BR112016000607B1 - Método para produzir um l-aminoácido - Google Patents

Abstract

MÉTODO PARA PRODUZIR UM L-AMINOÁCIDO. A presente invenção provê um método para produzir L-aminoácidos tais como L-aminoácidos que pertencem à família do glutamato por fermentação usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae, particularmente uma bactéria que pertence ao gênero Eschericia, que foi modificada para romper a via de ddegradação de putrescina através de, por exemplo, inativação de um gene ou vários genes do alongamento de genes puuADRCBE.

Description

Fundamentos da Invenção Campo Técnico

[001] A presente invenção refere-se à indústria microbiológica, e especificamente a um método para produzir L-aminoácidos por fermentação de uma bactéria da família Enterobacteriaceae que foi modificada para romper a via de degradação de putrescina.

Fundamentos da Técnica

[002] Convencionalmente, L-aminoácidos são industrialmente produzidos por métodos de fermentação usando cepas de microrganismos obtidas de fontes naturais, ou mutantes das mesmas. Tipicamente, os microrganismos são modificados para intensificar os rendimentos de produção de L-aminoácidos.

[003] Muitas técnicas para intensificar os rendimentos de produção de L-aminoácidos foram relatadas, incluindo transformação de microrganismos com DNA recombinante (ver, por exemplo, Patente US n° 4.278.765 A) e alteração de regiões reguladoras como promotor, sequência líder, e/ou atenuador, ou outras conhecidas da pessoa versada na técnica (ver, por exemplo, US2006216796 A1 e WO 9615246 A1). Outras técnicas para intensificar rendimentos de produção incluem aumentar as atividades de enzimas envolvidas em biossíntese de aminoácidos e/ou dessensibilizar as enzimas alvo para a inibição de realimentação pelo L-aminoácido resultante (ver, por exemplo, WO9516042 A1, EP0685555 A1 ou Patente US nos 4.346.170 A, 5.661.012 A, e 6.040.160 A).

[004] Um outro método para intensificar os rendimentos de produção de L-aminoácidos é atenuar a expressão de um gene ou vários genes que estão envolvidos na degradação do L-aminoácido alvo, genes que desviam os precursores do L-aminoácido alvo da via biossintética do L- aminoácido, genes envolvidos na redistribuição dos fluxos de carbono, nitrogênio e fosfato, e genes que codificam toxinas, etc.

[005] As vias para catabolismo de arginina, ornitina, putrescina, e ácido y-aminobutírico (GABA) são relacionadas (Schneider B.L. et al., Arginine catabolism and the arginine succinyltransferase pathway in Escherichia coli, J. Bacteriol., 1998, 180(16):4278-4286). Arginina e ornitina são degradadas por meio da via arginina succiniltransferase (AST) produtora de amônia em glutamato por enzimas AST codificadas pelos genes operon astCADBE. A via AST é necessária para a degradação de arginina durante crescimento limitado por nitrogênio, e contribui para a degradação de outros aminoácidos. Alternativamente à via AST, existe uma outra via catabólica de arginina por meio de agmatina para putrescina, que utiliza arginina decarboxilase (ADC) na reação inicial (via ADC). A via ADC não é usada para degradar arginina como fonte de nitrogênio única (Schneider B.L. et al., Putrescine catabolism is a metabolic response to several stresses in Escherichia coli, Mol. Microbiol., 2013, 88(3):537-550). Contrária à via de degradação de arginina, a ornitina é diretamente convertida em putrescina pela ornitina decarboxilase (ODC) na via ODC.

[006] Putrescina (também referida como tetrametilenodiamina ou 1,4-diaminobutano) é degradada por meio de GABA em succinato para uso como uma fonte de carbono e nitrogênio pela via putrescina glutamilada (GP) ou pela via transaminase. A via GP, também referida como via Puu, utiliza as enzimas para degradar completamente a putrescina em succinato. Os genes puuA, puuB, puuC, puuD e puuE, junto com os genes puuP e puuR que codificam um PuuP simporte de putrescina/H+ e PuuR repressor transcricional de ligação a DNA, são organizados no divergon puu. O aglomerado de genes puu foi encontrado em Escherichia coli (E. coli) e enterobactéria intimamente relacionadas (Nemoto N. et al., Mechanism for regulation of the putrescine utilization pathway by the transcription fator PuuR in Escherichia coli K-12, J. Bacteriol., 2012, 194(13):3437-3447). É postulado que E. coli e enterobactéria relacionadas podem utilizar a via GP como uma adaptação para sobrevivência no intestino mamífero, um ambiente em que poliaminas existem em concentrações relativamente altas. PatA, PatD, GabT, e GabD constituem a via transaminase de degradação de putrescina (Schneider B.L. et al., 2013, 88(3):537-550).

[007] Até agora, nenhum dado foi reportado demonstrando o efeito da ruptura da via de degradação de putrescina na produção de L-aminoácidos por cepas bacterianas modificadas da família Enterobacteriaceae.

Sumário da Invenção

[008] Um aspecto da presente invenção é prover uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie E. coli, que foi modificada para romper uma via de degradação de putrescina como, por exemplo, a via putrescina glutamilada ou a via transaminase.

[009] Um outro aspecto da presente invenção é prover um método para produzir L-aminoácidos como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L- ácido aspártico, L-citrulina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina usando uma bactéria da família Enterobacteriaceae como descrito daqui em diante.

[0010] Estes objetivos foram alcançados pelos achados inesperados de que ruptura de uma via de degradação de putrescina confere ao microrganismo produtividade mais alta de L-aminoácidos, em particular, mas não se limita aos L-aminoácidos que pertencem à família do glutamato como L-arginina e L-ornitina. Por exemplo, uma via de degradação de putrescina como a via putrescina glutamilada pode ser rompida pela desregulação da expressão de pelo menos um gene que codifica uma enzima da via, em particular, inativação de um gene ou vários genes do aglomerado de genes puuADRCBE no cromossomo de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae, que pode pertencer ao gênero Escherichia e, mais especificamente, à espécie E. coli. Estes achados resultaram nos seguintes aspectos não limitativos da presente invenção.

[0011] Um aspecto da presente invenção é prover um método para produzir um L-aminoácido compreendendo: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura; e (ii) coletar dito L-aminoácido na bactéria ou meio de cultura, ou ambos, em que dita bactéria foi modificada para romper uma via de degradação de putrescina.

[0012] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a via de degradação de putrescina é uma via transaminase ou uma via putrescina glutamilada.

[0013] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a via de degradação de putrescina é rompida por atenuação da expressão de um gene selecionado do grupo que consiste em patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuC, puuD, puuE, e combinações dos mesmos.

[0014] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a via de degradação de putrescina é a via putrescina glutamilada, em que a via putrescina glutamilada é rompida por atenuação da expressão de um gene ou vários genes do aglomerado de genes puuADRCBE, com a condição de que o gene puuR não pode ser o único gene que é atenuado.

[0015] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a via de degradação de putrescina é rompida por atenuação da expressão do gene puuA ou de todo o aglomerado de genes puuADRCBE.

[0016] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a expressão do(s) gene(s) é atenuada por inativação de dito(s) gene(s).

[0017] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que dito(s) gene(s) é/são deletados.

[0018] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Escherichia.

[0019] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria é Escherichia coli.

[0020] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria pertence ao gênero Pantoea.

[0021] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que a bactéria é Pantoea ananatis.

[0022] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido é selecionado do grupo que consiste em L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L- citrulina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L-histidina, L- isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-fenilalanina, L- prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L-valina.

[0023] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido pertence à família do glutamato e é selecionado do grupo que consiste em L-arginina, L-citrulina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, L-ornitina e L-prolina.

[0024] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido é L-arginina.

[0025] É um aspecto adicional da presente invenção prover o método como descrito acima, em que o L-aminoácido é L-ornitina.

Descrição das Modalidades

[0026] A presente invenção é descrita em detalhes abaixo.

1. Bactéria

[0027] C gzrtguu«q “woc dceVfitkc rtqfwVqtc fg N-cokpqáekfq” rqfg significar uma bactéria da família Enterobacteriaceae que tem uma capacidade de produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura ou células bacterianas quando a bactéria é cultivada no meio.

[0028] C gzrtguu«q “woc dcevfitkc rtqfwvqtc fg N-cokpqáekfq” rqfg significar também uma bactéria que é capaz de produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio de cultura em uma quantidade maior do que uma cepa tipo selvagem ou precursora, como E. coli K-12, e pode significar que o microrganismo é capaz de causar acumulação em um meio de uma quantidade não inferior a 0,5 g/L, ou não inferior a 1,0 g/ L, do L-aminoácido alvo. A bactéria pode produzir um tipo de aminoácido somente, ou uma mistura de dois ou mais tipos de aminoácidos.

[0029] C gzrtguu«q “ecrcekfcfg fg rtqfw>«q fg cmipqáekfq” rqfg significar a capacidade da bactéria de produzir, excretar ou secretar, e/ou causar acumulação de um L-aminoácido em um meio ou células bacterianas em um tal nível que o L-aminoácido pode ser coletado do meio ou células dcevgtkcpcu. swcpfq c dcevfitkc fi ewnvkxcfc pq ogkq0 C gzrtguu«q “N - cokpqáekfq” pode significar L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-citrulina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e L- valina.

[0030] C gzrtguu«q “N-cokpqáekfq ctqoávkeq” rqfg kpenwkt. rqt exemplo, L-fenilalanina, L-triptofano e L-tirosina. Como a L-histidina tem wmc rqt>«q atqmávkea, gurgekfíecmgpVg, wm cpgn kmkfazqn, c gzrtguu«q “N- aminoácido atqoávkeq” rqfg kpenwkt vcodfio. cnfio fqu N-aminoácidos aromáticos mencionados acima, L-histidina.

[0031] C gzrtguu«q “N-ammoácido não aromático” rqfg kpenwkt. rqt exemplo, L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-citrulina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L-prolina, L-serina, L-treonina e L-valina. Como a via biossintética de aminoácidos aromáticos como L-fenilalanina, L- triptofano, e L-tirosina é diferente da via biossintética da L-histidina, a gzrtguu«q “N-coipqáekfq p«q ctqoávkeq” rqfg kpenwkt Vcodfio. cnfio fqu N- aminoácidos não aromáticos mencionados acima, L-histidina.

[0032] Um L-aminoácido pode pertencer a mais de uma família de L- aminoácidos. Como exemplo, L-aminoácidos que pertencem à família do glutamato incluem L-arginina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, e L-prolina; L-aminoácidos que pertencem à família da serina incluem L-cisteína, glicina, e L-serina; L-aminoácidos que pertencem à família do aspartato incluem L- asparagina, L-ácido aspártico, L-isoleucina, L-lisina, L-metionina, e L- treonina; L-aminoácidos que pertencem à família do piruvato incluem L- alanina, L-isoleucina, L-valina, e L-leucina; e L-aminoácidos que pertencem à família aromática incluem L-fenilalanina, L-triptofano, e L-tirosina. Como alguns L-aminoácidos podem ser um intermediário na via biossintética de um outro L-aminoácido, as famílias de aminoácidos mencionadas acima podem também incluir outros L-aminoácidos, por exemplo, L-aminoácidos não proteinogênicos. Por exemplo, L-citrulina e L-ornitina são aminoácidos da via biossintética de arginina. Portanto, a família do glutamato pode incluir L- arginina, L-citrulina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, L-ornitina e L-prolina.

[0033] L-arginina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-histidina, L- isoleucina, L-lisina, L-ornitina, L-fenilalanina, L-prolina, L-treonina, L- triptofano, e L-valina são exemplos particulares. Os aminoácidos da família do glutamato como L-arginina, L-citrulina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, L-ornitina, e L-prolina são exemplos específicos. L-arginina e L-ornitina são exemplos particulares.

[0034] C gzrtguu«q “N-cmkpqáeifqu” rqfg uiipifíect p«q crgpcu wo L-aminoácido em uma forma livre, mas pode também significar um sal ou hidrato do L-aminoácido, ou um aduto formado pelo L-aminoácido e um outro composto orgânico ou inorgânico como descrito daqui em diante. Sais de aminoácidos incluem sulfatos, cloridratos, carbonatos, sais de amônio, sais de sódio, e sais de potássio.

[0035] As bactérias que pertencem à família Enterobacteriaceae podem ser dos gêneros Escherichia e/ou Pantoea, e assim por diante, e podem ter a capacidade de produzir um L-aminoácido. Especificamente, aquelas classificadas na família Enterobacteriaceae de acordo com a taxonomia usada no banco de dados do NCBI (National Center for Biotechnology Information) (www.ncbi.nlm.nih.gob/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=543) podem ser usadas. Exemplos de cepas da família Enterobacteriaceae que podem ser modificadas incluem uma bactéria do gênero Escherichia, Enterobacter ou Pantoea.

