클린 12.5mg/L를 포함하는 LBGM9 플레이트에 도포하였다. 출현한 콜로니에 관해서, 테트라사이클린 12.5mg/L, 및 클로람페니콜 25mg/L을 포함하는 LBGM9 플레이트에서 복제시켜, 클로람페니콜 감수성으로 된 주를 선택하여, pSTVCB가 탈락된 균주를 취득하고, G106S라고 명명하였다. 또한, G106S주를, LBGM9 액체 배지로 34℃에서 밤새 진탕 배양을 실시하여, 1 플레이트당 100 내지 200 콜로니가 되도록 희석하여, 약제를 포함하지 않은 LBGM9 플레이트에 도포하였다. 출현한 콜로니에 관해서, 테트라사이클린 12.5mg/L을 포함하는 LBGM9 플레이트 및 약제를 포함하지 않는 LBGM9 플레이트에서 복제시켜, 테트라사이클린 감수성으로 된 주를 선택하여, RSFCPG가 탈락된 균주를 취득하고, NP106이라고 명명하였다. 이렇게 해서 수득된 NP106주는 AJ13601주가 보유하는 2개의 플라스미드 RSFCPG와 pSTVCB의 양자를 갖지 않는 주이다.
G106S주는 동일하게 하여, AJ13601주로부터 pSTVCB만을 탈락시킨 주이다.
〔실시예 1〕gcd 유전자 결손주에 의한 L-글루탐산 생산
(1) gcd 유전자 결손주의 구축
서열번호 33 및 34에 나타내는 합성 DNA 프라이머 2개를 통상적인 방법으로 합성하였다.
서열번호 33에 나타내는 프라이머는 판토에아 아나나티스의 gcd 유전자 상류의 상동 서열에 λattL-Kmr-λattR의 5' 말단의 상동 서열이 계속되는 구성으로 되어 있다. 서열번호 34의 프라이머는 판토에아 아나나티스의 gcd 유전자 하류의 상보 서열에, λattL-Kmr-λattR의 3' 말단의 상보 서열이 이어지는 구성으로 되어 있다. 이들 프라이머를 사용하여, pMW118-(λattL-Kmr-λattR)을 주형으로 하여 PCR을 실시함으로써, λattL-Kmr-λattR의 서열의 5' 말단에 gcd 유전자 상류의 상동 서열이 연결되고, λattL-Kmr-λattR의 서열의 3' 말단에 gcd 유전자 하류의 상동 서열이 연결되는, 약 1.5kbp의 단편을 증폭시켰다.
상기 PCR 단편을 정제하고, 판토에아 아나나티스 염색체로의 λ 의존 통합에 사용하였다. 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER을, λ 파지 Red 유전자의 담체로서 사용하였다. 판토에아 아나나티스의 일렉트로컴피턴트(electrocompetent) 세포를 수득하기 위해, RSF-Red-TER 플라스미드로 SC17(0)주를 형질전환하여, 50μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 LB 배지로 34℃에서 하룻밤 배양하였다. 계속해서, 배양액을 50μg/ml의 클로람페니콜을 포함하는 신선한 LB 배지에서 100배로 희석시키고, 0D600이 0.3으로 될 때까지 34℃에서 통기하에서 생육시켰다. 그 후, IPTG를 1mM 첨가하고, OD600이 0.7로 될 때까지 배양을 계속하였다. 10mL의 배양액 중의 균체를 등량의 냉 10% 글리세롤로 3회 세정하고, 80μl의 냉 10% 글리세롤에 현탁시켰다. 상기 PCR 산물을 10μl의 탈이온수에 용해시켜, 100 내지 200ng의 PCR 단편을 세포 현탁액에 가하였다. 작업은 세균 전기천공 장치(「BioRad」; 미국, 카탈로그 번호 165-2089, 버전 2-89)를 사용하여 실시하였다. 사용한 펄스의 파라미터는 전계 강도: 18kV/cm, 펄스 시간: 5ms이었다.
전기천공 후, 즉시 글루코스(0.5%)를 보충한 1ml의 LB 배지를 세포 현탁액에 가하였다. 그리고, 세포를 34℃에서 2시간 통기하에서 생육시켜 40mg/L 카나마이신을 포함하는 L 배지(박토 트립톤 10g, 효모 추출물 5g, NaCl 5g, 한천 15g을 순수 1L에 포함하는 배지, pH 7.0)에서 선택하여, 약 20개의 콜로니를 형질전환체로서 취득하였다. gcd 유전자 영역에 카나마이신 내성 유전자의 단편이 삽입된 것을, 서열번호 35와 서열번호 36에 나타내는 합성 DNA 프라이머 2개를 사용한 PCR에 의해 확인하고, 단편의 삽입을 확인할 수 있었던 균주를 SC17(0)::Δgcd라고 명명하였다. 이의 균주로부터 게놈 DNA를 추출하고, 전기천공에 의해 NA1주를 형질전환하였다.
SC17(0)::Δgcd의 게놈 DNA를 도입한 NA1주를, 40mg/L의 카나마이신, 12.5mg/L의 테트라사이클린 염산염, 및 한천 15g/L를 첨가한 LBGM9 배지 플레이트에서 선택하고, 약 20개의 콜로니를 형질전환체로서 취득하였다. 이들 주는 모두 gcd 유전자 영역에 λattL-Kmr-λattR의 단편이 삽입되어 있고, 이들 중 1 클론을 선택하여, NA1::Δgcd라고 명명하였다.
(2) gcd 유전자 결손주의 L-글루탐산 생산능 평가
gcd 유전자의 결손이, L-글루탐산 생산에 주는 영향을 검토하기 위해서, NA1::Δgcd주와 NA1주를 사용하여, L-글루탐산 생산 배양을 실시하였다.
배양은 균체를 형성시키는 종배양과, L-글루탐산을 생성하는 본 배양의 2단계로 나누어 실시하였다.
종배양은 이하의 배지 조성으로써 실시되었다.
〔종배양 배지 조성〕
슈크로스 50g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
GD113(소포제) 0.1mL/L
(NH4)2SO4 4.0g/L
KH2PO4 2.0g/L
효모 추출물 4.0g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
시트르산 0.02g/L
L-리신 염산염 0.4g/L
DL-메티오닌 0.4g/L
ε-디아미노피멜산 0.4g/L
판토텐산칼슘 18mg/L
테트라사이클린 염산염 12.5mg/L
120℃, 20분간 증기 멸균을 실시하였다.
NA1::Δgcd주와 NA1주를, 12.5mg/L 테트라사이클린, 및 한천 15g/L을 첨가한 LBGM9 배지 플레이트에서 전(前)배양하고, 플레이트 1장분을 상기 조성의 종배양 배지를 300mL 가득 채운 1L 용적 미니 자(mini jar)에 식균하고, 34℃, pH6.0에서, 통기 1/1 vvm, 산소 농도가 3% 이상으로 되도록 제어하여 약 12시간 교반 배양을 실시하였다. 배양 중의 pH는 6.0이 되도록 암모니아 가스를 첨가함으로써 조정을 실시하였다. 배지 중의 당의 고갈을 지표로 종배양을 종료하였다.
본 배양 배지 조성은 이하에 나타낸다.
