JP6210162B2 - プトレシン分解経路が破壊された腸内細菌科の細菌を使用するｌ−アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、微生物工業に関し、更に詳しくは、プトレシン分解経路を破壊するように改変された腸内細菌科（family Enterobacteriaceae）の細菌の発酵によりＬ−アミノ酸を製造する方法に関する。

従来、Ｌ−アミノ酸は、天然起源から得られた微生物の株、又はその変異体を利用する発酵法によって工業的に製造されている。典型的には、微生物は、Ｌ−アミノ酸の生産収量を増強するように改変されている。

Ｌ−アミノ酸の生産収量を増強するための多数の技術が報告されており、これには組換えＤＮＡを用いて微生物を形質転換すること（例えば、特許文献１参照）、及びプロモータ、リーダー配列、及び／又はアテニュエータなどの制御領域、又は当業者に公知のものを変更すること（例えば、特許文献２〜３参照）が含まれる。生産収量を増強するための他の技術には、アミノ酸の生合成に関与する酵素の活性を増加させること、及び／又は結果的に得られるＬ−アミノ酸によるフィードバック阻害の標的酵素を脱感作することが含まれる（例えば、特許文献４〜８参照）。

Ｌ−アミノ酸の生産収量を増加させるための他の方法には、標的Ｌ−アミノ酸の分解に関与する１又は数個の遺伝子、標的Ｌ−アミノ酸の前駆体をＬ−アミノ酸の生合成経路から転用させる遺伝子、炭素、窒素、及びリン酸フラックスの再分布に関与する遺伝子、及びトキシン等をコードする遺伝子の発現を減弱させるものがある。

アルギニン、オルニチン、プトレシン、及びγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の異化のための経路は、関連している（非特許文献１）。アルギニン及びオルニチンは、ＣＡＤＢＥオペロン遺伝子によってコードされるＡＳＴ酵素により、アンモニア生産性アルギニンスクシニルトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）経路を介してグルタミン酸へと分解される。ＡＳＴ経路は、窒素が制限された生育の際のアルギニンの分解に必要であり、更にこれは他のアミノ酸の分解に寄与する。ＡＳＴ経路に対して代替的に、アグマチンを介してプトレシンに至る他のアルギニン異化経路が存在し、これは初発反応においてアルギニン脱炭酸酵素（ＡＤＣ）を利用するものである（ＡＤＣ経路）。ＡＤＣ経路は、唯一の窒素源としてのアルギニンを分解するためには使用されない（非特許文献２）。アルギニンの分解経路に対して、オルニチンは、ＯＤＣ経路においてオルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）によってプトレシンへと直接変換される。

プトレシン（テトラメチレンジアミン又は１，４−ジアミノブタンとも呼ばれる）は、グルタミル化プトレシン（ＧＰ）経路又はトランスアミナーゼ経路にによって、炭素源及び窒素源としての使用のために、ＧＡＢＡを介してコハク酸へと分解される。ＧＰ経路は、Puu経路とも呼ばれ、プトレシンをコハク酸へと完全に分解する酵素を利用するものである。puuA, puuB, puuC, puuD及びpuuE遺伝子は、プトレシン／Ｈ^＋共輸送体PuuP及びDNA結合性転写リプレッサPuuRをコードするpuuP及びpuuR遺伝子に沿って、puuダイバーゴン（divergon）内で組織化されている。puu遺伝子クラスタは、大腸菌（E. coli）及び密接に関連する腸内細菌において見出された（非特許文献３）。ポリアミンが相対的に高い濃度で存在する環境である哺乳類の腸において、E. coli及び関連する腸内細菌は、生存のための適応としてGP経路を利用する可能性があると仮定される。PatA, PatD, GabT及びGabDは、プトレシン分解のトランスアミナーゼ経路を構成する（非特許文献２）。

現在に至るまで、腸内細菌科の改変された細菌株によるＬ−アミノ酸生産に対するプトレシン分解経路の破壊の効果を示すデータは報告されていない。

米国特許第４，２７８，７６５Ａ号 米国特許第２００６０２１６７９６ Ａ１号 国際公開第９６１５２４６Ａ１号 国際公開第９５１６０４２Ａ１号 欧州特許第０６８５５５５Ａ１号 米国特許第４，３４６，１７０Ａ号 米国特許第５，６６１，０１２Ａ号 米国特許第６，０４０，１６０Ａ号

Schneider B.L.ら、「大腸菌におけるアルギニンの異化及びアルギニンスクシニルトランスフェラーゼ経路」、J. Bacteriol., 1998, 180, (16):4278-4286 Schneider B.L.ら、「プトレシンの異化は、大腸菌におけるいくつかのストレスに対する代謝的な応答である」、Mol. Microbiol., 2013, 88, (3):537-550 Nemoto N.ら、「Escherichia coli K-12における転写因子PuuRによるプトレシン利用経路の制御機構」、J. Bacteriol., 2012, 194, (13):3437-3447

本発明の１つの側面は、腸内細菌科に属する細菌であって、エシェリヒア（Escherichia）属に、更に詳しくは種E. coliに属するものとすることができ、例えば、グルタミル化プトレシン経路又はトランスアミナーゼ経路などのプトレシン分解経路を破壊するように改変した細菌を提供することにある。

本発明の他の側面は、後述する腸内細菌科の細菌を使用し、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンなどのＬ−アミノ酸を製造する方法を提供することにある。

これらの目的は、プトレシン分解経路の破壊により、Ｌ−アミノ酸、特に、限定されるものではないが、Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンなどのグルタミン酸ファミリーに属するＬ−アミノ酸のより高い生産性が微生物に対して与えられることを予期せず見出したことによって達成された。例えば、グルタミル化プトレシン経路などのプトレシン分解経路は、経路に由来する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現の調節解除により、特に、エシェリヒア属に、更に詳しくは種E. coliに属するものとすることのできる腸内細菌科に属する細菌の染色体上のpuuADRCBE遺伝子クラスタに由来する１又は数個の遺伝子の不活性化によって破壊させることができる。これらを見出したことは、本発明の限定的でない以下の側面に帰着する。

本発明の１つの側面は、
（i） 腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、
（ii） 細菌若しくは培養培地又は両方に含まれる前記Ｌ−アミノ酸を回収することを含み、
前記細菌が、プトレシン分解経路を破壊するように改変されていることを特徴とする、Ｌ−アミノ酸の製造方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路が、トランスアミナーゼ経路又はグルタミル化プトレシン経路である前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路が、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びこれらの組合せからなる群から選択される遺伝子の発現の減弱によって破壊されている前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路がグルタミル化プトレシン経路であり、グルタミル化プトレシン経路が、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の１又は数個の遺伝子の発現の減弱によって破壊されているが、puuR遺伝子は減弱された唯一の遺伝子とはなり得ない前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、プトレシン分解経路が、puuA遺伝子又は全puuADRCBE遺伝子クラスタの発現の減弱によって破壊されている前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、１又は数個の遺伝子の発現が、前記１又は数個の遺伝子の不活性化によって減弱されている前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、前記１又は数個の遺伝子が欠失している前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、パントエア（Pantoea）属に属する前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、細菌が、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）である前記方法を提供するものである。

本発明の更なる側面は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンからなる群から選択される前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、Ｌ−アミノ酸がグルタミン酸ファミリーに属し、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−オルニチン、及びＬ−プロリンからなる群から選択される前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニンである前記方法を提供するものである。
本発明の更なる側面は、Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−オルニチンである前記方法を提供するものである。

実施態様の説明
本発明を以下に詳細に説明する。
１．細菌
「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培養培地中
又は細菌細胞内でＬ−アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる能力を有する腸内細菌科の細菌を意味するものとすることができる。
「Ｌ−アミノ酸生産細菌」という記載は、野生株又は親株、例えば、E. coli K-12よりも多い量で培養培地中でＬ−アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させることのできる細菌を意味するものとすることができ、微生物が、０．５ｇ／Ｌ以上又は１．０ｇ／Ｌ以上の量の標的Ｌ−アミノ酸の培地中の蓄積させられることを意味するものとすることができる。細菌は、唯一の１種類のアミノ酸又は２種類以上のアミノ酸の混合物を生産することができる。

「Ｌ−アミノ酸生産能力」という記載は、細菌を培地中で培養した場合に、培地又は細菌細胞からＬ−アミノ酸を回収することができるようなレベルまで、培養培地中又は細菌細胞内でＬ−アミノ酸を生産し、放出若しくは分泌し、かつ／又は蓄積させる細菌の能力を意味するものとすることができる。

「Ｌ−アミノ酸」という記載は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンを意味するものとすることができる。

「芳香族Ｌ−アミノ酸」という記載は、例えば、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを含むことができる。Ｌ−ヒスチジンは芳香族部分、特にイミダゾール環を有していることから、「芳香族Ｌ−アミノ酸」という記載は、前記した芳香族Ｌ−アミノ酸の他に、Ｌ−ヒスチジンも含むことができる。
「非芳香族Ｌ−アミノ酸」という記載は、例えば、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、及びＬ−バリンを含むことができる。Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンなどの芳香族アミノ酸の生合成経路は、Ｌ−ヒスチジンの生合成経路とは異なることから、「非芳香族Ｌ−アミノ酸」という記載は、前記した非芳香族Ｌ−アミノ酸の他に、Ｌ−ヒスチジンも含むことができる。

１つのＬ−アミノ酸は、１を超えるＬ−アミノ酸ファミリーに属することができる。例として、グルタミン酸ファミリーに属するＬ−アミノ酸は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、及びＬ−プロリンを含み；セリンファミリーに属するＬ−アミノ酸は、Ｌ−システイン、グリシン、及びＬ−セリンを含み；アスパラギン酸ファミリーに属するＬ−アミノ酸は、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、及びＬ−スレオニンを含み；ピルビン酸ファミリーに属するＬ−アミノ酸は、Ｌ−アラン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−バリン、及びＬ−ロイシンを含み；芳香族ファミリーに属するＬ−アミノ酸は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−チロシンを含む。いくつかのＬ−アミノ酸は、他のＬ−アミノ酸の生合成経路における中間体となることができるため、前記したアミノ酸のファミリーは、他のＬ−アミノ酸、例えば、タンパク質を構成しないＬ−アミノ酸も含むことができる。例えば、Ｌ−シトルリン及びＬ−オルニチンは、アルギニン生合成経路由来のアミノ酸である。したがって、グルタミン酸ファミリーは、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−オルニチン、及びＬ−プロリンを含み得る。

Ｌ−アルギニン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイ
シン、Ｌ−リジン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、及びＬ−バリンが具体例である。グルタミン酸ファミリーアミノ酸、例えば、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−オルニチン、及びＬ−プロリンが具体例である。Ｌ−アルギニン及びＬ−オルニチンが具体例である。

「Ｌ−アミノ酸」という記載は、遊離した形態のＬ−アミノ酸だけを意味するのではなく、Ｌ−アミノ酸の塩又は水和物、又は後述するようにＬ−アミノ酸と他の有機又は無機化合物とにより形成される付加物をも意味し得るものとする。アミノ酸の塩には、硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩、アンモニウム塩、ナトリウム塩、及びカリウム塩が含まれる。
腸内細菌科に属する細菌は、エシェリヒア属及び／又はパントエア属等に由来するものとすることができ、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を有するものとすることができる。特に、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）データベース（www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543）で使用される分類学によって腸内細菌科に分類されるものを使用することができる。改変することのできる腸内細菌科に由来する株の例には、エシェリヒア属、エンテロバクター属又はパントエア属の細菌が含まれる。

ここに開示する主題に従ってエシェリヒア細菌を取得するために改変することのできるエシェリヒア細菌の株は、特に限定されず、具体的には、Neidhardtらの研究に記載されているものを使用することができる（Bachmann, B.J.,「E. coli K-12のいくつかの変異体誘導体の誘導と遺伝子型」, p. 2460-2488. F.C. Neidhardtら（編集）, 「E. coliとSalmonella: 細胞及び分子生物学、第２版」、ASM Press, Washington, D.C., 1996中に記載されている）。種E. coliは具体的な例である。E. coliの具体的な例には、E. coli W3110（ATCC 27325）、E. coli MG1655（ATCC 47076, ATCC 700926）等が含まれ、これらは原型の野生型株であるE. coli K-12株から誘導されたものである。これらの株は、例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（私書箱1549, マナッサス, VA 20108,アメリカ合衆国）から入手可能である。すなわち、それぞれの株に登録番号が与えられており、これらの登録番号を使用して株を注文することができる（www.atcc.org参照）。株の登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに列挙されている。

