CN100383252C - 生产l-谷氨酸的方法 - Google Patents
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Abstract
发酵生产L-谷氨酸的方法，包括：在处于特定pH值的含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，培养能在处于上述pH值的上述液体培养基中代谢碳源并积累L-谷氨酸的微生物，积累的量超过了在已经将培养基调节到允许L-谷氨酸进行沉淀的pH水平的条件下的L-谷氨酸饱和浓度，由此形成和积累从培养基中沉淀出的状态的L-谷氨酸，当培养基中的L-谷氨酸浓度低于允许自发结晶的水平时，向培养基中加入L-赖氨酸，从而沉淀出L-谷氨酸的α-晶体。
Description
技术领域
本发明涉及发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸广泛地用作调味品等的原料。
背景技术
L-谷氨酸主要利用所谓的能生产的L-谷氨酸的短杆菌属、棒杆菌属或微杆菌属中的棒状细菌或其突变株通过发酵生产。而且，已知使用芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉菌属、假单胞菌属、土壤细菌属、沙雷氏菌属、念珠菌属、产气气杆菌(现在的产气肠杆菌)、大肠杆菌的突变株等的方法。而且，本发明的发明人提出了使用克雷白氏菌属、欧文氏菌属或泛菌属的微生物生产L-谷氨酸的方法(美国专利号6,197,559)。
而且，已经公开了通过使用重组DNA技术增强L-谷氨酸生物合酶的活性来提高L-谷氨酸生产能力的各种技术。例如，已经报道，导入编码来自大肠杆菌或谷氨酸棒杆菌的柠檬酸合酶的基因，可以有效地增强棒杆菌属或短杆菌属细菌中的L-谷氨酸生产能力(日本专利公开(Kokoku)号7-121228)。另外，日本专利申请公开(Kokai)号61-268185公开了携带含有来自棒杆菌属细菌的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。而且，日本专利申请公开号63-214189公开了通过扩增编码谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶和柠檬酸盐合酶的基因来提高L-谷氨酸生产能力的技术。
通过前述的微生物培养或生产方法的改善，已经显著提高了L-谷氨酸的生产力。但是，为了满足将来需求的进一步增长，仍然需要开发能更有效的低成本生产L-谷氨酸的方法，因此仍然代表着本领域的一项需求。
另一方面，已经开发出了进行L-谷氨酸发酵同时沉淀在培养液中积累的L-谷氨酸的方法(欧洲专利申请公开号1078989)。因为通常的L-谷氨酸生产细菌不能在酸性条件下生长，L-谷氨酸发酵常规地在中性条件下进行。与这样的常规技术相反，选择出了具有在酸性条件生产L-谷氨酸的能力的微生物，已知通过在控制pH以便沉淀出L-谷氨酸的液体培养基中培养得到的微生物(成团肠杆菌)，可以生成L-谷氨酸并在培养基中积累，同时沉淀出L-谷氨酸。
而且，已知生产L-谷氨酸的方法，其包括：在其中会抑制细菌生长的有机酸的总含量不抑制细菌的生长的培养基中，培养这样的能在如上所述的酸性条件下生长的L-谷氨酸生产细菌(欧洲专利申请公开号1233070)，也已知生产L-谷氨酸的方法，其包括：在第一个微生物生长最佳的pH培养上述的细菌，然后在第二个微生物生产L-谷氨酸最佳的、且低于第一个pH的pH培养细菌(欧洲专利申请公开号1233068)。而且，已知在培养基中生产和积累L-谷氨酸同时在培养基中沉淀L-谷氨酸的方法，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度低于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，进行使培养基中存在L-谷氨酸晶体的操作(欧洲专利申请公开号1233069)。
L-谷氨酸的晶体存在2种形式，α-和β-型晶体(H.Takahashi，T.Takenishi，N.Nagashima，Bull.Chem.Soc.Japan，35，923(1962)；J.D.Bernal，Z.Krist.，78，363(1931)；S.Hirokawa，Acta Cryst.，8，637(1955))。β-型晶体在水中更稳定，而α-型晶体表现出更好的沉淀性质，且容易处理，例如，该晶体可以从结晶浆中有效地分离。在欧洲专利申请公开号1233069所述的方法中，当α-型晶体用于使培养基中存在L-谷氨酸晶体的操作中时，α-型晶体可以选择性地结晶。
另外，作为降低L-谷氨酸晶体中的β-型晶体的含量的方法，已经公开了加入苯丙氨酸、亮氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸或丙氨酸的方法(日本专利公开(Kokoku)号36-17712和日本专利公开(Kokoku)号38-16459)，或加入核糖核酸、羧甲基纤维素、果胶、聚丙烯酸或其盐、或藻酸或其盐(日本专利公开(Kokoku)号45-11286)。但是，已经在L-谷氨酸的等电点(pH3.2)检测了这些方法，但是在略高的pH、约pH4.5没有报道有作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种改进的使用具有L-谷氨酸-生产能力的微生物、例如泛菌属细菌生产L-谷氨酸的方法。
本申请的发明人发现，通过在发酵生产L-谷氨酸的方法中使L-赖氨酸存在于培养基中，同时沉淀出要在培养基中积累的L-谷氨酸，可以提高L-谷氨酸的超溶解度(super solubility)，从而当L-赖氨酸的浓度在特定水平或更高时，可以在培养基中选择性地结晶出L-谷氨酸的α-型晶体。而且，当进行使培养基中存在L-谷氨酸晶体的操作时，该操作应当在培养基中的L-谷氨酸等于或高于饱和浓度且低于发生L-谷氨酸的自然结晶时的浓度进行。但是，本发明的发明人发现，通过提高L-谷氨酸的超溶解度可以扩展操作的适用时间。
已经基于上述发现完成了本发明，本发明的要点如下。
(1)发酵生产L-谷氨酸的方法，其包括：在pH受控的培养基中培养在处于特定pH值的含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中能代谢碳源并具有在处于所述pH的液体培养基中以超过所述L-谷氨酸饱和浓度的对应量的量积累L-谷氨酸的能力的微生物，使得L-谷氨酸沉淀，以导致L-谷氨酸在培养基中积累同时沉淀L-谷氨酸，
其中该方法包括，当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生L-谷氨酸的自然结晶的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸，从而沉淀出L-谷氨酸的α-型晶体。
(2)如(1)的方法，其中微生物属于泛菌属。
(3)如(2)的方法，其中微生物是Pantoea ananatis。
(4)如(1)至(3)中的任一项的方法，其中加入的L-赖氨酸的量是900mg/L或更多。
(5)如(1)至(4)中的任一项的方法，其中在使L-赖氨酸存在时的培养基的pH是3.0-5.0。
(6)如(1)至(5)中的任一项的方法，其中在发生L-谷氨酸的自然结晶之前进行使培养基中存在L-谷氨酸的α-型晶体的操作。
附图说明
图1是源自Pantoea ananatis的pTWVEK101的DNA片段的限制图谱。
图2显示了含有基因gltA、ppc和gdhA的质粒pMWCPG的构建。
图3显示了含有广宿主范围质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建。
图4显示了含有广宿主范围质粒RSF1010的复制起点、四环素抗性基因、gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建。
图5显示了含有gltA基因的质粒pSTVCB的构建。
图6显示了L-赖氨酸的浓度和超溶解度之间的关系。
图7显示了加入的L-赖氨酸或L-苯丙胺酸的浓度和沉淀的L-谷氨酸的晶形之间的关系。
具体实施方式
下面将详细解释本发明。
本发明是发酵生产L-谷氨酸的方法，其包括：在pH受控的培养基中培养在处于特定pH值的含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中能代谢碳源并具有在处于所述pH的液体培养基中以超过所述L-谷氨酸饱和浓度的对应量的量积累L-谷氨酸的能力的微生物(此后也称作“L-谷氨酸-积累微生物”)，使得L-谷氨酸沉淀，以导致L-谷氨酸在培养基中积累同时沉淀L-谷氨酸，其中该方法包括，当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生L-谷氨酸的自然结晶的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸，从而沉淀出L-谷氨酸的α-型晶体。
可以例如如下得到上述L-谷氨酸积累微生物。将含有微生物的样品接种到处于特定pH值的含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，选择能代谢碳源的菌株。尽管特定pH没有特别限制，其通常是约5.0或更低，优选约4.5或更低，更优选约4.3或更低。L-谷氨酸-积累微生物可以用于发酵生产L-谷氨酸，伴有L-谷氨酸沉淀。如果pH过高，会使微生物难以生产其量足以沉淀的L-谷氨酸。因此，pH优选地在前述范围内。
如果降低含有L-谷氨酸的水性溶液的pH，L-谷氨酸的溶解度显著降至γ-羧基的pKa附近(4.25，25℃)。溶解度在等电点(pH3.2)变成最低，超过与饱和浓度相对应的量的L-谷氨酸发生沉淀。尽管依赖于培养基组成，在约30℃，L-谷氨酸在pH3.2的溶解量为10-20g/L，在pH4.0为30-40g/L，在pH4.7为50-60g/L。通常不需要使pH达到3.0或更低，因为当pH降至低于特定值时，L-谷氨酸沉淀作用达到其上限。但是，pH可以是3.0或更低。
另外，表述微生物“可以代谢碳源”是指，该微生物可以增殖，或者尽管它不增殖但是可以消耗碳源，也就是说，它表明该微生物能代谢碳源，例如糖和有机酸。更具体地，例如，当在合适温度(例如28℃、37℃或50℃)下pH5.0-4.0、优选pH4.5-4.0、更优选pH4.3-4.0、最优选约pH4.0的含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，如果微生物增殖，则该微生物是可以代谢培养基中的碳源的微生物。而且，例如，当在合适温度(例如28℃、37℃或50℃)下pH5.0-4.0、优选pH4.5-4.0、更优选pH4.3-4.0、最优选约pH4.0的含有饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，如果微生物消耗碳源，尽管该微生物不增殖，则该微生物是可以代谢培养基中的碳源的微生物。
可以代谢碳源的微生物包括可以在前述液体培养基中生长的微生物。表述微生物“可以生长”是指它可以增殖或者尽管它不能增殖但是可以生产L-谷氨酸。更具体地，例如，当在合适温度(例如28℃、37℃或50℃)下pH5.0-4.0、优选pH4.5-4.0、更优选pH4.3-4.0、最优选约pH4.0的含有饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基中培养2-4天时，如果微生物增殖，则该微生物是可以在该培养基中生长的微生物。而且，例如，当在合适温度(例如28℃、37℃或50℃)下pH5.0-4.0、优选pH4.5-4.0、更优选pH4.3-4.0、最优选约pH4.0的含有饱和浓度的L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天时，如果微生物增加合成液体培养基中的L-谷氨酸的量，尽管该微生物不增殖，则该微生物是可以在该培养基中生长的微生物。
如上所述的微生物的选择可以在相同条件下或改变pH或L-谷氨酸的浓度重复2次或多次。可以在含有其浓度低于饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行早期选择，此后可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行后续选择。而且，可以选择出具有优良性质(例如优越的增殖速度)的菌株。
除了上述的性质外，L-谷氨酸-积累微生物具有积累L-谷氨酸的能力，积累的量超过了与液体培养基中L-谷氨酸的饱和浓度相对应的量。前述液体培养基的pH优选地与用于选择具有前述性质的微生物的培养基相同或接近。通常，随着pH的降低，微生物变得对高浓度的L-谷氨酸敏感。因此，考虑到对L-谷氨酸的抗性，pH优选地不太低，但是考虑到L-谷氨酸的生产和伴随的沉淀，优选低pH。为了满足这些条件，pH可以在3-5、优选4-5、更优选4-4.7、再优选4-4.5、特别优选4-4.3的范围内。
因此，L-谷氨酸-积累微生物或培养物的实例包括但不限于泛菌属、肠杆菌属、克雷白氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属、脂环酸杆菌属、芽孢杆菌属、酵母菌属等属的微生物。其中，优选泛菌属的微生物。在下文中，本发明的微生物将主要解释泛菌属的微生物。但是，微生物不限于泛菌属的微生物，可以类似地使用其它属的那些。
泛菌属的微生物的实例包括但不限于Pantoea ananatis，优选Pantoea ananatis AJ13355株。该菌株分离自日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤，作为可以在低pH的含有L-谷氨酸和碳源的培养基中增殖的菌株。
Pantoea ananatis AJ13355于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为国际专利生物保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所)，保藏号为FERM P-16644。然后于1999年1月11日，按照布达佩斯条约将其转移到国际保藏，保藏号为FERM BP-6614。
分离时，将上述菌株鉴别为成团肠杆菌，并保藏为成团肠杆菌(Enterobacter agglomerans)AJ13355。但是，最近以16S rRNA等的核苷酸测序为基础将其重新分类为Pantoea ananatis(见实施例部分)。
虽然从AJ13355菌株衍生出的菌株AJ13356和AJ13601也保藏在前述的保藏机构作为成团肠杆菌，它们在本说明书中描述为Pantoeaananatis。
L-谷氨酸-积累微生物可以是原始地具有L-谷氨酸-生产能力的微生物，或具有通过诱变繁殖、重组DNA技术等赋予或增强的L-谷氨酸-生产能力的微生物。
通过例如增强能催化L-谷氨酸的生物合成反应的酶的活性，可以赋予或增强L-谷氨酸-生产能力。通过降低或消除能催化从L-谷氨酸的生物合成途径分叉、并生成L-谷氨酸之外的化合物的反应的酶的活性，也可以增强L-谷氨酸-生产能力。
能催化L-谷氨酸的生物合成反应的酶的实例包括但不限于谷氨酸脱氢酶(此后，也称作″GDH ″)，谷氨酰胺合酶，谷氨酸合酶，异柠檬酸脱氢酶，乌头酸水合酶，柠檬酸合酶(此后，也称作″CS″)，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(此后，也称作″PEPC″)，丙酮酸脱氢酶，丙酮酸激酶，烯醇酶，磷酸甘油变位酶，磷酸甘油酸激酶，甘油醛-3-磷酸脱氢酶，丙糖磷酸异构酶，果糖二磷酸醛缩酶，磷酸果糖激酶，磷酸葡萄糖异构酶等。在这些酶中，CS、PEPC和GDH中的一种、两种或三种是优选的。而且，优选在L-谷氨酸-积累微生物中的所有三种酶CS、PEPC和GDH的活性被加强。更具体地，乳发酵短杆菌的CS是优选的，因为它不会受到α-酮戊二酸、L-谷氨酸和NADH的抑制。
为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如，可以将编码CS、PEPC或GDH的基因克隆到适当的质粒上，用获得的质粒转化宿主微生物。在转化体中的编码CS、PEPC或GDH的基因(以后，分别缩写为“gltA基因”、“ppc基因”和“gdhA基因”)的拷贝数量增加，导致CS、PEPC或GDH活性的提高。
克隆的gltA、ppc和gdhA基因被单独地或以它们中的任意两种或三种的组合的形式导入前述的起始亲本株。当导入两种或三种基因时，这两种或三种基因可以克隆到一种质粒上，并导入宿主，或分别克隆到两种或三种能共存的质粒上，并导入宿主。
可以将编码同一类的但源自不同的微生物的酶的两种或更多种基因导入同一宿主。
上述质粒没有特别的限制，只要它们在微生物细胞中能自发地复制就行，所述的微生物属于例如泛菌属等。质粒的实例包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC177、pACYC184等。噬菌体DNA的载体也可以用于导入前述基因。