〔배양 배지 조성〕(20% 종배양액을 식균한 후의 농도)
글루코스 100g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
GD113 0.1mL/L
(NH4)2SO4 5.0g/L
KH2PO4 6.0g/L
효모 추출물 6.0g/L
FeSO4·7H2O 0.02g/L
MnSO4·5H2O 0.02g/L
시트르산 0.02g/L
베타인* 2.0g/L
L-리신 염산염 0.8g/L
DL-메티오닌 0.6g/L
ε-디아미노피멜산 0.6g/L
판토텐산칼슘 18mg/L
테트라사이클린 염산염 25mg/L
* N,N,N-트리메틸글리신
종배양에서 수득된 균체 60mL을 상기 조성의 본 배양 배지를 240mL 가득 채운 1L 용적 미니 자(mini jar)에 주입하고, 온도 34℃, 36℃ 또는 38℃에서, pH 4.9에서 배양을 실시하였다. 배지 중의 글루코스를 모두 소비한 시점에서 배양을 종료하였다. L-글루탐산 농도는 배양액 상청을 적당한 배율로 물로 희석한 후에, Biotech Analyzer(AS-210; 제조원: Sakura SI Co., Ltd)에 의해 측정하였다.
결과를, 표 1에 나타낸다. gcd 결손주인 NA1::Δgcd주는 비교 대조주 NA1주와 비교하고, L-글루탐산의 축적이 향상되는 것이 판명되었다.
Figure 112011024646435-pct00001
〔실시예 2〕gcd 유전자 결손주에 따르는 L-시스테인 생산
(1) L-시스테인 생산균의 구축
피.아나나티스에 있어서 gcd 유전자 결손의 L-시스테인 생산에 미치는 효과를 조사하기 위해서, L-시스테인 생산균을 구축하였다.
(1-1) yeaS 유전자 발현 플라스미드의 구축
우선, 상기 균주를 구축하기 위한 플라스미드를 구축하였다. 그 방법을 이하에 나타낸다.
이.콜라이 MG1655(ATCC No. 47076)의 염색체 DNA를 주형으로서 P11(agctgagtcg acccccagga aaaattggtt aataac, 서열번호 51), 및 P12(agctgagcat gcttccaact gcgctaatga cgc: 서열번호 52)를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해서 nlpD 유전자의 프로모터 영역(이하, 야생형 nlpD 유전자 프로모터를 「PnlpO」이라고 기재한다.) 약 300bp를 포함하는 DNA 단편을 취득하였다. 이들 프라이머의 5' 말단, 3' 말단에는 제한 효소 SalI 및 PaeI의 부위가 각각 디자인되어 있다. PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 15초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분. 수득된 단편을 SalI 및 PaeI로 처리하고, pMIV-5JS[참조: 일본 공개특허공보 2008-99668]의 SalI-PaeI 부위에 삽입하고, 플라스미드 pMIV-PnlpO을 취득하였다. 이 pMIV-PnlpO 플라스미드에 삽입된 PnlpO 프로모터의 PaeI-SalI 단편의 염기 서열은 서열번호 41에 나타낸 바와 같다.
다음에, MG1655의 염색체 DNA를 주형으로서, P13(agctgatcta gaaaacagaa tttgcctggc ggc: 서열번호 53), 및 P14(agctgaggat ccaggaagag tttgtagaaa cgc: 서열번호 54)를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해서 rrnB 유전자의 터미네이터 영역 약 300bp를 포함하는 DNA 단편을 취득하였다. 이들 프라이머의 5' 말단에는 제한 효소 XbaI 및 BamHI의 부위가 각각 디자인되어 있다. PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 59℃ 20초, 72℃ 15초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분. 수득된 단편을 XbaI 및 BamHI로 처리하고, pMIV-PnlpO의 XbaI-BamHI 부위에 삽입하여 플라스미드 pMIV-PnlpO-ter를 취득하였다.
이어서 MG1655의 염색체 DNA를 주형으로서, P15(agctgagtcg acgtgttcgc tgaatacggg gt: 서열번호 55), 및 P16(agctgatcta gagaaagcat caggattgca gc: 서열번호 56)을 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 yeaS 유전자를 포함하는 약 700bp의 DNA 단편을 취득하였다. 이들 프라이머의 5' 말단에는 제한 효소 SalI 및 XbaI의 부위가 각각 디자인되어 있다. PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 55℃ 20초, 72℃ 15초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분. 수득된 단편을 SalI 및 XbaI로 처리하고, pMIV-PnlpO-ter의 SalI-XbaI 부위에 삽입하여 플라스미드 pMIV-PnlpO-YeaS3을 취득하였다. 이렇게 해서, pMIV-5JS 벡터상에, nlpD 프로모터, yeaS 유전자, 및 rrnB 터미네이터가 이러한 순서대로 연결된 yeaS의 발현 유닛이 구축되었다.
nlpD 프로모터의 -10 영역을 개변함으로써 강력한 프로모터로 하기 위해서, 이하의 수법으로 -10 영역의 랜덤화를 실시하였다. nlpD 프로모터 영역(도 3)에는 2개소의 프로모터로서 기능한다고 추정되는 영역이 존재하고, 각각 도면중에서는 pnlp1, pnlp2로 나타낸다. 플라스미드 pMIV-PnlpO을 주형으로서, P11 및 P17(atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg("n"은 a, t, g, c의 어느 것이라도 양호한 것을 의미한다): 서열번호 57)을 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 nlpD 프로모터의 3' 말단측에 포함되는 -10 영역(-10(Pnlp1)이라고 기재한다)을 랜덤화한 DNA 단편을 취득하였다(도 3). PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 15초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분.
한편, 동일하게 플라스미드 pMIV-PnlpO을 주형으로서, P12 및 P18(tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg("n"은 a, t, g, c의 어느 것이라도 좋은 것을 의미한다): 서열번호 58)을 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 nlpD 프로모터의 5' 말단측에 포함되는 -10 영역(-10(Pnlp2)라고 기재)을 랜덤화한 DNA 단편을 취득하였다(도 3). PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 15초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분.
수득된 3' 말단측과 5' 말단측의 단편은 프라이머 P17과 P18에 디자인되어 있는 BglII 부위에 의해 서로 연결시킬 수 있고, 2개소의 -10 영역이 랜덤화된 nlpD 프로모터 전장을 구축할 수 있다. 이 단편을 주형으로 하여, P11 및 P12를 프라이머로서 사용한 PCR에 의해 개변형 nlpD 프로모터 전장의 DNA 단편을 취득하였다. PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 15초를 12사이클, 최후에 72℃ 5분.
증폭 단편을, 프라이머의 5' 말단에 디자인되어 있는 제한 효소 SalI 및 PaeI로 처리하고, 동일하게 SalI 및 PaeI로 처리한 플라스미드 pMIV-PnlpO-YeaS3에 삽입함으로써, 플라스미드상의 야생형 nlpD 프로모터 부위(PnlpO)를 변이형 Pnlp로 치환하였다. 이들 중에서 도 3에 도시하는 프로모터 서열(Pnlp8)을 갖는 것을 선택하여, pMIV-Pnlp8-YeaS7로 하였다. 이 플라스미드에 삽입된 Pnlp8 프로모터의 PaeI-SalI 단편의 염기 서열은 서열번호 42에 나타낸 바와 같다.