エンテロバクター属細菌の例には、エンテロバクター・アグロメランス、エンテロバクター・アエロゲネス等が含まれるものとすることができる。パントエア属細菌の例には、パントエア・アナナティス等が含まれるものとすることができる。エンテロバクター・アグロメランスのいくつかの株は、最近、１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列解析等に基づいて、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、パントエア・アナナティス（Pantoea ananatis）、又はパントエア・スチューアルティ（Pantoea stewartii）に再分類された。腸内細菌科に分類される細菌である限り、エンテロバクター属又はパントエア属のいずれかに属する細菌を使用することができる。パントエア・アナナティス（株を遺伝子工学技術によって育種する場合、Pantoea ananatis AJ13355株（FERM BP-6614）, AJ13356株（FERM BP-6615）, AJ13601株（FERM BP-7207）及びこれらの誘導体を使用することができる。単離してエンテロバクター・アグロメランスとして寄託した時点では、これらの株は、エンテロバクター・アグロメランスとして同定されていた。しかしながら、前記したように、これらは、最近、１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列決定等に基づいてパントエア・アナナティスとして再分類された。

Ｌ−アミノ酸生産細菌
腸内細菌科に属する細菌であって、プトレシン分解経路を破壊するように改変され、Ｌ−アミノ酸を生産することのできる細菌を使用することができる。
細菌は、Ｌ−アミノ酸生産能力を固有に有するものとすることができ、又は変異方法又はＤＮＡ組換え技術によってＬ−アミノ酸生産能力を有するように改変されたものとすることができる。細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌中に、破壊したプトレシン分解経路を含むよう改変することができる。代替的に、細菌は、プトレシン分解経路を破壊するように既に改変した細菌に対して、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を付与することによって取得することができる。

Ｌ−アルギニン生産細菌
Ｌ−アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli株237 （VKPM B-7925）
（米国特許出願2002/058315 A1）及びその誘導体株（変異体Ｎ−アセチルグルタメート合成酵素を保有する（ロシア特許第2215783号））、E. coli株382 （VKPM B-7926, EP1170358 A1）、 N-アセチルグルタメート合成酵素をコードするargA遺伝子が内部に導入されたＬ−アルギニン生産株（EP1170361 A1）等が含まれる。
Ｌ−アルギニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、Ｌ−アルギニン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、N-アセチル−γ−グルタミルリン酸還元酵素（argC）、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ（argJ）、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、N-アセチルオルニチンアミノトランスフェラーゼ（argD）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF）、アルギニノコハク酸合成酵素（argG）、アルギニノコハク酸リアーゼ（argH）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）をコードする遺伝子が含まれる。

Ｌ−シトルリン生産細菌
Ｌ−シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli変異体N-アセチルグルタミン酸合成酵素株237/pMADS11, 237/pMADS12, 及び237/pMADS13 （ロシア特許第2215783号, 欧州特許第1170361 B1号, 米国特許第6790647 B2号）が含まれるとすることができる。共に変異体フィードバック耐性カルバモイルリン酸合成酵素を保有するE. coli株333
（VKPM B-8084）及び374 （VKPM B-8086）（ロシア特許RU2264459 C2）、α−ケトグルタル酸合成酵素活性が増加すると共にフェレドキシンNADP⁺還元酵素、ピルビン酸合成酵素又はα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が付加的に改変されたE. coli株（EP 2133417 A1）、及びコハク酸脱水素酵素及びα−ケトグルタル酸脱水素酵素の活性が減少したP.
ananantis株NA1sucAsdhA （米国特許出願第2009286290号）等が更なる例である。
Ｌ−シトルリンは、Ｌ−アルギニン生合成経路の中間体であることから、Ｌ−シトルリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、Ｌ−アルギニン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株が含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、Ｎ−アセチルグルタミン酸合成酵素（argA）、Ｎ−アセチルグルタミン酸キナーゼ（argB）、Ｎ−アセチルグルタミルリン酸還元酵素（argC）、アセチルオルニチントランスアミナーゼ（argD）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（argE）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ（argF/I）、及びカルバモイルリン酸合成酵素（carAB）、並びにこれらの組合せが含まれる。
Ｌ−シトルリン生産細菌は、いずれかのＬ−アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株（VKPM B-7926）から、argG遺伝子によってコードされるアルギノコハク酸合成酵素の不活性化によっても容易に取得することができる。

Ｌ−システイン生産細菌
Ｌ−システイン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、フィードバック耐性セリンアセチルトランスフェラーゼをコードする異なるcysE 対立遺伝子により形質転換されたE. coli JM15（米国特許第6,218,168号, ロシア特許第2279477号）、細胞に有毒な物質を分泌
するのに適切なタンパク質をコードする過剰発現した遺伝子を有するE. coli W3110（米国特許第5,972,663号）、低下したシステインデスルホヒドラーゼ活性を有するE. coli株（特開平11-155571 A2）、cysB遺伝子によってコードされたシステインレギュロン（cysteine regulon）についての正の転写レギュレータの増加した活性を有するE. coli W3110 （WO0127307 A1）、E. coli JM15（ydeD） （米国特許第6,218,168号）等が含まれるものとすることができる。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌
Ｌ−グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli VL334thrC⁺ （EP 1172433）が含まれるものとすることができる。E. coli VL334 （VKPM B-1641）は、thrC及びilvA遺伝子に変異を有する、Ｌ−イソロイシン及びＬ−スレオニン栄養要求株である（米国特許第4,278,765号）。thrC遺伝子の野生型対立遺伝子は、野生型E. coli K-12株 （VKPM B-7）細胞上で生育させたバクテリオファージＰ１を使用する一般的なトランスダクションの方法によって転移させた。この結果、Ｌ−グルタミン酸を生産することのできるＬ−イソロイシン栄養要求株VL334thrC⁺ （VKPM B-8961）を取得した。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Ｌ−グルタミン酸の生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株が含まれるものとすることができる。この種の遺伝子の例には、グルタミン酸脱水素酵素（gdhA）, グルタミン合成酵素（glnA）, グルタミン酸合成酵素（gltAB）, イソクエン酸脱水素酵素（icdA）, アコニテートヒドラターゼ（acnA, acnB）, クエン酸合成酵素（gltA）, ホスホエノールピルピン酸カルボキシラーゼ（ppc）, ピルビン酸カルボキシラーゼ（pyc）, ピルビン酸脱水素酵素（aceEF, lpdA）, ピルビン酸キナーゼ（pykA, pykF）, ホスホエノールピルビン酸合成酵素（ppsA）, エノラーゼ（eno）, ホスホグリセロムターゼ（pgmA, pgmI）, ホスホグリセリン酸キナーゼ（pgk）, グリセルアルデヒド-3-リン酸脱水素酵素（gapA）, トリオースリン酸イソメラーゼ（tpiA）, フルクトース二リン酸アルドラーゼ（fbp）, ホスホフルクトキナーゼ（pfkA, pfkB）及びグルコースリン酸イソメラーゼ（pgi）をコードする遺伝子が含まれる。
クエン酸合成酵素遺伝子、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子及び／又はグルタミン酸脱水素酵素遺伝子の発現が増強されるよう改変された株の例には、EP1078989 A2, EP955368 A2及びEP952221 A2に開示されるものが含まれる。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、Ｌ−グルタミン酸生合成経路から分岐させることによりＬ−グルタミン酸以外の化合物の合成を触媒する酵素の活性を減少させるか、又は除去した株も含まれるものとすることもできる。この種の酵素の例には、イソクエン酸リアーゼ（aceA）, α−ケトグルタル酸脱水素酵素（sucA）, ホスホトランスアセチラーゼ（pta）, 酢酸キナーゼ（ack）, アセトヒドロキシ酸合成酵素（ilvG）, アセト乳酸合成酵素（ilvI）, ギ酸アセチルトランスフェラーゼ（pfl）, 乳酸脱水素酵素（ldh）及びグルタミン酸脱炭酸酵素（gadAB）が含まれる。α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損するか、又は減少したα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を有するエシェリヒア属に属する細菌及びこれらを取得する方法は、米国特許第5,378,616号及び第5,573,945号に記載されている。具体的には、これらの株には以下のものが含まれる：

E. coli W3110sucA::Km^R
E. coli AJ12624 （FERM BP-3853）
E. coli AJ12628 （FERM BP-3854）
E. coli AJ12949 （FERM BP-4881）
E. coli W3110sucA::Km^Rは、E. coli W3110のα−ケトグルタル酸脱水素酵素遺伝子（
以下では「sucA遺伝子」と呼ぶ）を破壊することによって得られた株である。この株は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素を完全に欠損している。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌の他の例には、エシェリヒア属に属し、アスパラギン酸代謝抵抗物質に対して耐性を有するものが含まれる。これらの株は、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損したものとすることもでき、これらには、例えば、E. coli AJ13199 （FERM BP-5807） （米国特許第5,908,768号）, 低いＬ−グルタミン酸分解能力を付加的に有するFFRM P-12379 （米国特許第5,393,671号）, AJ13138 （FERM BP-5565） （米国特許第6,110,714号）等が含まれるものとすることができる。

Ｌ−グルタミン酸生産細菌の例には、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性が欠損しているか、又は減少したα−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を有し、前記したようにして取得することのできるパントエア属に属する変異株が含まれる。この種の株には、Pantoea ananatis AJ13356 （米国特許第6,331,419号）が含まれる。Pantoea ananatis AJ13356は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE-IPOD）、〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室、日本国）において、1998年2月19日に、FERM P-16645の受託番号の下で寄託された。その後、これはブダペスト条約の規定の下で、1999年1月11日に国際寄託へと移管され、FERM BP-6615の受託番号を受けた。Pantoea ananatis AJ13356は、αKGDH-E1サブユニット遺伝子（sucA）の破壊の結果として、α−ケトグルタル酸脱水素酵素活性を欠損している。前記株は、Enterobacter agglomerans AJ13356として単離されて寄託された際は、エンテロバクター・アグロメランスとして同定された。しかしながら、最近では、１６Ｓ ｒＲＮＡのヌクレオチド配列決定等に基づいて、これはパントエア・アナナティスとして再分類された。AJ13356は、前記した寄託においては、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されているが、この明細書の目的のためには、これらはパントエア・アナナティスとして記載する。

Ｌ−ヒスチジン生産細菌
Ｌ−ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli株24 （VKPM B-5945, RU2003677）, E. coli株80 （VKPM B-7270, RU2119536）, E. coli NRRL B-12116−B12121
（米国特許第4,388,405号）, E. coli H-9342 （FERM BP-6675）及びH-9343 （FERM BP-6676） （米国特許第6,344,347号）, E. coli H-9341 （FERM BP-6674） （EP1085087）,
E. coli AI80/pFM201 （米国特許第6,258,554号）等が含まれるものとすることができる。

また、Ｌ−ヒスチジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、Ｌ−ヒスチジン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれ得る。この種の遺伝子の例には、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（hisG）、ホスホリボシル-AMPシクロヒドロラーゼ（hisI）、ホスホリボシル−ＡＭＰシクロヒドロラーゼ／ホスホリボシル−ＡＴＰピロホスファターゼ（hisIE）、ホスホリボシルホルムイミノ−５−アミノイミダゾールカルボキシアミドリボチドイソメラーゼ（hisA）、アミドトランスフェラーゼ（hisH）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（hisC）、ヒスチジノールホスファターゼ（hisB）、ヒスチジノール脱水素酵素（hisD）等をコードする遺伝子が含まれる。
hisG及びhisBHAFIによってコードされるＬ−ヒスチジン生合成酵素は、Ｌ−ヒスチジンによって阻害され、したがって、Ｌ−ヒスチジン生産能力も、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼに変異を導入してフィードバック阻害に対する耐性を与えることによって効率的に増強することができる（ロシア特許第2003677号及び第2119536号）。