[0036] Cepas de bactéria Escherichia que podem ser modificadas para obter bactérias Escherichia de acordo com a matéria atualmente descrita não são particularmente limitadas, e especificamente, aquelas descritas na obra de Neidhardt et al. podem ser usadas (Bachmann, B.J., Derivations and genotypes of some mutant derivatives of E. coli K-12, p. 2460-2488. In F.C. Neidhardt et al. (ed.), E. coli and Salmonella: cellular and molecular biology, 2a ed. ASM Press, Washington, D.C., 1996). A espécie E. coli é um exemplo particular. Exemplos específicos de E. coli incluem E. coli W3110 (ATCC 27325), E. coli MG1655 (ATCC 47076, ATCC 700926), e assim por diante, que são derivadas da cepa tipo selvagem protótipo, a cepa E. coli K- 12. Essas cepas estão disponíveis junto à, por exemplo, American Type Culture Collection (P.O. Box 159, Manassas, VA 20108, Estados Unidos da América). Isto é, números de registro são dados a cada uma das cepas, e as cepas podem ser ordenadas usando esses números de registro (consultar www.atcc.org). Os números de registro das cepas são listados no catálogo da America Type Culture Collection.

[0037] Exemplos das bactérias Enterobacter podem incluir Enterobacter agglomerans, Enterobacter aerogenes, e assim por diante. Exemplos das bactérias Pantoea podem incluir Pantoea ananatis, e assim por diante. Algumas cepas de Enterobacter agglomerans foram recentemente reclassificadas em Pantoea agglomerans, Pantoea ananatis ou Pantoea stewartii em consonância com a análise de sequência de nucleotídeos de 16S rRNA, etc. Uma bactéria que pertence a qualquer um dos gêneros Enterobacter ou Pantoea pode ser usada desde que seja uma bactéria classificada na família Enterobacteriaceae. Quando uma cepa Pantoea ananatis é criada por técnicas de engenheiramento genético, Pantoea ananatis cepa AJ13355 (FERM BP-6614), cepa AJ13356 (FERM BP-6615), cepa AJ13601 (FERM BP-7207) e derivados das mesmas podem ser usadas. Essas cepas foram identificadas como Enterobacter agglomerans quando foram isoladas, e depositadas como Enterobacter agglomerans. Entretanto, foram recentemente reclassificadas como Pantoea ananatis em consonância com o sequenciamento de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante como descrito acima.

Bactérias produtoras de L-aminoácido

[0038] Uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae e modificada para romper a via de degradação da putrescina, que é capaz de produzir um L-aminoácido, pode ser usada.

[0039] A bactéria pode ter inerentemente a capacidade de produção de L-aminoácido ou pode ser modificada para ter uma capacidade de produção de L-aminoácido usando um método de mutação ou técnicas de recombinação de DNA. A bactéria pode ser modificada para conter a via de degradação de putrescina rompida em uma bactéria que inerentemente tem a capacidade de produzir um L-aminoácido. Alternativamente, a bactéria pode ser obtida conferindo a capacidade de produzir um L-aminoácido a uma bactéria já modificada para romper a via de degradação de putrescina.

Bactérias produtoras de L-arginina

[0040] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-arginina incluem, mas não se limitam a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia como a cepa E. coli 237 (VKPM B-7925) (Pedido de Patente U.S. 2002/058315 A1) e suas cepas derivadas abrigando N-acetilglutamato sintase mutante (Patente Russa n° 2215783), cepa E. coli 328 (VKPM B-7926, EP1170358 A1), uma cepa produtora de L- arginina na qual o gene argA que codifica N-acetilglutamato sintase é introduzido (EP1170361 A1), e similares.

[0041] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-arginina podem também incluir cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam N-acetil-y-glutamilfosfato redutase (argC), ornitina acetiltransferase (argJ), N-acetilglutamato cinase (argB), N-acetilornitina aminotransferase (argD), ornitina carbamoiltransferase (argF), argininosuccinato sintase (argG), argininosuccinato liase (argH), e carbamoil fosfato sintetase (carAB).

Bactérias produtoras de L-citrulina

[0042] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-citrulina podem incluir, mas não se limitam a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia como as cepas E. coli N- acetilglutamato sintase mutantes 237/pMADS11, 237/pMADS12, e 237/pMADS13 (Patente Russa n° 2215783, Patente Europeia n° 1170361 B1, Patente U.S. n° 6790647 B2). Cepas E. coli 333 (VKPM B-8084) e 374 (VKPM B-8086), ambas abrigam carbamoil fosfato sintase resistente a realimentação mutante (Patente Russa RU2264459 C2), cepas E. coli em que c" cvkxkfcfg" fg" g-cetoglutarato é aumentada, e as atividades de ferredoxina PCFR-" tgfwvcug." rktwxcvq" ukpvcug" qw" g-cetoglutarato deidrogenase são adicionalmente modificadas (EP 2133417 A1), e cepa P. ananantis PC3uweCufjC." go" swg" cu" cvkxkfcfgu" fg" uweekpcvq" fgkftqigpcug" g" g- cetoglutarato deidrogenase são diminuídas (Pedido de Patente U.S. n° 2009286290), e similares, são exemplos adicionais.

[0043] Como a L-citrulina é um intermediário da via biossintética de L-arginina, exemplos de cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-citrulina, incluem cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-arginina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam a genes que codificam N-acetilglutamato sintase (argA), N-acetilglutamato cinase (argB), N-acetilglutamil fosfato redutase (argC), acetilornitina transaminase (argD), acetilornitina desacetilase (argE), ornitina carbamoiltransferase (argG/I), e carbamoil fosfato sintetase (carAB), e combinações das mesmas.

[0044] A bactéria produtora de L-citrulina também pode ser facilmente obtida a partir de qualquer bactéria produtora de L-arginina, por exemplo, cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), por inativação de argininosuccinato sintase codificada pelo gene argG.

Bactérias produtoras de L-cisteína

[0045] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-cisteína podem incluir, mas não se limitam a, cepas que pertencem ao gênero Escherichia, como E. coli JM15 que é transformada com diferentes alelos cysE que codificam serina acetiltransferases resistentes a realimentação (Patente U.S. 6.218.168, Patente Russa n° 2279477), E. coli W3110 tendo genes superexpressados que codificam proteínas adequadas para secretar substâncias tóxicas para células (Patente U.S. 5,972,663), cepas E. coli tendo atividade de cisteína dessulfo- hidrase diminuída (JP11155571 A2), E. coli W330 com atividade aumentada de um regulador transcricional positivo para régulon de cisteína codificado pelo gene cysB (WO0127307 A1), E. coli JM15(ydeD) (Patente U.S. n° 6.218.168), e similares.

Bactérias produtoras de L-ácido glutâmico

[0046] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-ácido glutâmico podem incluir, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia, como E. coli VL334thrC+ (EP 1172433). A E. coli VL334 (VKPM B-1641) é uma cepa auxotrófica de L-isoleucina e L-treonina tendo mutações nos genes thrC e ilvA (Patente U.S. n° 4.278.765). Um alelo tipo selvagem do gene thrC foi transferido pelo método de transdução geral usando um bacteriófago P1 crescido nas células da cepa E. coli tipo selvagem K-12 (VKPM B-7). Como resultado, foi obtida uma cepa auxotrófica de L-isoleucina VL334thrC+ (VKPM B-8961), que é capaz de produzir L-ácido glutâmico.

[0047] Exemplos de cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-ácido glutâmico podem incluir, mas não se limitam a cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-ácido glutâmico é intensificada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam glutamato deidrogenase (gdhA), glutamina sintetase (glnA), glutamato sintetase (gltAB), isocitrato deidrogenase (icdA), aconitato hidratase (acnA, acnB), citrato sintase (gltA), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), piruvato carboxilase (pyc), piruvato deidrogenase (aceEF, lpdA), piruvato cinase (pykA, pykF), fosfoenolpiruvato sintase (ppsA), enolase (eno), fosfogliceromutase (pgmA, pgmI), fosfoglicerato cinase (pgk), gliceraldeído-3-fosfato deidrogenase (gapA), triose fosfato isomerase (tpiA), frutose bifosfato aldolase (fbp), fosfofrutocinase (pfkA, pfkB), e glicose fosfato isomerase (pgi). Exemplos de cepas modificadas de modo que a expressão do gene citrato sintetase, do gene fosfoenolpiruvato carboxilase, e/ou do gene glutamato deidrogenase seja intensificada incluem os descritos em EP1078989 A2, EP955368 A2, e EP952221 A2. Exemplos de cepas precursoras, que podem ser usadas para derivar as bactérias produtoras de L-ácido glutâmico podem também incluir cepas tendo atividade diminuída ou eliminada de uma enzima que catalisa síntese de um composto que não L-ácido glutâmico por ramificação a partir de uma via de biossíntese de L-ácido glutâmico. Exemplos de tais enzimas incluem isocitrato liase (aceA), g-cetoglutarato deidrogenase (sucA), fosfotransacetilase (pta), acetato cinase (ack), aceto-hidróxi ácido sintase (ilvG), acetolactato sintase (ilvI), formato acetiltransferase (pft), lactato deidrogenase (ldh), e glutamato decarboxilase (gadAB). Bactérias que pertencem ao gênero Escherichia fghkekgpvgu"pc"cvkxkfcfg"fg"g-cetoglutarato deidrogenase e métodos para obtê-las são descritos nas Patentes U.S. 5.378.616 e 5.573.945. Especificamente, essas cepas incluem as seguintes: E. coli W3110sucA::KmR E. coli AJ12624 (FERM BP-3853) E. coli AJ12628 (FERM BP-3854) E. coli AJ12949 (FERM BP-4881)

[0048] E. coli W3110sucA::KmR é uma cepa obtida por ruptura do igpg g-egVqinwVctcVq fgkftqigpcug *fcswk go fkcpVg tgfgtkfq eqoq “igpg sucA”+ fg E. coli W3110. Essa cepa é coorngVcogpVg fgfiekgpVg fg g- cetoglutarato deidrogenase.

[0049] Outros exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico incluem as que pertencem ao gênero Escherichia e têm resistência a um antimetabólito de ácido aspártico. Essas cepas podem também ser deficientes pc cvkxkfcfg fg g-cetoglutarato deidrogenase e podem incluir, por exemplo, E. coli AJ13199 (FERM BP-5807) (Patente U.S. n° 5.908.768), FFRM P-12379, que tem adicionalmente uma capacidade de decomposição de L-ácido glutâmico baixa (Patente U.S. n° 5.393.671), AJ13138 (FERM BP-5565) (Patente U.S. n° 6.110.714), e similares.

[0050] Exemplos de bactérias produtoras de L-ácido glutâmico incluem cepas mutantes que pertencem ao gênero Pantoea que são deficientes pc"cvkxkfcfg"fg" g-cetoglutarato deidrogenase ou tem woc"cvkxkfcfg"fg"g- cetoglutarato deidrogenase diminuída, e pode ser obtida como descrito acima. Tais cepas incluem Pantoea ananatis AJ13356 (Patente U.S. n° 6.331.419). Pantoea ananatis AJ13356 foi depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (NITE-IPOD), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba-ken 292-0818, JAPÃO) em 19 de fevereiro de 1998 sob um número de acesso de FERM P-16645. Ela foi então convertida para um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 11 de janeiro de 1999 e recebeu um número de acesso de FERM BP-6615. Pantoea ananatis AJ13356 é deficiente pc"cvkxkfcfg"fg" g- cetoglutarato deidrogenase como resultado da ruptura do gene de subunidade gMIFJ-E1 (sucA). A cepa acima foi identificada como Enterobacter agglomerans quando foi isolada e depositada como a Enterobacter agglomerans AJ13356. Entretanto, foi recentemente reclassificada como Pantoea ananatis em consonância com o sequenciamento de nucleotídeo de 16S rRNA e assim por diante. Embora a AJ13356 tenha sido depositada no depositório mencionado acima como Enterobacter agglomerans, para os fins deste relatório descritivo, elas são descritas como Pantoea ananatis. Bactérias produtoras de L-histidina

[0051] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-histidina podem incluir, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como E. coli cepa 24 (VKPM B-5945, RU2003677), E. coli cepa 80 (VKPM B-7270, RU2119536), E. coli NRRL B-12116 - B12121 (Patente U.S. n° 4.388.405), E. coli H-9342 (FERM BP-6675) e H-9343 (FERM BP-6676) (Patente U.S. n° 6.344.347), E. coli H-9341 (FERM BP-6674) (EP1085087), E. coli AI80/pFM201 (Patente U.S. n° 6.258.554), e similares.

[0052] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-histidina podem também incluir cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-histidina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem genes que codificam ATP fosforibosiltransferase (hisG), fosforibosil-AMP ciclo- hidrolase (hisI), fosforibosil-AMP ciclo-hidrolase/fosforibosil-ATP pirofosfatase (hisIE), fosforibosilformimino-5-aminoimidazol carboxamida ribotida isomerase (hisA), amidotransferase (hisH), histidinol fosfato aminotransferase (hisC), histidinol fosfatase (hisB), histidinol deidrogenase (hisD), e assim por diante.

[0053] Sabe-se que as enzimas biossintéticas de L-histidina codificadas por hisG e hisBHAFI são inibidas por L-histidina, e, portanto, a capacidade de produção de L-histidina pode também ser eficientemente intensificada introduzindo uma mutação na ATP fosforibosiltransferase para conferir resistência à inibição de realimentação (Patente Russa nos 2003677 e 2119536).