(1-2) 변이형 cysE 발현 플라스미드의 구축
다음에, pMW-Pomp-cysE5[참조: W02005/007841]로부터 PaeI, SacI로 Pomp-cysE5 카세트 부분을 절단하여, pMIV-5JS의 같은 부위에 삽입, pMIV-Pomp-CysE5를 구축하였다. pMW-Pomp-cysE5는 ompC 유전자 프로모터에 연결된 변이형 SAT를 암호화하는 유전자 cysE5를 pMW118에 삽입하여 수득된 플라스미드이다. pACYC184(GenBank/EMBL accession number X06403, NIPPON GENE으로부터 구입 가능)로부터, XbaI, Eco88I에서 테트라사이클린 내성 유전자를 절단하여, 당해 유전자 단편을 Klenow 단편으로 처리한 후, pMIV-Pomp-CysE5의 PvuI 부위에 삽입하고, pMT-Pomp-CysE5를 구축하였다. 이어서, pMIV-Pnlp8-YeaS7을 HindIII로 소화하여, Klenow 단편으로 평활말단화한 후, NcoI로 소화하여, Pnlp8-YeaS-rrnB 터미네이터의 카세트와 클로람페니콜 내성 마커를 포함하는 단편을 절단하였다. 이 단편을, 동일하게 pMIV-5JS를 백본(backbone)에 갖는 pMT-Pomp-CysE5의 SmaI, NcoI 절단 단편과 서로 연결시키고, pMT-EY2를 구축하였다. PMT-EY2는 Pnlp8-YeaS-rrnB 터미네이터 카세트와, Pomp-CysE5 카세트를 하나의 플라스미드상에 갖는 플라스미드이다.
(1-3) 피.아나나티스 SC17주로의 cysE5, yeaS의 도입
상기한 pMT-EY2는 pMIV-5JS[참조: 일본 공개특허공보 2008-99668]에 유래하는 Mu 파지의 부착 부위를 구비한다. 당해 플라스미드를 Mu 트랜스포사제를 갖는 헬퍼 플라스미드 pMH1O[참조: Zimenkov D. et al., Biotechnologiya(in Russian), 6, 1-22(2004)]과 동일 세포내에서 공존시킴으로써, 이 pMT-EY2 플라스미드상에서 Mu 파지의 부착 부위에 끼워져 있는 형태로 존재하는 클로람페니콜 내성 마커를 포함하는 PompC-cysE5-Pnlp8-YeaS-rrnB 터미네이터의 카세트를, 피.아나나티스 SC17주[참조: 미국특허 6596517]의 염색체상에 삽입할 수 있다. 또한, pMT-EY2 플라스미드상에 존재하는 클로람페니콜 내성 마커는 2개의 λ 파지의 부착 부위(λattR과 λattL) 사이에 끼워져 있는 구조를 갖기 때문에, 후술하는 방법에 의해 클로람페니콜 내성 마커를 잘라내어 제거할 수 있다.
우선, SC17주에 전기천공에 의해 pMH10이 도입된 주를, 20mg/L의 카나마이신을 포함하는 LB 한천 배지에서 30℃에서 밤새 배양함으로써 선택하였다. 수득된 형질전환주를 30℃에서 배양하고, 또한 이 주에 전기천공에 의해 pMT-E2를 도입하였다. 이 pMH10과 pMT-EY2의 양쪽에서 형질전환된 주에, 42℃, 20분간의 조건으로 열 충격을 준 후, 20mg/L의 클로람페니콜을 포함하는 LB 한천 배지에서 클로람페니콜 내성주의 콜로니를 선택하였다. 이 때 배양 온도는 39℃로 하였다. 이렇게 하여, 약 50 클론을 취득하고, 각각을 LB 한천 배지에서 39℃, 48시간 배양함으로써, pMH10 및 pMT-EY2의 큐어링(curing)을 실시하였다. 염색체상에 카세트가 삽입됨으로써 클로람페니콜 내성을 나타내고, 양 플라스미드를 큐어링한 결과 카나마이신 및 암피실린 감수성을 나타내는 주를 취득하였다. 또한, 이 주의 염색체 DNA를 주형으로서, P11과 P16을 프라이머로서 사용한 PCR에 의해, 수득된 주의 염색체상에 원하는 카세트가 삽입되어 있는 것을 확인하였다. 수득된 모든 클론을 각각 EYO1 내지 EY50이라고 명명하고, EYO1 내지 EY50주의 L-시스테인 생산 배양을 실시하였다. 배양은 후술하는 방법을 사용하였다. 그 결과, 가장 많이 L-시스테인을 생산한 클론인 EY19주를 선발하였다.
EY19주에 도입된 클로람페니콜 내성 마커를, 람다 파지 유래의 절단 시스템에 의해서 제거하였다. 구체적으로는, 람다 파지의 Int-Xis 유전자를 탑재한 pMT-Int-Xis2[참조: W02005/010175]에서 EY19주를 형질전환하고, 수득된 형질전환주로부터 클로람페니콜 감수성을 나타내는 EY19(s)주를 취득하였다.
(1-4) EY19(s)주로부터의 cysPTWA 유전자 발현 강화주의 제작
다음으로, cysPTWA 유전자의 발현을 강화시키기 위해서, 염색체상의 cysPTWA 유전자 클러스터의 상류에 존재하는 프로모터를, 앞에서 기술한 강력한 프로모터Pnlp8로 치환하였다. 우선 pMIV-Pnlp8-YeaS7을 주형으로, P11 및 P12를 사용한 PCR에 의해 nlp8 프로모터 약 300bp를 포함하는 DNA 단편을 취득하였다. PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 59℃ 20초, 72℃ 15초를 20사이클, 최후에 72℃ 5분.
증폭된 nlp8 프로모터를 포함하는 DNA 단편을 Klenow 단편으로 처리하고, XbaI로 절단 후에 Klenow 단편으로 처리된 플라스미드 pMW118-(λattL-KmR-λattR)[참조: W02006/093322A2]에 삽입하여, 플라스미드 pMW-Km-Pnlp8을 취득하였다. pMW-Km-Pnlp8을 주형에 사용하여, 프라이머 P19(tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta: 서열번호 59), 및 P20(tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag ttg: 서열번호 60)을 사용한 PCR에 의해, Km-Pnlp8 카세트를 포함하는 약 1.6kb의 DNA 단편을 증폭시켰다. 이 때의 PCR 사이클은 다음과 같다. 95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 54℃ 20초, 72℃ 90초를 30사이클, 최후에 72℃ 5분. 양 프라이머상에는 λ 의존 통합(「Red-driven integration」이라고 불리는 방법[참조: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)] 에 의해 목적의 단편을 삽입하기 위한 염색체상의 타깃이 되는 서열(이 경우는 cysPTWA의 프로모터 근방의 서열)이 디자인되어 있다. 이로 인해, 취득된 DNA 단편을 목적의 균주에 λ 의존 통합에 의해 삽입한 경우에는 염색체상의 cysPTWA 유전자 직전에 Km-Pnlp8이 삽입되고, nlp8 프로모터에 cysPTWA 유전자가 연결되는 구조로 된다. cysPTWA 유전자 클러스터의 염기 서열을 서열번호 43에, cysP, cysT, cysW의 각 유전자에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 44 내지 46에 나타낸다. cysA 유전자의 염기 서열, 및 당해 유전자가 암호화되는 아미노산 서열을, 각각 서열번호 47, 48에 나타낸다.
피.아나나티스 SC17(0)/RSF-Red-TER주는 λ 의존 통합을 효율적으로 실시하기 위한 숙주 균주이며, λ Red 유전자 산물에 내성인 피.아나나티스 균주인 SC17(0)주에 λ의 gam, bet 및 exo의 각 유전자(이하, 「λ Red 유전자」)를 발현하는 헬퍼 플라스미드 RSF-Red-TER이 도입된 균주이다[참조: WO2008/075483]. SC17(0)주는 2005년 9월 21일에 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(Russian National Collection of Industrial Microorganisms(VKPM), GNII Genetika)(주소: Russia, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd. 1)에 수탁번호 VKPM B-9246하에 기탁되어 있다. 또한, 이 RSF-Red-TER 플라스미드의 구축 방법은 W02008/075483에 상세하게 기재되어 있다.