Ｌ−ヒスチジン生産能力を有する株の具体例には、Ｌ−ヒスチジン生合成酵素をコードするＤＮＡを担持するベクターにより形質転換されたE. coli FERM-P 5038及び5048 （特開平昭56-005099 A）、アミノ酸の搬出のための遺伝子であるrhtにより形質転換されたE.
coli株（EP1016710A）、スルファグアニジン、DＬ−1,2,4-トリアゾール-3-アラニン、及びストレプトマイシン耐性を付与されたE. coli 80株（VKPM B-7270, RU2119536）、及びE. coli MG1655+hisGr hisL'_ΔpurR（RU2119536、及びDoroshenko V.G.ら、「ヒスチジン生産変異体を得るためのEscherichia coli MG1655の指向性修飾」、Prikl. Biochim.
Mikrobiol. （ロシア語）, 2013, 49(2):149-154）等が含まれる。

Ｌ−イソロイシン生産細菌
Ｌ−イソロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、６−ジメチルアミノプリンに対する耐性を有する変異体（特開平05-304969 A）、チアイソロイシン及びイソロイシンヒドロキサメートなどのイソロイシンアナログに対する耐性を有する変異体、及びＤＬ−エチオニン及び／又はアルギニンヒドロキサメートに対する耐性を付加的に有する変異体（特開平05-130882 A）が含まれる。加えて、スレオニンデアミナーゼ及びアセトヒドロキサメート合成酵素などのＬ−イソロイシン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる（特開平02-458 A, EP0356739 A1及び米国特許第5,998,178号）。

Ｌ−ロイシン生産細菌
Ｌ−ロイシン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、Escherichia属に属する株、例えば、ロイシン（例えば、株57 （VKPM B-7386, 米国特許第6,124,121号））又はβ−２−チエニルアラニン、３−ヒドロキシロイシン、４−アザロイシン、５，５，５−トリフルオロロイシンを含むロイシンアナログ（特開昭62-34397 B及び特開平08-70879 A）に対して耐性のE. coli株；WO96/06926に記載された遺伝子工学的方法によって得られたE. coli株；E. coli H-9068 （特開平08-70879
A）等が含まれる。
細菌は、Ｌ−ロイシン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。例には、leuABCDオペロンの遺伝子が含まれ、これは、Ｌ−ロイシンによるフィードバック阻害から解放されたイソプロピルリンゴ酸合成酵素をコードする変異体leuA遺伝子によって代表されるものとすることができる（米国特許第6,403,342号）。加えて、細菌は、細菌細胞からＬ−アミノ酸を分泌させるタンパク質をコードする１以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。この種の遺伝子の例には、b2682及びb2683 （ygaZH遺伝子） （EP1239041 A2）が含まれる。

Ｌ−リジン生産細菌
エシェリヒア・ファミリーに属するＬ−リジン生産細菌の例には、Ｌ−リジンアナログに対する耐性を有する変異体が含まれる。Ｌ−リジンアナログは、エシェリヒア属に属する細菌の生育を阻害するが、この阻害は、培地中にＬ−リジンが存在する場合は、完全に又は部分的に脱感作される。Ｌ−リジンアナログの例には、限定されるものではないが、オキサリジン、リジンヒドロキサメート、Ｓ−（２−アミノエチル）−Ｌ−システイン（ＡＥＣ）、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等が含まれる。これらのリジンアナログに対する耐性を有する変異体は、エシェリヒア属に属する細菌を従来の人工的な変異誘発処理に供することによって取得することができる。Ｌ−リジンを生産するのに有用な細菌株の具体例には、E. coli AJ11442 （FERM BP-1543, NRRL B-12185; 米国特許第4,346,170号参照）及びE. coli VL611が含まれる。これらの微生物においては、Ｌ−リジンによるアスパルトキナーゼのフィードバック阻害が脱感作されている。

Ｌ−リジン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるも
のではないが、Ｌ−リジン生合成酵素をコードする１以上の遺伝子の発現が増強された株も含まれる。この種の遺伝子の例には、限定されるものではないが、ジヒドロジピコリネート合成酵素（dapA）、アスパルトキナーゼ（lysC）、ジヒドロジピコリネート還元酵素（dapB）、ジアミノピメレート脱水素酵素（lysA）、ジアミノピメレート脱水素酵素（ddh）（米国特許第6,040,160号）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、アスパルテートセミアルデヒド脱水素酵素（asd）、及びアスパルターゼ（aspA）（EP1253195 A1）をコードする遺伝子が含まれる。加えて、親株は、エネルギー効率に関与する遺伝子（cyo）（EP1170376 A1）、ニコチンアミドヌクレオチドトランスヒドロゲナーゼ（pntAB）（米国特許第5,830,716号）をコードする遺伝子、ybjE遺伝子（WO2005/073390）又はこれらの組合せの増加したレベルの発現を有し得る。

Ｌ−アミノ酸生産細菌は、Ｌ−アミノ酸生合成経路からの分岐を引き起こし、結果的に他の化合物の生産に至る反応を触媒する酵素の活性が低減しているか、又はこの活性を有さないものとすることができる。また、細菌は、Ｌ−アミノ酸の合成又は蓄積に対して負に作用する酵素の活性が低減しているか、又はこの活性を有さないものとすることもできる。Ｌ−リジン生産に関与するこの種の酵素の例には、ホモセリン脱水素酵素、リジンデカルボキシラーゼ（cadA, ldcC）、リンゴ酸酵素等が含まれ、これらの酵素の活性を減少させるか、又は欠失させた株は、WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175等に開示されている。
リジンデカルボキシラーゼをコードするcadA及びldcC遺伝子の両者の発現は、リジンデカルボキシラーゼ活性を減少させるか、又は欠失させるために減少させることができる。両者の遺伝子の発現は、例えば、WO2006/078039に記載された方法によって減少させることができる。

Ｌ−リジン生産細菌の例には、E. coli WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株（WO2006/078039）を含むものとすることができる。この株は、リジン生合成遺伝子を含むプラスミドpCABD2 （米国特許第6,040,160号）を、リジンデカルボキシラーゼをコードする破壊したcadA及びldcCを有するWC196株に導入することによって構築された。

WC196株は、W3110株から育種されたものであり、これは、W3110株の染色体上の野生型lysC遺伝子を、位置352のスレオニンをイソロイシンで交換した変異体アスパルトキナーゼIIIをコードする変異体LysC遺伝子を用いて交換し、この結果としてＬ−リジンによるフィードバック阻害の脱感作を得ると共に（米国特許第5,661,012号）、この結果得られた株に対してAEC耐性を付与する（米国特許第5,827,698号）ことにより、E. coli K-12から誘導されたものである。WC196株は、E. coli AJ13069と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE-IPOD）、〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室、日本国）において、1994年12月6日に寄託され、FERM P-14690の受託番号を割り当てられた。その後、これはブダペスト条約の規定の下で、1995年9月29日に国際寄託へと移管され、FERM BP-5252の受託番号が割り当てられた（米国特許第5,827,698号）。

WC196ΔcadAΔldcC株自体も、Ｌ−リジン生産細菌の具体例である。WC196ΔcadAΔldcCは、AJ110692と命名され、工業技術院生命工学工業技術研究所（現在は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許生物寄託センター（NITE-IPOD）、〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８ １２０号室、日本国）において、2008年10月7日に、FERM BP-11027の受託番号の下で、国際寄託として寄託された。

Ｌ−メチオニン生産細菌
Ｌ−メチオニン生産細菌及びＬ−メチオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア細菌、例えば株AJ11539 （
NRRL B-12399）, AJ11540 （NRRL B-12400）, AJ11541 （NRRL B-12401）, AJ 11542 （NRRL B-12402） （特許GB2075055）; 株218 （VKPM B-8125） （特許RU2209248）及び73 （VKPM B-8126） （特許RU2215782）（Ｌ−メチオニンアナログであるノルロイシン等に耐性である）が含まれる。株E. coli 73は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（Russian National Collection of Industrial Microorganisms （VKPM） （ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny Proezd, 1））において、2001年5月14日に、受託番号VKPM B-8126の下で寄託され、ブダペスト条約の規定の下で、2002年2月1日に国際寄託に移管された。更に、メチオニンリプレッサ欠損株並びにホモセリントランススクシニラーゼ及びシスタチオニンγ−合成酵素（特開2000-139471 A）などのＬ−メチオニン生合成に関与するタンパク質をコードする遺伝子により形質転換された組換え株も、親株として使用することができる。

Ｌ−オルニチン生産細菌
Ｌ−オルニチン生産細菌は、argF及びargI遺伝子の両者によってコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化により、いずれかのＬ−アルギニン生産細菌、例えば、E. coli 382株（VKPM B-7926）から容易に取得することができる。オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化のための方法は、ここに記載されている。

Ｌ−フェニルアラニン生産細菌
Ｌ−フェニルアラニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli AJ12739 （tyrA::Tn10, tyrR） （VKPM B-8197）, 変異体pheA34遺伝子を保有するE. coli HW1089 （ATCC 55371） （米国特許第5,354,672号）, E. coli MWEC101-b （KR8903681）, E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146及びNRRL B-12147 （米国特許第4,407,952号）が含まれる。また、E. coli K-12 [W3110 （tyrA）/pPHAB （FERM BP-3566）, E. coli K-12 [W3110 （tyrA）/pPHAD] （FERM BP-12659）, E. coli K-12 [W3110 （tyrA）/pPHATerm] （FERM BP-12662）及びE. coli K-12 [W3110 （tyrA）/pBR-aroG4, pACMAB]（AJ 12604 （FERM BP-3579）として命名された）を親株として使用することができる（EP488424
B1）。更に、yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされるタンパク質の増強された活性を有するエシェリヒア属に属するＬ−フェニルアラニン生産細菌も使用することができる（米国特許出願2003/0148473 A1及び2003/0157667 A1）。

Ｌ−プロリン生産細菌
Ｌ−プロリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli 702ilvA （VKPM B-8012）が含まれるものとすることができ、これはilvA遺伝子を欠損し、Ｌ−プロリンを生産することのできるものである（EP1172433 A1）。この細菌は、Ｌ−プロリン生合成に関与する１以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。Ｌ−プロリン生産細菌中で使用することのできる遺伝子の例には、Ｌ−プロリンによるフィードバック阻害が脱感作されたグルタミン酸キナーゼをコードするproB遺伝子が含まれる（DE3127361 A1）。加えて、この細菌は、細菌細胞からＬ−アミノ酸を分泌する要因であるタンパク質をコードする１以上の遺伝子の発現を増強することによって改良することができる。この種の遺伝子としては、b2682及びb2683 （ygaZH遺伝子） （EP1239041 A2）を例示することができる。
Ｌ−プロリンを生産する能力を有するエシェリヒア属に属する細菌の例には、次のE. coli株が含まれる：NRRL B-12403及びNRRL B-12404 （GB特許2075056）, VKPM B-8012 （ロシア特許出願第2000124295号）, DE3127361 A1に記載されたプラスミド変異体, Bloom F.R.ら「第15回マイアミ冬季シンポジウム」, 1983, p.34に記載されたプラスミド変異体等。

Ｌ−スレオニン生産細菌
Ｌ−スレオニン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、E. coli TDH-6/pVIC40 （VKPM B-3996） （米国特許第5, 175, 107号, 米国特許第5,705,371号）, E. coli 472T23/pYN7
（ATCC 98081） （米国特許第5,631,157号）, E. coli NRRL-21593 （米国特許第5,939,307号）, E. coli FERM BP-3756 （米国特許第5,474,918号）, E. coli FERM BP-3519 and FERM BP-3520 （米国特許第5,376,538号）, E. coli MG442 （Gusyatinerら、Genetika
（ロシア語）, 1978, 14:947-956）, E. coli VL643及びVL2055 （EP1149911 A2）等が含まれる。