[0054] Exemplos específicos de cepas tendo uma capacidade de produção de L-histidina incluem E. coli FERM-P 5038 e 5048 que foram transformadas com um vetor transportando um DNA que codifica uma enzima biossintética de L-histidina (JP 56-005099 A), cepas de E. coli transformadas com rht, um gene para exportação de aminoácido (EP1016710A), E. coli cepa 80 conferida com resistência à sulfaguanidina, DL-1,2,4-triazol-3-alanina, e estreptomicina (VKPM B-7270, RU2119536), e E. coli MG1655+his Gr jkuN^ArwtT (RU2119536 e Doroshenko V. G. et al., The directed modification of Escherichia coli MG1655 to obtain histidine- producing mutants, Prikl. Biochim. Mikrobiol. (Russian), 2013, 49(2):149- 154.), e assim por diante. Bactérias produtoras de L-isoleucina

[0055] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-isoleucina podem incluir, mas não se limitam a mutantes tendo resistência a 6-dimetilaminopurina (JP 5-304969 A), mutantes tendo resistência a um análogo de isoleucina como tiaisoleucina e isoleucina hidroxamato, e mutantes adicionalmente tendo resistência a DL- etionina e/ou arginina hidroxamato (JP 5-130882 A). Além disso, cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas na biossíntese de L-isoleucina, como treonina deaminase e aceto-hidrato sintase, podem também ser usadas como cepas precursoras (JP 2-458 A, EP0356739 A1, e Patente U.S. n° 5.998.178). Bactérias produtoras de L-leucina

[0056] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-leucina podem incluir, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como cepas de E. coli resistentes a leucina (por exemplo, a cepa 57 (VKPM B-7386, Patente U.S. n° 6.124.121)) ou análogos de leucina incluindo β-2-tienilalanina, 3- hidroxileucina, 4-azaleucina, 5,5,5-trifluoroleucina (JP 62-34397 B e JP 870879 A), cepas de E. coli obtidas pelo método de engenheiramento de gene descrito em WO96/06926, E. coli H-9068 (JP 8-70879 A), e similares.

[0057] A bactérias pode ser melhorada por intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-leucina. Exemplos incluem genes do operon leuABCD, que pode ser representado por um gene leuA mutante que codifica isopropilmalato sintase livre de inibição de realimentação por L-leucina (Patente U.S. n° 6.403.342). Além disso, a bactéria pode ser melhorada por intensificação da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas que excretam L-aminoácido da célula bacteriana. Exemplos de tais genes incluem b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

Bactérias produtoras de L-lisina

[0058] Exemplos de bactérias produtoras de L-lisina que pertencem à família Escherichia incluem mutantes tendo resistência a um análogo de L- lisina. O análogo de L-lisina inibe o crescimento de bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, mas essa inibição é completa ou parcialmente dessensibilizada quando L-lisina está presente no meio. Exemplos do análogo de L-lisina incluem, mas não se limitam a oxalisina, lisina hidroxamato, S-(2- aminoetil)-L-ekuVgíPC *CGE+. y-metil-nkukpc, g-clorocaprolactama, e assim por diante. Mutantes tendo resistência a esses análogos de lisina podem ser obtidos submetendo bactérias que pertencem ao gênero Escherichia a um tratamento de mutagênese artificial convencional. Exemplos específicos de cepas bacterianas úteis para a produção de L-lisina incluem E. coli AJ11442 (FERM BP-1543, NRRL B-12185; ver Patente U.S. n° 4.346.170) e E. coli VL611. Nesses microrganismos, a inibição de realimentação de aspartocinase por L-lisina é dessensibilizada.

[0059] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-lisina também incluem, mas não se limitam a cepas em que a expressão de um ou mais genes que codificam uma enzima biossintética de L-lisina é intensificada. Exemplos de tais genes incluem, mas não se limitam a genes que codificam di-hidrodipicolinato sintase (dapA), aspartocinase (lysC), di-hidrodipicolinato redutase (dapB), diaminopimelato decarboxilase (lysA), diaminopimelato deidrogenase (ddh) (Patente U.S. n° 6.040.160), fosfoenolpiruvato carboxilase (ppc), aspartato semialdeído deidrogenase (asd), e aspartase (aspA) (EP1253195 A1). Além disso, as cepas precursoras podem ter um nível aumentado de expressão do gene envolvido em eficiência de energia (cyo) (EP1170376 A1), o gene que codifica nicotinamida nucleotídeo trans-hidrogenase (pntAB) (Patente U.S. n° 5.830.716), o gene ybjE (WO2005/073390), ou combinações dos mesmos.

[0060] Bactérias produtoras de L-aminoácido podem ter atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que catalisa uma reação que causa uma ramificação da via de biossíntese de L-aminoácido e resulta na produção de um outro composto. Além disso, as bactérias podem ter atividade reduzida ou nenhuma atividade de uma enzima que atua negativamente na síntese ou acumulação de L-aminoácido. Exemplos de tais enzimas envolvidas na produção de L-lisina incluem homoserina deidrogenase, lisina decarboxilase (cadA, ldcC), enzima málica, e assim por diante, e cepas em que atividades dessas enzimas são diminuídas ou deletadas são descritas em WO95/23864, WO96/17930, WO2005/010175, e assim por diante.

[0061] A expressão de ambos os genes cadA e ldcC que codificam lisina decarboxilase pode ser diminuída a fim de diminuir ou deletar a atividade de lisina decarboxilase. A expressão de ambos os genes pode ser diminuída, por exemplo, pelo método descrito em WO2006/078039.

[0062] A expressão de bactérias produtoras de L-lisina pode incluir a cepa E. coli YE3%ΔecfCΔnfeE1rEADF4 *YQ4228129:25^ A egra foi construída por introdução do plasmídeo pCABD2 contendo genes de biossíntese de lisina (Patente U.S. n° 6.040.160) na cepa WC196 tendo genes cadA e ldcC rompidos que codificam lisina carboxilase.

[0063] A cepa WC196 foi criada a partir da cepa W3110, que foi derivada de E. coli K-12 por reposição do gene lysC tipo selvagem no cromossomo da cepa W3110 com um gene lysC mutante que codifica uma aspartocinase III mutante em que treonina na posição 352 foi reposta com isoleucina, resultando em dessensibilização da inibição de realimentação por L-lisina (Patente U.S. n° 5.661.012), e conferindo resistência a AEC à cepa resultante (Patente U.S. n° 5.827.698). A cepa WC196 foi designada E. coli AJ13069, depositada no National Institute of Bioscience and HumanTechnology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (NITE-IPOD), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu- shi, Chiba-ken 292-0818, JAPÃO) em 6 de dezembro de 1994, e atribuída um número de acesso de FERM P-14690. Ela foi então convertida para um depósito internacional sob as disposições do Tratado de Budapeste em 29 de setembro de 1995 e atribuída um número de acesso de FERM BP-5252 (Patente U.S. n° 5.827.698).

[0064] C egrc YE3;8ΔecfCΔnfeE rtqrtkcogpVg fkVc fi Vcodfio wo exemplo de bactéria produtora de L-nkukpCo C YE3;8ΔecfCΔnfeE fok designada AJ110692 e depositada no National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (atualmente, Incorporated Administrative Agency, National Institute of Technology and Evaluation, International Patent Organism Depositary (NITE-IPOD), #120, 2-5-8 Kazusakamatari, Kisarazu- shi, Chiba-ken 292-0818, JAPÃO) em 7 de outubro de 2008 como um depósito internacional sob um número de acesso de FERM BP-11027. Bactérias produtoras de L-metionina

[0065] Exemplos de bactérias produtoras de L-metionina e cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L- metionina incluem, mas não se limitam a cepas de bactérias Escherichia como as cepas AJ11539 (NRRL B-12399), AJ11540 (NRRL B-12400), AJ11541 (NRRL B-12401) AJ 11542 (NRRL B-12402) (patente GB2075055); cepas 218 (VKPM B-8125) (patente RU2209248) e 73 (VKPM B-8126) (patente RU2215782) resistentes a norleucina, o análogo de L-metionina, ou similares. A cepa E. coli 73 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscou, 1o Dorozhny Proedz, 1) em 14 de maio de 2001 sob o número de acesso VKPM B-8126, e foi convertida para um depósito internacional sob o Tratado de Budapeste em 1 de fevereiro de 2002. Adicionalmente, cepa deficiente de repressor de metionina e cepas recombinantes transformadas com genes que codificam proteínas envolvidas em biossíntese de L-metionina como homoserina Vtcpuweemücug g ekuVcVkqnknc y-sintase (JP 2000-139471 A) podem também ser usadas como cepas precursoras. Bactérias produtoras de L-ornitina

[0066] A bactéria produtora de L-ornitina pode ser facilmente obtida a partir de bactéria produtora de L-arginina, por exemplo cepa E. coli 382 (VKPM B-7926), por inativação de ornitina carbamoiltransferase codificada pelos genes argF e argI. Métodos para inativação de ornitina carbamoiltransferase são descritos aqui.

Bactérias produtoras de L-fenilalanina

[0067] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-fenilalanina incluem, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como E. coli AJ12739 (tyrA::Tn10, tyrR) (VKPM B-8197), E. coli HW1089 (ATCC 55371) abrigando o gene pheA34 mutante (Patente U.S. n° 5.354.672), E. coli MWEC101-b (KR8903681), E. coli NRRL B-12141, NRRL B-12145, NRRL B-12146 e NRRL B-12147 (Patente U.S. n° 4.407.952). Além disso, E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAB (FERM BP-3566), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHAD] (FERM BP-12659), E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pPHATerm] (FERM BP-12662), e E. coli K-12 [W3110 (tyrA)/pBR-aroG4, pACMAB] denominada AJ 12604 (FERM BP-3579) podem ser usadas como uma cepa precursora (EP488424 B1). Adicionalmente, bactérias produtoras de L- fenilalanina que pertencem ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína codificada pelo gene yedA ou gene yddG podem também ser usadas (pedidos de patente U.S. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

Bactérias produtoras de L-prolina

[0068] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como E. coli 702ilvA (VKPM B-8012), que é deficiente no gene ilvA e é capaz de produzir L-prolina (EP1172433 A1). A bactéria pode ser melhorada por intensificação da expressão de um ou mais genes envolvidos na biossíntese de L-prolina. Exemplos de genes que podem ser usados nas bactérias produtoras de L-prolina incluem o gene proB que codifica glutamato cinase com inibição de realimentação dessensibilizada por L-prolina (DE3127361 A1). Além disso, a bactéria pode ser melhorada por intensificação da expressão de um ou mais genes que codificam proteínas responsáveis por excretar L-aminoácidos da célula bacteriana. Tais genes podem ser exemplificados por b2682 e b2683 (genes ygaZH) (EP1239041 A2).

[0069] Exemplos de bactérias que pertencem ao gênero Escherichia, que têm uma atividade para produzir L-prolina incluem as seguintes cepas de E. coli: NRRL B-12403 e NRRL B-12404 (Patente GB 2075056), VKPM B- 8012 (pedido de patente russa n° 2000124295), mutantes de plasmídeo descritos em DE3127361 A1, mutantes de plasmídeo descritos por Bloom H0T0 gV cL go “Vjg 37th Okcok ykpVgt u{orqukwo”. 3;:5. ^56, e ukokLcteUo Bactérias produtoras de L-treonina

[0070] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-prolina incluem, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como E. coli TDH-6/pVIC40 (VKPM B-3996) (Patente U.S. n° 5.175.107, Patente U.S. n° 5.705.371), E. coli 472T23/pYN7 (ATCC 98081) (Patente U.S. n° 5.631.157), E. coli NRRL- 21593 (Patente U.S. n° 5.939.307), E. coli FERM BP-3756 (Patente U.S. n° 5.474.918), E. coli FERM BP-3519 e FERM BP-3520 (Patente U.S. n° 5.376.538), E. coli MG442 (Gusyatiner et al., Genetika (Russian), 1978, 14:947-956), E. coli VL643 e VL2055 (EP1149911 A2), e similares.

[0071] A cepa TDH-6 é deficiente no gene thrC, além de ser assimiladora de sacarose, e o gene ilvA tem uma mutação hipomórfica. Essa cepa também tem uma mutação no gene rhtA, que confere resistência a altas concentrações de treonina ou homoserina. A cepa B-3996 contém o plasmídeo pVIC40 que foi obtido por inserção de um operon thrA*BC que inclui um gene thrA mutante em um vetor derivado de RSF1010. Esse gene thrA mutante codifica aspartocinase homoserina deidrogenase I que tem inibição de realimentação substancialmente dessensibilizada por treonina. A cepa B-3996 foi depositada em 19 de novembro de 1987 na All-Union Scientific Center of Antibiotics (Russian Federation, 117105 Moscow, Nagatinskaya Street 3-A) sob o número de acesso RIA 1867. A cepa foi também depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1o Dorozhny proezd, 1) em 7 de abril de 1987 sob o número de acesso B-3996.