상기 SC17(0)/RSF-Red-TER주를, λ Red 유전자 발현 유도를 위해 IPTG를 첨가한 조건으로 배양하고, 전기천공용의 세포를 조제하였다. 이들의 세포에, 상기 목적의 DNA 단편을 전기천공으로 도입하고, 카나마이신 내성을 지표에 λ 의존 통합에 의해 cysPTWA 유전자 상류에 nlp8 프로모터가 삽입된 재조합주를 취득하였다. 취득된 주의 염색체 DNA를 주형에, P21(ctttgtccct ttagtgaagg: 서열번호 61), P22(agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac: 서열번호 62)를 프라이머에 사용한 PCR로써, 목적의 Km-Pnlp8-cysPTWA의 구조가 형성되어 있는 것을 확인하고, 이 주를 SC17(0)-Pnlp8-PTWA주라고 명명하였다.
다음에, SC17(0)-Pnlp8-PTWA주의 염색체 DNA를 정제하고, 이 염색체 DNA 10μg을 전기천공법에 의해 EY19(s)주에 도입하고, 카나마이신 내성주를 취득하였다. 수득된 주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, P21, P22를 프라이머로서 사용한 PCR에 의한 증폭을 실시하고, EY19(s)주의 염색체에 Km-Pnlp8-cysPTWA의 구조가 도입된 것을 확인하였다. 이렇게 해서 취득된 주를 EYP197주라고 명명하였다. 또한 상기 pMT-Int-Xis2를 사용한 카나마이신 내성 마커의 염색체상에서의 제거를 실시하고, 카나마이신 감수성이 된 주를 EYP197(s)주라고 명명하였다.
(1-5) EYP197(s)주로부터의 변이형 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제(serA348) 유전자 탑재주의 제작
L-시스테인 생산균에 도입하는 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제로서, 판토에아 아나나티스 유래의 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제를 암호화하는 유전자로서, 348위치의 아스파라긴 잔기가 알라닌으로 치환된 변이형 효소(N348A)를 암호화하는 serA348 유전자[참조: J. Biol. Chem. 1996; 271(38): 23235-8]를 이하의 방법으로 구축하였다.
판토에아 아나나티스 유래의 야생형 serA 유전자의 서열을 서열번호 49에 나타낸다. 당해 유전자가 암호화되는 아미노산 서열을 서열번호 50에 나타낸다. 상기 변이가 도입된 serA 유전자의 3'측 DNA 단편을 수득하기 위해서, SC17주 염색체 DNA를 주형에, P23(agctgagtcg acatggcaaa ggtatcactg gaa: 서열번호 63) 및 P24(gagaacgccc gggcgggctt cgtgaatatg cagc: 서열번호 64)를 프라이머에 사용한 PCR(95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 60초를 25사이클, 최후에 72℃ 5분)을 실시하였다. 다음으로 동일하게 하여 변이가 도입된 5'측 DNA 단편을 수득하기 위해서, SC17주 염색체 DNA를 주형에, P25(agctgatcta gacgtgggat cagtaaagca gg: 서열번호 65), 및 P26(aaaaccgccc gggcgttctc ac: 서열번호 66)을 프라이머에 사용한 PCR(95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 20초를 20사이클, 최후에 72℃ 5분)을 실시하였다. 수득된 양 PCR 단편을 제한 효소 SmaI에 의해 처리한 후, DNA 리가제에 의한 라이게이션에 의해 연결하고, 목적의 변이(N348A)를 포함하는 변이형 serA 유전자 전장의 DNA 단편을 수득하였다. 당해 DNA 단편을 주형으로 하여 P23과 P25를 프라이머에 사용하여 PCR 증폭(95℃ 3분 후, 95℃ 60초, 50℃ 30초, 72℃ 40초를 2사이클, 94℃ 20초, 60℃ 20초, 72℃ 75초를 15사이클, 최후에 72℃ 5분)을 실시하였다. P23 및 P25 프라이머에 디자인되어 있는 SalI, XbaI 제한 효소 부위를 SalI, XbaI로 처리한 후, 동일하게 SalI, XbaI로 처리한 pMIV-Pnlp8-ter에 삽입하여, pMIV-Pnlp8-serA348을 제작하였다.
구축된 pMIV-Pnlp8-serA348에는 pMIV-5JS[참조: 일본 공개특허공보 2008-99668]에 유래하는 Mu의 부착 부위가 탑재되어 있다. 이 플라스미드를 사용하면, 상기한 바와 같이, Mu 트랜스포사제를 갖는 헬퍼 플라스미드 pMH10을 사용함으로써, 클로람페니콜 내성 마커를 포함하는 Pnlp8-serA348-rrnB 터미네이터의 카세트를 피.아나나티스 SC17주의 염색체상에 삽입할 수 있다. SC17(0)주에 pMIV-Pnlp8-serA348 플라스미드 및 pMH10을 도입하고, 염색체에 Pnlp8-serA348-rrnB 터미네이터의 카세트가 삽입된 주를 취득하였다. 프라이머 P11, P25를 사용한 PCR에 의해, 목적의 카세트가 세포 중에 존재하는 것을 확인하였다. 수득된 50 클론에 대해, 세포 추출액 중의 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제 활성을 측정하여, 가장 활성이 높았던 균주를 선발하여, SC17int-serA348주라고 명명하였다. 다음으로, SC17int-serA348주의 염색체 DNA 10μg을 전기천공에 의해 EYP197(s)주에 도입하고, 클로람페니콜 내성주를 취득하여, 프라이머 P11, P25를 사용한 PCR에 의해, EYP197(s)주의 염색체에 클로람페니콜 내성 마커와 함께 Pnlp8-serA348의 구조가 도입된 것을 확인하였다. 이렇게 해서 취득된 주를 EYPS1976주라고 명명하였다.
상기한 pMT-Int-Xis2를 사용한 마커 제거 방법에 의해, 클로람페니콜 내성 마커를 제거하고, 클로람페니콜 감수성으로 된 주를 EYPS1976(s)주라고 명명하였다.
(1-6) EYPS1976(s)주로부터의 gcd 유전자 결손주의 제작
실시예 1에 기재된 SC17(0)::Δgcd주로부터 게놈 DNA를 조제하고, 전기천공에 의해 EYPS1976(s)주에 도입하고, 카나마이신 내성을 지표로 EYPS1976(s)주와 gcd 결손주(EYPS1976Δgcd주)를 취득하였다.
(2) L-시스테인 생산균 EYPS1976(s)주와 EYPS1976Δgcd주의 배양
gcd 유전자 결손이 L-시스테인 및 L-시스테인의 전구체인 O-아세틸세린의 발효 생산에 미치는 효과를 조사하기 위해서, L-시스테인 생산균 EYPS1976(s)주와 이것으로부터 유도된 gcd 결손주 EYPS1976Δgcd주에 의한 발효 생산 배양을 실시하고, 생산되는 L-시스테인 및 0-아세틸 세린의 양을 비교하였다. 배양에는 하기 조성의 L-시스테인 생산 배지를 사용하였다.
[L-시스테인 생산 배지] (각 성분의 농도는 최종 농도)
성분 1:
(NH4)2SO4 15g/L
KH2PO4 1.5g/L
MgSO4·7H2O 1g/L
티아민 염산염 0.1mg/L
성분 2:
FeSO4·7H2O 1.7mg/L
Na2MoO4·2H2O 0.15mg/L
CoCl2·6H2O 0.7mg/L
MnCl·4H2O 1.6mg/L
ZnSO4·7H2O 0.3mg/L
CuSO4·5H2O 0.25mg/L
성분 3:
트립톤 0.6g/L
효모 추출물 0.3g/L
염화나트륨 0.6g/L
성분 4:
탄산칼슘 20g/L
성분 5:
L-히스티딘 염산염 일수화물 135mg/L
성분 6:
티오황산나트륨 6g/L
성분 7:
피리독신 염산염 2mg/L
성분 8:
글루코스 40g/L
각 성분에 대하여, 각각 10배(성분 1), 1000배(성분 2), 100/6배(성분 3), 100배(성분 5), 35Og/L(성분 6), 1000배(성분 7), 10배(성분 8)의 저장 용액을 제작해두고, 사용시에 혼합하여, 멸균수로 규정 양까지 증량하여 최종 농도로 하였다. 살균은 110℃, 30분의 오토클레이브(성분 1, 2, 3, 5, 8), 180℃, 5시간 이상의 건열 멸균(성분 4), 및 필터 멸균(성분 6, 7)에 의해 실시하였다.