株TDH-6は、thrC遺伝子を欠損すると共に、ショ糖同化性であり、ilvA遺伝子はリーキー変異を有する。この株は、rhtA遺伝子にも変異を有し、これにより高濃度のスレオニン又はホモセリンに対する耐性が与えられている。株B-3996はプラスミドpVIC40を含み、これは、変異体thrA遺伝子を含むthrA*BCオペロンをRSF1010誘導ベクター中に挿入することによって取得された。この変異体thrA遺伝子は、スレオニンによるフィードバック阻害が実質的に脱感作されたアスパルトキナーゼホモセリン脱水素酵素Iをコードする。株B-3996は、1987年11月19日に、AlL-Union Scientific Center of Antibiotics （ロシア連邦 （Russian Federation）, 117105 モスクワ （Moscow）, Nagatinskaya Street 3-A）において、受託番号RIA 1867の下で寄託された。また、この株は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM） （ロシア連邦 （Russian Federation）, 117545 モスクワ （Moscow）, 1st Dorozhny proezd, 1）において、1987年4月7日に、受託番号B-3996の下でも寄託された。

E. coli VKPM B-5318 （EP0593792 A1）も、Ｌ−スレオニン生産細菌を誘導するための親株として使用することができる。株B-5318は、イソロイシンに関して原栄養性であり、温度感受性のラムダファージC1リプレッサ及びPRプロモータにより、プラスミドpVIC40中のスレオニンオペロンの制御領域が交換されている。株VKPM B-5318は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM）において、1990年3月3日に受託番号VKPM B-5318の下で寄託された。

細菌は、次の遺伝子の１以上の発現を増強するために付加的に改変することができる：−スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼホモセリン脱水素酵素IをコードするthrA遺伝子；
−ホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子；
−スレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子；
−スレオニン及びホモセリン排出系の推定膜貫通タンパク質をコードするrhtA遺伝子；
−アスパルテート−β−セミアルデヒド脱水素酵素をコードするasd遺伝子；及び
−アスパルテートアミノトランスフェラーゼ（アスパルテートトランスアミナーゼ）をコードするaspC遺伝子。

E. coliのアスパルトキナーゼI及びホモセリン脱水素酵素IをコードするthrA遺伝子は、既に解明されている（KEGGエントリー番号b0002; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 337〜2,799; 遺伝子ID: 945803）。thrA遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrL遺伝子とthrB遺伝子との間に局在している。
E. coliのホモセリンキナーゼをコードするthrB遺伝子は、既に解明されている（KEGGエントリー番号b0003; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 2,801〜3,733;
遺伝子ID: 947498）。thrB遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrA遺伝子とthrC遺伝子との間に局在している。
E. coliのスレオニン合成酵素をコードするthrC遺伝子は、既に解明されている（KEGGエントリー番号b0004; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3,734〜5,020;
遺伝子ID: 945198）。thrC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上のthrB遺伝子とyaaX遺伝子との間に局在している。これら３つの遺伝子の全ては、単一のスレオニンオペロンthrABCとして機能する。スレオニンオペロンの発現を増強するためには、転写に影響を与えるアテニュエータ領域を、望ましくはオペロンから除去する（WO2005049808 A1, WO2003097839 A1）。

Ｌ−スレオニンによるフィードバック阻害に対して耐性であるアスパルトキナーゼI及びホモセリン脱水素酵素Iをコードする変異体thrA遺伝子、並びにthrB及びthrC遺伝子は、Ｌ−スレオニン生産性E. coli株VKPM B-3996中に存在する周知のプラスミドpVIC40から、１つのオペロンとして取得することができる。プラスミドpVIC40は、米国特許第5,705,371号に詳細に記載されている。
E. coliのスレオニン及びホモセリン排出系のタンパク質（内側膜輸送体）をコードするrhtA遺伝子は、既に解明されている（KEGGエントリー番号b0813; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 848,433〜849,320, 相補体; 遺伝子ID: 947045）。rhtA遺伝子は、glnHPQオペロンに近接したE. coli K-12の染色体上のdps遺伝子とompX遺伝子との間に局在しており、これはグルタミン輸送系の構成要素をコードする。rhtA遺伝子は、ybiF遺伝子と同一である（KEGGエントリー番号B0813）。

E. coliのアスパルテート−β−セミアルデヒド脱水素酵素をコードするasd遺伝子は、既に解明されている（KEGGエントリー番号b3433; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 3,571,798〜3,572,901, 相補体; 遺伝子ID: 947939）。asd遺伝子は、E. coli K-12の染色体上の同一のストランド（反対側のストランド上のyhgN遺伝子）上のglgB遺伝子とgntU遺伝子との間に局在している。
また、E. coliのアスパルテートアミノトランスフェラーゼをコードするaspC遺伝子も、既に解明されている（KEGGエントリー番号b0928; GenBank受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 983,742〜984,932, 相補体; 遺伝子ID: 945553）。aspC遺伝子は、E. coli K-12の染色体上で、反対側のストランド上のycbL遺伝子と同一のストランド上のompF遺伝子との間に局在している。

Ｌ−トリプトファン生産細菌
Ｌ−トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、エシェリヒア属に属する株、例えば、変異体trpS遺伝子によってコードされるトリプトファニル-tRNA合成酵素が欠損したE. coli JP4735/pMU3028 （DSM10122）及びJP6015/pMU91 （DSM10123） （米国特許第5,756,345号）、セリンによるフィードバック阻害から解放されたホスホグリセレート脱水素酵素をコードするserA対立遺伝子及びトリプトファンによるフィードバック阻害から解放されたアントラニレート合成酵素をコードするtrpE対立遺伝子を有するE. coli SV164 （pGH5） （米国特許第6,180,373号）、酵素トリプトファナーゼが欠損したE. coli AGX17 （pGX44） （NRRL B-12263）及びAGX6（pGX50）aroP （NRRL B-12264） （米国特許第4,371,614号）、ホスホエノールピルビン酸生産能力が増強されたE. coli AGX17/pGX50,pACKG4-pps （WO9708333, 米国特許第6,319,696号）等が含まれる。yedA遺伝子又はyddG遺伝子によってコードされる、同定されたタンパク質の増強された活性を有するエシェリヒア属に属するＬ−トリプトファン生産細菌も使用することができる（米国特許出願2003/0148473 A1、及び2003/0157667 A1）。

Ｌ−トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、アントラニレート合成酵素、ホスホグリセレート脱水素酵素、及びトリプトファン合成酵素から選択される１以上の酵素の活性が増強された株も含まれる。アントラニレート合成酵素及びホスホグリセレート脱水素酵素は、両者ともＬ−トリプトファン及びＬ−セリンによるフィードバック阻害を受けることから、フィードバック阻害を脱感作する変異をこれら
の酵素に導入することができる。この種の変異を有する株の具体例には、脱感作したアントラニレート合成酵素を保有するE. coli SV164、及びE. coli SV164にプラスミドpGH5 （WO 94/08031）（フィードバック脱感作ホスホグリセレート脱水素酵素をコードする変異体serA遺伝子を含む）を導入することにより得られる形質転換体株が含まれる。

Ｌ−トリプトファン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、脱感作したアントラニレート合成酵素をコードする遺伝子を含むトリプトファンオペロンを導入した株も含まれる（特開昭57-71397 A, 特開昭62-244382 A, 米国特許第4,371,614号）。更に、Ｌ−トリプトファン生産能力は、トリプトファンオペロン（trpBA）の内のトリプトファン合成酵素をコードする遺伝子の発現を増強することによって与えることができる。トリプトファン合成酵素は、それぞれtrpA及びtrpB遺伝子によってコードされるα及びβサブユニットにより構成される。加えて、Ｌ−トリプトファン生産能力は、イソクエン酸リアーゼ−リンゴ酸合成酵素オペロンの発現を増強することによって改良することができる（WO2005/103275）。

Ｌ−バリン生産細菌
Ｌ−バリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、限定されるものではないが、ilvGMEDAオペロンを過剰発現するように改変された株が含まれるものとすることができる（米国特許第5,998,178号）。生産されるＬ−バリンによってオペロンの発現が減弱されないよう、減弱に必要なilvGMEDAオペロンの領域を除去することが望ましい。更に、オペロン内のilvA遺伝子は、スレオニンデアミナーゼ活性が減少するように、望ましくは破壊させるものとする。

Ｌ−バリン生産細菌を誘導するのに使用することのできる親株の例には、アミノアシル-tRNA合成酵素の変異を有する変異体も含まれるものとすることができる（米国特許第5,658,766号）。例えば、イソロイシンtRNA合成酵素をコードするileS遺伝子に変異を有するE. coli VL1970を使用することができる。E. coli VL1970は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM） （ロシア連邦,
117545 モスクワ, 1st Dorozhny Proezd, 1）において、1988年6月24日に、受託番号VKPM B-4411の下で寄託された。
更に、生育にリポ酸を要求しかつ／又はH⁺-ATPaseを欠如する変異体も、親株として使用することができる（WO96/06926）。

Ｌ−バリン生産株の例には、E. coli株H-81 （VKPM B- 8066）, NRRL B-12287及びNRRL
B-12288 （米国特許第4,391,907号）, VKPM B-4411 （米国特許第5,658,766号）, VKPM B-7707 （欧州特許出願EP1016710A2）が含まれる。
腸内細菌科（Enterobacteriaceae）に属する本発明の細菌は、トランスアミナーゼ経路又はグルタミル化プトレシン経路とすることのできるプトレシン分解経路を破壊させるよう改変することができる。例示的であって、本発明の範囲を限定するものではないが、プトレシン分解経路は、経路由来の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現の減弱により、特に、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の１又は数個の遺伝子、及び／又はpatA, patD, gabT又はgabD遺伝子などの１又は数個の遺伝子（種E. coliの細菌などの腸内細菌科ファミリーに属する細菌の染色体上にある）の不活性化により破壊させることができる。

「プトレシン分解経路」という記載は、後で説明するように、γ−アミノ酪酸（GABA）を介してプトレシンをコハク酸へと分解する「トランスアミナーゼ経路」又は「グルタミル化プトレシン経路」などのプトレシンの分解のための以下の経路の１つに言及するものである。

プトレシンの分解のための「トランスアミナーゼ経路」という記載は、プトレシントラ
ンスアミナーゼ（PatA）、γ−アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（PatD）、γ−アミノ酪酸トランスアミナーゼ（GabT）、及びコハク酸セミアルデヒド脱水素酵素（GabD）によって触媒される１組の連続した酵素反応に言及するものであり、この場合、Schneider B.L.ら、2013, 88（3）:537-550に記載されているように、プトレシンは、γ−アミノブチルアルデヒド（ＡＢＡＬ）、ＧＡＢＡ及びコハク酸セミアルデヒド（ＳＳＡ）を介してコハク酸（コハク酸塩）へと変換される。E. coliのトランスアミナーゼ経路由来の酵素をコードする遺伝子は、既に解明されており、例えば、patA （oat, pat, ygjGと同義; KEGG, 京都遺伝子ゲノム百科事典, エントリー番号b3073; PatAをコードする）, patD （prr, ydcWと同義; KEGG, エントリー番号b1444; PatDをコードする）, gabT （KEGG, エントリー番号b2662; GabTをコードする）, 及びgabD （KEGG, エントリー番号b2661; GabDをコードする）がある。

プトレシンの分解のための「グルタミル化プトレシン経路」という記載は、γ−グルタミルプトレシン合成酵素（PuuA）、γ−グルタミルプトレシン酸化酵素（PuuB）、γ−グルタミル−γ−アミノブチルアルデヒド脱水素酵素（PuuC）、γ−グルタミル−γ−アミノ酪酸ヒドロラーゼ（PuuD）、4-アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（puuE）によって触媒される１組の連続した酵素反応に言及するものであり、この場合、Schneider B.L.ら、2013, 88（3）:537-550に記載されているように、プトレシンは、γ−グルタミルプトレシン、γ−グルタミルＡＢＡＬ、γ−グルタミルＧＡＢＡ、ＧＡＢＡ及びＳＳＡを介してコハク酸（コハク酸塩）へと変換される。プトレシン結合リプレッサPuuRは、グルタミル化プトレシン経路を抑圧する。したがって、puuR遺伝子単独の発現の減弱は、プトレシン分解経路の増強に帰着し得る。よって、puuR遺伝子単独の減弱は、プトレシン分解経路の破壊に包含されない。