可以通过例如D.M.Morrison的方法(Methods in Enzymology，68，326(1979))进行转化，在该方法中，通过用氯化钙(Mandel M.和Higa A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、电穿孔(Miller J.H.，“A Short Course in Bacterial Genetics”，Cold Spring HarborLaboratory Press，美国，1992)等处理细胞，提高受体细菌细胞的DNA的通透性。
通过使多拷贝的gltA基因、PPc基因或gdhA基因出现在前述起始亲株的染色体DNA上，也可以提高CS、PEPC或GDH的活性。为了将gltA基因、ppc基因或gdhA基因以多拷贝数量导入泛菌属细菌的染色体DNA中，可以使用染色体DNA上的多拷贝数量序列，例如在可转座元件末端的重复DNA和反向重复序列。或者，通过将它们掺入转座子并将其转移，可以将多拷贝导入染色体DNA。结果，在转化体的细胞中的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的拷贝数量得到增加，由此，CS、PEPC或GDH的活性得到增强。
可以采用任何生物作为要增加其拷贝数量的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的来源生物，只要它具有CS、PEPC或GDH活性。该生物的实例优选地包括但不限于泛菌属、肠杆菌属、克雷白氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏杆菌属、棒杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属的原核细菌。具体地，大肠杆菌、乳发酵短杆菌等包括在本发明中。可以从上述微生物的染色体DNA获得gltA基因、ppc基因和gdhA基因。
使用CS、PEPC或GDH活性缺陷的突变株，从前述微生物的染色体DNA分离能补充其营养缺陷体的DNA片段，可以获得gltA基因、ppc基因或gdhA基因。而且，既然已知埃希氏杆菌属和棒杆菌属细菌的这些基因的核苷酸序列(Biochemistry，22，第5243-5249页(1983)；J.Biochem.，95，第909-916页(1984)；Gene，27，第193-199页(1984)；Microbiology，140，第1817-1828页(1994)；Mol.Gen.Genet.，218，第330-339页(1989)；Molecular Microbiology，6，第317-326，(1992))，也可以通过PCR获得它们，PCR中使用基于各核苷酸序列合成的引物和染色体DNA作为模板。已经知道，在肠细菌例如肠杆菌属或克雷白氏菌属的细菌中，导入来自棒杆菌的gltA基因比导入来自相同种的细菌的gltA基因对于提高L-谷氨酸生产能力更有效(欧洲专利申请公开号0999282)。在该专利文件中，将说明书中公开的pantoeaananatis菌株描述为成团肠杆菌。
除了前述的基因扩增以外，CS、PEPC或GDH的活性也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达来得到提高。例如，通过用另一种更强的启动子来代替gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子，可以增强表达。例如，已知lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子和PL启动子等是强启动子。将其启动子被代替的gltA基因、ppc基因和gdhA基因克隆到质粒上，并导入宿主微生物，或使用重复DNA、反向重复序列、转座子等导入到宿主微生物的染色体DNA上。
通过用另一种更强的启动子来代替染色体上的gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子(参见WO87/03006和日本专利申请公开号61-268183)，或在各基因的编码序列的上游插入强启动子(参见Gene 29，第231-241页(1984))，也可以使CS、PEPC或GDH的活性增强。具体地，可以在其启动子被更强的启动子或含其一部分的DNA代替的gltA基因、ppc基因或gdhA基因和染色体上相应的基因之间进行同源重组。
催化从L-谷氨酸生物合成途径中分叉并产生非L-谷氨酸的化合物的反应的酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶(以下，也称为“αKGDH”)、异柠檬酸裂合酶、磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶和1-吡咯啉脱氢酶等。在这些酶中，αKGDH是优选的。
为了降低或消除泛菌等属的微生物中前述酶的活性，通过常规的诱变处理方法或基因工程方法，可以将降低或消除酶的胞内活性的突变导入前述酶的基因。
诱变处理方法的实例包括，例如使用X-射线或紫外线照射的方法，使用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理的方法。导入突变的基因位点可以是编码酶蛋白的编码区或调节表达的区域例如启动子。
基因工程方法的实例包括，例如使用基因重组、转导和细胞融合等方法。例如，将抗药性基因插入克隆的靶基因，以制备丧失其功能的基因(缺陷基因)。随后，将该缺陷基因导入宿主微生物细胞，通过同源重组(基因破坏)，用前述缺陷基因代替染色体上的靶基因。
通过测量对从候选菌株获得的细胞提取物或其纯化部分的酶活性，并将其与野生株进行比较，可以确认细胞中的靶酶的胞内活性的降低或缺乏和活性的降低程度。例如，可以通过Reed等的方法测定αKGDH活性(Reed L.J.和Mukher jee B.B.，Methods in Enzymology，13，第55-61页(1969))。
根据靶酶，可以基于突变株的表型选择靶突变株。例如，在需氧培养条件下，在含有葡萄糖的基本培养基中或在含有乙酸或L-谷氨酸作为唯一碳源的基本培养基中，αKGDH活性被消除或降低的突变株不能增殖，或表现出明显减小的增殖速率。然而，即使在同样条件下，通过向含葡萄糖的基本培养基中添加琥珀酸或赖氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸，也可以实现正常增殖。利用这些现象作为指示，可以选择具有减小的αKGDH活性或缺乏活性的菌株。
使用同源重组制备乳发酵短杆菌的αKGDH基因缺陷株的方法详细记载在WO95/34672中。类似的方法可以用于其它微生物。
而且，克隆基因、消化和连接DNA、转化等技术详细记载在MolecularCloning，第2版，Cold Spring Harbor Press(1989)等中。
如上所述得到的αKGDH活性缺陷或αKGDH活性降低的突变株的具体实例包括Pantoea ananatis AJ13356。Pantoea ananatis AJ13356于1998年2月19日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为国际专利生物保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所)，且收到的保藏号是FERM P-16645。根据布达佩斯条约的有关条款，在1999年1月11日转为国际保藏，且收到的保藏号是FERM BP-6615。作为αKGDH-E1亚基基因(sucA)破坏的结果，Pantoeaananatis AJ13356缺乏αKGDH活性。分离时，将该菌株鉴别为成团肠杆菌，并保藏为成团肠杆菌AJ13356株。但是，最近以16S rRNA等的核苷酸测序为基础将其重新分类为Pantoea ananatis(见实施例部分)。
当将作为用于本发明的微生物的一个实例的Pantoea ananatis培养在含糖的培养基中时，会胞外分泌粘液，有时导致低操作效率。因此，当使用具有这样的分泌粘液性质的Pantoea ananatis时，优选使用粘液分泌比野生株少的突变株。诱变处理的实例包括，例如使用X-射线或紫外线照射的方法，使用诱变剂例如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理的方法。通过将诱变的细菌细胞接种于含糖的培养基中，可以选择粘液分泌降低的突变株，例如所述的培养基是含5g/L葡萄糖的LB培养基平板，培养它们时将板倾斜约45度，并选择没有粘液流下的菌落。
在本发明中，可以以任意的顺序赋予或增强L-谷氨酸-生产能力和赋予其它良好性质，例如上述较少粘液分泌的突变。
作为用于繁殖上述的L-谷氨酸-生产菌的基因，将Pantoeaananatis的sucA基因的核苷酸序列和该基因编码的KGDH-E1亚基的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3中。
而且，含有源自大肠杆菌的gltA基因、gdhA基因和ppc基因的质粒RSFCPG的核苷酸序列(见参考实施例1)显示在SEQ ID NO：8中。在SEQ ID NO：8中，gltA基因、gdhA基因和ppc基因的编码区分别对应核苷酸编号1770-487(由互补链编码)、2598-3941和7869-5218(由互补链编码)。这些基因编码的CS、GDH和PEPC的氨基酸序列显示在SEQID NO：9、10和11中。而且，含有源自乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒pSTVCB的核苷酸序列(见参考实施例1)和该基因编码的CS的氨基酸序列显示在SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13中。
CS、GDH和PEPC除了可以是野生型以外，还可以是具有包含取代、缺失、插入、添加或颠倒了一个或几个氨基酸残基(这基本上不降低酶的活性)的氨基酸序列的那些。尽管在这里提及的“几个”氨基酸残基的数目根据蛋白的三维结构的位置或氨基酸残基的类型而变，它可以特别地是2-30，优选2-20，更优选2-10。
编码与CS、GDH或PEPC基本上相同的蛋白或肽的DNA的实例包括可与SHQ ID NO：12或8所示的核苷酸序列的开放读码框(ORF)杂交的DNA，或可以在严格条件下从该核苷酸序列制备出的编码具有CS、GDH或PEPC活性的蛋白的探针。“严格条件”在这里包括能形成所谓的特异性杂交、且不形成非特异性杂交的条件。难以使用任何数字值来清楚地表达该条件。但是，例如，严格条件包括这样的条件，其中具有高度同源性的DNA，例如具有不低于50％、优选不低于70％、更优选不低于90％、最优选不低于95％同源性的DNA能彼此杂交，但是具有低于上述同源性的DNA不能彼此杂交。或者，严格条件包括这样的条件，其中在60℃、在与DNA杂交中的普通洗涤条件相应的盐浓度(即1xSSC、0.1％SDS，优选0.1xSSC、0.1％SDS)DNA能彼此杂交。
SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的ORF或其部分序列也可以用作探针。使用在SEQ ID NO：8或12的核苷酸序列的基础上生产的寡核苷酸作为引物，使用含有SEQ ID NO：8或12的核苷酸序列或其部分核苷酸序列的NDA片段作为模板，通过PCR可以制备出这样的探针。当长度为约300碱基对的DNA片段用作探针时，杂交的洗涤条件可以是例如在50℃、2xSSC和0.1％SDS。
如果用于基因破坏的缺失型sucA基因的同源性程度能造成与目标微生物的染色体DNA上的sucA基因发生同源重组，则该同源性是足够的。这样的同源性优选地不低于85％，更优选地不低于90％，特别优选地不低于95％。而且，可以在严格条件下杂交的DNA可以造成同源重组。
如上所述得到的菌株的具体实例包括源自前述的Pantoeaananatis AJ13355株的AJ13601株。通过选择来自AJ13355株的低粘液生产菌、破坏DGDH基因、导入源自大肠杆菌的gltA、ppc和gdhA基因和源自乳发酵短杆菌的gltA基因、选择在低pH表现出对高浓度的L-谷氨酸的抗性的菌株、和选择表现出优越的生长能力和L-谷氨酸生产能力的菌株，可以得到该菌株。
通过在液体培养基中培养L-谷氨酸积累微生物，所述液体培养基的pH条件调节至使L-谷氨酸沉淀，可以产生L-谷氨酸，并伴随着其在培养基中的沉淀而积累。“使微生物生产的L-谷氨酸沉淀的条件”在这里是指，当L-谷氨酸积累微生物生成并积累L-谷氨酸时，使L-谷氨酸沉淀的条件。尽管这些条件的pH可以随微生物的L-谷氨酸生产能力而变化，当微生物是泛菌属的细菌时，它通常是3-5，优选4.5或更低，更优选4或更低。
而且，关于前述的使L-谷氨酸沉淀的pH条件，根据L-谷氨酸积累微生物可以代谢含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中的碳源、且表现出在培养基中积累L-谷氨酸(其量超过该pH的培养基中的饱和浓度的L-谷氨酸对应的量)的能力的条件，确定pH。
当在上述条件的培养基中培养L-谷氨酸积累微生物来生产和积累L-谷氨酸、同时使L-谷氨酸在培养基中沉淀时，通过在培养基中的L-谷氨酸的浓度低于发生自然结晶的浓度时使培养基中存在一定量的或更多的L-赖氨酸，可以选择性地沉淀出α-型晶体。当在没有L-赖氨酸的培养基中培养L-谷氨酸积累微生物来生产和积累L-谷氨酸、同时使L-谷氨酸在培养基中沉淀时，培养基中应当存在作为种晶的L-谷氨酸的α-型晶体，以确保沉淀α-型晶体。另一方面，使用本发明的方法，即使不加入种晶，通过使培养基中存在一定量的或更多的L-赖氨酸，也可以沉淀α-型晶体。
使培养基中存在L-赖氨酸的方法包括，例如，向培养基中加入L-赖氨酸的方法。当培养基中的L-谷氨酸的浓度低于发生自然结晶的浓度时，加入L-赖氨酸。这是因为，在发生了β-型晶体的自然结晶后，即使向培养基中加入L-赖氨酸，α-型晶体也难以沉淀。优选地，在使培养基中的L-谷氨酸的浓度等于或大于饱和浓度后，向培养基中加入L-赖氨酸。另外，如果培养基中的L-谷氨酸的浓度变得小于饱和浓度，可以向培养基中加入L-赖氨酸。而且，当培养基中的L-谷氨酸的浓度低于其发生自然结晶的浓度时，使用能在培养基中积累L-赖氨酸和L-谷氨酸的微生物，可以使L-赖氨酸在培养基中积累(例如，见WO 96/06180)。
上述的表述“自然结晶”是指，具有L-谷氨酸生产能力的微生物对L-谷氨酸的积累导致培养基中的L-谷氨酸随着培养基中的L-谷氨酸浓度超过饱和浓度而自然沉淀。
在本发明中，在培养基中存在的L-赖氨酸的量是500mg/L或更多，典型地600mg/L-1500mg/L，优选1000mg/L或更多，更优选1500mg/L或更多。具体地，当不加入种晶时，L-赖氨酸的量是900mg/L或更多，优选1000mg/L或更多，更优选1500mg/L或更多。
在培养基中沉淀L-谷氨酸结晶时培养基的pH可以基本上与用于在培养基中积累L-谷氨酸的pH相等，但是优选地设定为3.0-5.0，更优选3.0-4.9，特别优选4.5-4.9。
已知的使用L-谷氨酸积累微生物生产L-谷氨酸、同时沉淀L-谷氨酸的方法都可以用于本发明，除非当培养基中的L-谷氨酸浓度小于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸(例如，日本专利公开号2001-333769(欧洲专利申请公开号1078989)，日本专利公开号2002-338591(欧洲专利申请公开号1233070)，日本专利公开号2002-238593(欧洲专利申请公开号1233069))。
例如，本发明的方法的一个优选实施方案是生产L-谷氨酸的方法，其包括：在pH5.0或更低的培养基中培养L-谷氨酸积累微生物，其中能抑制微生物生长的有机酸的总含量是不会抑制微生物生长的量，当培养基中的L-谷氨酸浓度小于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸(见日本专利公开号2002-338591(欧洲专利申请公开号1233070))。在该实施方案中，在培养基的pH能抑制微生物生长的有机酸是指，当其以一定的浓度(通常0.5g/L或更高)存在于该pH的培养基中时，对微生物的生长具有抑制作用的有机酸，它通常是具有1-3个碳的有机酸，例如甲酸、乙酸或丙酸。
有机酸的总含量优选地是0.4g/L或更低，更优选0.3g/L或更低，再优选0.2g/L或更低。
本发明的方法的另一个优选实施方案是生产L-谷氨酸的方法，其包括：在对于微生物的生长最佳的第一个pH培养L-谷氨酸积累微生物，然后在对于微生物生产L-谷氨酸最佳的、且低于第一个pH的第二个pH培养该微生物，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度小于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸(见日本专利公开号2002-238592(欧洲专利申请公开号1233068))。
本发明的方法的另一个优选实施方案是生产L-谷氨酸的方法，其包括：在培养基中含有的有机酸不会抑制微生物的生长的第一个pH培养L-谷氨酸积累微生物，然后在对于微生物生产L-谷氨酸最佳的、且低于第一个pH的第二个pH培养该微生物，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度小于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸(见日本专利公开号2002-238591(欧洲专利申请公开号1233070))。