L-시스테인 생산 배양은 이하의 순서로 실시하였다. EYPS1976(s)주와 EYPS1976Δgcd주를 LB 한천 배지에 넓게 도포하고, 34℃에서 하룻밤 전(前)배양을 실시한 후, 10마이크로리터 사이즈의 식균용 루프(Blue Loop; 제조원: NUNC사)로 플레이트상 약 7cm분의 균체를 2회 긁어모아, 대시험관(내경 23mm, 길이 20cm)에서 2ml 가득 채운 L-시스테인 생산 배지 중에 식균하고, 배양 개시 시점에서의 균체량이 거의 같아지도록 조제하였다.
34℃ 및 38℃ 각각에서 진탕 배양을 실시하고, 24시간 후에 배양을 종료하였다. 이 시점에서 탄소원인 글루코스를 다 소비하는 것이 확인되었다. 배지 중에 생산된 L-시스테인의 정량은 Gaitonde, M.K.[참조: Biochem J. 1967 Aug;104(2): 627-33]에 기재된 방법으로 실시하였다. 또한, 배지 중에 생산된 OAS(O-아세틸세린)의 정량은 HPLC에 의해서 실시하였다. 이 때, 샘플을 200mM의 Tris-HCl(pH 9.0)로 희석함으로써 OAS를 보다 안정된 NAS(N-아세틸세린)로 변환하여 검출하는 방법을 취하였다. HPLC의 조건은 다음과 같다.
칼럼: Inertsil ODS-3(소수성 칼럼/ 제조원: GL Science Co., Ltd.)
완충액 유속: 1.0mL/분
칼럼 온도: 40℃
검출기: UV210nm
샘플 공급량: 10mL
완충액: 0.1M KH2PO4·H3P04(pH 2.2), 5mM 1-옥탄설폰산 Na.
각 주 모두 6반복으로 실험을 실시하고, 각 평균치와 표준편차를 표 2에 나타내었다. 표 2에 나타낸 바와 같이, gcd 결손은 34℃, 38℃ 어느 배양 온도에 있어서도 L-시스테인과 O-아세틸세린을 증가시키는 효과가 있는 것을 알았다. 이의 증가 폭은 38℃에서 보다 현저하고, 고온에서의 배양에서 특히 큰 효과가 있음을 알았다. 또한, 38℃에서는 균량(OD)을 증가시키는 효과가 있음을 알았다.
Figure 112011024646435-pct00002
[서열표의 설명]
서열번호 1: 판토에아 아나나티스의 gcd 유전자의 염기 서열
서열번호 2: 판토에아 아나나티스의 GCD의 아미노산 서열
서열번호 3: 판토에아 아나나티스의 hisD 유전자의 염기 서열
서열번호 4: Kmr유전자의 hisD 유전자로의 조합을 위한 단편의 증폭용 프라이머
서열번호 5: Kmr유전자의 hisD 유전자로의 조합을 위한 단편의 증폭용 프라이머
서열번호 6: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 7: cat 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 8: sacB 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 9: sacB 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 10: PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 11: PlacUV5 프로모터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 12: λRedαβγ 유전자 및 tL3을 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 13: λRedαβγ 유전자 및 tL3을 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 14: PlacUV5 프로모터 및 TrrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 15: PlacUV5 프로모터 및 TrrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 16: attL 증폭용 프라이머
서열번호 17: attL 증폭용 프라이머
서열번호 18: attL의 염기 서열
서열번호 19: attR 증폭용 프라이머
서열번호 20: attR 증폭용 프라이머
서열번호 21: attR의 염기 서열
서열번호 22: bla 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 23: bla 유전자를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 24: ter_rrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 25: ter_rrnB를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 26: ter_thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편의 염기 서열
서열번호 27: ter_thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 28: ter_thrL 터미네이터를 포함하는 DNA 단편 증폭용 프라이머
서열번호 29: gltA 유전자의 0RF 이외의 부분을 증폭하기 위한 프라이머
서열번호 30: gltA 유전자의 0RF 이외의 부분을 증폭하기 위한 프라이머
서열번호 31: prpC 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 32: prpC 유전자 증폭용 프라이머
서열번호 33: gcd 결손용 프라이머
서열번호 34: gcd 결손용 프라이머
서열번호 35: gcd 결손 확인용 프라이머
서열번호 36: gcd 결손 확인용 프라이머
서열번호 37: 야생형 cysE 유전자의 염기 서열
서열번호 38: 야생형 cysE가 암호화되는 세린 아세틸트랜스퍼라제의 아미노산 서열
서열번호 39: 야생형 yeaS 유전자의 염기 서열
서열번호 40: 야생형 YeaS의 아미노산 서열
서열번호 41: PnlpO의 염기 서열
서열번호 42: Pnlp8의 염기 서열
서열번호 43: cysPTWA 유전자 클러스터의 염기 서열
서열번호 44: cysP 유전자가 암호화되는 아미노산 서열
서열번호 45: cysT 유전자가 암호화되는 아미노산 서열
서열번호 46: cysW 유전자가 암호화되는 아미노산 서열
서열번호 47: cysA 유전자의 염기 서열
서열번호 48: cysA 유전자가 암호화되는 아미노산 서열
서열번호 49: 판토에아 아나나티스 야생형 serA 유전자의 염기 서열
서열번호 50: 판토에아 아나나티스 야생형 serA 유전자가 암호화되는 아미노산 서열
서열번호 51 내지 66: 프라이머 P11 내지 P26
독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터 FERMBP-11091 20090204 통상산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소 FERMBP-7207 19990818 러시안 내셔널 컬렉션 오브 인더스트리얼 마이크로오거니즘즈(VKPM) B-9246 20050921
<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Microorganism capable of producing L-amino acid, and method for producing L-amino acid <130> D095-C9293 <150> JP 2008-229736 <151> 2008-09-08 <150> JP 2009-032839 <151> 2009-02-16 <160> 66 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2931 <212> DNA <213> Pantoea anantis <220> <221> CDS <222> (301)..(2691) <400> 1 gcgtctggcg atctcattcc ctttacgctt taacctttct tatctcctgg cactattgaa 60 tcatatcggc aaggccccat taacaccctc taaagtattg ccttagatgc gttgttaaga 120 gctttaagcc aaaaaaatca aaactcatac caattttgct ataacattta acagatatgg 180 atcatcacgc ttcagggaag agcgaaataa gaatgccttt catcttttgt actttatgac 240 tgacaacaat ctatctgatt gttttcctga gttttctggc aacgaaatga ggtcaacatt 300 atg ggg aaa aac tcc tca tcc ttt agc gtg gtc cgt ttt tta acg gtg 348 Met Gly Lys Asn Ser Ser Ser Phe Ser Val Val Arg Phe Leu Thr Val 1 5 10 15 ctg ttc gcc gtg cta acg ggt gcg ttc atg tta att ggt ggt atc tgg 396 Leu Phe Ala Val Leu Thr Gly Ala Phe Met Leu Ile Gly Gly Ile Trp 20 25 30 ctg gcc acg atc ggt ggt tcc tgg tac tac atc atc ggc ggt gca gcc 444 Leu Ala Thr Ile Gly Gly Ser Trp Tyr Tyr Ile Ile Gly Gly Ala Ala 35 40 45 atg ctg ctt acc gct ttc ctg ctg tgg cga cgt aac agc gct gcc ctg 492 Met Leu Leu Thr Ala Phe Leu Leu Trp Arg Arg Asn Ser Ala Ala Leu 50 55 60 gtt gtc tat gcg ctc tta ctg ctg gct acg ctg gcc tgg ggc gtt tgg 540 Val Val Tyr Ala Leu Leu Leu Leu Ala Thr Leu Ala Trp Gly Val Trp 65 70 75 80 gaa gtc ggc acc gac ttc tgg gca ctg gca ccg cgt acc gac gta ctg 588 Glu Val Gly Thr Asp Phe Trp Ala Leu Ala Pro Arg Thr Asp Val Leu 85 90 95 gtg atc ttt ggc gtc tgg ctg gtg ttg ccc ttt gtc tat cgc ggc tta 636 Val Ile Phe Gly Val Trp Leu Val Leu Pro Phe Val Tyr Arg Gly Leu 100 105 110 tac cag ccg ggt aaa ggc gca ctg ggt gcc