[0072] E. coli VKPM B-5318 (EP05933792 A1) pode também ser usada como uma cepa precursora para derivar bactérias produtoras de L- treonina. A cepa B-5318 é prototrófica em relação à isoleucina; e um repressor C1 fago lambda sensível à temperatura e promotor PR repõem a região reguladora do operon de treonina no plasmídeo pVIC40. A cepa VKPM B-5318 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) em 3 de maio de 1900 sob o número de acesso de VKPM B-5318.

[0073] A bactéria pode ser adicionalmente modificada para intensificar a expressão de um ou mais dos seguintes genes: - o gene thrA mutante que codifica aspartocinase homoserina deidrogenase I resistente à inibição de realimentação por treonina; - o gene thrB que codifica homoserina cinase; - o gene thrC que codifica treonina sintase; - o gene rhtA que codifica uma proteína transmembranar putativa do sistema de efluxo de homoserina e treonina; - o gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido deidrogenase; e - o gene aspC que codifica aspartato aminotransferase (aspartato transaminase).

[0074] O gene thrA que codifica aspartocinase I e homoserina deidrogenase I de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b0002; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 337 a 2.799; ID do gene: 945803). O gene thrA é localizado entre os genes thrL e thrB no cromossomo de E. coli K-12.

[0075] O gene thrB que codifica homoserina cinase de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b0003; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 2.801 a 3.733; ID do gene: 947498). O gene thrB é localizado entre os genes thrA e thrC no cromossomo de E. coli K-12.

[0076] O gene thrC que codifica treonina sintase de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b0004; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 3.734 a 5.020; ID do gene: 945198). O gene thrC é localizado entre os genes thrB e yaaX no cromossomo de E. coli K-12. Todos os três genes funcionam como um único operon de treonina thrABC. Para intensificar a expressão do operon de treonina, a região atenuadora que afeta a transcrição é desejavelmente removida do operon (WO2005049808 A1, WO2003097839 A1).

[0077] O gene thrA mutante que codifica aspartocinase I e homoserina deidrogenase I resistente à inibição de realimentação por L- treonina, assim como os genes thrB e thrC, pode ser obtido como um operon do plasmídeo bem-conhecido pVIC40 que está presente na cepa de E. coli produtora de L-treonina VKPM B-3996. O plasmídeo pVIC40 é descrito em detalhes na Patente U.S. 5.705.371.

[0078] O gene rhtA que codifica uma proteína do sistema de efluxo de homoserina e treonina (um transportador de membrana interno) de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b0813; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 848.433 a 849.320, complemento; ID do gene: 947045). O gene rhtA é localizado entre os genes dps e ompX no cromossomo de E. coli K-12 próximo ao operon glnHPQ, que codifica componentes do sistema de transporte de glutamina. O gene rhtA é idêntico ao gene ybiF (inscrição KEGG n° B0813).

[0079] O gene asd que codifica aspartato-β-semialdeido deidrogenase de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b3433; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 3.571.798 a 3.572.901, complemento; ID do gene: 947939). O gene asd é localizado entre os genes glgB e gntU na mesma fita (gene yhgN na fita oposta) no cromossomo de E. coli K-12.

[0080] Além disso, o gene aspC que codifica aspartato aminotransferase de E. coli foi elucidado (inscrição KEGG n° b0928; n° de acesso no Banco de Gene NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 983.742 a 984.932, complemento; ID do gene: 945553). O gene aspC é localizado entre o gene ycbL na fita oposta e o gene ompF na mesma fita no cromossomo de E. coli K-12. Bactérias produtoras de L-triptofano

[0081] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-triptofano incluem, mas não se limitam a cepas que pertencem ao gênero Escherichia como E. coli JP4735/pMU3028 (DSM10122) e JP6015/pMU91 (DSM10123) deficiente na triptofanil-tRNA sintetase codificada pelo gene trpS mutante (Patente U.S. n° 5.756.345), E. coli SV164 (pGH5) tendo um alelo serA que codifica fosfoglicerato deidrogenase livre de inibição de realimentação por serina e um alelo trpE que codifica antranilato sintase livre de inibição de realimentação por triptofano (Patente U.S. n° 6.180.373), E. coli AGX17 (pGX44) (NRRL B- 12263) e AGX6(pGX50)aroP (NRRL B-12264) deficiente na enzima triptofanase (Patente U.S. n° 4.371.614), E. coli AGX17/pGX50,pACKG4- pps em que uma capacidade de produção de fosfoenolpiruvato é intensificada (WO9708333, Patente U.S. n° 6.319.696), e similares podem ser usadas. Bactérias produtoras de L-triptofano que pertencem ao gênero Escherichia com uma atividade intensificada da proteína identificada codificada pelo gene yedA ou gene yddG podem também ser usadas (pedidos de patente U.S. 2003/0148473 A1 e 2003/0157667 A1).

[0082] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-triptofano podem também incluir cepas em que uma ou mais atividade das enzimas selecionadas de antranilato sintase, fosfoglicerato deidrogenase, e triptofano sintase é intensificada. A antranilato sintase e fosfoglicerato deidrogenase são ambas submetidas à inibição de realimentação por L-triptofano e L-serina, de modo que uma mutação dessensibilizando a inibição de realimentação pode ser introduzida nestas enzimas. Exemplos específicos de cepas tendo tal mutação incluem uma E. coli SV164 que abriga antranilato sintase dessensibilizada e uma cepa transformante obtida por introdução do plasmídeo pGH5 na E. coli SV164 (WO 94/08031), que contém um gene serA mutante que codifica fosfoglicerato deidrogenase dessensibilizada à realimentação.

[0083] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-triptofano podem também incluir cepas em que o operon de triptofano que contém um gene que codifica antranilato sintase dessensibilizada foi introduzido (JP 57-71397 A, JP 52-244382 A, Patente U.S. 4.371.614). Além disso, a capacidade de produção de L- triptofano pode ser conferida por intensificação da expressão de um gene que codifica triptofano sintase, dentre operons de triptofano (trpBA). A triptofano sintase consiste em unidades g g β swg u«q eqfifíecfcu rgnqu igpgu trpA e trpB, respectivamente. Além disso, a capacidade de produção de L-triptofano pode ser melhorada por intensificação da expressão do operon de isocitrato liase-malato sintase (WO2005/103275).

Bactérias produtoras de L-valina

[0084] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina podem incluir, mas não se limitam a cepas que foram modificadas para superexpressar o operon ilvGMEDA (Patente U.S. n° 5.998.178). É desejável remover a região do operon ilvGMEDA que é requerida para atenuação de modo que a expressão do operon não é atenuada pela L-valina que é produzida. Adicionalmente, o gene ilvA no operon é desejavelmente rompido de modo que a atividade de treonina deaminase é diminuída.

[0085] Exemplos de cepas precursoras que podem ser usadas para derivar bactérias produtoras de L-valina podem também incluir mutantes tendo uma mutação de aminoacil-tRNA sintetase (Patente U.S. n° 5.658.766). Por exemplo, E. coli VL1970, que tem uma mutação no gene ileS que codifica isoleucina tRNA sintetase, pode ser usada. E. coli VL1970 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1o Dorozhny proezd, 1) em 24 de junho de 1988 sob o número de acesso de VKPM B-4411.

[0086] Adicionalmente, mutantes que requerem ácido lipoico para crescimento e/ou que carecem de H+-ATPase podem também ser usados como cepas precursoras (WO96/06926).

[0087] Exemplos de cepas produtoras de L-valina incluem a cepa de E. coli H-81 (VKPM B-8066), NRRL B-12287 e NRRL B-12288 (Patente U.S. n° 4.391.907), VKPM B-4411 (Patente U.S. n° 5.658.766), VKPM B- 7707 (pedido de patente europeu EP1016710A2), ou similares.

[0088] A bactéria da presente invenção que pertence à família Enterobacteriaceae pode ser modificada para romper a via de degradação de putrescina, que pode ser a via transaminase ou via putrescina glutamilada. Exemplificativa e sem limitar o escopo da presente invenção, uma via de degradação de putrescina pode ser rompida pela atenuação da expressão de pelo menos um gene que codifica uma enzima da via, em particular inativação de um gene ou vários genes do aglomerado de genes puuADRCBE, e/ou um gene ou vários genes como os genes patA, patD, gabT ou gabD no cromossomo de uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae como uma bactéria da espécie E. coli.

[0089] C gzrtguu«q “woc xkc fg fgitcfc>«q fg rwttgueknc” tgfetg-se a woc fcu ugiwkpVgu xkcu rctc fgitcfc>«q fg rwVtguekpc eqoq c “xkc Vtcnucomcug” qw “c xkc rwVtguekpc glutciiiilccfr. swg fgitcfc rwVtguekpc go succinato por meio de ácido y-aminobutírico (GABA) como explicado daqui em diante.

[0090] C gzrtguu«q “c xkc Vtcnucokncug” rctc fgitcfc>«q fg putrescina refere-se a um conjunto de reações enzimáticas consecutivas ecVclkucfcu rqt rwVtgueknc Vtcnucokncug *RcVC+. y-aminobutiraldeído deidrogenaug *RcVF+. y-aminobutirato transaminase (GabT), e semialdeído succínico deidrogenase (GabD), em que a putrescina é convertida em ácido uweeínkeq *uweeknctq+ rqt ogkq fg y-aminobutiraldeído (ABAL), GABA e semialdeído succínico (SSA) como descrito em Schneider B.L. et al., 2013, 88(3):537-550. Os genes que codificam enzimas da via transaminase de E. coli foram elucidados como patA (sinônimos oat, pat, ygjG; KEGG, Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, inscrição n° b3073; codifica PatA), patD (sinônimos prr, ydcW; KEGG, inscrição n° b1444; codifica PatD), gabT (KEGG, inscrição n° b2662; codifica GabT), e gabD (KEGG, inscrição n° b2661; codifica GabD).

[0091] C gzrtguu«q “c xkc rwttgueknc ilwtcokncfc” rctc fgitcfc>«q de putrescina refere-se a um conjunto de reações enzimáticas consecutivas ecVclkucfcu rqt y-ilwVcoklrwVtgueknc uknVcug *RwwC+. y-glutamilputrescina oxidase (PuuB). y-glutamil-y-coknqdwVktclfgífq fgkftqigncug *RwwE+. y- glutamil-y-aminobutirato hidrolase (PuuD), 4-aminobutirato aminotransferase (PuuE), em que a putrescina é convertida em ácido succínico (succinato) por ogkq"fg"y-inwvcokn"rwvtguekpc."y-inwvcokn"CDCN."y-glutamil GABA, GABA e SSA como descrito em Schneider B.L. et al., 2013, 88(3):537-550. O repressor de ligação à putrescina PuuR reprime a via putrescina glutamilada. Portanto, a atenuação da expressão do gene puuR sozinho pode resultar na intensificação da via de degradação de putrescina. Assim, a atenuação do gene puuR sozinho não é englobada na ruptura da via de degradação da putrescina.

[0092] Os genes que codificam enzimas da via putrescina glutamilada de E. coli foram elucidados como puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR como descrito daqui em diante. Esses genes são organizados no aglomerado de genes puuADRCBE no cromossomo da cepa de E. coli K-12.

[0093] O gene puuA (sinônimo ycjK+" eqfkhkec" y-glutamilputrescina sintase PuuA (KEGG, inscrição n° b1297; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P78061). O gene puuA (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1357514 a 1358932, complemento; ID do gene: 946202) é localizado entre o gene puuP na mesma fita e o gene puuD na fita oposta no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene puuA e a sequência de aminoácidos da proteína PuuA codificada pelo gene puuA são mostradas na SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2, respectivamente.

[0094] O gene puuD (sinônimo ycjL) codifica y-glutamil-y- aminobutirato hidrolase PuuD (KEGG, inscrição n° b1298; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P76038). O gene puuD (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1359144 a 1359908, complemento; ID do gene: 945882) é localizado entre o gene puuR na mesma fita e o gene pupP na fita oposta no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene puuD e a sequência de aminoácidos da proteína PuuD codificada pelo gene puuD são mostradas na SEQ ID NO: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente.

[0095] O gene puuR (sinônimo ycjC) codifica o repressor transcricional de ligação ao DNA para o divergon de puu PuuR (KEGG, inscrição n° b1299; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P0A9U6). O gene puuD (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1359935 a 1360492, complemento; ID do gene: 945886) é localizado entre os genes puuD e puuC na mesma fita no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene puuR e a sequência de aminoácidos da proteína PuuR codificada pelo gene puuR são mostradas na SEQ ID NO: 5 e SEQ ID NO: 6, respectivamente.

[0096] O gene puuC (sinônimo aldH) codifica y-glutamil-y- aminobutiraldeído deidrogenase PuuC (KEGG, inscrição n° b1300; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P23883). O gene puuC (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1360767 a 1362254, complemento; ID do gene: 947003) é localizado entre os genes puuR e puuB na mesma fita no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene puuC e a sequência de aminoácidos da proteína PuuC codificada pelo gene puuC são mostradas na SEQ ID NO: 7 e SEQ ID NO: 8, respectivamente.