发现L-谷氨酸生产细菌的生长在酸性条件下通常会受到有机酸的抑制，然而在中性条件下它能消耗有机酸(EP1233070A)。基于该性质，通过在中性pH实现细胞生长，然后将pH改变成酸性pH来生产L-谷氨酸，可以得到更高的生产力，也可以使用多种物质作为糖源。
在该实施方案中，有机酸是指当以一定的浓度(通常0.5g/L或更高)存在于第二个pH的培养基中时，对微生物的生长具有抑制作用的有机酸，它通常是具有1-3个碳的有机酸，例如甲酸、乙酸或丙酸。
选择第一个pH和第二个pH，使得它们满足要使用的L-谷氨酸生产细菌的性质。本领域的技术人员可以容易地检测这些pH值。例如，通过在调节至不同pH值的含有有机酸的培养基中培养L-谷氨酸生产细菌，基于吸光度等检测细胞量，并将该细胞量与在相同条件(除了培养基中不含有有机酸之外)下培养的L-谷氨酸生产细菌的细胞量进行对比，可以检测培养基中的有机酸没有抑制微生物生长时的pH。适用于生产L-谷氨酸的pH是指L-谷氨酸在培养基中积累时的pH，其可以通过在不同pH值的培养基中培养L-谷氨酸生产细菌来检测。具体地，通过检测不同pH值的培养基中积累的L-谷氨酸的量、并对其进行比较，可以确定该pH值。
第一个pH没有特别限制，只要培养基中的有机酸不会抑制微生物的生长即可，但是它通常是5.0-8.0。
第二个pH优选地是，生成的L-谷氨酸会发生沉淀的pH，这样的pH通常是3.0-5.0。通过在生成的L-谷氨酸会发生沉淀的pH进行培养，可以避免高浓度的L-谷氨酸积累造成的生产力降低。
在培养过程中，第一个pH和第二个pH可以不是严格恒定的，只要能得到本发明的优点即可，它们可以波动。
即使在第一个pH，L-谷氨酸生产细菌也会生成L-谷氨酸，因此生成的L-谷氨酸会降低pH。因此，优选地在第一个pH进行培养时，同时通过向培养基中加入碱性物质，将培养基的pH维持在第一个pH。
尽管碱性物质没有特别限制，只要它不会负面影响L-谷氨酸生产细菌的生长或L-谷氨酸的生产即可，但氨气是优选的。
通过加入酸性物质，可以将培养基的pH从第一个pH降至第二个pH。但是，在如上所述的培养过程中，L-谷氨酸生产细菌生成的L-谷氨酸会降低pH。因此，优选地通过控制碱性物质的加入量来将培养基的pH从第一个pH降至第二个pH，因为可以省略酸性物质的加入。
可以继续在第一个pH培养，直到培养基中的有机酸耗尽。耗尽是指，有机酸的量降低至在第二个pH的培养过程中不会抑制L-谷氨酸生产细菌的生长的水平。本领域的技术人员可以容易地检测这样的有机酸水平。例如，通过在第二个pH的含有不同浓度的有机酸的培养基中培养L-谷氨酸生产细菌，检测L-谷氨酸生产细菌的细胞量，并将该细胞量与在相同条件(除了培养基中不含有有机酸之外)下培养的L-谷氨酸生产细菌的细胞量进行对比，可以确定该水平。通常，随着第二个pH降低，有机酸的水平也降低。
本发明的方法的另一个优选实施方案是发酵生产L-谷氨酸的方法，包括：在pH受控的培养基中培养L-谷氨酸积累微生物，使微生物生产的L-谷氨酸沉淀，造成L-谷氨酸在培养基中积累，同时沉淀L-谷氨酸，其中当培养基中的L-谷氨酸浓度小于L-谷氨酸发生自然结晶时的浓度时，使培养基中存在L-赖氨酸，并在L-谷氨酸发生自然结晶之前进行操作，使培养基中存在L-谷氨酸的α-型晶体(种晶)(见日本专利公开号2002-238593(欧洲专利申请公开号1233069))。
在L-谷氨酸的β-型晶体发生自然结晶之前，进行使培养基中存在种晶的操作。另外，如果在培养基中的L-谷氨酸浓度达到饱和浓度之前加入种晶，该种晶可以是溶解的。因此，优选地在培养基中的L-谷氨酸浓度超过饱和浓度之后、但是L-谷氨酸发生自然结晶之前加入种晶。在本发明中，使培养基中存在L-赖氨酸来提高其发生自然结晶时的L-谷氨酸的浓度，可以扩展加入种晶的适用时间。
使培养基中存在L-谷氨酸的α-型晶体的操作是指，人工地使培养基中存在L-谷氨酸的晶体的操作。该操作的实例包括加入α-型晶体、在开始培养时将一定量的L-谷氨酸溶解到培养基中的操作，和在培养过程中降低pH以强制沉淀晶体等。在培养基中存在的α-型晶体的量通常是0.01-10g/L。通过本领域的技术人员熟知的方法，可以检测在培养基中存在的L-谷氨酸晶体的量和L-谷氨酸的浓度。在静置培养基后，检测L-谷氨酸晶体，通过倾析收集晶体。在培养基中L-谷氨酸的浓度是溶解的L-谷氨酸的浓度。当晶体沉淀在培养基中时，L-谷氨酸的浓度是指，从通过离心(或过滤)由培养基分离固体成分得到的澄清溶液测得的L-谷氨酸浓度的值。
使培养基中存在L-谷氨酸的α-型晶体的操作优选地是，加入L-谷氨酸的α-型晶体。
要加入的晶体的优选量通常是0.2g/L或更多。如果以前述量或更大的量加入晶体，可以以良好的再现性得到α-型晶体。考虑到其形态学，α-型晶体比β-型晶体更容易处理。
作为用于本发明的培养基，可以使用通常的含有所需的碳源、氮源、无机盐和有机痕量营养物(例如氨基酸和维生素)的培养基，只要调节pH满足预定条件即可。可以使用合成的培养基或天然的培养基。要培养的菌株可以利用的任意碳源和氮源都可以用于培养基中。
糖，例如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物和糖蜜，可以用作碳源。另外，有机酸例如乙酸和柠檬酸可以分别单独使用或与另外的碳源结合使用。
氨、铵盐例如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和乙酸铵和硝酸盐等可以用作氮源。
氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸、含有胨、酪蛋氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白分解产物等的物质可以用作有机痕量营养物。当使用其代谢或生长需要氨基酸等的营养缺陷突变株时，必须补充所需的营养物。
磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐和锰盐等可以用作无机盐。
关于培养方法，通常在20-42℃进行通气培养，只要控制pH至预定值，优选3至5。
在完成培养之后，通过离心或过滤等方式收集沉淀在培养物中的L-谷氨酸。通过公知的方法，也可以收集溶解在培养基中的L-谷氨酸。例如，通过浓缩培养液使其结晶，可以分离L-谷氨酸，或通过离子交换色谱法等来分离。也可以使溶解在培养基中的L-谷氨酸结晶，然后收集结晶的L-谷氨酸和在培养过程中沉淀的L-谷氨酸。
在一个实施方案中，当超过饱和浓度的L-谷氨酸沉淀时，溶解在培养基中的L-谷氨酸的浓度维持在恒定水平。因此，可以减少高浓度的L-谷氨酸对微生物的影响。因此，也可以繁殖具有进一步提高的L-谷氨酸生产能力的微生物。而且，由于L-谷氨酸以晶体的形式沉淀，会抑制由L-谷氨酸的积累造成的培养液酸化，由此可以明显降低用于维持培养基pH的碱的量。
实施例
在下文中，将结合下面的实施例更具体地解释本发明。
参考实施例1
<1>选择在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物
如下选择在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物。将从自然环境(包括土壤、果实、植物体和河水等)中获得的各1g的约500个样品悬浮于5ml无菌水中，并将其中的200μl涂布在20ml用HCl调节pH为4.0的固体培养基上。该培养基的组成如下：3g/L的葡萄糖、1g/L的硫酸铵、0.2g/L的七水硫酸镁、0.5g/L的磷酸二氢钾、0.2g/L的氯化钠、0.1g/L的二水氯化钙、0.01g的七水硫酸亚铁、0.01g/L的四水硫酸锰、0.72mg/L二水硫酸锌、0.64mg/L五水硫酸铜、0.72mg/L六水氯化钴、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L二水钼酸钠、50μg/L的生物素、50μg/L的泛酸钙、50μg/L的叶酸、50μg/L的肌醇、50μg/L的烟酸、50μg/L的对氨基苯甲酸、50μg/L的盐酸吡哆醇、50μg/L的核黄素、50μg/L的盐酸硫胺素、50mg/L环己酰亚胺和20g/L的琼脂。
将用上述样品涂布的培养基在28℃、37℃或50℃孵育2至4天，获得了378个形成菌落的菌株。
然后，将上述得到的各菌株接种在装有3mL含饱和浓度的L-谷氨酸的液体培养基(用HCl调节pH为4.0)的长16.5cm和直径14mm的试管中，并在摇动的情况下在28℃、37℃或50℃培养24小时至3天。然后，选择生长的菌株。前述培养基的组成如下：40g/L的葡萄糖、20g/L的硫酸铵、0.5g/L的七水硫酸镁、2g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的氯化钠、0.25g/L的二水氯化钙、0.02g的七水硫酸亚铁、0.02g/L的四水硫酸锰、0.72mg/L二水硫酸锌、0.64mg/L五水硫酸铜、0.72mg/L六水氯化钴、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L二水钼酸钠和2g/L的酵母提取物。
由此，成功地获得了78个在酸性环境中显示出L-谷氨酸抗性的微生物菌株。
<2>从在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物中选择显示出优越生长速率的菌株
将多种如上所述获得的在酸性环境中具有L-谷氨酸抗性的微生物分别接种在长16.5cm和直径14mm的装有3mL培养基(用HCl调节pH为4.0)的试管中，所述的培养基通过向M9培养基(Sambrook，J.，Fritsh、E.F.和Maniatis，T.，″Molecular Cloning″，Cold SpringHarbor Laboratory Press，美国，1989)中添加20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖获得，测定在一个时间段内的培养基的浊度，以选择显示良好生长速率的菌株。结果，作为显示良好生长的菌株，是从日本的Iwata-shi，shizuoka土壤中得到的AJ13355菌株。基于其上述的细菌学性质，将该菌株确定为成团肠杆菌。成团肠杆菌包括基于其16S rRNA等的核苷酸序列分析重新分类为成团泛菌、Pantoea ananatis、斯氏泛菌等的那些，AJ13355分类到其中的Pantoea ananatis。
<3>从Pantoea ananatis AJ13355菌株得到具有较少粘液分泌的菌株
由于在含糖的培养基中培养时，Pantoea ananatis AJ13355菌株进行细胞外粘液分泌，使操作效率不太好。因此，通过紫外线照射方法得到了具有较少粘液分泌的菌株(Miller J.H.等，″A Short Course inBacterial genetics；Laboratory Manual″，第150页，1992，ColdSpring Harbor Laboratory Press，美国)。
将Pantoea ananatis AJ13355菌株用紫外线在离60W紫外灯60cm远的位置进行照射分钟，并在LB培养基中培养过夜，以固定突变。稀释该诱变菌株，并接种在含5g/L的葡萄糖和20g/L的琼脂的LB培养基中，这样每板就会出现约100个菌落，并在倾斜约45度的板上在30℃下培养过夜，然后选择没有粘液流下的20个菌落。
菌株满足的条件是，即使在含5g/L的葡萄糖和20g/L的琼脂的LB培养基中经5次继代培养后，仍然没有出现回复体，且其表现出与在LB培养基、含5g/L的葡萄糖的LB培养基和添加了20g/L的L-谷氨酸和2g/L的葡萄糖、并用HCl调节pH为4.5的M9培养基(Sambrook.J等，Molecular Cloning，第2版，Cold Spring Harbor Press，美国，1989)中的亲本株等同的生长，从上面选择的菌株中选择出了SC17菌株。
<4>由Pantoea ananatis SC17菌株构建谷氨酸生产细菌
(1)由Pantoea ananatis SC17菌株制备αKGDH缺陷型菌株
由Pantoea ananatis SC17菌株制备出了αKGDH缺陷型的、具有增强的L-谷氨酸生物合成系统的菌株。
(i)克隆Pantoea ananatis AJ13355菌株的αKGDH基因(以后，称为“sucAB”)
通过从Pantoea ananatis AJ13355菌株的染色体DNA选择能补充大肠杆菌的αKGDH-E1亚单位基因(以后，称为“sucA”)的缺陷型菌株的乙酸-未同化性质的DNA片段，克隆了Pantoea ananatis AJ13355菌株的sucAB基因。
通过常用的从大肠杆菌提取染色体DNA的方法(Text forBioengineering Experiments，Society for Bioscience andBioengineering编，日本，第97-98页，Baifukan，1992)，分离了Pantoea ananatis AJ13355菌株的染色体DNA。pTWV228(抗氨苄青霉素)用作载体，这是Takara Shuzo Co.，Ltd的市售产品。
用T4连接酶连接EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和PstI消化的pTWV228，并用连接混合物转化sucA缺陷型大肠杆菌JRG465菌株(Herbert，J.等，Mol.Gen.Genetics.，105，182(1969))。从上述获得的转化菌株中选择能在乙酸盐基本培养基中生长的菌株，从其得到的菌株中提取质粒，命名为pTWVEK101。携带pTWVEK101的大肠杆菌JRG465菌株除了乙酸-未同化性质的特点以外，还恢复了琥珀酸或L-赖氨酸和L-蛋氨酸营养缺陷。这表明pTWVEK101含有Pantoeaananatis的sucA基因。
图1显示了pTWVEK101中的源自Pantoea ananatis的DNA片段的限制酶图。SEQ ID NO：1显示了图1的阴影线部分的测序结果。在该核苷酸序列中，发现了被认为是两个全长的ORF的核苷酸序列，和两个被认为是ORF的部分序列的核苷酸序列。SEQ ID NO：2-5中的每一个从5’端依次显示了可以由这些ORF或其部分序列编码的氨基酸序列。对它们进行同源性研究的结果，揭示了其核苷酸序列被确定为含琥珀酸脱氢酶铁-硫蛋白质基因(sdhB)的3’端部分序列、全长sucA和αKGDH-E2亚基基因(SucB基因)和琥珀酰CoA合成酶β亚基基因(sucC基因)的5’端部分序列的部分。当将从这些核苷酸序列推断出的氨基酸序列与源自大肠杆菌的那些序列(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；Biochemistry，24，第6245-6252页(1985))进行比较时，每种氨基酸序列彼此之间显示出非常高的同源性。另外，发现sdhB-sucA-sucB-sucC簇构建在Pantoea ananatis的染色体上，这与在大肠杆菌中一样(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；Biochemistry，24，第6245-6252页(1985))。
(ii)从Pantoea ananatis SC17菌株得到αKGDH缺陷型菌株
使用如上所述得到的Pantoea ananatis的sucAB基因进行同源重组，以获得Pantoea ananatis的αKGDH缺陷型菌株。
在用SphI消化pTWVEK101以切除含sucA的片段之后，该片段用Klenow片段(Takara Shuzo Co.，Ltd)平端化，并使用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo Co.，Ltd)连接EcoRI消化的和Klenow片段平端化的pBR322。使用限制酶BglII，在该酶的限制性识别位点(约位于sucA的中心)消化得到的质粒，用Klenow片段平端化，然后使用T4DNA连接酶再次连接。认为sucA基因变成无功能的，因为将移码突变导入到了通过上述步骤新构建的质粒的sucA中。
用限制酶ApaLI消化如上所述构建的质粒，且经琼脂糖凝胶电泳，将含导入了移码突变的sucA的DNA片段和源自pBR322的抗四环素基因回收。使用T4DNA连接酶再次连接回收的DNA片段，以构建用于破坏αKGDH基因的质粒。
通过电穿孔，使用如上所述获得的用于破坏αKGDH基因的质粒转化Pantoea ananatis SC17菌株(Miller J.H.等，A short Course inBacterial Genetics；Handbook，第279页，1992，Cold Spring HarborLaboratory Press，美国)，使用四环素抗性作为标记，得到了其中染色体上的sucA经同源重组被质粒的突变sucA所代替的菌株。得到的菌株命名为SC17sucA菌株。
为了确定SC17sucA菌株在αKGDH活性方面是有缺陷的，使用Reed等的方法(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，Methods in Enzymology，13，第55-61页(1969))，使用在LB培养基中培养至对数生长期的菌株的细胞，测定酶活性。结果，从SC17菌株检测到的αKGDH活性是0.073(ΔABS/min/mg蛋白)，而从SC17sucA菌株没有检测出αKGDH活性，由此确定sucA被如愿消除了。