atg ggc gta gcg ctg gtt 684 Tyr Gln Pro Gly Lys Gly Ala Leu Gly Ala Met Gly Val Ala Leu Val 115 120 125 gcc agt gca gcg gtg tta acc tat tcc gtc ttt aat gat ccg caa gtg 732 Ala Ser Ala Ala Val Leu Thr Tyr Ser Val Phe Asn Asp Pro Gln Val 130 135 140 gtt aac ggt gca tta ccg gca aca gcg gat aat gcg cct cag gca cag 780 Val Asn Gly Ala Leu Pro Ala Thr Ala Asp Asn Ala Pro Gln Ala Gln 145 150 155 160 ccg ttg agc aat att gct gat ggt gac tgg ccg gcc tat gcg cgc gat 828 Pro Leu Ser Asn Ile Ala Asp Gly Asp Trp Pro Ala Tyr Ala Arg Asp 165 170 175 cag caa ggg acg cgc ttc tcg ccg ctc aag cag atc aac cac gac aat 876 Gln Gln Gly Thr Arg Phe Ser Pro Leu Lys Gln Ile Asn His Asp Asn 180 185 190 gtg aaa gaa ctg cag gtt gcc tgg caa ttc cag acc ggt gat atg aaa 924 Val Lys Glu Leu Gln Val Ala Trp Gln Phe Gln Thr Gly Asp Met Lys 195 200 205 cgc cca agc gat ccg ggc gaa att acc gat gaa gtg acg cca atc aag 972 Arg Pro Ser Asp Pro Gly Glu Ile Thr Asp Glu Val Thr Pro Ile Lys 210 215 220 att cgc gac acg ctg tat ctt tgc acg cca cat cag att tta ttt gct 1020 Ile Arg Asp Thr Leu Tyr Leu Cys Thr Pro His Gln Ile Leu Phe Ala 225 230 235 240 ctg gat gcg gcc acc ggc aag caa aag tgg aag ttt gat ccc ggc ctg 1068 Leu Asp Ala Ala Thr Gly Lys Gln Lys Trp Lys Phe Asp Pro Gly Leu 245 250 255 aaa acc aac cca acc ttc cag cac gtg acc tgt cgt ggt gtg tca tac 1116 Lys Thr Asn Pro Thr Phe Gln His Val Thr Cys Arg Gly Val Ser Tyr 260 265 270 cac gaa ttc cct gca gcg aag gat gcg tcc aat acc cag cct gcg ctg 1164 His Glu Phe Pro Ala Ala Lys Asp Ala Ser Asn Thr Gln Pro Ala Leu 275 280 285 tgc tcg cgt cgt atc tac ctg cca gtc aat gac ggg cgt ttg ttc gcg 1212 Cys Ser Arg Arg Ile Tyr Leu Pro Val Asn Asp Gly Arg Leu Phe Ala 290 295 300 ctg gat gcg gaa acc ggt gaa cgc tgc ccg gcc ttt ggt aac aac ggt 1260 Leu Asp Ala Glu Thr Gly Glu Arg Cys Pro Ala Phe Gly Asn Asn Gly 305 310 315 320 gag ctg gat ctg cag cac aag cag ccg gtc aca acg cca ggc atg tat 1308 Glu Leu Asp Leu Gln His Lys Gln Pro Val Thr Thr Pro Gly Met Tyr 325 330 335 gag cca acc tcg cca ccg gtg att act gac acc acc att gtg atg gct 1356 Glu Pro Thr Ser Pro Pro Val Ile Thr Asp Thr Thr Ile Val Met Ala 340 345 350 ggc gcg gta acc gat aac ttt tca acc cgt gaa cct tca ggc gcc atc 1404 Gly Ala Val Thr Asp Asn Phe Ser Thr Arg Glu Pro Ser Gly Ala Ile 355 360 365 cgt ggc ttt gat gtg aac acc ggt aag ctg ttg tgg gtg ttc gat ccg 1452 Arg Gly Phe Asp Val Asn Thr Gly Lys Leu Leu Trp Val Phe Asp Pro 370 375 380 ggc gcg aaa gat cct aac gcg att ccg gcg gat gaa cac acg ttc acc 1500 Gly Ala Lys Asp Pro Asn Ala Ile Pro Ala Asp Glu His Thr Phe Thr 385 390 395 400 atg aac tcc cct aac tcg tgg gca cct gcg gtt tac gat ccg aag ctg 1548 Met Asn Ser Pro Asn Ser Trp Ala Pro Ala Val Tyr Asp Pro Lys Leu 405 410 415 gat atc gtt tac ctg cca atg ggg gtg acc acg ccg gat atc tgg ggc 1596 Asp Ile Val Tyr Leu Pro Met Gly Val Thr Thr Pro Asp Ile Trp Gly 420 425 430 ggc aac cgc aca cct gag cag gaa cgt tat gcc agc agc gtg ctg gcg 1644 Gly Asn Arg Thr Pro Glu Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ser Val Leu Ala 435 440 445 ctg aac gcg acg acc ggt aag ctg gtg tgg tca tat cag act gtg cat 1692 Leu Asn Ala Thr Thr Gly Lys Leu Val Trp Ser Tyr Gln Thr Val His 450 455 460 cac gat ctg tgg gat atg gac ctg cct tcg cag ccg acg ctg gcg gat 1740 His Asp Leu Trp Asp Met Asp Leu Pro Ser Gln Pro Thr Leu Ala Asp 465 470 475 480 att acc gat aaa gac ggt aat acc gtg ccg gtt atc tat gcc cct gcc 1788 Ile Thr Asp Lys Asp Gly Asn Thr Val Pro Val Ile Tyr Ala Pro Ala 485 490 495 aaa acc ggg aac atc ttt gtt ctg gat cgc cgc aca ggt aaa act gtg 1836 Lys Thr Gly Asn Ile Phe Val Leu Asp Arg Arg Thr Gly Lys Thr Val 500 505 510 gtt ccg gcc ccg gaa acc cct gtt ccg cag ggc gca gct aag ggc gac 1884 Val Pro Ala Pro Glu Thr Pro Val Pro Gln Gly Ala Ala Lys Gly Asp 515 520 525 cat gtc tca gct aca cag cct tac tct gaa ctg acc ttc cgt ccg aaa 1932 His Val Ser Ala Thr Gln Pro Tyr Ser Glu Leu Thr Phe Arg Pro Lys 530 535 540 cag aac ctg acg gat aag gac atg tgg ggc gcg acg atg tat gac cag 1980 Gln Asn Leu Thr Asp Lys Asp Met Trp Gly Ala Thr Met Tyr Asp Gln 545 550 555 560 ctg gtg tgc cgc gtg att ttc aaa cgt ctg cgc tac gaa ggt ccg ttc 2028 Leu Val Cys Arg Val Ile Phe Lys Arg Leu Arg Tyr Glu Gly Pro Phe 565 570 575 acg cca cct tct gag cag ggc acc ctg gtc ttc ccg ggc aac ctg ggc 2076 Thr Pro Pro Ser Glu Gln Gly Thr Leu Val Phe Pro Gly Asn Leu Gly 580 585 590 atg ttt gaa tgg ggc ggc att tcc gtt gat ccg cat cgt cag att gcg 2124 Met Phe Glu Trp Gly Gly Ile Ser Val Asp Pro His Arg Gln Ile Ala 595 600 605 att gct aac cca atg gcg ctg ccg ttc gtg tct aag ctg atc cca cgc 2172 Ile Ala Asn Pro Met Ala Leu Pro Phe Val Ser Lys Leu Ile Pro Arg 610 615 620 ggt ccg ggt aat ccg gaa gag cca cca aaa ggc gca acg ggc ggt tca 2220 Gly Pro Gly Asn Pro Glu Glu Pro Pro Lys Gly Ala Thr Gly Gly Ser 625 630 635 640 ggt act gaa acc ggt att cag ccg cag tac ggt gtg cca tat ggc gtt 2268 Gly Thr Glu Thr Gly Ile Gln Pro Gln Tyr Gly Val Pro Tyr Gly Val 645 650 655 gaa ctg aat ccg ttc ctg tca cct ttt ggt ctg ccg tgt aaa caa cct 2316 Glu Leu Asn Pro Phe Leu Ser Pro Phe Gly Leu Pro Cys Lys Gln Pro 660 665 670 gca tgg ggt tat gtt tct gct gtt gac ctg aaa acc aac gaa gtg gtg 2364 Ala Trp Gly Tyr Val Ser Ala Val Asp Leu Lys