E. coliのグルタミル化プトレシン経路由来の酵素をコードする遺伝子は、既に解明されており、例えば、後述するように、puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuRがある。これらの遺伝子は、E. coli K-12株の染色体上で、puuADRCBE遺伝子クラスタへと組織化されている。
puuA遺伝子（同義はycjK）は、γ−グルタミルプトレシン合成酵素PuuAをコードする（KEGG, エントリー番号b1297; プロテイン・ナレッジベース（Protein Knowledgebase）, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P78061）。puuA遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2;
ヌクレオチド位置: 1357514〜1358932, 相補体; 遺伝子ID: 946202）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuP遺伝子と反対側のストランド上のpuuD遺伝子との間に局在している。puuA遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuA遺伝子によってコードされるPuuAタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。

puuD遺伝子（同義はycjL）は、γ−グルタミル−γ−アミノ酪酸ヒドロラーゼPuuDをコードする（KEGG, エントリー番号b1298; プロテイン・ナレッジベース, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P76038）。puuD遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1359144〜1359908, 相補体; 遺伝子ID: 945882）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuR遺伝子と反対側のストランド上のpuuP遺伝子との間に局在している。puuD遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuD遺伝子によってコードされるPuuDタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号３及び配列番号４に示す。
puuR遺伝子（同義はycjC）は、puuダイバーゴン（divergon） PuuRのためのDNA結合転写リプレッサをコードする（KEGG, エントリー番号b1299; プロテイン・ナレッジベース,
UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P0A9U6）。puuD遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1359935〜1360492, 相補体; 遺伝子ID: 945886）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuD遺伝子とpuuC遺伝子との間に局在している。puuR遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuR遺伝子によってコードされるPuuRタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５及び配列番号６に示す。

puuC遺伝子（同義はaldH）は、γ−グルタミル−γ−アミノブチルアルデヒド脱水素酵素PuuCをコードする（KEGG, エントリー番号b1300; プロテイン・ナレッジベース, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P23883）。puuC遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1360767〜1362254, 相補体; 遺伝子ID: 947003）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuR遺伝子とpuuB遺伝子との間に局在している。puuC遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuC遺伝子によってコードされるPuuCタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号７及び配列番号８に示す。
puuB遺伝子（同義はycjA, ordL）は、γ−グルタミルプトレシン酸化酵素PuuBをコードする（KEGG, エントリー番号b1301; プロテイン・ナレッジベース, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P37906）。puuB遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1362256〜1363536, 相補体; 遺伝子ID: 945072）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuC遺伝子とpuuB遺伝子との間に局在している。puuB遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuB遺伝子によってコードされるPuuBタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号９及び配列番号１０に示す。

puuE遺伝子（同義はgoaG）は、４−アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼPuuEをコードする（KEGG, エントリー番号b1302; プロテイン・ナレッジベース, UniProtKB/Swiss-Prot, 受託番号P50457）。puuB遺伝子（GenBank 受託番号NC_000913.2; ヌクレオチド位置: 1363574〜1364839, 相補体; 遺伝子ID: 945446）は、E. coli K-12株の染色体上で、同一のストランド上のpuuB遺伝子と反対側のストランド上のpspF遺伝子との間に局在している。puuE遺伝子のヌクレオチド配列及びpuuE遺伝子によってコードされるPuuEタンパク質のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１１及び配列番号１２に示す。

「生化学経路」又は「代謝経路」と呼んでもよい「経路」は、１つのバイオ分子種を他のものへと変換するための１組の同化又は異化（生）化学反応を意味するものとすることができる。よって、「経路」は、その中間体によって結び付けられた一連の（生）化学反応（すなわち、１つの反応の１以上の生成物が、後続する１以上の反応等の１又は複数の基質となっている）を含むことができる。「経路」という記載の意味は、通常は当業者に明らかである。

「プトレシン分解経路を破壊するように改変された細菌」という記載は、改変されていない細菌、例えば、野生型株又は親株、例えば、E. coli K-12におけるように、プトレシン分解経路が破壊されていない細菌と比較して、改変された細菌では、経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束がより低いか、又は存在すらしないような様式で細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。プトレシン分解経路が破壊するように改変された細菌においては、改変されていない細菌の経路における炭素の流束と比較して、経路の１以上の（生）化学反応を介する炭素の流束は、９９％以下、９５％以下、９０％以下、８５％以下、８０％以下、７５％以下、７０％以下、６５％以下、６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、又は０％とすることができる。

「炭素の流束」という記載は、代謝経路を介した炭素含有分子の代謝回転の速度（rate）を意味するものとすることができる。例えば、例としてＬ−アルギニン又はＬ−オルニチンなどのアミノ酸の炭素の流束は、トランスアミナーゼ経路又はグルタミル化プトレシン経路などのプトレシン分解経路におけるＬ−アミノ酸からの炭素の分布を決定するために計算することができる（Szyperski T. 「タンパク質を構成するアミノ酸の生合成的に指向した分画^１３Ｃ-ラベリング。中間体代謝を検討するための効率的な分析ツール」, Eur. J. Biochem., 1995, 232:433-448; Stephanopoulos, G., Aristidou, A.A., Nielsen, J. 「代謝工学：原理と方法論」, アカデミック・プレス、第１版, （1998）; Matsuok
a Y.とShimizu K. 「^１３−Ｃ代謝流束分析と代謝制御」, Chemical Biology, Prof. Deniz Ekinci （編集）, DOI: 10.5772/35121, http://www.intechopen.com/books/chemical-biology/13c-metabolic-flux-analysis-and-metabolic-regulation）。

また、「プトレシン分解経路を破壊するように改変された細菌」という記載は、改変された細菌において、プトレシン分解経路が減弱されているような様式で、細菌が改変されたことを意味するものとすることもできる。
「改変された細菌において、プトレシン分解経路が減弱されている」という記載は、改変された細菌において、プトレシン分解経路由来の酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱されているような様式で、細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。例えば、トランスアミナーゼ経路由来の酵素をコードするpatA, patD, gabT及びgabDから選択される１又は数個の遺伝子の発現を減弱させることができる。他の例では、グルタミル化プトレシン経路由来の酵素をコードするpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子の１又は数個の発現を減弱させることができる。更に他の例では、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子の１又は数個の発現を減弱させることができる。プトレシン分解経路を破壊させるためにその発現を減弱させることのできる遺伝子の組合せは、１又は数個の遺伝子の減弱が経路の破壊に帰着する限り、特に限定されない。すなわち、patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD及びpuuE遺伝子の１又は数個の発現は、細菌がＬ−アミノ酸生産能力を有する限り、プトレシン分解経路を破壊させるためのあらゆる組合せで減弱させることができる。例えば、プトレシン分解経路を破壊させるために、例としてpuuAなどの１つの遺伝子の発現を減弱させることができ、又は全puuADRCBE遺伝子クラスタを構成するpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR遺伝子を減弱させることができる。しかしながら、puuR遺伝子の減弱は、プトレシン分解経路の破壊のために必須ではない。

「数個の遺伝子」という記載は、２以上の遺伝子、例えば、例として、３、４、５、６、７、８、９、１０又はそれ以上の遺伝子を意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載は、例えば、puuA遺伝子などの単一の遺伝子、又は例えば、puuCBEオペロンなどのオペロン、又は例えば、ここに記載するようなpuuADRCBE遺伝子クラスタなどの遺伝子クラスタ全体さえも意味するものとすることができる。したがって、「１又は数個の遺伝子」という記載及び「少なくとも１つの遺伝子」という記載は等価であることを受け入れることができる。

本発明の目的のためには、グルタミル化プトレシン経路由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子に関して以下に示す説明は、トランスアミナーゼ経路由来のタンパク質及びそれをコードする遺伝子に対して、準用して適用することができる。更に、本発明の目的のためには、puuADRCBE遺伝子クラスタに関して以下に示す説明は、patA, patD, gabT,
gabD, puuA, puuB, puuC, puuD及びpuuE遺伝子の１又は数個、又はこれらの組合せに対して、準用して適用することができる。

「puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱させるよう改変した細菌」という記載は、改変されていないpuuADRCBE遺伝子クラスタを含む細菌、例えば、野生型又は親株と比較して、改変した細菌において、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現が減少しているような様式で、細菌が改変されたことを意味するものとすることができる。
「減弱」又は「減弱された」という記載は、細菌中の１以上の酵素の量又は活性が減少するか、又は存在しなくなり、これにより遺伝子産物の活性が減少するか、又は完全に除去されるよう、プトレシン分解経路由来の酵素をコードする細菌中の少なくとも１つの遺伝子を減弱させるか、又は改変することを意味するものとすることができる。

「puuADRCB遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子が不活性化された」という記載は、改変された遺伝子クラスタ由来のpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuRなどの遺伝子の少なくとも１つが、改変されていない遺伝子又は改変されていないpuuADRCBE遺伝子クラスタを含む細菌と比較して、完全に不活性であるか、又は非機能性であるタンパク質をコードすることを意味するものとすることができる。
遺伝子の一部の欠失又は全遺伝子の欠失、遺伝子によってコードされるタンパク質中でアミノ酸の置換を引き起こす１以上の塩基の交換（ミスセンス変異）、ストップコドンの導入（ナンセンス変異）、遺伝子のリーディングフレームのシフトを引き起こす１又は２の塩基の欠失、薬剤耐性遺伝子及び／又は転写終止信号の挿入、又はプロモータ（１又は複数）、エンハンサ（１又は複数）、アテニュエータ（１又は複数）、リボソーム結合部位（１又は複数）（ＲＢＳ）等などの遺伝子発現を調節する配列を含む、遺伝子の隣接する領域の改変のために、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の改変されたＤＮＡ領域の少なくとも１つが、遺伝子を自然に発現することができないということも可能である。puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の不活性化は、例えば、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を使用する変異誘発処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用する遺伝子破壊、及び／又は「Red/ET-駆動組込み（Red/ET-driven integration）」又は「λRed/ET-媒介組込み（λRed/ET-mediated integration）」に基づいた挿入−欠失変異誘発（Yu D.ら、Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 2000, 97（11）:5978-5983; Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645; Zhang Y.ら、Nature Genet., 1998, 20:123-128）などの従来の方法によって行うこともできる。

「puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現が減弱された」という記載は、１又は数個の遺伝子の発現が減弱された改変された細菌におけるpuuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuRなどのpuuADRCBE遺伝子クラスタ由来の改変された１又は数個の遺伝子によってコードされる１又は数個のタンパク質の量が、例えば、野生型株又は親株、例えば、E. coli K-12などの改変されていない細菌と比較して、低減されていることを意味するものとすることができる。

「puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子が減弱された」という記載は、改変された細菌が、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の１以上の遺伝子に機能的に連結した１以上の領域を含むことを意味するものとすることができ、これには、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の遺伝子の発現を調節する配列、例えば、プロモータ、エンハンサ、アテニュエータ及び転写終止信号、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、及び他の発現調節要素（これらは改変され、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現レベルの減少に帰着している）、並びに他の例（例えば、WO95/34672; Carrier T.A. とKeasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-64参照）が含まれる。「遺伝子に機能的に連結した」という記載は、「１以上の遺伝子に機能的に連結した」という記載の具体例であり、１又は複数の制御領域が、ヌクレオチド配列の発現（例えば、増強された、増加した、構成的な、基本的な、反終止的な、減弱された、脱制御された、減少した又は抑圧された発現）、特に、ヌクレオチド配列によってコードされる遺伝子産物の発現を可能とする様式で、核酸分子又は遺伝子のヌクレオチド配列に連結されたことを意味するものとすることができる。

puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現は、より弱いものを用いて、染色体ＤＮＡ上のプロモータなどの発現調節配列を交換することにより減弱させることができる。プロモータの強さは、RNA合成の開始動作の頻度によって特定される。プロモータの強さ及び強いプロモータを評価する方法の例は、Goldstein M.A.ら（Goldstein M.A.とDoi R.H., 「バイオテクノロジーにおける原核プロモータ」, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128）等に記載されている。更に、国際特許公開WO00/18935に開示
されているように、標的遺伝子のプロモータ領域にいくつかのヌクレオチドについてヌクレオチド置換を導入することにより、プロモータが弱くなるよう改変することもできる。更に、シャイン・ダルガーノ（ＳＤ）配列における、及び／又はＳＤ配列と開始コドンとの間のスペーサにおける、及び／又はリボソーム結合部位（ＲＢＳ）中で開始コドンから直ぐ上流及び／又は下流の配列におけるいくつかのヌクレオチドの置換は、ｍＲＮＡの転写効率に大きく影響を与えることが知られている。このＲＢＳの改変は、puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の転写を減少させることと組合せることができる。

puuADRCBE遺伝子クラスタ由来の少なくとも１つの遺伝子の発現は、トランスポゾン又は挿入配列（ＩＳ）の、遺伝子のコード領域への（米国特許第5,175,107号）、又は遺伝子の発現を調節する領域における挿入によって、又は紫外線照射（ＵＶ照射）若しくはニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）を用いる変異誘発などの従来の方法によって減弱させることもできる。更に、部位特異的変異の取込みは、例えば、λRed/ET-媒介組込みに基づいて、公知の染色体校正方法によって行うことができる。

コピー数、puuADRCBE遺伝子クラスタ又は全クラスタ由来の遺伝子の存在又は非存在は、染色体ＤＮＡの制限処理を行った後に、遺伝子配列に基づいたプローブを使用するサザンブロッティング、蛍光インサイツハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）等を行うことによって測定することができる。遺伝子発現のレベルは、ノーザンブロッティング、定量的ＲＴ−ＰＣＲ等を含む種々の周知の方法を使用し、遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を測定することによって決定することができる。遺伝子によってコードされるタンパク質の量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後にイムノブロッティングアッセイ（ウエスタンブロッティング解析）、又はタンパク質サンプルの質量分析解析等を行うことを含む公知の方法によって測定することができる。

プラスミドＤＮＡの調製、消化、DNAの連結及び形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択、変異の組込み等などのＤＮＡの組換え分子の操作及び分子クローニングは、当業者に周知の通常の方法とすることができる。これらの方法は、例えば、Sambrook J., Fritsch E.F.とManiatis T., 「分子クローニング：実験室マニュアル」, 第２版, Cold Spring Harbor Laboratory Press （1989）又はGreen M.R.とSambrook J.R., 「分子クローニング：実験室マニュアル」, 第４版, Cold Spring Harbor Laboratory Press （2012）; Bernard R. Glick, Jack J. PasternakとCheryl L. Patten, 「分子バイオテクノロジー：組換えＤＮＡの原理と応用」, 第４版, Washington, DC, ASM Press （2009）に記載されている。

前記説明したように、E. coliのトランスアミナーゼ経路（patA, patD, gabT及びgabD）及びグルタミル化プトレシン経路（puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びpuuR）由来の酵素をコードする遺伝子は、既に解明されている。本発明の目的のために、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuEなどのpuuADRCBE遺伝子クラスタ由来の遺伝子に関する以下に示す説明は、patA, patD, gabT及びgabD遺伝子に準用して適用することができる。
腸内細菌科の属、種又は株の間で、ＤＮＡ配列が幾分異なり得ることから、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子は、配列番号１、３、５、７、９及び１１にそれぞれ示す遺伝子に限定されるものではないが、配列番号１、３、５、７、９及び１１の変異体（variant）ヌクレオチド配列またはそれに相同なものであって、それぞれPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質の変異体をコードする遺伝子を含むものとすることができる。

「変異体タンパク質」という記載は、１又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失、挿入、
及び／又は付加のいずれであるかに拘らず、配列番号２、４、６、８、１０又は１２と比較して、配列中に１又は数個の変更を有するが、それぞれPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質のものと類似する活性又は機能を依然として維持するか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないタンパク質を意味するものとすることができる。変異体タンパク質における変更の数は、タンパク質の三次元構造中の位置又はアミノ酸残基の種類に依存する。これは、厳密には限定されるものではないが、配列番号２、４、６、８、１０又は１２において、１〜３０、他の例では１〜１５、他の例では１〜１０、更に他の例では１〜５とすることができる。これは、いくつかのアミノ酸は互いに高い相同性を有し、このため、この種の変更によって活性又は機能が影響を受けないか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質の三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないためである。したがって、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子によってコードされるタンパク質変異体は、PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質の活性又は機能が維持されるか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていない限り、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用した場合、配列番号２、４、６、８、１０又は１２にそれぞれ示す全アミノ酸配列に対して８０％以上、９０％以上、９５％以上、又は９８％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有し得る。

１又は数個のアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、保存的な１又は数個の変異とすることができる。代表的な保存的な変異は、保存的な置換である。保存的な置換は、限定されるものではないが、置換部位が芳香族アミノ酸である場合は互いにPhe, Trp及びTyrの間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合はAla, Leu, Ile及びValの間で、置換部位が親水性アミノ酸である場合はGlu, Asp, Gln, Asn, Ser, His及びThrの間で、置換部位が極性アミノ酸である場合はGln及びAsnの間で、置換部位が塩基性アミノ酸である場合はLys, Arg及びHisの間で、置換部位が酸性アミノ酸である場合はAsp及びGluの間で、置換部位が水酸基を有するアミノ酸である場合はSer及びThrの間で置換を引き起こす置換とすることができる。保存的な置換の例には、AlaについてのSer又はThrの置換、ArgについてのGln, His又はLysの置換、AsnについてのGlu, Gln, Lys, His又はAspの置換、AspについてのAsn, Glu又はGlnの置換、CysについてのSer又はAlaの置換、GlnについてのAsn, Glu, Lys, His, Asp又はArgの置換、GluについてのAsn, Gln, Lys又はAspの置換、GlyについてのProの置換、HisについてのAsn, Lys, Gln, Arg又はTyrの置換、IleについてのLeu, Met, Val又はPheの置換、Leu についてのIle, Met, Val又はPheの置換、LysについてのAsn, Glu, Gln, His又はArgの置換、MetについてのIle, Leu, Val又はPheの置換、PheについてのTrp, Tyr, Met, Ile又はLeu の置換、SerについてのThr又はAla の置換、Thr についてのSer又はAlaの置換、TrpについてのPhe又はTyrの置換、TyrについてのHis, Phe又はTrpの置換、及びValについてのMet, Ile又はLeuの置換が含まれる。

変異体タンパク質の活性又は機能が維持され、PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質のものと類似するか、又はPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEの三次元構造が、野生型又は改変されていないタンパク質に対して有意に変更されていないものとなるよう、１又は複数の変異が、アミノ酸配列中の異なる位置（１又は複数）における１以上の二次的な変異によって補償される限り、１又は数個のアミノ酸残基の例示的な置換、欠失、挿入、及び／付加は、１又は複数の非保存的な変異とすることもできる。

タンパク質又はＤＮＡの相同性の程度を評価するために、ＢＬＡＳＴサーチ、ＦＡＳＴＡサーチ及びＣｌｕｓｔａｌＷ法などのいくつかの計算方法を使用することができる。ＢＬＡＳＴ（Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）サーチは、プログラムblastp, blastn, blastx, megablast, tblastn及びtblastxによって用い
られるヒューリスティックなサーチアルゴリズムであり、これらのプログラムは、Samuel
K.とAltschul S.F. （「一般的なスコアリングスキームを使用することにより分子配列特徴の統計的な有意性を評価する方法」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; 「分子配列におけるマルチプルな高スコアリング断片についての応用と統計」Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877）の統計的な方法を使用するその所見に有意性を帰するものである。コンピュータプログラムＢＬＡＳＴにより、３つのパラメータ：スコア、同一性及び類似性が計算される。ＦＡＳＴＡサーチ法は、Pearson W.R. （「FASTP及びFASTAを用いる迅速で感度の高い配列比較」, Methods Enzymol., 1990, 183:63-98）によって記載されている。ＣｌｕｓｔａｌＷ法は、Thompson J.D.ら（「CLUSTAL W：配列の重み付け、位置特異的ギャップペナルティ及びウエイトマトリックス選択により斬新的なマルチプル配列の並びの感度を改良する」, Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680）によって記載されている。

更に、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子は、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、標準的な遺伝子コード表（例えば、Lewin B., 「遺伝子VIII」（Genes VIII）, 2004, Pearson Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458参照）に従ういずれかの同義アミノ酸コドンを使用してPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質をコードするヌクレオチド配列を意味するものとすることができ、これは、PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB又はPuuEタンパク質の「変異体タンパク質」と呼ぶこともできる。puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子は、遺伝子コードの縮退のため、変異体ヌクレオチド配列とすることができる。

また、「変異体ヌクレオチド配列」という記載は、限定されるものではないが、ストリンジェントな条件下で、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示す配列に相補的なヌクレオチド配列、又はストリンジェントな条件下でヌクレオチド配列から調製することのできるプローブ（ただし、これは活性又は機能性のタンパク質をコードする）とハイブリダイズするヌクレオチド配列を意味するものとすることもできる。「ストリンジェントな条件」には、特異的なハイブリッド、例えば、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴを使用した場合に、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、又は９９％以上のパラメータ「同一性」として特定される相同性を有するハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッド、例えば、前記より低い相同性を有するハイブリッドが形成されないものが含まれる。例えば、ストリンジェントな条件は、６０℃又は６５℃において、１×ＳＳＣ（標準クエン酸ナトリウム又は標準塩化ナトリウム）の塩濃度、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、又は他の例では、０．１カケルＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄すること、又は他の例では、２回又は３回洗浄することにより例示されるものとすることができる。洗浄の継続時間は、ブロッティングのために使用する膜の種類に依存し、通常は、製造業者によって推奨されたものとすることができる。例えば、ストリンジェントな条件下において、アマシャム・ハイボンド（登録商標）−Ｎ＋の正荷電ナイロン膜（ＧＥヘルスケア）について推奨された洗浄の継続時間は１５分である。洗浄工程は、２〜３回行うことができる。プローブとして、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示す配列に相補的な配列の一部を使用することもできる。この種プローブは、配列番号１、３、５、７、９又は１１に示す配列に基づいて調製したプライマーとしてのオリゴヌクレオチド、及び鋳型としてのヌクレオチド配列を含むＤＮＡ断片を使用し、ＰＣＲによって作製することができる。プローブの長さは、＞５０ｂｐであることが推奨されており、これは、ハイブリダイゼーション条件に依存して適切に選択することができ、通常は１００ｂｐ〜１ｋｂｐである。例えば、約３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ断片をプローブとして使用する場合は、ハイブリダイゼーション後の洗浄条件は、５０℃、６０℃又は６５℃で２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにより例示されるものとすることができる。

種E. coliのPuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質をコードする遺伝子は既に解明されていることから（前記参照）、PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質の変異体タンパク質をコードする変異体ヌクレオチド配列は、puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて調製されたプライマーを使用するＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応；White T.J.ら、「ポリメラーゼ連鎖反応」, Trends Genet., 1989,
5:185-189参照）；又は例えば、ヒドロキシルアミンを用いた試験管内で野生型puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子を含むＤＮＡを処理することによる部位特異的変異誘発方法、又はこの種の処理に通常使用される紫外線（ＵＶ）照射又はＮ−メチル−Ｎ'−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）及び亜硝酸などの変異剤を用いて、微生物、例えば、野生型puuA, puuD, puuR, puuC, puuB及びpuuE遺伝子を保有する腸内細菌科に属する細菌を処理する方法；又は全長の遺伝子として化学的に合成された構造によって取得することができる。他の微生物のPuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB及びPuuEタンパク質又はその変異体タンパク質をコードする遺伝子は、類似する様式で取得することができる。