[0097] O gene puuB (sinônimo ycjA, ordL) codifica y- glutamilputrescina oxidase PuuB (KEGG, inscrição n° b1301; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P37906). O gene puuB (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1362256 a 1363536, complemento; ID do gene: 945072) é localizado entre os genes puuC e puuB na mesma fita no cromossomo da cepa de E. coli K-12. A sequência de nucleotídeos do gene puuB e a sequência de aminoácidos da proteína PuuB codificada pelo gene puuB são mostradas na SEQ ID NO: 9 e SEQ ID NO: 10, respectivamente.

[0098] O gene puuE (sinônimo goaG) codifica a 4-aminobutirato aminotransferase PuuE (KEGG, inscrição n° b1302; Protein Knowledgebase, UniProtKB/Swiss-Prot, n° de acesso P50457). O gene puuB (n° de acesso no Banco de Gene n° NC_000913.2; posições de nucleotídeo: 1363574 a 1364839, complemento; ID do gene: 945446) é localizado entre o puuB na mesma fita e o gene pspF na fita oposta no cromossomo da cepa de E. coli K- 12. A sequência de nucleotídeos do gene puuE e a sequência de aminoácidos da proteína PuuE codificada pelo gene puuE são mostradas na SEQ ID NO: 11 e SEQ ID NO: 12, respectivamente.

[0099] Woc “vic”, swg rqfg Vcodfio ugt referifc eqoq woc “xic dkqswiokec” qw woc “xic oeVcd„niec”, rqfe uiipifiect um conjunto de reações (bio)químicas anabólicas ou catabólicas para converter uma espécie de diqoqnfiewnc eo woc qwVtco Cuuio, c “xic” rqfe ipenwit woc ufitie fe tec>õeu (bio)químicas conectadas por seus intermediários, isto é, um ou mais produtos de uma reação é/são o(s) substrato(s) para uma ou mais reações subsequentes, e assim por diante. Q uiipihiecfq fc ezrteuu«q “xic” fi ietcnoepve cparente para a pessoa versada na técnica.

[00100] C ezrteuu«q “woc dcevfitic oqfihiecfc rctc tqoret woc xic fe feitcfc>«q fe rwVteueipc” rqfe uiipifiear swe c dceVfitic foi modificada de tal modo que na bactéria modificada o fluxo de carbono através de uma ou mais reações (bio)químicas da via é menor ou até mesmo ausente em comparação com uma bactéria em que a via de degradação de putrescina não é rompida como em uma bactéria não modificada, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou precursora como E. coli K-12. Na bactéria, que foi modificada para romper a via de degradação de putrescina, o fluxo de carbono através de uma ou mais reações (bio)químicas da via pode ser 99% ou menor, 95% ou menor, 90% ou menor, 85% ou menor, 80% ou menor, 75% ou menor, 70% ou menor, 65% ou menor, 60% ou menor, 55% ou menor, 50% ou menor, 45% ou menor, 40% ou menor, 35% ou menor, 30% ou menor, 25% ou menor, 20% ou menor, 15% ou menor, 10% ou menor, 5% ou menor, ou 0%, em comparação com o fluxo de carbono na via de uma bactéria não modificada.

[00101] C gzrtguu«q “flwzq fg ectdqpq” rqfg ukipkfiect a taxa de volume de moléculas contendo carbono através de uma via metabólica. Por exemplo, o fluxo de carbono de um aminoácido como, por exemplo, L- arginina ou L-ornitina, pode ser calculado para determinar distribuição de carbono do L-aminoácido em uma via de degradação de putrescina como a via transaminase ou via putrescina glutamilada (Szyperski T. Biosynthetically directed fractional 13C-labeling of proteinogenic amino acids. An efficient analytical tool to investigate intermediate metabolism, Eur. J. Biochem., 1995, 232:433-448; Stephanopoulos, G., Aristidou, A.A., Nielsen, J. Metabolic engineering: principles and methodologies, Academic Press, 1o ed., (1998); Matsuoka Y. and Shimizu K. 13C-Metabolic flux analysis and metabolic regulation, Chemical Biology, Prof. Deniz Ekinci (Ed.), DOI: 10.5772/35121, http://www.intechopen.com/books/chemical-biology/13c- metabolic-flux-analysis-and-metabolic-regulation).

[00102] C gzrtguu«q “woa dceVfitkc oqfkfiecfc rctc tqorgt xkc fg degradação fg rwvtguekpc” rqfg vcodfio ukipkhkect que a bactéria foi modificada de tal modo que a via de degradação de putrescina é atenuada na bactéria modificada.

[00103] C gzrtguu«q “a via de degradação de putrescina é atenuada na dcevfitkc oqfkhkecfc” rqfg ukipkhkect que a bactéria foi modificada de tal modo que na bactéria modificada a expressão de pelo menos um gene que codifica uma enzima da via de degradação de putrescina é atenuada. Por exemplo, a expressão de um gene ou vários genes selecionados de patA, patD, gabT e gabD, enzimas codificadoras da via transaminase, pode ser atenuada. Em um outro exemplo, a expressão de um ou vários dos genes puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR, enzimas codificadoras da via putrescina glutamilada, pode ser atenuada. Em ainda um outro exemplo, a expressão de um ou vários dos genes patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR pode ser atenuada. Uma combinação de genes, cuja expressão pode ser atenuada para romper a via de degradação de putrescina, não é especificamente limitada desde que a atenuação de um gene ou vários genes resulte na ruptura da via. Isto é, a expressão de um ou vários dos genes patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD e puuE pode ser atenuada em qualquer combinação para romper a via de degradação de putrescina desde que a bactéria tenha capacidade de produção de L-aminoácido. Por exemplo, a expressão de um gene como, por exemplo, puuA pode ser atenuada, ou todos os genes puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR, constituindo todo o aglomerado de genes puuADRCBE, pode ser atenuada para romper a via de degradação de putrescina. Entretanto, a atenuação do gene puuR não é essencial para ruptura da via de degradação de putrescina.

[00104] C gzrtguu«q “xátiqu igpgu” rqfg uiipifíeat fqku qw ocku igpgu como, por exemplo, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove ou dez genes, ou oaiUo Rqrtaptq, a gzrtguu«q “wo qw xátiqu igpgu” rqfg uiipifíeat wo úpieq gene como, por exemplo, o gene puuA, ou um operon como, por exemplo, o operon puuCBE, ou até mesmo um aglomerado de genes inteiro como, por exemplo, o aglomerado de genes puuADRCBE como descrito aqui. É, portanto, aegitáxgn swg au gzrtguuõgu “wo qw xátiqu igpgu” g “rgnq ogpqs um igpg” u«q gswixangpvgu0

[00105] Para os fins da presente invenção, explicações dadas daqui em diante para proteínas e genes que codificam as mesmas da via putrescina glutamilada podem ser aplicadas mutatis mudandis a proteínas e genes que codificam as mesmas da via transaminase. Adicionalmente, para os fins da presente invenção, explicações dadas daqui em diante para o aglomerado de genes puuADRCBE podem ser aplicadas mutatis mudandis a um ou vários dos genes patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD e puuE, ou uma combinação dos mesmos.

[00106] A expressão “woc dceVfitkc oqfkfíecfc rctc cVgpwct gzrtguu«q de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE” rqfg significar que a bactéria foi modificada de tal modo que na bactéria modificada, a expressão de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE é diminuída em comparação a uma bactéria que contém um aglomerado de genes puuADRCBE não modificado, por exemplo, uma cepa tipo selvagem ou precursora.

[00107] C gzrtguu«q “cVgpwc>«q” qw “cVgpwcfq” rqfg ukipkfiect a alteração ou modificação de pelo menos um gene em uma bactéria que codifica uma enzima da via de degradação de putrescina, de modo que uma quantidade ou atividade de uma ou mais enzimas na bactéria é diminuída ou ausente, assim diminuindo ou eliminando completamente a atividade dos produtos de gene.

[00108] C gzrtguu«q “rgnq ogpqu wo igpg fq cinqogtcfq fg igpgu puuADRCBE fi kpcvkxcfq” rqfg ukipkhkect swg rgnq ogpqu wo fqu igpgu eqoq puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR do aglomerado de genes modificado codifica uma proteína completamente inativa ou não funcional, em comparação com uma bactéria que contém o gene não modificado ou aglomerado de genes puuADRCBE não modificado.

[00109] Também é possível que pelo menos uma das regiões de DNA modificadas seja incapaz de expressar naturalmente o gene devido à deleção de uma parte do gene ou deleção do gene inteiro, reposição de uma base ou mais para causar uma substituição de aminoácido na proteína codificada pelo gene (mutação de sentido trocado), introdução de um códon de terminação (mutação sem sentido), deleção de uma ou duas bases para causar um desvio do quadro de leitura do gene, inserção de um gene de resistência à droga e/ou sinal de terminação de transcrição, ou modificação de uma região adjacente do gene, incluindo sequencias controlando a expressão de gene como promotor(es), intensificador(es), atenuador(es), sítio(s) de ligação de ribossomo (RBS), etc. Inativação de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE pode também ser realizada, por exemplo, por métodos convencionais como um tratamento de mutagênese usando irradiação UV ou nitrosoguanidina (N-metil-PÓ-nitro-N-nitrosoguanidina), mutagênese direcionada por sítio, ruptura de gene usando recombinação homologa, e/ou mutagênese de inserção-deleção (Yu D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(11):5978-5983; Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645; Zhang Y. et al., Nature Genet., 1998, 20:123-34:+ eqo dcug go “kpVgitc>«q cekqpcfc rqt TgfIGV” qw “kpVgitc>«q mediada por XTgfIGV”

[00110] C gzrtguu«q “rgnq ogpqu wo igpg fq c^qogtcfq fg igpgu puuADRCBE fi cvgpwcfq” rqfg vcodfio ukipkhkect swg c dcevfitkc oqfkhkecfc contém uma ou mais regiões operativamente ligadas a um ou mais genes do aglomerado de genes puuADRCBE como promotores, intensificadores, atenuadores e sinais de terminação de transcrição, sítios de ligação a ribossomos (RBS), e outros elementos de controle de expressão, que são modificados resultando em uma diminuição no nível de expressão de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE; e outros exemplos (ver, por exemplo, WO95/34672; Carrier T.A. and Keasling J.D., Biotechnol. Prog., 1999, 15:58-86+o C gzrtguu«q “qrgtcVkxcogpVg nkicfc cq igpg” fi wo gxgmplq gurgekfieq fc gzrtguu«q “qrgtcVkxcogpVg nkicfc c wo qw ocku igpgu” e pode significar que a(s) região(ões) reguladora(s) é/são ligada(s) à sequência de nucleotídeo da molécula de ácido nucleico ou gene em uma maneira que permite expressão (por exemplo, expressão intensificada, aumentada, constitutiva, basal, antiterminada, atenuada, desregulada, diminuída ou reprimida) da sequência de nucleotídeo, especificamente, expressão de um produto de gene codificado pela sequência de nucleotídeo.

[00111] A expressão de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE pode ser atenuada por reposição de uma sequência de controle de expressão do gene, como um promotor no DNA cromossômico, por uma mais fraca. A força de um promotor é definida pela frequência de atos de iniciação de síntese de RNA. Exemplos de métodos para avaliar a força de promotores e promotores fortes são descritos em Goldstein M.A. et al. (Goldstein M.A. and Doi R.H., Prokaryotic promoters in biotechnology, Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1:105-128), e assim por diante. Adicionalmente, é também possível introduzir uma substituição de nucleotídeo para vários nucleotídeos em uma região de promotor de um gene alvo e assim modificar o promotor a ser enfraquecido como descrito na Publicação de Patente Internacional WO00/18935. Adicionalmente, sabe-se que a substituição de vários nucleotídeos na sequência Shine-Dalgarno (SD), e/ou no espaçador entre a sequência SD e o códon de iniciação, e/ou uma sequência imediatamente a montante e/ou a jusante do códon de iniciação no sítio de ligação ao ribossomo (RBS) afeta bastante a eficiência de tradução de mRNA. Essa modificação do RBS pode ser combinada com a diminuição da tradução de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE. A expressão de pelo menos um gene do aglomerado de genes puuADRCBE pode também ser atenuada por inserção de um transpóson ou uma sequência de inserção (IS) na região de codificação do gene (Patente U.S. n° 5.175.107) ou na região que controla a expressão de genes, ou por métodos convencionais como mutagênese com irradiação ultravioleta (UV) ou nitrosoguanidina (N- metil-PÓ-nitro-N-nitrosoguanidina). Adicionalmente, a incorporação de uma mutação específica de local pode ser conduzida por métodos de edição cromossômica conhecidos com base, por exemplo em recombinação mediada rqtXTgfIGVo

[00112] O número de cópia, presença ou ausência de um gene do aglomerado de genes puuADRCBE do aglomerado inteiro pode ser medido, por exemplo, restringindo o DNA cromossômico seguido de Southern blotting usando uma sonda com base na sequência de genes, hibridização fluorescente in situ (FISH), e similares. O nível de expressão de gene pode ser determinado por medição da quantidade de mRNA transcrito do gene usando vários métodos bem-conhecidos, incluindo Northern blotting, RT-PCR quantitativo, e similares. A quantidade de proteína codificada pelo gene pode ser medida por métodos conhecidos incluindo SDS-PAGE seguido de ensaio de imunomarcação (análise por Western blot), ou análise por espectrometria de massa das amostras de proteína, e similares.