Thr Asn Glu Val Val 675 680 685 tgg aaa caa cgt att ggt acc gtt cgt gac agc tca cct gta ccg ctg 2412 Trp Lys Gln Arg Ile Gly Thr Val Arg Asp Ser Ser Pro Val Pro Leu 690 695 700 ccc ttt aaa atg ggt atg cca atg ctg ggc gga ccg gtt gcc acc gca 2460 Pro Phe Lys Met Gly Met Pro Met Leu Gly Gly Pro Val Ala Thr Ala 705 710 715 720 ggc aaa gtg ttc ttt att ggc gca acg gct gat aac tac ctg cgc gct 2508 Gly Lys Val Phe Phe Ile Gly Ala Thr Ala Asp Asn Tyr Leu Arg Ala 725 730 735 ttc agc acc gac acc ggt gaa ctc ttg tgg cag gcg cgc ctg cca gcc 2556 Phe Ser Thr Asp Thr Gly Glu Leu Leu Trp Gln Ala Arg Leu Pro Ala 740 745 750 ggt ggt cag gca acg cca atg acc tat gaa gtt aac ggc aag caa tac 2604 Gly Gly Gln Ala Thr Pro Met Thr Tyr Glu Val Asn Gly Lys Gln Tyr 755 760 765 gtt gtg att gct gcc ggt ggc cat ggt tca ttc ggc acc aag ctg ggc 2652 Val Val Ile Ala Ala Gly Gly His Gly Ser Phe Gly Thr Lys Leu Gly 770 775 780 gat tac gtg att gcc tat gcg ctg ccc gac cag aag taa ttaacacctg 2701 Asp Tyr Val Ile Ala Tyr Ala Leu Pro Asp Gln Lys 785 790 795 aacagaggcg gactccggtc cgcctttttt tatgcctgct atctgccctg tgcttttgcg 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gccttcgttg cctctgatct gctgtcgcag 780 gcggaacacg gccctgactc gcaggtgatt ttactgacgc cttcgctggc gctggccgag 840 cgcgtcgccg aggcggtgga ggatcagctg gcccagttgc cacgtgcggc gacagcccgc 900 caggcactgg aaagcagccg cctgatcgtc gcccgggata tgcagcaatg cattgcgatc 960 tccaaccgct atggtccgga gcacctgatt ctgcaaaccc gcacgccacg ggatctggtg 1020 gaacagatta ccagcgccgg ttcggttttc ctgggcgact ggtcaccgga atccgcagga 1080 gattatgctt cgggcaccaa ccacgtgctg ccgacctacg gctataccgc gacatgctcc 1140 agcctgggcc tggccgactt tcagaaacgc atgacggtac aggagctgac gccgcagggc 1200 ttcctgaacc tggcggcgac catcgaaacc ctggcggccg ctgaacagct gcacgcccac 1260 aaaaatgccg tcacgttgcg cgttgccgca ctcaaggagc aagcatga 1308 <210> 4 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 4 ccatagcggt tggagatcgc aatgcattgc tgcatatccc tgaagcctgc ttttttatac 60 taagttgg 68 <210> 5 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer <400> 5 gcccgccagg cactggaaag cagccgcctg atcgtcgccc cgctcaagtt agtataaaaa 60 agctgaac 68 <210> 6 <211> 33 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1229 actaccgaca ccgcattgga cagattcatg ctgcggctgt ccggcaccat cggaatgcga 1289 attttttgtt cagcgggcag ggcatcaaga atgctcgctg gcaggccgcg tgtttccggg 1349 ccgaacatca gataatcgcc atcctgatag cttacggcgc tgtgagcagg tgtacctttc 1409 gtggtgaggg cga 1422 <210> 38 <211> 273 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 38 Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala Glu 1 5 10 15 Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe Tyr His 20 25 30 Ala Thr Leu Leu Lys His Glu Asn Leu Gly Ser Ala Leu Ser Tyr Met 35 40 45 Leu Ala Asn Lys Leu Ser Ser Pro Ile Met Pro Ala Ile Ala Ile Arg 50 55 60 Glu Val Val Glu Glu Ala Tyr Ala Ala Asp Pro Glu Met Ile Ala Ser 65 70 75 80 Ala Ala Cys Asp Ile Gln Ala Val Arg Thr Arg Asp Pro Ala Val Asp 85 90 95 Lys Tyr Ser Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Lys Gly Phe His Ala Leu Gln 100 105 110 Ala Tyr Arg Ile Gly His Trp Leu Trp Asn Gln Gly Arg Arg Ala Leu 115 120 125 Ala Ile Phe Leu Gln Asn Gln Val Ser Val Thr Phe Gln Val Asp Ile 130 135 140 His Pro Ala Ala Lys Ile Gly Arg 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Asp Val Ser Arg Arg Ser Ser Leu 275 280 285 Glu Thr Pro Leu Pro Val Gln Val Leu Glu Val Ser Pro Arg Gly His 290 295 300 Phe Trp Gln Leu Val Val Gln Pro Thr Gly Trp Gln Ser Glu Pro Phe 305 310 315 320 Ser Leu Val Phe Asp Gly Glu Gln Thr Ala Pro Leu Arg Gly Glu Arg 325 330 335 Leu Phe Val Gly Leu Gln Gln Ala Arg Leu Tyr Gln Gly Ala Thr Pro 340 345 350 Leu Arg Ala Val Ala Phe Ala His Ser Ala 355 360 <210> 49 <211> 1779 <212> DNA <213> Pantoea ananatis <220> <221> CDS <222> (301)..(1536) <400> 49 gtcaaaaccc tcaaaaaata aagcaccggg cgcacaacag ggcgcccgct ttttttgatt 60 taaaaaaact tttctcacca ggctgaaatt tggtgactta tgtcacataa ccgtcatcgg 120 cagcgggttc gttcttctcg atgcggccaa cccacgattt tgtctggcaa agtacgtcct 180 ctgagccctg ccatgctggc ggtcaggcaa tcgtttgtat tgccgcaggc gatttttttg 240 atattttgac agacggctga ctgcgttcag tcctcgttga attctgaata gggttgggaa 300 atg gca aag gta tca ctg gaa aaa gac aaa att aag ttc ctg ctg gtg 348 Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu Val 1 5 10 15 gaa ggt gtc 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ggc acc gtg gta gat att cct gct ttg tgc gaa gcg ctg gcc agc aag 1068 Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Glu Ala Leu Ala Ser Lys 245 250 255 cag gtt ggt ggc gct gcg att gat gtg ttc cct gta gag ccg gcg acc 1116 Gln Val Gly Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Val Glu Pro Ala Thr 260 265 270 aac agc gat ccg ttt gtt tcc cca ctg agc gaa ttc gac aac gtt atc 1164 Asn Ser Asp Pro Phe Val Ser Pro Leu Ser Glu Phe Asp Asn Val Ile 275 280 285 ctg acg ccg cac atc ggg gga tcg acg gaa gaa gct cag gag aat atc 1212 Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Glu Glu Ala Gln Glu Asn Ile 290 295 300 ggg att gaa gtc gcg ggc aag ctg gcg aaa tat tcg gat aac ggt tca 1260 Gly Ile Glu Val Ala Gly Lys Leu Ala Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser 305 310 315 320 acg ctg tcc gcc gtc aat ttc ccg gaa gtg tca ttg ccg atg cac ggc 