「野生型タンパク質」という記載は、腸内細菌科の野生型又は親細菌株、例えば野生型E. coli MG1655株によって天然に生産されるネイティブタンパク質を意味するものとすることができる。野生型タンパク質は、野生型細菌のゲノム中に天然に存在する「野生型遺伝子」又は「改変されていない遺伝子」によってコードされることができる。
ここに記載する細菌は、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を固有に有する細菌中で、プトレシン分解経路の少なくとも１つの遺伝子の発現を減弱させることによって取得することができる。代替的に、ここに記載する細菌は、プトレシン分解経路の少なくとも１つの遺伝子の発現が既に減弱された細菌に対して、Ｌ−アミノ酸を生産する能力を付与することにより取得することができる。
細菌は、既に言及した性質に加えて、本発明の範囲から逸脱することなく、種々の栄養要求、薬剤耐性、薬剤感受性、及び薬剤依存性などの他の特定の性質を有するものとすることができる。

２．方法
本発明の方法は、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−シトルリン、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−オルニチン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、及びＬ−バリンなどのアミノ酸、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。更に詳しくは、本発明の方法は、Ｌ−アルギニン、Ｌ−シトルリン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−プロリン、及びＬ−オルニチンなどのグルタミン酸ファミリーのＬ−アミノ酸、又はこれらの混合物を製造する方法を含む。更に、本発明の方法は、Ｌ−アルギニンを製造する方法を含む。

Ｌ−アミノ酸を製造する方法は、培養培地中で細菌を培養してＬ−アミノ酸を生産させ、分泌させ、かつ／又は培地中に蓄積させ、培養培地及び／又は細菌細胞からＬ−アミノ酸を回収する工程を含むものとすることができる。回収したアミノ酸は、更に精製することができる。Ｌ−アミノ酸は、その塩若しくは水和物の形態、又はその組合せとして製造することができる。例えば、Ｌ−アミノ酸のナトリウム、カリウム、アンモニウム等の塩を、この方法によって製造することができる。Ｌ−アミノ酸は、例えば、他の有機又は無機化合物との、その付加物の形態で製造することができる。特に、Ｌ−アミノ酸のモノクロロハイドレート塩は、例えば、Ｌ−リジンのモノクロロハイドレート塩（Ｌ−リジン−ＨＣｌ）又はＬ−アルギニンのモノクロロハイドレート塩（Ｌ−アルギニン−ＨＣｌ）の方法により製造することができる。

細菌の培養、及び培地等からのＬ−アミノ酸、又はその塩若しくは水和物の回収及び精
製は、微生物を使用してＬ−アミノ酸を製造する従来の発酵法に類似する様式で行うことができる。Ｌ−アミノ酸の製造のための培養培地は、合成又は天然培地、例えば、炭素源、窒素源、イオウ源、無機イオン、及び必要に応じて他の有機及び無機成分を含む典型的な培地とすることができる。炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトース、フラクトース、ショ糖、アラビノース、マルトース、キシロース、トレハロース、リボース、及び澱粉の加水分解物などの糖類；グリセリン、マンニトール、及びソルビトールなどのアルコール；グルコン酸、フマル酸、クエン酸、リンゴ酸、及びコハク酸などの有機酸等を使用することができる。窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、及びリン酸アンモニウムなどの無機アンモニウム塩；大豆加水分解物などの有機窒素；アンモニアガス；アンモニア水等を使用することができる。イオウ源は、硫酸アンモニウム、硫酸マグネシウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン等を含むものとすることができる。ビタミンＢ１などのビタミン、要求物質、例えば、有機栄養素、例えば、アデニン及びＲＮＡなどの核酸、又は酵母エキス等は、例え微量であっても、適量存在するものとし得る。これらの他、少量のリン酸カルシウム、鉄イオン、マンガンイオン等を、必要に応じて添加し得る。

培養は、好気的条件下で１６〜７２時間、又は１６〜６５時間行うことができ、培養の際の培養温度は、３０〜４５℃以内、又は３０〜３７℃以内で調節することができ、ｐＨは、５〜８、又は６．５〜７．５に調整することができる。ｐＨは、無機若しくは有機の酸性又はアルカリ性物質、並びにアンモニアガスを使用することにより調整することができる。
培養の後、細胞及び細胞の残骸などの固体を、遠心分離又は膜ろ過によって液体培地から除去することができ、その後、標的Ｌ−アミノ酸又はその塩を、濃縮、イオン交換クロマトグラフィー、及び結晶化などの従来の技術のいずれかの組合せにより、発酵液から回収することができる。

回収した標的Ｌ−アミノ酸組成物は、標的物質に加えて、微生物細胞、培地成分、水分、及び微生物の副生代謝産物を含有し得る。回収した標的物質の純度は、５０％以上、好ましくは８５％以上、特に好ましくは９５％以上である（米国特許第5,431,933号, 特許第1214636号, 米国特許第4,956,471号, 4,777,051号, 4,946,654号, 5,840,358号, 6,238,714号, 米国特許公開2005/0025878）。

以下の限定的ではない実施例を参照し、本発明を以下に更に詳しく説明する。

実施例１．不活性化したpuuADRCBE遺伝子クラスタを有するE. coli株の構築
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」と呼ばれる方法により（Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645）、不活性化されたpuuADRCBE遺伝子クラスタを有するE. coli株を構築した。プライマーＰ１（配列番号：１３）及びＰ２（配列番号：１４）並びに鋳型としてpMW118-λattL-Cm-λattRプラスミド（WO2005010175 A1）を用いるＰＣＲにより、λattL-Cm-λattRカセットを含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーＰ１は、puuA遺伝子の５’−末端に局在する領域に相補的な領域及びattR領域に相補的な領域の両者を含む。プライマーＰ２は、puuE遺伝子の３’−末端に局在する領域に相補的な領域及びattL領域に相補的な領域の両者を含む。ＰＣＲの条件は次の通りとした：９５℃で３分の変性工程；最初の２つのサイクルのプロフィール：９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の２５のサイクルのプロフィール：９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で１分４０秒；最終工程：７２℃で５分。

得られたＰＣＲ産物（約１．６ｋｂｐ）は、アガロースゲル中で電気泳動によって精製
し、温度感受性の複製開始点を有するpKD46プラスミドを含むE. coli MG1655株のエレクトロポーレーションに使用した。pKD46プラスミド（Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645）は、ファージλの2,154ヌクレオチドのＤＮＡ断片を含み（31088〜33241のヌクレオチド位置、GenBank受託番号: J02459）、アラビノース誘導性のParaBプロモータの調節下にあるlRed相同組換え系の遺伝子（γ,
βエクソ遺伝子）を含む。pKD46プラスミドは、E. coli MG1655株の染色体へのＰＣＲ産物の組込みのために必要である。組換えプラスミドpKD46を含むE. coli MG1655株は、Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, 米国（受託番号CGSC7669）から取得することができる。

エレクトロコンピテント細胞は、次のようにして調製した：アンピシリン（100 mg/L）を含有するＬＢ培地（Luria-Bertani broth, lysogenic brothとも呼ばれる; Sambrook J.とRussell D.W., 「分子クローニング：実験室マニュアル」（第３版）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）中で、E. coli MG1655/pKD46株を30℃で生育させた後；アンピシリン（100 mg/L）及びＬ−アラビノース（1 mM）を含有する5 mLのＳＯＢ培地（Sambrook J.とRussell D.W., 「分子クローニング：実験室マニュアル」 （第３版）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）を用いて、培養物を１００倍に希釈した。通気しながら（250 rpm）３０℃で〜０．６のＯＤ_６００まで細胞を生育させた。１００倍に濃縮し、氷冷した脱イオン水を用いて３回洗浄することによりエレクトロコンピテント細胞を作製した。70 mLの細胞と約100 ngのＰＣＲ産物とを使用してエレクトロポーレーションを行った。1 mLのＳＯＣ培地（Sambrook J.とRussell D.W., 「分子クローニング：実験室マニュアル」 （第３版）, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001）を用いて、３７℃で２．５時間、エレクトロポーレーションした細胞をインキュベートし、クロラムフェニコール（25 mg/L）を含有するＬ寒天上でプレート処理し、３７℃で生育させてCm^R組換え体を選択した。pKD46プラスミドを除去するために、クロラムフェニコール（25 mg/L）を補填したＬ寒天上で４２℃で２回継代を行い、アンピシリンに対する感受性について、得られたコロニーを試験した。このようにして、E. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株を取得した。

実施例２．E. coli 382ilvA⁺ΔpuuADRCBEによるＬ−アルギニンの生産
最小寒天培地上で、良好に生育するコロニーとして、E. coli 382ilvA⁺のクローンを選択した。E. coli K-12株由来の野生型ilvA遺伝子のＰ１トランスダクションにより、Ｌ−アルギニン生産株382（VKPM B-7926, EP1170358 A1）から株382ilvA⁺を取得した。株382は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM） （ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny proezd, 1）において、2000年4月10日に、受託番号VKPM B-7926の下で寄託された後、2001年5月18日に、ブダペスト条約の下での寄託に移管された。Ｌ−アルギニン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cmの染色体由来のDNA断片を、Ｐ１トランスダクション（Miller, J.H. （1972） 「分子遺伝学の実験」, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY）によって、Ｌ−アルギニン生産性E. coli strain 382ilvA⁺へと転移させ、E. coli 382ilvA⁺ΔpuuADRCBE::Cm株を取得した。

E. coli株382ilvA⁺及び382ilvA⁺ΔpuuADRCBE::Cmの両者を、それぞれ3 mLのニュートリエント・ブロス中で、３７℃で１８時間、振盪しながら（220 rpm）培養した。その後、0.3 mLの得られた培養物を、20×200 mmの試験管内の2 mLの発酵培地に接種し、〜３８のＯＤ_５４０に達してグルコース消費に至るまで、３２℃で４８時間培養した。
培養後、培地中に蓄積したＬ−アルギニンの量を、ブタノール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーによって決定した。アセトン中のニンヒドリン（２％）の溶液を、可視化試薬として使用した。Ｌ−アルギニン
を含むスポットを切り出し、0.5％塩化カドミウム水溶液を用いてＬ−アルギニンを溶出させ、Ｌ−アルギニンの量を、540 nmで分光光度的に見積もった。

発酵培地の組成（g/L）は次の通りとした：
グルコース 48.0
硫酸アンモニウム 35.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・７水和物 1.0
塩酸チアミン 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
炭酸カルシウム 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌した。炭酸カルシウムは、１８０℃で２時間乾熱殺菌した。水酸化カリウム溶液を用いてｐＨ７．０に調整した。

８つの独立した試験管発酵の結果を（平均値として）表１に示す。表１から分るように、改変したE. coli 382ilvA⁺ΔpuuADRCBE::Cm株は、親株のE. coli 382ilvA⁺と比較して、より高い量のＬ−アルギニン（Arg）を生産することができた。
puuA遺伝子が不活性化されたE. coli 382ilvA⁺ΔpuuA::Km株は、実施例５に記載する。

実施例３．E. coli Ｌ−オルニチン生産株の構築
argF及びargI遺伝子の両者によってコードされるオルニチンカルバモイルトランスフェラーゼの不活性化により、E. coli Ｌ−アルギニン生産株382ilvA⁺からE. coli Ｌ−オルニチン生産株を取得した。

３．１．argF遺伝子の不活性化
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」（Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645）と呼ばれる方法により、argF遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーＰ３（配列番号１５）及びＰ４（配列番号１６）並びに鋳型としてのpMW118-attL-Km-attRプラスミド（WO2011043485 A1）を使用するＰＣＲにより、カナマイシン耐性マーカー（Km^R）を含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーＰ３は、argF遺伝子の５’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attR領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーＰ４は、argF遺伝子の３’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。ＰＣＲの条件は次の通りとした：９５℃で３分の変性工程；最初の２つのサイクルのプロフィール：９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の２５サイクルのプロフィール：９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終工程：７２℃で５分。
得られたＰＣＲ産物（約1.6 kbp）をアガロースゲル中で電気泳動により精製し、前記したように（実施例１）λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の（native）argF遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔargF::Km株を取得した。