[00113] Métodos para manipulação com moléculas recombinantes de DNA e clonagem molecular como preparação de DNA plasmídico, digestão, ligação e transformação de DNA, seleção de um oligonucleotídeo como iniciador, incorporação de mutações, e similares podem ser métodos comuns bem-conhecidos da pessoa versada na técnica. Esses métodos são descritos, por exemplo, em Sambrook Lo. HtkVuej G.H. cpf OcnkcVku V., “Oqngewnct Enqpkpi< C NcdqtcVqt{ Ocnwcn”, 4a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press *3;:;+ qt Itggn O0T0 cnf Ucodtqqm L.T., “Oqngewnct Enqnkni< C Naboratory Ocnwcn”, 6th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (2012); Bernard R. Inkem, Lcem L. Rcuvgtncm cnf Ejgt{n N. Rcvvgn, “Oqngewnct Dkqvgejnqnqi{< principles and applications of recombinant DNA”, 6th ed., Washington, DC, ASM Press (2009).

[00114] Como explicado acima, os genes que codificam enzimas da via transaminase (patA, patD, gabT e gabD) e da via putrescina glutamilada (puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e puuR) de E. coli foram elucidados. Para os fins da presente invenção, explicações dadas daqui em diante para os genes do aglomerado de genes puuADRCBE como puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE podem ser aplicadas mutatis mudandis aos genes patA, patD, gabT e gabD.

[00115] Como pode haver algumas diferenças nas sequências de DNA entre os gêneros, espécies ou cepas da família Enterobacteriaceae, os genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE não são limitados aos genes mostrados nas SED ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 e 11, respectivamente, mas podem incluir genes que são sequências de nucleotídeos variantes das ou homólogas às SED ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9 e 11, e que codificam variantes das proteínas PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB e PuuE, respectivamente.

[00116] C gzrtguu«q “woc rtqVgipc xctkcpVg” rqfg ukipkfiect woc proteína que tem uma ou várias mudanças na sequência em comparação com SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, sejam elas substituições, deleções, inserções, e/ou adições de um ou vários resíduos de aminoácido, mas que ainda mantém uma atividade ou função similar à da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE, respectivamente, ou a estrutura tridimensional da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE não é significativamente mudada em relação à proteína tipo selvagem ou não modificada. O número de mudanças na proteína variante depende da posição na estrutura tridimensional da proteína ou tipo de resíduo de aminoácido. Pode ser, mas não é estritamente limitado a, 1 a 30, em um outro exemplo 1 a 15, em um outro exemplo 1 a 10, e em um outro exemplo 1 a 5, nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12. Isto é porque alguns aminoácidos têm alta homologia um com o outro de modo que a atividade ou função não é afetada por tal mudança, ou a estrutura tridimensional da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE não é significativamente mudada em relação à proteína tipo selvagem ou não modificada. Portanto, as variantes de proteína codificadas pelos genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE podem ter uma homologia, definida eqoq c “kfgpVkfcfg” rctâogVtq swcnfq wucpfq q rtqitcoc fg eqorwVcfqt BLAST, de não menos que 80%, não menos que 90%, não menos que 95%, ou não menos que 98% em relação à sequência de aminoácidos inteira mostrada nas SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 ou 12, respectivamente, desde que a atividade ou função das proteínas PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB e PuuE seja mantida, ou a estrutura tridimensional da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE não seja significativamente mudada em relação à proteína tipo selvagem ou não modificada.

[00117] A substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificativa de um ou vários resíduos de aminoácido pode ser uma mutação conservativa. A mutação conservativa representativa é uma substituição conservativa. A substituição conservativa pode ser, mas não é limitada a, uma substituição, em que a substituição acontece mutuamente entre Phe, Trp e Tyr, se o sítio de substituição é um aminoácido aromático; entre Ala, Leu, Ile e Val, se o sítio de substituição é um aminoácido hidrofóbico; entre Glu, Asp, Gln, Asn, Ser, His e Thr, se o sítio de substituição é um aminoácido hidrofílico; entre Gln e Asn, se o sítio de substituição é um aminoácido polar; entre Lys, Arg e His, se o sítio de substituição é um aminoácido básico; entre Asp e Glu, se o sítio de substituição é um aminoácido ácido; e entre Ser e Thr, se o sítio de substituição é um aminoácido tendo grupo hidroxila. Exemplos de substituições conservativas incluem substituição de Ser ou Thr por Ala, substituição de Gln, His ou Lys por Arg, substituição de Glu, Gln, Lys, His ou Asp por Asn, substituição de Asn, Glu ou Gln por Asp, substituição de Ser ou Ala por Cys, substituição de Asn, Glu, Lys, His, Asp ou Arg por Gln, substituição de Asn, Gln, Lys ou Asp por Glu, substituição de Pro por Gly, substituição de Asn, Lys, Gln, Arg ou Tyr por His, substituição de Leu, Met, Val ou Phe por Ile, substituição de Ile, Met, Val ou Phe por Leu, substituição de Asn, Glu, Gln, His ou Arg por Lys, substituição de Ile, Leu, Val ou Phe por Met, substituição de Trp, Tyr, Met, Ile ou Leu por Phe, substituição de Thr ou Ala por ser, substituição de Ser ou Ala por Thr, substituição de Phe ou Tyr por Trp, substituição de His, Phe ou Trp por Tyr, e substituição de Met, Ile ou Leu por Val.

[00118] A substituição, deleção, inserção e/ou adição exemplificativa de um ou vários resíduos de aminoácido pode também ser uma mutação não conservativa, considerando que a(s) mutação(ões) é/são compensadas por uma ou mais mutações secundárias na(s) diferente(s) posição(ões) de sequência de aminoácidos de modo que a atividade ou função da proteína variante é mantida e similar à da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE, ou a estrutura tridimensional da proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE não é significativamente mudada em relação à proteína tipo selvagem ou não modificada.

[00119] Para avaliar o grau de homologia do DNA ou proteína, vários métodos de cálculo podem ser usados, como busca BLAST, busca FASTA e método ClustalW. A busca BLAST (Ferramenta de Busca de Alinhamento Local Básico, Basic Local Alignment Search Tool, www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) é o algoritmo de busca heurístico empregado pelos programas blastp, blastn, blastx, megablast, tblastn, e tblastx; esses programas atribuem significado aos seus achados usando os métodos guVaVíuVkeou fg Ucowgn M. g Cnvuejwn U.H. *“OgVjofu for cuuguukpi Vjg statistical significance of molecular sequence features by using general ueotkpi uejgogu” Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, 87:2264-2268; “CrrnkecVkopu anf uVcVkuVkeu hot ownvkrng jkij-scoring segments in molecular ugswgpegu”. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:5873-5877). O programa de computador BLAST calcula três parâmetros: escore, identidade e similaridade. O método de busca FASTA é descrito por Pearson W.R. *“Tarkf anf ugnukvkxg ugswgneg eooratkuon ykvj HCUVR anf HAUVA”. Methods Enzymol., 1990, 183:63-98). O método ClustalW é descrito por Thompson J.D. et an. *“ENWUVAL Y< kortoxkni Vjg ugnukvkxkty oh progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-urgekhke iar rgnanvkgu anf ygkijv oavtkz ejokeg”. Nucleic Acids Res., 1994, 22:4673-4680).

[00120] Além disso, os genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE rofgo ugt ugswênekau fg nwengoVífgo xatkanVgu. A gzrtguu«o “uoa ugswêneka fg nwengoVífgo xatkanVg” rofg ukinkhkeat uoa ugswêneka fg nwengoVífgo sug codifica a proteína PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB ou PuuE usando qualquer códon de aminoácido sinônimo de acordo com a tabela de código igpfivkeq rcft«q *xgt. rqt gzgornq. Ngykp B., “Igpgu VIII”, 4226. Rectuqn Education, Inc., Upper Saddle River, NJ 07458), que pode também ser tefetkfc eqoq “woc rtqVgipc variante” fc rtqVgipc RwwC, RwwF, RwwT, RwwE, PuuB ou PuuE. Os genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE podem ser sequências de nucleotídeo variantes devido à degeneração do código genético.

[00121] C ezrteuu«q “woc ueswêpekc fe pweneqvifeq xctkanVe” rqfe também significar, mas não é limitada a uma sequência de nucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com a sequência de nucleotídeo complementar à sequência mostrada na SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11, ou uma sonda que pode ser preparada a partir da sequência de nucleotídeo sob condições rigorosas considerando que codifica rtqVeinc cVkxc qw funekqnal. “Eqnfk>õeu tkiqtqucu” incluem aquelas sob as quais um híbrido específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia, fefinkfc eqoq a “kfenVkfcfe” rctâoeVtq swcnfq wucnfq q rtqitcoc fe computador BLAST, de não menos que 70%, não menos que 80%, não menos que 90%, não menos que 95%, não menos que 96%, não menos que 97%, não menos que 98%, ou não menos que 99% é formado, e um híbrido não específico, por exemplo, um híbrido tendo homologia menor que a acima não é formado. Por exemplo, condições rigorosas podem ser exemplificadas por lavagem, uma vez ou mais, ou em um outro exemplo, duas ou três vezes, em uma concentração de sal de 1xSSC (citrato de sódio padrão ou cloreto de sódio padrão), 0,1% SDS (sulfato de sódio dodecila), ou em um outro exemplo, 0,1xSSC, 0,1% SDS a 60°C ou 65°C. A duração da lavagem depende do tipo de membrana usado para marcação e, como regra, pode ser a que é recomendada pelo fabricante. Por exemplo, a duração recomendada de lavagem para a membrana de náilon positivamente carregada Amersham HybondTM-N+ (GE Healthcare) sob condições rigorosas é 15 minutos. A etapa de lavagem pode ser realizada de 2 a 3 vezes. Quanto à sonda, uma parte das sequências complementar às sequências mostradas nas SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11 pode também ser usada. Tal sonda pode ser produzida por PCR usando oligonucleotídeos como iniciadores preparados com base nas sequências mostradas nas SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9 ou 11 e um fragmento de DNA contendo a sequência de nucleotídeo como modelo. Recomenda-se que o comprimento da sonda seja >50 bp; pode ser adequadamente selecionado dependendo das condições de hibridização, e é geralmente 100 bp a 1 kbp. Por exemplo, quando um fragmento de DNA com um comprimento de cerca de 300 bp é usado como sonda, as condições de lavagem após a hibridização podem ser exemplificadas por 2xSSC, 0,1% SDS a 50°C, 60°C ou 65°C.

[00122] Como os genes que codificam as proteínas PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB e PuuE da espécie E. coli já foram elucidados (ver acima), as proteínas variantes das sequências de nucleotídeo variantes de proteínas PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB e PuuE podem ser obtidas por PCR (reação em cadeia de polimerase; referir-se a White T.J. et al., The polymerase chain reaction, Trends Genet., 1989, 5:185-189) utilizando iniciadores preparados com base nas sequências de nucleotídeo dos genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE; ou o método de mutagênese direcionado por sítio tratando o DNA contendo o gene puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE tipo selvagem in vitro, por exemplo, com hidroxilamina, ou um método para tratar um microrganismo, por exemplo, uma bactéria que pertence à família Enterobacteriaceae abrigando os genes puuA, puuD, puuR, puuC, puuB e puuE com irradiação ultravioleta (UV) ou um agente de mutação como N- metil-PÓ-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) e ácido nitroso geralmente usado para tais proteínas PuuA, PuuD, PuuR, PuuC, PuuB e PuuE ou suas proteínas variantes de outros microrganismos podem ser obtidos de maneira similar.

[00123] A exprguu«q “woc rtqVgipc Vkrq ugnxcigo” rqfg ukipkfiect uma proteína nativa naturalmente produzida por uma cepa bacteriana tipo selvagem ou precursora da família Enterobacteriaceae, por exemplo, pela cepa E. coli MG1655 tipo selvagem. Uma proteína tipo selvagem pode ser eqfkfiecfc rgnq “igpg vkrq ugnxcigo”. qw rgnq “igpg p«q oqfkfiecfq” swg ocorre naturalmente no genoma de uma bactéria tipo selvagem.

[00124] A bactéria como descrita aqui pode ser obtida por atenuação de expressão de pelo menos um dos genes da via de degradação de putrescina em uma bactéria que tem inerentemente a capacidade de produzir um L- aminoácido. Alternativamente, a bactéria como descrita aqui pode ser obtida conferindo a capacidade de produzir um L-aminoácido a uma bactéria em que a expressão de pelo menos um dos genes da via de degradação de putrescina já está atenuada.

[00125] A bactéria pode ter, além das propriedades já mencionadas, outras propriedades específicas como várias exigências nutricionais, resistência a drogas, sensibilidade a drogas, e dependência de drogas, sem fugir do escopo da presente invenção.