1308 Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Met His Gly 325 330 335 att agc gcc agt cgt ctg ctg cat att cac gaa aac cgt ccg ggc gtt 1356 Ile Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Ile His Glu Asn Arg Pro 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Val His Gln Ser Ala Leu Glu Asn Leu Arg Ala Ala Gly Tyr 20 25 30 Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Ala Glu Ala Leu Lys 35 40 45 Ala Ser Ala Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Ile Arg Ser Arg Ser Gln 50 55 60 Leu Thr Glu Glu Ile Phe Ala Ala Ala Glu Lys Leu Val Ala Val Gly 65 70 75 80 Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gln Val Asp Leu Asn Ala Ala Ala Lys 85 90 95 Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val 100 105 110 Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Met Leu Leu Met Leu Arg Gly Val Pro 115 120 125 Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Ile Trp Asn Lys Ile Ala Lys 130 135 140 Gly Ser Phe Glu Ala Arg Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly 145 150 155 160 His Ile Gly Met Gln Leu Gly Val Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met His 165 170 175 Val Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Ser 180 185 190 Gln Val Arg Ser Leu Thr Gln Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser 195 200 205 Leu His Val Pro Glu Thr Ala Ser Thr Gln Asn Met Ile Ser Ala Asn 210 215 220 Glu Leu Ala Gln Met Lys Pro Gly Gly Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg 225 230 235 240 Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Glu Ala Leu Ala Ser Lys 245 250 255 Gln Val Gly Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Val Glu Pro Ala Thr 260 265 270 Asn Ser Asp Pro Phe Val Ser Pro Leu Ser Glu Phe Asp Asn Val Ile 275 280 285 Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Glu Glu Ala Gln Glu Asn Ile 290 295 300 Gly Ile Glu Val Ala Gly Lys Leu Ala Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser 305 310 315 320 Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Met His Gly 325 330 335 Ile Ser Ala Ser Arg Leu Leu His Ile His Glu Asn Arg Pro Gly Val 340 345 350 Leu Thr Ala Ile Asn Gln Ile Phe Ala Glu Gln Gly Ile Asn Ile Ala 355 360 365 Ala Gln Tyr Leu Gln Thr Ser Pro Met Met Gly Tyr Val Val Ile Asp 370 375 380 Ile Asp Ala Glu His Glu Leu Ala Glu Lys Ala Leu Gln Leu Met Lys 385 390 395 400 Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr 405 410 <210> 51 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P11 <400> 51 agctgagtcg acccccagga aaaattggtt 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misc_feature <222> (51)..(51) <223> n is a, c, g, or t <400> 57 atcgtgaaga tcttttccag tgttnannag ggtgccttgc acggtnatna ngtcactgg 59 <210> 58 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P18 <220> <221> misc_feature <222> (16)..(20) <223> n is a, c, g, or t <400> 58 tggaaaagat cttcannnnn cgctgacctg cg 32 <210> 59 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P19 <400> 59 tccgctcacg atttttttca tcgctggtaa ggtcatttat cccccaggaa aaattggtta 60 <210> 60 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P20 <400> 60 tttcacaccg ctcaaccgca gggcataacc ggcccttgaa gcctgctttt ttatactaag 60 ttg 63 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P21 <400> 61 ctttgtccct ttagtgaagg 20 <210> 62 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P22 <400> 62 agctgatcta gaagctgact cgagttaatg gcctcccaga cgac 44 <210> 63 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer P23 <400> 63 agctgagtcg acatggcaaa 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Claims (9)

  1. 장내세균과(Enterobacteriaceae)에 속하고 L-아미노산 생산능을 갖는 세균을 배지에서 배양하여, 배양물 중에 L-아미노산을 생산 축적시켜, 당해 배양물로부터 L-아미노산을 채취함을 포함하는 L-아미노산의 제조 방법으로서, 상기 세균은 본래 피롤로퀴놀린 퀴논을 조효소로서 사용하는 글루코스 탈수소효소(GCD)의 활성을 갖지만, 당해 GCD의 활성이 저하되도록 개변된 세균으로, 상기 GCD의 활성의 저하가
    (1) gcd 유전자의 일부 또는 전부의 결손,
    (2) gcd 유전자에 다른 서열의 삽입,
    (3) gcd 유전자에 변이의 도입, 및
    (4) gcd 유전자의 프로모터 서열의 개변으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 방법에 의해 달성되고,
    상기 세균이, 판토에아(Pantoea)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 에르위니아(Erwinia)속, 클렙시엘라(Klebsiella)속, 프로비덴시아(Providencia)속, 살모넬라(Salmonella)속, 세라티아(Serratia)속, 모르가넬라(Morganella)속, 및 예르시니아(Yersinia)속으로부터 선택되는 속에 속하는 세균인, 방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 gcd 유전자가, 서열번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 또는 이의 변이체인, 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산, L-리신, L-트레오닌, L-아르기닌, L-히스티딘, L-이소류신, L-발린, L-류신, L-페닐알라닌, L-티로신, L-트립토판, 및 L-시스테인으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 L-아미노산인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산 또는 L-시스테인인, 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-글루탐산이며, 상기 세균에서 시트르산 신타제, 메틸 시트르산 신타제, 포스포에놀피루브산 카복실라제, 및 글루타메이트 데하이드로게나제로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 효소의 활성이 증강되어 있는, 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 L-아미노산이 L-시스테인이며, 상기 세균에서 3-포스포글리세레이트 데하이드로게나제, 세린 아세틸트랜스퍼라제, 및 황산염/티오황산염 수송계로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 활성이 증강되거나, 또는 yeaS 유전자의 발현이 증강되거나, 또는 상기 활성 및 발현이 둘 다 증강되는, 방법.
  8. 삭제
  9. 제1항에 있어서, 상기 세균이 판토에아 아나나티스(Pantoea ananatis)인, 방법.
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