３．２．argI遺伝子の不活性化
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」（Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645）と呼ばれる方法により、argI遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーＰ５（配列番号１７）及びＰ６（配列番号１８）並びに鋳型としてのpMW118-attL-Cm-attRプラスミド（WO2005010175 A1）を使用するＰＣＲにより、λattL-Cm-λattRカセットを含むDNA断片を取得した。プライマーＰ５は、argI遺伝子の５'−末端に局在する領域に相補的な領域と、attR領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーＰ６は、argI遺伝子の３’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。ＰＣＲの条件は次の通りとした：９５℃で３分の変性工程；最初の２つのサイクルのプロフィール：９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の２５サイクルのプロフィール：９５℃で３０秒、５４℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終工程：７２℃で５分。
得られたＰＣＲ産物（約1.6 kbp）をアガロースゲル中で精製し、前記したように（実施例１）λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の（native）argI遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔargI::Cm株を取得した。

３．３． argI及びargF遺伝子が不活性化されたE. coli株の構築
E. coliのＬ−オルニチン生産株を取得するために、得られたE. coli MG1655ΔargF::Km（実施例３．１）及びE. coli MG1655ΔargI::Cm（実施例３．２）株の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｌ−アルギニン生産性E. coli株382ilvA⁺にＰ１トランスダクションによって継続的に転移させ、E. coli 382ilvA⁺ΔargI::Cm ΔargF::Km株を取得した。
pMW-Int/Xisヘルパープラスミド（WO2005010175 A1）を使用してCm^R及びKm^Rマーカーを同時に除去し、これにより、ＰＣＲで生成されたＤＮＡ断片のエレクトロポーレーションのために、前記したような（実施例１）エレクトロポーレーションを使用し、選択されたプラスミドのない組込み体中へとエレクトロポーレーションを行った。エレクトロポーレーションの後、0.5％グルコース及びアンピシリン（150 mg/L）を含有するＬ寒天上で細胞をプレート処理し、３０℃で一夜インキュベートし、Int/Xisタンパク質の合成を誘導した。生育したコロニーを、クロラムフェニコールとカナマイシンとの混合物を含む場合及び含まない場合で、L寒天上でレプリカプレート処理し、Cm^S及びKm^S（クロラムフェニコール及びカナマイシン感受性）変異体を選択した。このようにして、E. coli 382ilvA⁺ΔargI ΔargF株を取得した。

実施例４．E. coli 382ilvA⁺ΔargI ΔargF ΔpuuADRCBE::CmによるＬ−オルニチンの生産
Ｌ−オルニチン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm（実施例１）の染色体に由来するＤＮＡ断片を、Ｐ１トランスダクションにより、Ｌ−オルニチン生産性E. coli株382ilvA⁺ΔargIΔargF（実施例３）に転移させ、E. coli 382ilvA⁺ΔargI ΔargF ΔpuuADRCBE::Cm株を取得した。
Ｌ−アルギニン生産（実施例２）について前記したように、Ｌ−オルニチン生産を評価した。６つの独立した試験管発酵の結果を（平均値として）表２に示す。表２から分るように、改変したE. coli 382ilvA⁺ΔargI ΔargF ΔpuuADRCBE::Cm株は、親株のE. coli 382ilvA⁺ΔargI ΔargFと比較して、より高い量のＬ−オルニチン（Orn）を生産することができた。

実施例５． puuA遺伝子が不活性化されたE. coli株の構築
Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET媒介組込み」（Datsenko K.AとWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645）と呼ばれる方法により、puuA遺伝子が欠失した株を構築した。プライマーＰ７（配列番号１９）及びＰ８（配列番号２０）並びに鋳型としてのpMW118-attL-Km-attRプラスミド（WO2011043485 A1）を使用するＰＣＲにより、λattL-Km-λattRカセットを含むＤＮＡ断片を取得した。プライマーＰ７は、puuA遺伝子の５’−末端に局在する領域に相補的な領域と、ａｔｔＲ領域に相補的な領域との両者を含む。プライマーＰ８は、puuA遺伝子の３’−末端に局在する領域に相補的な領域と、attL領域に相補的な領域との両者を含む。ＰＣＲの条件は次の通りとした：９５℃で３分の変性工程；最初の２つのサイクルのプロフィール：９５℃で１分、５０℃で３０秒、７２℃で４０秒；最後の２５サイクルのプロフィール：９５℃で３０秒、５９℃で３０秒、７２℃で４０秒；最終工程：７２℃で５分。
得られたＰＣＲ産物（約1.6 kbp）をアガロースゲル中で精製し、前記したように（実施例１）λRed媒介組込みにより、E. coli MG1655株の染色体中に組込み、元の（native）puuA遺伝子を交換した。このようにして、E. coli MG1655ΔpuuA::Km株を取得した。

実施例６．E. coli 382ilvA⁺ΔpuuA::KmによるＬ−アルギニンの生産
Ｌ−アルギニン生産に対するpuuA遺伝子の不活性化の効果を試験するために、得られたE. coli MG1655ΔpuuA::Kmの染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｐ１トランスダクションによって、Ｌ−アルギニン生産性E. coli株382ilvA⁺に転移させ、E. coli 382ilvA⁺ΔpuuA::Km株を取得した。
実施例２に記載したようにＬ−アルギニン生産を評価した。８つの独立した試験管発酵の結果を（平均値として）表１に示す。表１から分るように、改変されたE. coli 382ilvA⁺ΔpuuA::Km株は、親株のE. coli 382ilvA⁺と比較して、より高い量のＬ−アルギニンを蓄積することができた。

実施例７．E. coli 382ΔargG ΔpuuADRCBE::CmによるＬ−シトルリンの生産
Ｌ−シトルリン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｐ１トランスダクションによってシトルリン生産性E. coli株382ΔargGに転移させ、株382ΔargG ΔpuuADRCBE::Cmを取得した。株382ΔargGは、Datsenko K.A.とWanner B.L.によって最初に開発され、「λRed/ET-媒介組込み」と呼ばれる方法により（Datsenko K.A.とWanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97（12）:6640-6645）、Ｌ−アルギニン生産株382（VKPM B-7926, EP1170358 A1）の染色体上のargG遺伝子を欠失させることによって取得される。この手順によれば、argG遺伝子に隣接する領域と鋳型プラスミド中で抗生物質耐性を与える遺伝子との両者に相同なＰＣＲプライマーが構築される。プラスミドpMW118-λattL-Cm-λattR （WO2005010175 A1）を、ＰＣＲ反応における鋳型として使用する。

E. coli株382ΔargG及び382ΔargG ΔpuuADRCBE::Cmを、3 mLのニュートリエント・ブロス中で、振盪しながら37℃で18時間別々に培養し、0.3 mLの得られた培養物を、20×200 mm試験管中の2 mLの発酵培地に接種し、ロータリーシェーカー上で３２℃で４８時間培
養する
培養後、培地中に蓄積するＬ−シトルリンの量を、ブタン−１−オール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーにより決定する。アセトン中のニンヒドリン（２％）の溶液を可視化剤として使用する。シトルリンを含有するスポットを切り出し、0.5％塩化カドミウム水溶液を用いてＬ−シトルリンを溶出させ、５４０ｎｍで分光光度的にＬ−シトルリンの量を見積もる。

培養培地の組成（g/L）は次の通りである：
グルコース 48.0
硫酸アンモニウム 35.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・７水和物 1.0
塩酸チアミン 0.0002
酵母エキス 1.0
Ｌ−イソロイシン 0.1
Ｌ−アルギニン 0.1
炭酸カルシウム 5.0
グルコースと硫酸マグネシウムとは別々に殺菌する。炭酸カルシウムは、１８０℃で２時間乾熱する。ｐＨは７．０に調整する。

実施例８．E. coli VL334thrC⁺ΔpuuADRCBE::CmによるＬ−グルタミン酸の生産
Ｌ−グルタミン酸生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化に由来する効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｐ１トランスダクションによって、グルタミン酸生産性E. coli株VL334thrC⁺ （EP1172433 A1）に転移させ、株VL334thrC⁺ΔpuuADRCBE::Cmを取得した。株VL334thrC⁺は、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM） （ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1 Dorozhny proezd, 1）において、2004年12月6日に、受託番号VKPM B-8961の下で寄託された後、2004年12月8日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。

E. coli株VL334thrC⁺及びVL334thrC⁺ΔpuuADRCBE::Cmを、Ｌ寒天平板上で３７℃で１８〜２４時間別々に培養する。その後、１白金耳の細胞を、２ｍＬの発酵培地を含む試験管に移す。振盪しながら３０℃で３日間培養を行う。
培養の後、培地中に蓄積するＬ−グルタミン酸の量を、ブタン−１−オール：酢酸：水＝４：１：１（ｖ／ｖ）よりなる移動相を使用するペーパークロマトグラフィーにより、後続するニンヒドリン（アセトン中の１％溶液）による染色、0.5％塩化カドミウム水溶液を用いる50％エタノール中での化合物の抽出、更に540 nmでのＬ−グルタミン酸の見積もりを行って決定する。

発酵培地の組成（g/L）は次の通りである：
グルコース 60.0
硫酸アンモニウム 25.0
リン酸二水素カリウム 2.0
硫酸マグネシウム・７水和物 1.0
塩酸チアミン 0.1
Ｌ−イソロイシン 0.07
炭酸カルシウム 25.0
グルコースと炭酸カルシウムとは別々に殺菌する。ｐＨは７．２に調整する。

実施例９．E. coli 702ilvAΔpuuADRCBE::CmによるＬ−プロリンの生産
Ｌ−プロリン生産に対するpuuADRCBE遺伝子クラスタの不活性化由来の効果を試験するために、前記したE. coli MG1655ΔpuuADRCBE::Cm株の染色体由来のＤＮＡ断片を、Ｐ１トランスダクションによってプロリン生産性E. coli株702ilvAに転移させ、株702ilvAΔpuuADRCBE::Cmを取得する。株702ilvAは、ロシアン・ナショナル・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオーガニズムス（VKPM） （ロシア連邦, 117545 モスクワ, 1st Dorozhny proezd, 1）において、2000年7月18日に、受託番号VKPM B-8012の下で寄託された後、2001年5月18日にブダペスト条約の下での寄託に移管された。
E. coli株702ilvA及び702ilvAΔpuuADRCBE::Cmを、L寒天平板上で37℃で18〜24時間別々に培養する。その後、実施例８（Ｌ−グルタミン酸の生産）と同一の条件下でこれらの株を培養する。

この発明を、その好適な態様を参照して詳細に説明したが、この発明の範囲から逸脱することなく種々の変更を行うことができ、等価物を用いることができることは当業者に明らかであろう。ここに引用した全ての参考文献は、この出願の一部として参考によりここに組み入れるものとする。

本発明によれば、腸内細菌科の細菌による、グルタミン酸ファミリーに属するアミノ酸などのＬ−アミノ酸の製造を改良することができる。

Claims (8)

1. Ｌ−アミノ酸の製造方法であって、
   （i）腸内細菌科のＬ−アミノ酸生産細菌を培養培地中で培養し、
   （ii）細菌若しくは培養培地又は両方に含まれる前記Ｌ−アミノ酸を回収することを含み、
   前記細菌が、プトレシン分解経路を破壊するように改変されており、
   前記プトレシン分解経路が、グルタミル化プトレシン経路であり、
   前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属し、
   前記Ｌ−アミノ酸が、Ｌ−アルギニン又はＬ−オルニチンである、方法。
2. 前記プトレシン分解経路が、puuA, puuB, puuC, puuD, puuE及びこれらの組合せからなる群から選択される１又は数個の遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項１に記載の方法。
3. さらに、puuR遺伝子の発現が減弱されている、請求項２に記載の方法。
4. 前記プトレシン分解経路が、少なくともpuuA遺伝子の発現の減弱によって破壊されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記プトレシン分解経路が、puuA遺伝子又は全puuADRCBE遺伝子クラスタの発現の減弱
   によって破壊されている、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記発現が、前記１又は数個の遺伝子又は前記遺伝子クラスタの不活性化のために減弱している、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記１又は数個の遺伝子又は前記遺伝子クラスタが欠失している、請求項６に記載の方法。
8. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。