2. Método

[00126] Um método da presente invenção inclui o método para produzir um L-aminoácido como L-alanina, L-arginina, L-asparagina, L-ácido aspártico, L-citrulina, L-cisteína, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L- histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-ornitina, L- fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina, e L- valina, ou uma mistura dos mesmos. Mais especificamente, um método da presente invenção inclui o método para produzir um L-aminoácido da família do glutamato como L-arginina, L-citrulina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, L-prolina e L-ornitina, ou uma mistura dos mesmos. Adicionalmente, um método da presente invenção inclui o método para produzir L-arginina.

[00127] O método para produzir um L-aminoácido pode incluir as etapas de cultivar a bactéria em um meio de cultura para permitir que o L- aminoácido seja produzido, excretado, e/ou acumulado no meio de cultura, e coletar o L-aminoácido do meio de cultura e/ou células bacterianas. O aminoácido coletado pode ser adicionalmente purificado. O L-aminoácido pode ser produzido em um sal ou forma de hidrato do mesmo, ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, sódio, potássio, amônio, e sais similares do L-aminoácido podem ser produzidos pelo método. O L- aminoácido pode ser produzido em forma de aduto do mesmo com, por exemplo, um outro composto orgânico ou inorgânico. Especificamente, um sal monocloridrato de um L-aminoácido pode ser produzido pelo método como sal monocloridrato de L-lisina (L-lisina-HCl) ou sal monocloridrato de L-arginina (L-arginina-HCl).

[00128] O cultivo da bactéria, e a coleta e purificação do L- aminoácido, ou um sal ou hidrato do mesmo, do meio e similares podem ser realizados de maneira similar aos métodos de fermentação convencionais em que o L-aminoácido é produzido usando um microrganismo. O meio de cultura para produção do L-aminoácido pode ser um meio sintético ou natural como um meio típico que contém uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de enxofre, íons inorgânicos, e outros componentes orgânicos e inorgânicos como necessário. Como a fonte de carbono, sacarídeos como glicose, lactose, galactose, frutose, sacarose, arabinose, maltose, xilose, trealose, ribose e hidrolisados de amidos; álcoois como glicerol, manitol e sorbitol; ácidos orgânicos como ácido glucônico, ácido fumárico, ácido cítrico, ácido málico, e ácido succínico; e similares podem ser usados. Como a fonte de nitrogênio, sais de amônio inorgânicos como sulfato de amônio, cloreto de amônio e fosfato de amônio; nitrogênio orgânico como o de hidrolisados de soja; gás de amônia; amônia aquosa; e similares podem ser usados. A fonte de enxofre pode incluir sulfato de amônio, sulfato de magnésio, sulfato ferroso, sulfato de manganês, e similares. Vitaminas como vitamina B1, substâncias necessárias, por exemplo, nutrientes orgânicos como ácidos nucleicos como adenina e RNA, ou extrato de levedura, e similares podem estar presentes em quantidades apropriadas, mesmo se vestigiais. Além destes, pequenas quantidades de fosfato de cálcio, íons de ferro, íons de manganês, e similares podem ser adicionadas, se necessário.

[00129] O cultivo pode ser realizado sob condições aeróbicas durante 16 a 72 horas, ou 16 a 65 horas; a temperatura de cultura durante o cultivo pode ser controlada dentro de 30 a 45°C, ou dentro de 30 a 37°C; e o pH pode ser ajustado entre 5 a 8, ou entre 6,5 e 7,5. O pH pode ser ajustado usando uma substância ácida ou alcalina inorgânica ou orgânica, assim como gás de amônia.

[00130] Depois do cultivo, sólidos como células e detritos de células podem ser removidos do meio líquido por centrifugação ou filtração por membrana, e então o L-aminoácido alvo ou um sal do mesmo pode ser recuperado do licor de fermentação por qualquer combinação de técnicas convencionais como concentração, cromatografia de troca iônica, e cristalização.

[00131] A composição de L-aminoácido alvo coletada pode conter células microbianas, componentes do meio, umidade e metabólitos de subprodutos do microrganismo em adição à substância alvo. A pureza da substância alvo coletada é 50% ou maior, preferivelmente 85% ou maior, particularmente preferivelmente 95% ou maior (Patente U.S. n° 5.431.933, patente japonesa n° 1214636, patentes U.S. nos 4.956.471, 4.777.051, 4.946.654, 5.840.358, 6.238.714, pedido publicado de patente U.S. n° 2005/0025878).

Exemplos

[00132] A presente invenção será mais especificamente explicada abaixo com referência aos seguintes exemplos não limitativos. Exemplo 1. Construção de cepa de E. coli tendo inativado o aglomerado de genes puuADRCBE

[00133] Uma cepa de E. coli tendo inativado o aglomerado de genes puuADRCBE foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por FcVugpmq M.C. g Ycnngt D0N0 ejcocfq “inVgira>«q ogfkcfc rqt XTgfIGV” (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-8867+. Wo frcimgnVq fg FPC eqnVgnfq q ecuugVg XattL-Cm- XattR foi obtido por PCR usando iniciadores P1 (SEQ ID NO: 13) e P2 (SEQ ID NO: 14) e o plasmídeo pMW118-XattL-Cm-XattR (WO2005010175 A1) como o modelo. O iniciador P1 contém tanto uma região complementar à rgik«q nqecnkzcfc nc gzVrgmifcfg 7’ fq igng puuA e uma região eqorngognVcr § rgik«q nqecnkzcfc nc gzVrgmifcfg 3’ fq igng puuE e uma região complementar à região attL. As condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 minutos a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 minuto a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 25 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C, 1 minuto e 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 minutos a 72°C.

[00134] O produto de PCR obtido (cerca de 1,6 kbp) foi purificado por eletroforese em gel de agarose e usado para eletroporação da cepa de E. coli MG1655 contendo o plasmídeo pKD46 tendo uma origem de replicação sensível à temperatura. O plasmídeo pKD46 (Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645) inclui um hrcimgnVq fg FPC fg 4.376 nwengqVifgqu fg Icgq X *rqui>õgu fg nwengqVifgqu de 31088 a 33241, n° de acesso no GenBank: J02459) e contém genes do uiuVgmc fg rgeqmdinc>«q jqm„nqiq XTgf *igngu gzq y, β+ uqd q eqnVrqng fq promotor ParaB induzível por arabinose. O plasmídeo pKD46 é necessário para integração de um produto de PCR no cromossomo da cepa de E. coli MG1655. A cepa de E. coli MG1655 contendo o plasmídeo recombinante pKD46 pode ser obtida do E. coli Genetic Stock Center, Universidade de Yale, New Haven, EUA (n° de acesso CGSC7669).

[00135] Células eletrocompetentes foram preparadas da seguinte maneira: a cepa de E. coli MG1655/pKD46 foi crescida a 30°C durante a noite em meio de LB (caldo Luria-Bertani, também referido como caldo lisogênico; Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) contendo ampicilina (100 mg/L); em seguida a cultura foi diluída 100 vezes com 5 mL de meio de SOB (Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) contendo ampicilina (100 mg/L) e L-arabinose (1 mM). As células foram crescidas com aeração (250 rpm) a 30°C a OD600 de ~0,6. Células eletrocompetentes foram feitas concentrando 100 vezes e lavando três vezes com H2O deionizada gelada. Eletroporação foi realizada usando 70 μL de células e cerca de 100 ng do produto de PCR. Células eletroporadas foram incubadas com 1 mL de meio de SOC (Sambrook J. and Russell D.W., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3a ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) a 37°C por 2,5 horas, banhadas em L-ágar contendo cloranfenicol (25 mg/L), e crescidas a 37°C para selecionar recombinantes CmR-. Para eliminar o plasmídeo pKD46, duas passagens em L-ágar suplementado com cloranfenicol (25 mg/L) a 42°C foram realizadas, e as colônias obtidas foram testadas para sensibilidade à ampicilina. Assim a cepa de E. coli OI3877ΔruuAFTEDG<<Eo hqi qdVkfCo Exemplo 2. Produção de L-arginina por E. coli 382ilvA+ΔrwuAFTEDG

[00136] Clones de E. coli 382ilvA+ foram selecionados como colônias de bom crescimento em placas de ágar mínimas. A cepa 382ilvA+ foi obtida da cepa produtora de L-arginina 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1) por transdução de P1 do gene ilvA tipo selvagem da cepa de E. coli K-12. A cepa 382 foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1o Dorozhny proezd, 1) em 10 de abril de 2000 sob o número de acesso V KPM B-7926 e em seguida convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001. Para testar o efeito da inativação do aglomerado de genes puuADRCBE na produção de L-arginina, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli OI3877ΔrwuCFTEDG<<Eo fok transferido da cepa de E. coli produtora de L-arginina 382ilvA+ por transdução de P1 (Miller, J.H. (1972) “Gzrgtkogptu kp Oolgeulct IgpgVkeu”, Cold Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY) para obter a cepa de E. coli 382ilvA+ΔruuCFTEDG::Cm.

[00137] Ambas as cepas de E. coli 382ilvA+ e 382ilvA+ΔruuCFTEDG<<Eo fotco cultivadas eoo cikVc>«o *442 ipni) c 37°C por 18 horas em 3 mL de caldo nutriente. Em seguida 0,3 mL das culturas obtidas foi inoculado em 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 x 200-mm e cultivado a 32°C por 48 horas em um agitador rotativo a uma OD540 de ~38 até consumo da glicose.

[00138] Após o cultivo, a quantidade de L-arginina que acumulou no meio foi determinada por cromatografia de papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol: ácido acético: água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninidrina (2%) em acetona foi usada como reagente de visualização. Um ponto contendo L-arginina foi cortado, L-arginina foi eluída com uma solução de água a 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-arginina foi estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

[00139] A composição do meio de fermentação (g/L) foi a seguinte:

[00140] Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSO4.7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 L-isoleucina 0,1 CaCO3 5,0 Glicose e sulfato de magnésio foram esterilizados separadamente. CaCO3 foi esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. O pH foi ajustado a 7,0 com solução de KOH.

[00141] Os resultados de oito fermentações em tubo de ensaio independentes (como valores médios) são mostrados na Tabela 1. Como pode ser visto na Tabela 1, a cepa de E. coli 382ilvA+ΔrwwCFTEDG<<Eo hqk ecrcz de produzir uma quantidade maior de L-arginina (Arg) em comparação à cepa precursora de E. coli 382ilvA+.

[00142] A cepa de E. coli 382ilvA+ΔrwwC<<Mo"vgpfq"kpcvkxcfq"q"igpg" puuA é descrita no Exemplo 5. Tabela 1. Produção de L-arginina.

Exemplo 3. Construção da cepa de E. coli produtora de L-ornitina

[00143] Uma cepa de E. coli produtora de L-ornitina foi obtida da cepa de E. coli 382ilvA+ produtora de L-arginina por inativação de ornitina carbamoiltransferase codificada por ambos os genes argF e argI.

3.1. Inativação do gene argF

[00144] Uma cepa em que o gene argF é deletado foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. ejcocfq “kpVgitc>«q ogfkcfc rqt XRgflEV” *Dctsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). Um fragmento de DNA contendo o marcador de resistência de canamicina (KmR) foi obtido por PCR usando iniciadores P3 (SEQ ID NO: 15) e P4 (SEQ ID NO: 16) e o plasmídeo pMW118-attL-Km-attR como o modelo (WO2011043485 A1). O iniciador P3 contém tanto uma região complementar à região localizada na gzvtgokfcfg 7Ó fq igpg argF quanto uma região complementar à região attR. O iniciador P4 contém tanto uma região complementar à região localizada na gzvtgokfcfg 5Ó fq igpg argF quanto uma região complementar à região attL. As condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 minutos a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 minuto a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 25 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 minutos a 72°C.

[00145] O produto de PCR obtido (cerca de 1,6 kbp) foi purificado por eletroforese em gel de agarose e integrado no cromossomo da cepa de E. coli OI3877 rgnc knVgitc>«q ogfkcfc rqt XTgf eqoq fguetkVq cekoc *Gzgornq 3+ para repor o gene argF nativo. Assim a cepa de E. coli OI3877ΔctiH<<Mo foi obtida.

3.2. Inativação do gene argI

[00146] Uma cepa em que o gene argI é deletado foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. ejcocfq “mVgitc>«q ogfkcfc rqt XTgfIGV” (IFitugnko M.C. cpf Ycnngt B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). Um fragmento de DNA contendo q ecuugtg XattL-Cm-XattR foi obtido por PCR usando iniciadores P5 (SEQ ID NO: 17) e P6 (SEQ ID NO: 18) e o plasmídeo pMW118-attL-Cm-attR como o modelo (WO2005010175 A1). O iniciador P5 contém tanto uma região complementar à região localizada na extremidade 7Ó fq igng argI quanto uma região complementar à região attR. O iniciador P4 contém tanto uma região complementar à região localizada na extremidade 5Ó fq igng argI quanto uma região complementar à região attL. As condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 minutos a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 minuto a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 25 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 54°C, 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 minutos a 72°C.