(2)增强Pantoea ananatis SC17sucA菌株的L-谷氨酸生物合成系统
随后，将源自大肠杆菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脱氢酶基因导入SC17sucA菌株。
(i)制备源自大肠杆菌的具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒
将参照图2和3，解释制备具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的步骤。
用HindIII和SphI消化具有源自大肠杆菌的gdhA基因的质粒pBRGDH(日本专利申请公开号7-203980)，通过T4 DNA聚合酶处理平端化两端，然后纯化和回收具有gdhA基因的DNA片段。独立地用XbaI消化源自大肠杆菌的具有gltA基因和ppc基因的质粒pMWCP(WO97/08294)，然后使用T4DNA聚合酶将两端平端化。将其与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片段混合，并使用T4连接酶连接，以获得质粒pMWCPG，其相当于进一步含有gdhA基因的pMWCP(图2)。
同时，用NotI消化具有宽宿主范围的质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(日本专利申请公开号8-047397)，用T4DNA聚合酶处理并用PstI消化。用EcoT14I消化pBR322，用T4DNA聚合酶处理并用PstI消化。将两产物混合，并使用T4连接酶连接，以获得具有RSF1010的复制起点和抗四环素基因的质粒RSF-Tet(图3)。
然后，用EcoRI和PstI消化pMWCPG，纯化和回收具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片段。类似地用EcoRT和PstI消化RSF-Tet，纯化和回收具有RSF1010的复制起点的DNA片段。将这两个产物混合，并使用T4连接酶连接，以获得质粒RSFCPG，其对应于含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图4)。基于对源自大肠杆菌的gltA基因、ppc基因或gdhA基因缺陷型菌株的营养缺陷补充和各酶活性的测量，确定得到的质粒RSFCPG表达了gltA基因、ppc基因和gdhA基因。
(ii)制备具有源自乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒
如下构建具有源自乳发酵短杆菌的gltA基因的质粒。使用具有SEQIDNO：6和7所示的核苷酸序列的基于谷氨酸棒杆菌gltA基因的核苷酸序列制备的引物DNA(Microbiology，140，第1817-1828页(1994))，将乳发酵短杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板，进行PCR，以获得约3kb的gltA基因片段。将该片段插入SmaI消化的质粒pHSG399(购自Takara Shuzo Co.，Ltd)，以获得质粒pHSGCB(图5)。然后，用HindIII消化pHSGCB，将切除的约3kb的gltA基因片段插入用HindIII消化的质粒pSTV29(购自Takara Shuzo Co.，Ltd)，以获得质粒pSTVCB(图5)。通过测量Pantoea ananatis AJ13355菌株的酶活性，确定获得的质粒pSTVCB表达了gltA基因。
(iii)将RSFCPG和pSTVCB导入SC17 sucA菌株
通过电穿孔，用RSFCPG转化Pantoea ananatis SC17sucA菌株，以获得显示出四环素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG菌株。而且，通过电穿孔，用pSTVCB转化SC17sucA/RSFCPG菌株，以获得显示出氯霉素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。
<5>获得具有提高的在低pH环境中对L-谷氨酸的抗性的菌株
从Pantoea ananatis SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株分离出了具有提高的在低pH环境中对高浓度L-谷氨酸抗性的菌株(以后，也称为在低pH下具有高浓度Glu-抗性的菌株)。
将SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株在30℃、在LBG培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L的NaCl、5g/L葡萄糖)中培养过夜，并将用盐水洗涤的细胞适当稀释，并接种于M9-E培养基(4g/L葡萄糖、17g/L的Na2HPO4·12H2O、3g/L的KH2PO4、0.5g/L的NaCl、1g/L的NH4Cl、10mM的MgSO4、10μm的CaCl2、50mg/L的L-赖氨酸、50mg/L的L-蛋氨酸、50mg/L的DL-二氨基庚二酸、25mg/L四环素、25mg/L氯霉素、30g/L的L-谷氨酸，用氨水调节pH为4.5)平板上。在32℃培养2天之后，获得出现的菌落，即在低pH下具有高浓度Glu抗性的菌株。
对于获得的菌株，测定在M9-E液体培养基中的生长水平，在含5mlL-谷氨酸生产测试培养基(40g/L葡萄糖、20g/L的硫酸铵、0.5g/L的七水硫酸镁、2g/L的磷酸二氢钾、0.5g/L的氯化钠、0.25g/L的二水氯化钙、0.02g的七水硫酸亚铁、0.02g/L的四水硫酸锰、0.72mg/L二水硫酸锌、0.64mg/L五水硫酸铜、0.72mg/L六水氯化钴、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L二水钼酸钠、2g/L的酵母提取物、200mg/L L-盐酸赖氨酸、200mg/L L-蛋氨酸、200mg/L DL-α，ε-二氨基庚二酸、25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素)的50-ml体积的大试管中测试L-谷氨酸的生产能力。将表现出最佳生长水平和与其亲本株相同的L-谷氨酸生产能力的菌株，即SC17/RSFCPG+pSTVCB菌株，命名为Pantoea ananatisAJ13601。AJ13601菌株于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(现在为国际专利生物保藏机构，国立生命科学和人体技术研究所，Central 6，Higashi1-1-1，Tsukuba-shi，Ibaraki305-8566，日本)，收到的保藏号是FERM P-17516。然后根据布达佩斯条约的有关条款，在2000年7月6日转为国际保藏，收到的保藏号是FERM BP-7207。
实施例1：研究L-赖氨酸对最大饱和浓度的L-谷氨酸的影响
在含有25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素的LBG琼脂培养基(10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、10g/L的NaCl和15g/L琼脂)上，将Pantoea ananatis AJ13601菌株的细胞在30℃培养14小时，从一个平板上刮下细胞，并接种到300mL具有下述组成的、装在1L体积的发酵罐中的种子培养基中，在34℃、pH6.0的条件下进行种子培养。
[种子培养基的组成]
蔗糖 50g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
KH2PO4 2.0g/L
酵母提取物 4.0g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
L-盐酸赖氨酸 0.4g/L
DL-蛋氨酸 0.4g/L
DL-α，ε-二氨基庚二酸 0.4g/L
盐酸四环素 25mg/L
氯霉素 25mg/L
在培养过程中，通过加入氨气来调节pH至6.0。观察培养基中的糖耗尽作为指标，完成种子培养，将与20％体积主培养基对应的种子培养基接种到装在1L体积的发酵罐中的300ml主培养基中，在34℃、pH4.5的条件下进行主培养。主培养基的组成如下所示。
[主培养基的组成]
葡萄糖 50g/L
(NH4)2SO4 5.0g/L
MgSO4·7H2O 0.4g/L
KH2PO4 6.0g/L
NaCl 1.5g/L
FeSO4·7H2O 0.01g/L
MnSO4·5H2O 0.01g/L
L-盐酸赖氨酸 0.8g/L
DL-蛋氨酸 0.6g/L
DL-α，ε-二氨基庚二酸 0.6g/L
盐酸四环素 25mg/L
氯霉素 25mg/L
二水氯化钙 0.75g/L
在培养过程中，通过加入氨气来调节pH至4.5。培养基中的糖消耗并耗尽以后，连续加入700g/L葡萄糖水溶液(6ml/小时)。
当培养基中的L-谷氨酸浓度超过40g/L以后，向每300ml培养基中加入0-0.9g L-盐酸赖氨酸。然后，随着时间测量培养基的上清液中的L-谷氨酸浓度。该培养基的上清液是在10000XG离心培养基1分钟得到的上清液。另一方面，通过显微镜观察，确定在培养基中沉淀出来的晶体的多态性。培养基中的L-谷氨酸浓度随着培养时间而升高，上清液中的L-谷氨酸浓度也随着晶体的沉淀而降低。因此，上清液中的L-谷氨酸的最大浓度由其沉淀浓度决定。该结果如图6所示。
在pH4.5的培养系统中，44g/L的L-谷氨酸的β-型晶体在没有L-赖氨酸的培养基中沉淀。L-谷氨酸在pH4.5的溶解度是40g/L。因此，在加入种晶的情况下，应当在40g/L至44g/L的浓度范围内加入种晶。当L-谷氨酸在培养基中的生产速度是5g/L/h时，该范围对应着50分钟，所以考虑到分析误差，还需要非常精确的控制。相反地，在存在600mg/L的L-赖氨酸的系统中，β-型晶体发生沉淀的浓度增加到62g/L，允许加入种晶的范围也较大地扩展到40g/L至62g/L。当L-谷氨酸的生产速度是5g/L/h时，该范围对应着4小时，所以控制变得非常容易。而且，L-谷氨酸的超溶解度随着L-赖氨酸浓度的增加而增加(图6)。
认为上述现象发生的原因是，L-赖氨酸向L-谷氨酸的α-型晶体的结晶平面上的吸附会抑制晶体的生长。因此，需要较大的超饱和来实现晶体生长(包括核的生成)，使其足以合并谷氨酸浓度随着培养的增加。因此，猜想超饱和度随着L-赖氨酸浓度的增加而增加。
当加入培养基中的L-赖氨酸的浓度超过900mg/L时，发现即使不加入种晶，α-型晶体也会自然结晶。这是成立的，因为通过其在pH4.5会强烈吸附到β-型晶体的、而不是α-型晶体的表面的性质，L-赖氨酸会抑制晶体生长。因此，猜想由于存在一定浓度或更高的L-赖氨酸，使β-型晶体的结晶生长受到抑制，而α-型晶体则能结晶和生长。
(2)用L-赖氨酸控制L-谷氨酸晶体的晶形
接着，将L-谷氨酸溶解到水中，得到的超饱和度为2(Css/Cs[-])，然后改变pH和加入培养基的L-赖氨酸浓度，以研究在冷却结晶系统(34℃)中沉淀出的L-谷氨酸晶体的晶形。通过加入氨水调节pH。另外，加入L-苯丙氨酸来代替L-赖氨酸，进行相同的实验。结果如图7所示。而且，将在每种pH下的溶解度和谷氨酸浓度列在表1中。
如图7所示，在pH4.5，发现通过加入L-赖氨酸沉淀出的晶形可以控制成α-型。另一方面，L-苯丙氨酸在pH3.2表现出相同的效果，但是在pH4.5或更高不能观察到这样的效果。这二者的差别可能因为氨基酸在每种pH诱导不同的解离状态。
表1
| pH | 溶解度(g/100g H<sub>2</sub>O) | L-谷氨酸浓度(g/100g H<sub>2</sub>O) |
| 3.24.54.75 | 1.24610 | 2.481220 |
工业实用性
在通过发酵生产和积累L-谷氨酸、同时在培养基中沉淀L-谷氨酸来生产L-谷氨酸的方法中，通过使培养基中存在一定量的或更多的L-赖氨酸，无需加入种晶即可沉淀出L-谷氨酸的α-型晶体。
另外，在向培养基中加入种晶的情况下，通过使培养基中存在L-赖氨酸，可以容易地控制加入种晶的时机。
序列表
<110>Ajinomoto Co.，Inc.
(120>生产L-谷氨酸的方法
<130>C2330PC4010
<150>JP 2003-128722
<151>2003-05-07
<160>13
<170>PatentIn Ver.2.0
<210>1
<211>4556
<212>DNA
<213>Pantoea ananatis
<220>
<221>CDS
<222>(2)..(121)
<220>
<221>CDS
<222>(322)..(3129)
<220>
<221>CDS
<222>(3145)..(4368)
<220>
<221>CDS
<222>(4437)..(4556)
<400>1
t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49
Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val
1 5 10 15
tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg 97
Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
20 25 30
atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148
Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala
35
ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208
gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268
aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324
Met
1
cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372
Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly
5 10 15
gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420
Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp
20 25 30
cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468
Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro
35 40 45
ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516
Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr
50 55 60 65
ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc 564
Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr
70 75 80
gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612
Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn
85 90 95
gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660
Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly
100 105 110
ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708
Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp
115 120 125
ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc 756
Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala
130 135 140 145
att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804
Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys
150 155 160
cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac atc aat aac 852
Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn
165 170 175
acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc 900
Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser
180 185 190
cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948
Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu
195 200 205
acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996
Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly
210 215 220 225
gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044
Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu
230 235 240
cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta 1092
Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val
245 250 255
ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg 1140
Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu
260 265 270
ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188
Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys
275 280 285
gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg 1236
Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser
290 295 300 305
gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284
Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn
310 315 320
ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt 1332
Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg
325 330 335
gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct 1380
Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro
340 345 350
atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428
Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val Gln
355 360 365
gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg 1476
Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr
370 375 380 385
gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524
Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro
390 395 400
aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg 1572
Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val
405 410 415
ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620
Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala
420 425 430
ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat 1668
Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp
435 440 445
gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg 1716
Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala
450 455 460 465
gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag 1764
Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys
470 475 480
cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812
His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly
485 490 495
gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat 1860
Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp
500 505 510
gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc 1908
Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser
515 520 525
ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956
Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu
530 535 540 545
cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004
Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu
550 555 560
cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc 2052
Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala
565 570 575
aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100
Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe
580 585 590
gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148
Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu
595 600 605
ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196
Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe
610 615 620 625
ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244
Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr
630 635 640
acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292
Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp
645 650 655
gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340
Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr
660 665 670
gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388
Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly
675 680 685
gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct 2436
Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser
690 695 700 705
ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484
Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro
710 715 720
cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa 2532
His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu
725 730 735
cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580
Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro
740 745 750
tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628
Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg
755 760 765
ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc 2676
Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg
770 775 780 785
cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724
His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe
790 795 800
cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat cog cag ggc gtg aaa 2772
Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys
805 810 815
cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820
Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln
820 825 830
cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag 2868
Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln
835 840 845
ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916
Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr
850 855 860 865
tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964
Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln
870 875 880
ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012
Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe
885 890 895
ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc 3060
Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala
900 905 910
gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108
Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn
915 920 925
gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat 3159
Asp Ala Leu Asn Val Asn Met Ser Ser Val Asp
930 935 1 5
att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207
Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala
10 15 20
acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc 3255
Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile
25 30 35
gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303
Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala
40 45 50
gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351
Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr
55 60 65
tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399
Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys
70 75 80 85
gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447
Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg
90 95 100
cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg 3495
Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala
105 110 115
atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa 3543
Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys
120 125 130
ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591
Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His
135 140 145
ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639
Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly
150 155 160 165
gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt 3687
Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val
170 175 180
ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735
Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala
185 190 195
aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag 3783
Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys
200 205 210
ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831
Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg
215 220 225
cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc 3879
His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val
230 235 240 245
gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa 3927
Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu
250 255 260
gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg 3975
Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr
265 270 275
cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc 4023
Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser
280 285 290
atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071
Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg
295 300 305
gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc 4119
Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile
310 315 320 325
acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac 4167
Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn
330 335 340
ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215
Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro
345 350 355
atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct 4263
Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala
360 365 370
ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat 4311
Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr
375 380 385
ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg 4359
Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu
390 395 400 405
gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415
Asp Val
gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag 4466
Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln
1 5 10
ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514
Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr
15 20 25
aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca 4556
Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala
30 35 40丂
<210>2
<211>39
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>2
Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val
1 5 10 15
Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser
20 25 30
Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala
35
<210>3
<211>935
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>3
Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10 15
Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr
20 25 30
Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu
35 40 45
Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu
50 55 60
Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val
65 70 75 80
Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile
85 90 95
Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu
100 105 110
Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His
115 120 125
Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe
130 135 140
Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu
145 150 155 160
Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn
165 170 175
Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala
180 185 190
Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu
195 200 205
Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro
210 215 220
Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met
225 230 235 240
Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val
245 250 255
Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val
260 265 270
Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His
275 280 285
Lys Glu His Leu Gly Thr Gly AsP Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser
290 295 300
Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe
305 310 315 320
Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val
325 330 335
Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu
340 345 350
Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val
355 360 365
Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly
370 375 380
Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn
385 390 395 400
Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met
405 410 415
Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val
420 425 430
Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 435
440 445
Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu
450 455 460
Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys
465 470 475 480
Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu
485 490 495
Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg
500 505 510
Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met
515 520 525
Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp
530 535 540
Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala
545 550 555 560
Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val
565 570 575
Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala
580 585 590
Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp
595 600 605
Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr
610 615 620
Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr
625 630 635 640
Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val
645 650 655
Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly
660 665 670
Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe
675 680 685
Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser
690 695 700
Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu
705 710 715 720
Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu
725 730 735
Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val
740 745 750
Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu
755 760 765
Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu
770 775 780
Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser
785 790 795 800
Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val
805 810 815
Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu
820 825 830
Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu
835 840 845
Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala
850 855 860
Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn
865 870 875 880
Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro
885 890 895
Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro
900 905 910
Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val
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Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn
930 935
<210>4
<211>407
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>4
Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala
1 5 10 15
Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu
35 40 45
Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu
50 55 60
Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Glr Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly
65 70 75 80
Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr
85 90 95
Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp
100 105 110
Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp
115 120 125
Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu
130 135 140
Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala
145 150 155 160
Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg
165 170 175
Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu
180 185 190
Arg Leu Leu Glu Ala Lys AsnSer Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn
195 200 205
Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp
210 215 220
Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr
225 230 235 240
Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala
245 250 255
Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser
260 265 270
Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp
275 280 285
Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu
290 295 300
Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly
305 310 315 320
Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser
325 330 335
Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala
340 345 350
Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro
355 360 365
Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg
370 375 380
Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro
385 390 395 400
Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val
405
<210>5
<211>40
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>5
Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly
1 5 10 15
Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu
20 25 30
Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala
35 40
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>6
gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 30
<210>7
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：引物
<400>7
aagcttatcg acgctcccct ccccaccgt t 30
<210>8
<211>16214
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：质粒RSFCPG
<400>8
gaattccgcc agaaccttca tcagcagcat aaacaggtgc agtgaacagc agagatacgg 60
ccagtgcggc caatgttttt tgtcctttaa acataacaga gtcctttaag gatatagaat 120
aggggtatag ctacgccaga atatcgtatt tgattattgc tagtttttag ttttgcttaa 180
aaaatattgt tagttttatt aaattggaaa actaaattat tggtatcatg aattgttgta 240
tgatgataaa tatagggggg atatgataga cgtcattttc atagggttat aaaatgcgac 300
taccatgaag tttttaattc aaagtattgg gttgctgata atttgagctg ttctattctt 360
tttaaatatc tatataggtc tgttaatgga ttttattttt acaagttttt tgtgtttagg 420
catataaaaa tcaagcccgc catatgaacg gcgggttaaa atatttacaa cttagcaatc 480
gaaccattaa cgcttgatat cgcttttaaa gtcgcgtttt tcatatcctg tatacagctg 540
acgcggacgg gcaatcttca taccgtcact gtgcatttcg ctccagtggg cgatccagcc 600
aacggtacgt gccattgcga aaatgacggt gaacatggaa gacggaatac ccatcgcttt 660
caggatgata ccagagtaga aatcgacgtt cgggtacagt ttcttctcga taaagtacgg 720
gtcgttcagc gcgatgtttt ccagctccat agccacttcc agcaggtcat ccttcgtgcc 780
cagctctttc agcacttcat ggcaggtttc acgcattacg gtggcgcgcg ggtcgtaatt 840
tttgtacacg cggtgaccga agcccatcag gcggaaagaa tcatttttgt ctttcgcacg 900
acgaaaaaat tccggaatgt gtttaacgga gctgatttct tccagcattt tcagcgccgc 960
ttcgttagca ccgccgtgcg caggtcccca cagtgaagca atacctgctg cgatacaggc 1020
aaacgggttc gcacccgaag agccagcggt acgcacggtg gaggtagagg cgttctgttc 1080
atggtcagcg tgcaggatca gaatacggtc catagcacgt tccagaatcg gattaacttc 1140
atacggttcg cacggcgtgg agaacatcat attcaggaag ttaccggcgt aggagagatc 1200
gttgcgcggg taaacaaatg gctgaccaat ggaatacttg taacacatcg cggccatggt 1260
cggcattttc gacagcaggc ggaacgcggc aatttcacgg tgacgaggat tgttaacatc 1320
cagcgagtcg tgatagaacg ccgccagcgc gccggtaata ccacacatga ctgccattgg 1380
atgcgagtcg cgacggaaag catggaacag acgggtaatc tgctcgtgga tcatggtatg 1440
acgggtcacc gtagttttaa attcgtcata ctgttcctga gtcggttttt caccattcag 1500
caggatgtaa caaacttcca ggtagttaga atcggtcgcc agctgatcga tcgggaaacc 1560
gcggtgcagc aaaatacctt catcaccatc aataaaagta attttagatt cgcaggatgc 1620
ggttgaagtg aagcctgggt caaaggtgaa cacacctttt gaaccgagag tacggatatc 1680
aataacatct tgacccagcg tgcctttcag cacatccagt tcaacagctg tatccccgtt 1740
gagggtgagt tttgcttttg tatcagccat ttaaggtctc cttagcgcct tattgcgtaa 1800
gactgccgga acttaaattt gccttcgcac atcaacctgg ctttacccgt tttttatttg 1860
gctcgccgct ctgtgaaaga ggggaaaacc tgggtacaga gctctgggcg cttgcaggta 1920
aaggatccat tgatgacgaa taaatggcga atcaagtact tagcaatccg aattattaaa 1980
cttgtctacc actaataact gtcccgaatg aattggtcaa tactccacac tgttacataa 2040
gttaatctta ggtgaaatac cgacttcata acttttacgc attatatgct tttcctggta 2100
atgtttgtaa caactttgtt gaatgattgt caaattagat gattaaaaat taaataaatg 2160
ttgttatcgt gacctggatc actgttcagg ataaaacccg acaaactata tgtaggttaa 2220
ttgtaatgat tttgtgaaca gcctatactg ccgccagtct ccggaacacc ctgcaatccc 2280
gagccaccca gcgttgtaac gtgtcgtttt cgcatctgga agcagtgttt tgcatgacgc 2340
gcagttatag aaaggacgct gtctgacccg caagcagacc ggaggaagga aatcccgacg 2400
tcggggatcc tctagagctt tagcgtctga ggttatcgca atttggttat gagattactc 2460
tcgttattaa tttgctttcc tgggtcattt ttttcttgct taccgtcaca ttcttgatgg 2520
tatagtcgaa aactgcaaaa gcacatgaca taaacaacat aagcacaatc gtattaatat 2580
ataagggttt tatatctatg gatcagacat attctctgga gtcattcctc aaccatgtcc 2640
aaaagcgcga cccgaatcaa accgagttcg cgcaagccgt tcgtgaagta atgaccacac 2700
tctggccttt tcttgaacaa aatccaaaat atcgccagat gtcattactg gagcgtctgg 2760
ttgaaccgga gcgcgtgatc cagtttcgcg tggtatgggt tgatgatcgc aaccagatac 2820
aggtcaaccg tgcatggcgt gtgcagttca gctctgccat cggcccgtac aaaggcggta 2880
tgcgcttcca tccgtcagtt aacctttcca ttctcaaatt cctcggcttt gaacaaacct 2940
tcaaaaatgc cctgactact ctgccgatgg gcggtggtaa aggcggcagc gatttcgatc 3000
cgaaaggaaa aagcgaaggt gaagtgatgc gtttttgcca ggcgctgatg actgaactgt 3060
atcgccacct gggcgcggat accgacgttc cggcaggtga tatcggggtt ggtggtcgtg 3120
aagtcggctt tatggcgggg atgatgaaaa agctctccaa caataccgcc tgcgtcttca 3180
ccggtaaggg cctttcattt ggcggcagtc ttattcgccc ggaagctacc ggctacggtc 3240
tggtttattt cacagaagca atgctaaaac gccacggtat gggttttgaa gggatgcgcg 3300
tttccgtttc tggctccggc aacgtcgccc agtacgctat cgaaaaagcg atggaatttg 3360
gtgctcgtgt gatcactgcg tcagactcca gcggcactgt agttgatgaa agcggattca 3420
cgaaagagaa actggcacgt cttatcgaaa tcaaagccag ccgcgatggt cgagtggcag 3480
attacgccaa agaatttggt ctggtctatc tcgaaggcca acagccgtgg tctctaccgg 3540
ttgatatcgc cctgccttgc gccacccaga atgaactgga tgttgacgcc gcgcatcagc 3600
ttatcgctaa tggcgttaaa gccgtcgccg aaggggcaaa tatgccgacc accatcgaag 3660
cgactgaact gttccagcag gcaggcgtac tatttgcacc gggtaaagcg gctaatgctg 3720
gtggcgtcgc tacatcgggc ctggaaatgc cacaaaacgc tgcgcgcctg ggctggaaag 3780
ccgagaaagt tgacgcacgt ttgcatcaca tcatgctgga tatccaccat gcctgtgttg 3840
agcatggtgg tgaaggtgag caaaccaact acgtgcaggg cgcgaacatt gccggttttg 3900
tgaaggttgc cgatgcgatg ctggcgcagg gtgtgattta agttgtaaat gcctgatggc 3960
gctacgctta tcaggcctac aaatgggcac aattcattgc agttacgctc taatgtaggc 4020
cgggcaagcg cagcgccccc ggcaaaattt caggcgttta tgagtattta acggatgatg 4080
ctccccacgg aacatttctt atgggccaac ggcatttctt actgtagtgc tcccaaaact 4140
gcttgtcgta acgataacac gcttcaagtt cagcatccgt taactttctg cggactcacg 4200
cgcgcagcac tatgccagta aagaaatccc atttgactat ttttttgata atcttcttcg 4260
ctttcgaaca actcgtgcgc ctttcgagaa gctagagtcg actcgccaat caccagcact 4320
aaagtgcgcg gttcgttacc cgattcatct ttgaaattag ccagtggcgg caaggcatta 4380
ttttcattca gtaactttgt tagcgagttt agttgctgac gatactgata atagccggtc 4440
aggaattgcc acggtgcggc aggctccata cgcgaggcca ggttatccaa cgttttctca 4500
aacggcttgt ttttgataaa cgtattcatg gcgatcggat gcagaatcaa gccataaagc 4560
agggcaaaag agacaacata acgccacggc tttggaatat agaccgggcg caggcgtgtc 4620
cacagcagaa ctgccaccgc cgtataggcc agcgcgataa gcacaatttt caggctgaaa 4680
tactggctta aatactcgct ggcttcgttg gtgttggttt cgaacatcac aaacagaacg 4740
ctctgcgaga actcctgacc gtagatgacg tagtagcaca gcgccgccag agaggccgcc 4800
catagcacca cgccgattac tgcggcaata attttaatcc gcttcggaaa gaggaatacc 4860