[00147] O produto de PCR obtido (cerca de 1,6 kbp) foi purificado por eletroforese em gel de agarose e integrado no cromossomo da cepa de E. coli OI3877 rgnc kntgitc>«q ogfkcfc rqt XTgf eqoq fguetktq cekoc *Gzgornq 3+ para repor o gene argI nativo. Assim a cepa de E. coli OI3877ΔctgI::Cm foi obtida.

3.3. Construção da cepa de E. coli tendo inativado os genes argI e argF

[00148] Para obter uma cepa de E. coli produtora de L-ornitina, os fragmentos de DNA dos cromossomos das cepas de E. coli OI3877ΔctiH<<Mo"*Gzgornq"503+"g"E. coli OI3877ΔctiK<<Eo"*Gzgornq" 3.2) foram consecutivamente transferidos para a cepa de E. coli produtora de L-arginina 382ilvA+ por transduções de P1 para obter a cepa de E. coli 382ilvA+ΔrwwCFTEDG<<Eo0

[00149] Os marcadores CmR e KmR foram simultaneamente eliminados usando o plasmídeo ajudante pMW-Int/Xis (WO2005010175 A1) que foi eletroporado nos integrantes com menos plasmídeos selecionados usando eletroporação como descrito acima (Exemplo 1) para eletroporação do fragmento de DNA gerado por PCR. Após eletroporação, as células foram banhadas em L-ágar contendo 0,5% de glicose e ampicilina (150 mg/L), e incubadas a 30°C durante a noite para induzir síntese das proteínas Int/Xis. Os clones crescidos foram banhados à réplica em L-ágar com e sem uma mistura de cloranfenicol e canamicina para selecionar as variantes CmS e KmS (sensíveis a cloranfenicol e canamicina). Assim a cepa de E. coli 382ilvA+ ΔctiK"ΔctiH"hqk"qdvkfc0

Exemplo 4. Produção de L-ornitina por E. coli 382ilvA+ ΔctiK" ΔctiH ΔrwwCFTEDG<<Eo

[00150] Para testar o efeito da inativação do aglomerado de genes puuADRCBE na produção de L-ornitina, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli OI3877ΔrwuADRCBE::Cm (Exemplo 1) foi transferido para a cepa de E. coli produtora de L-ornitina 382ilvA+ ΔctiK ΔctiH" *Gzgornq" 5+" por transdução de P1 para obter a cepa de E. coli 382ilvA+ ΔctiK"ΔctiH"ΔrwwCFTEDG<<Eo.

[00151] A produção de L-ornitina foi avaliada como descrito acima para a produção de L-arginina (Exemplo 2). Os resultados de seis fermentações em tubo de ensaio independentes (como valores médios) são mostrados na Tabela 2. Como pode ser visto na Tabela 2, a cepa de E. coli 382ilvA+ ΔcriK ΔcriH ΔrwwAFTEDG<<Eo oodificada foi capaz de produzir uma quantidade maior de L-ornitina (Orn) em comparação à cepa precursora de E. coli 382ilvA+ ΔctiK"ΔctiH0 Tabela 1. Produção de L-ornitina.

Exemplo 5. Construção da cepa de E. coli tendo inativado o gene puuA

[00152] Uma cepa em que o gene puuA é deletado foi construída pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. ejcocfq “mtgirc>«q ogfkcfc rqt XRgflEV” (Dctugnko M.A. cpf Ycnngt B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). Um fragmento de DPA eqntgnfq q ecuugtg XattL-Km-XattR foi obtido por PCR usando iniciadores P7 (SEQ ID NO: 19) e P8 (SEQ ID NO: 20) e o plasmídeo pMW118-attL-Km-attR como o modelo (WO2011043485 A1). O iniciador P7 contém tanto uma região complementar à região localizada na extremidade 7Ó fq igng puuA quanto uma região complementar à região attR. O iniciador P8 contém tanto uma região complementar à região localizada na extremidade 5Ó fq igng puuA quanto uma região complementar à região attL. As condições para PCR foram as seguintes: etapa de desnaturação por 3 minutos a 95°C; perfil para os dois primeiros ciclos: 1 minuto a 95°C, 30 segundos a 50°C, 40 segundos a 72°C; perfil para os últimos 25 ciclos: 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 59°C, 1 minuto e 40 segundos a 72°C; etapa final: 5 minutos a 72°C.

[00153] O produto de PCR obtido (cerca de 1,6 kbp) foi purificado em gel de agarose e integrado no cromossomo da cepa de E. coli MG1655 pela kpVgÍtc>«q ogfkcfc rqt XTgf eqoq fguetkVq cekoc *Gzgornq 3+ rctc tgrqt q genepuuA nativo. Assim a cepa de E. coli OI3877ΔpuuA::Km foi obtida. Exemplo 6. Produção de L-arginina por E. coli 382ilvA+ΔrwuC<<Mo

[00154] Para testar o efeito da inativação do gene puuA na produção de L-arginina, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli MG1655 ΔruuC<<Mo qdvkfq foi transferido para a cepa de E. coli produtora de L- arginina 382ilvA+ por transdução de P1 para obter a cepa de E. coli 382ilvA+ΔruuC<<Mo.

[00155] A produção de L-arginina foi avaliada como descrito no Exemplo 2. Os resultados de oito fermentações em tubo de ensaio independentes (como valores médios) são mostrados na Tabela 1. Como pode ser visto na Tabela 1, a cepa de E. coli 382ilvA+ΔruuC<<Mo modificada foi capaz de acumular uma quantidade maior de L-arginina (Orn) em comparação à cepa precursora de E. coli 382ilvA+. Exemplo 7. Produção de L-citrulina por E. coli 382ΔctiI ΔruuCFTEDG<<Eo

[00156] Para testar o efeito da inativação do aglomerado de genes puuADRCBE na produção de L-citrulina, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli OI3877ΔruuCFTEDG<<Eo fguetkvq cekoc fi transferido para a cepa de E. coli produtora de L-citrulina 5:4ΔctiI por transdução de P1 para obter a cepa de E. coli 5:4ΔctiI ΔruuCFTEDG<<Eo. A cepc 5:4ΔctiI fi qdvkfc rqt fgng>«q fq igpg argG no cromossomo da cepa produtora de L-arginina 382 (VKPM B-7926, EP1170358 A1) pelo método inicialmente desenvolvido por Datsenko K.A. e Wanner B.L. chamado “kpVgitc>«q ogfkcfc rqt XTgfIGV” *FcVugpmq MA cpf Ycpner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97(12):6640-6645). De acordo com esse procedimento, os iniciadores de PCR homólogos tanto à região adjacente ao gene argG quanto ao gene que confere resistência antibiótica no plasmídeo modelo são construídos. O plasmídeo pMW118-X attL-Cm-/. attR (WO2005010175 A1) é usado como modelo na reação PCR.

[00157] Cepas de E. coli 5:4ΔctiI g 5:4ΔctiI ΔruuCFTEDG<<Eo são separadamente cultivadas com agitação a 37°C por 18h em 3 mL de caldo nutriente, e 0,3 mL das culturas obtidas é inoculado em 2 mL de um meio de fermentação em tubos de ensaio de 20 x 200-mm e cultivado a 32°C por 48h em um agitador rotativo.

[00158] Após o cultivo, a quantidade de L-citrulina que acumula no meio é determinada por cromatografia de papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol: ácido acético: água = 4 : 1 : 1 (v/v). Uma solução de ninidrina (2%) em acetona foi usada como reagente de visualização. Um ponto contendo L-citrulina é cortado, L-citrulina é eluída com uma solução de água a 0,5% de CdCl2, e a quantidade de L-citrulina é estimada espectrofotometricamente a 540 nm.

[00159] A composição do meio de fermentação (g/L) é a seguinte:

[00160] Glicose 48,0 (NH4)2SO4 35,0 KH2PO4 2,0 MgSO4.7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,0002 Extrato de levedura 1,0 L-isoleucina 0,1 L-arginina 0,1 CaCO3 5,0 Glicose e sulfato de magnésio são esterilizados separadamente CaCO3 é esterilizado por calor seco a 180°C por 2 horas. O pH é ajustado a 7,0. Exemplo 8. Produção de L-ácido glutâmico por E. coli VL334thrC+ΔruuCFTEDG<<Eo

[00161] Para testar o efeito da inativação do aglomerado de genes puuADRCBE na produção de L-ácido glutâmico, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli OI3877ΔrwuCFTEDG<<Eo fguetkVq cekoc fi transferido para a cepa de E. coli produtora de L-ácido glutâmico VL334thrC+ (EP1172433 A1) por transdução de P1 para obter a cepa de E. coli VL334thrC+ΔruuCFTEDG<<Eo0" C" egrc" XN556vjtE+ foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) em 6 de dezembro de 2004 sob o número de acesso VKPM B-8961 e então convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 8 de dezembro de 2004.

[00162] Cepas de E. coli VL334thrC+ e VL334thrC+ΔruuCFTEDG<<Eo"u«q"ugrctcfcogpvg"eunvkxcfcu"rqt"3:"c"24 horas a 37°C em placas de ágar. Em seguida, uma alça das células é transferida para tubos de ensaio contendo 2 mL de meio de fermentação. O cultivo é realizado a 30°C por 3 dias com agitação.

[00163] Após o cultivo, a quantidade de L-ácido glutâmico que acumula no meio é determinada por cromatografia de papel usando uma fase móvel consistindo em butan-1-ol: ácido acético: água = 4 : 1 : 1 (v/v) com subsequente manchamento por ninidrina (solução a 1% em acetona), eluição dos compostos em 50% de etanol com 0,5% de CdCl2 e adicional estimativa de L-ácido glutâmico a 540 nm.

[00164] A composição do meio de fermentação (g/L) é a seguinte:

[00165] Glicose 60,0 (NH4)2SO4 25,0 KH2PO4 2,0 MgSO4.7H2O 1,0 Tiamina-HCl 0,1 L-isoleucina 0,07 CaCO3 25,0 Glicose e CaCO3 são esterilizados separadamente. O pH é ajustado a 7,2. Exemplo 9. Produção de L-prolina por E. coli 702ilvAΔrwwCFTEDG<<Eo

[00166] Para testar o efeito da inativação do aglomerado de genes puuADRCBE na produção de L-prolina, um fragmento de DNA do cromossomo de E. coli OI3877ΔrwwCFTEDG<<Eo" fguetkvq" cekoc" fi" transferido para a cepa de E. coli produtora de L-prolina 702ilvA por transdução de P1 para obter a cepa de E. coli 924knxCΔrwwCFTEDG<<Eo. A cepa 702ilvA foi depositada na Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Russian Federation, 117545 Moscow, 1 Dorozhny proezd, 1) em 18 de julho de 2000 sob o número de acesso VKPM B-8012 e então convertida para um depósito sob o Tratado de Budapeste em 18 de maio de 2001.

[00167] Cepas de E. coli 702ilvA e 924knxCΔrwwCFTEDG<<Eo são separadamente cultivadas por 18 a 24 horas a 37°C em placas de ágar. Em seguida, essas cepas são cultivadas sob as mesmas condições do Exemplo 8 (Produção de L-ácido glutâmico).

[00168] Embora a invenção tenha sido descrita em detalhe com referência às modalidades preferidas da mesma, será aparente a um versado na técnica que várias mudanças podem ser feitas, e equivalentes empregadas, sem fugir do escopo da invenção. Todas as referências citadas aqui são incorporadas como uma parte deste pedido.

Aplicabilidade Industrial

[00169] De acordo com a presente invenção, a produção de L- aminoácido como os que pertencem à família de aminoácidos do glutamato por uma bactéria da família Enterobacteriaceae pode ser melhorada.

Claims (7)

1. Método para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) cultivar uma bactéria produtora de L-aminoácido da família Enterobacteriaceae em um meio de cultura; e (ii) coletar dito L-aminoácido na bactéria ou meio de cultura, ou ambos, em que dita bactéria foi modificada para romper uma via de degradação de putrescina, em que a referida via de degradação da putrescina é rompida por atenuação da expressão de um gene selecionado do grupo que consiste em patA, patD, gabT, gabD, puuA, puuB, puuC, puuD, puuE e combinações dos mesmos, em que a referida bactéria é Escherichia coli, e em que o referido L-aminoácido pertence à família do glutamato e é selecionado do grupo que consiste em L-arginina, L-citrulina, ácido L-glutâmico, L-glutamina, L-ornitina e L-prolina.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que dita via de degradação de putrescina é uma via putrescina glutamilada, em que dita via putrescina glutamilada é rompida por atenuação da expressão de um gene ou vários genes do aglomerado de genes puuADRCBE, com a condição de que o gene puuR não pode ser o único gene que é atenuado.

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita via de degradação de putrescina é rompida por atenuação da expressão do gene puuA ou de todo o aglomerado de genes puuADRCBE.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que dita expressão do(s) gene(s) é atenuada por inativação de dito(s) gene(s).

5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que dito(s) gene(s) é/são deletados.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito L-aminoácido é L-arginina.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que dito L-aminoácido é L-ornitina.