gggatcaacc acagcgaact gaataacagc gagtcgcgaa tgccgttagt gccactataa 4920
ccactgatgt aaataatggc ctgtagcaga gtagagaaaa accaaaagta gagcagtgcc 4980
caacccaggg ctttccagct aaaaagaggt ttagcctgga cttctgtgga atgcatagta 5040
agaacctgtc ttgaaaaaat atcgccgaat gtaacgacaa ttccttaagg atatctgaag 5100
gtatattcag aatttgaata aaatgcagac agaaatatat tgaaaacgag ggtgttagaa 5160
cagaagtatt tcagaaaacc ctcgcgcaaa agcacgaggg tttgcagaag aggaagatta 5220
gccggtatta cgcatacctg ccgcaatccc ggcaatagtg accattaacg cttgttcgac 5280
gcgaggatcc ggttcctggc cttctttttc tgcctggcgg gagcggtgca gcaactcggc 5340
ctgcaatacg ttcagcgggt cggtgtaaat attccgtagc tgaatagact ctgcaatcca 5400
cggcagatcg gccatcagat gggaatcgtt ggcaatcgcc agcaccactt tgatgtcttc 5460
ttcttgcagg ttgcgtaact ctttacctaa cggccacagt gctttgtcta ccaggcgttg 5520
gtcatagtat tccgccagcc acaggtctgc tttggcgaag accatctcca gcatgccgag 5580
acgcgtcgag aagaatggcc aatcgcggca catagcctcc agctcgctct gtttgccgtc 5640
ttcgaccact ttttgcagcg ccgtacctgc acccagccag gcggggagca tcagacggtt 5700
ttgcgtccag gcgaagatcc acggaatggc gcgtagtgac tcgacgccgc cggttgggcg 5760
acgtttcgcc ggacgtgaac ccaacggcag tttgcccagt tcttgttccg gcgtagcgga 5820
gcggaagtaa ggcacaaaat ctttgttttc acgtacgtag ccgcggtaga catcgcagga 5880
gatgactgac agttcatcca taatgcgacg ccagctctct ttcggctccg gcggtggcag 5940
caggttggct tccagaatcg ccccggtata aagcgacagg ctgctgacgg tgatttctgg 6000
cagaccatat ttaaagcgga tcatctcgcc ctgttcggtt acgcgcaggc cgcctttcag 6060
gcttcctggc ggttgtgaca gcagcgccgc atgagcaggt gcgccgccgc gaccaatgga 6120
accgccgcga ccgtggaaca acgtcagctc aatacccgct ttttcgcagg ttttgattaa 6180
tgcatcctgt gcctgatatt gcgcccagga agctgccatc actcccgcat cttttgctga 6240
gtcggaatag ccaatcatca ccatctgttt gccctgaatc aggccacgat accagtcaat 6300
attgagcagc tgggtcatga catcgttggc gttgttcaga tcatcgaggg tttcaaacag 6360
cggagcaacc ggcatcgcaa acccgatacc cgcttctttc agcagcaggt ggacagccag 6420
tacgtcggac ggcgttttcg ccatcgagat cacgtaggcg gcaatggagc cttgcggtgc 6480
ttcggcaatc acctggcagg tatcgagcac ttcgcgcgtt tcggcgcttg gttgccagtt 6540
gcgcggcaga agcggacgtt tggagttcag ttcgcggatc aggaacgcct gtttgtcggc 6600
ctctgaccag ctttcgtagt cgccgatacc gaggtagcgg gtcagctcgc ccagcgcttc 6660
ggtatgacgc gtgctctcct gacggatatc aatacggacc agcggtacgc cgaaacattt 6720
cacgcggcgc agggtgtcga gcagatcgcc gttggcgata atacccatgc cacacgcctg 6780
aagtgactgg tagcaagcgt agagcggttc ccacagttct tcgttttgtg tcagcaggcc 6840
ttctggtttt ggcagttctt cgcctttcag gcgcgcttcc agccatgcct gtgtcgccat 6900
caggcgagaa cgcaggtttt tcatcagata gcgatacggt tctgcggcac cttcttcgcc 6960
aaccagcgcc agcagttcag gggtcgcttc aaccatcgac agttcagaaa ccagcacctg 7020
aatatctttc aggaacaaat cggtggcttt ccagcggctg agtagcagga cgtggcgggt 7080
gatatcggca gtgacgttcg ggttgccgtc gcggtcgccg cccatccacg aagtaaaacg 7140
gaccggaaca aattcgacgg gcagtttgta gccgaggttc tcttccagtt gttcgttcag 7200
ttcgcgcagg taatttggta cgccttgcca caggctgttt tccactacgg caaagcccca 7260
tttggcttca tctaccgggc ttggacgcag cttacggatt tcatcggtat gccatgactg 7320
ggcgatcaac tggcgcaggc gacgcatcag ctggttgtgt tcgtagtcag cgatatcttt 7380
gttatcgagc tgttttaaac aggcgttcac ttccaccatt ttgtggatca gtgtacgacg 7440
ggtaatttcg gttgggtgag ccgtgaggac cagttccagc gacagcgatt ccactgcttt 7500
tttgatggtg tcttcgctca gttccggctg gtttttcagt ttacgcaggg tgcgggcgat 7560
cacttccggg ttgctggcag cttcgccttt cggcgaaatg ctgtggtatt gctcggcggt 7620
gttggccagg ttcaggaact gactaaacgc acgcgcaacg ggcagcagct cgtcgttcga 7680
caaattttgt aaggtggtga gcaactcctg gcggttagca tcattgccag cgcgtgaaga 7740
tttcgacaac ttacggatag tttctacgcg ttcaagaatg tgttctccca acgcatcctt 7800
gatggtttct cccagcactt tgccgagcat actgacatta ctacgcaatg cggaatattg 7860
ttcgttcata ttaccccaga caccccatct tatcgtttga tagccctgta tccttcacgt 7920
cgcattggcg cgaatatgct cgggctttgc ttttcgtcgt cttttataaa gccacgtaaa 7980
agcggtgacg tcaaatgctg cgaaatcgct tcagcaaacg aataaatagc aggaatttac 8040
gtcattaaat tcacgacgct ttaaataagc gtaacttatg gaaatgttaa aaaatcgccc 8100
caagtaacac caaaggtgta ggtcggataa gatgcgcaag tatcgcatcc gacattattg 8160
cggcactgga gtttggcaac agtgccggat gcggcgcgag cgccttatcc ggcctacagt 8220
tgggcatcgt ttgagtcact gtcggtcgga taagatgcgc aagtatcgca tccgacatta 8280
ttgcggcact ggagtttggc aacagtgccg gatgcggcgc gagcgcctta tccggcctac 8340
ggttgggcat cgtttgagtc actgtaggtc ggataagatg cgcaagcatc gcatccgaca 8400
ttattgcggc actggagttt ggcaacagcg ccggatgcgg cgcgagcgcc ttatccggcc 8460
tacgttttaa tgccagcaaa aatggtgaat tacctgggtt atcagttcgc gggtgggctt 8520
gataaaccgt gtttccagat attcatcagg ttgatgagcc tgattaattg agccaggccc 8580
caacaccagc gtcgggcata acgtttgaat aaacggcgct tcggtacagt agttcaccac 8640
ttcggttttt gctccgagca atttctcaac cacttcaacc agttgatgat tcggtgggca 8700
ttcatagcca gggatcggcg gatgcagctc gtcgacctgc aggagcagaa gagcatacat 8760
ctggaagcaa agccaggaaa gcggcctatg gagctgtgcg gcagcgctca gtaggcaatt 8820
tttcaaaata ttgttaagcc ttttctgagc atggtatttt tcatggtatt accaattagc 8880
aggaaaataa gccattgaat ataaaagata aaaatgtctt gtttacaata gagtgggggg 8940
ggtcagcctg ccgccttggg ccgggtgatg tcgtacttgc ccgccgcgaa ctcggttacc 9000
gtccagccca gcgcgaccag ctccggcaac gcctcgcgca cccgctggcg gcgcttgcgc 9060
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ttgccggttt tgccggggtc gatccagcca cacagccgct ggtgcagcag gcgggcggtt 9180
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acggcctgcg cgatcaaggg gttcagggcc acgtacaggc gcccgtccgc ctcgtcgctg 9300
gcgtactccg acagcagccg aaacccctgc cgcttgcggc cattctgggc gatgatggat 9360
accttccaaa ggcgctcgat gcagtcctgt atgtgcttga gcgccccacc actatcgacc 9420
tctgccccga tttcctttgc cagcgcccga tagctacctt tgaccacatg gcattcagcg 9480
gtgacggcct cccacttggg ttccaggaac agccggagct gccgtccgcc ttcggtcttg 9540
ggttccgggc caagcactag gccattaggc ccagccatgg ccaccagccc ttgcaggatg 9600
cgcagatcat cagcgcccag cggctccggg ccgctgaact cgatccgctt gccgtcgccg 9660
tagtcatacg tcacgtccag cttgctgcgc ttgcgctcgc cccgcttgag ggcacggaac 9720
aggccggggg ccagacagtg cgccgggtcg tgccggacgt ggctgaggct gtgcttgttc 9780
ttaggcttca ccacggggca cccccttgct cttgcgctgc ctctccagca cggcgggctt 9840
gagcaccccg ccgtcatgcc gcctgaacca ccgatcagcg aacggtgcgc catagttggc 9900
cttgctcaca ccgaagcgga cgaagaaccg gcgctggtcg tcgtccacac cccattcctc 9960
ggcctcggcg ctggtcatgc tcgacaggta ggactgccag cggatgttat cgaccagtac 10020
cgagctgccc cggctggcct gctgctggtc gcctgcgccc atcatggccg cgcccttgct 10080
ggcatggtgc aggaacacga tagagcaccc ggtatcggcg gcgatggcct ccatgcgacc 10140
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tgcgccgctc tgagttcttc caggcactcg cgcagcgcct cgtattcgtc gtcggtcagc 10740
cagaacttgc gctgacgcat ccctttggcc ttcatgcgct cggcatatcg cgcttggcgt 10800
acagcgtcag ggctggccag caggtcgccg gtctgcttgt ccttttggtc tttcatatca 10860
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tgacgtataa ccaaagccac cgggcaacca atagcccttg tcacttttga tcaggtagac 11040
cgaccctgaa gcgctttttt cgtattccat aaaaccccct tctgtgcgtg agtactcata 11100
gtataacagg cgtgagtacc aacgcaagca ctacatgctg aaatctggcc cgcccctgtc 11160
catgcctcgc tggcggggtg ccggtgcccg tgccagctcg gcccgcgcaa gctggacgct 11220
gggcagaccc atgaccttgc tgacggtgcg ctcgatgtaa tccgcttcgt ggccgggctt 11280
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gccccggctg gccagcttct gcgcggcgat aaagtcgcac ttgctgaggt catcaccgaa 11400
gcgcttgacc agcccggcca tctcgctgcg gtactcgtcc agcgccgtgc gccggtggcg 11460
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cttgcccttg gattcacgca gcagcaccca cggctgataa ccggcgcggg tggtgtgctt 11640
gtccttgcgg ttggtgaagc ccgccaagcg gccatagtgg cggctgtcgg cgctggccgg 11700
gtcggcgtcg tactcgctgg ccagcgtccg ggcaatctgc ccccgaagtt caccgcctgc 11760
ggcgtcggcc accttgaccc atgcctgata gttcttcggg ctggtttcca ctaccagggc 11820
aggctcccgg ccctcggctt tcatgtcatc caggtcaaac tcgctgaggt cgtccaccag 11880
caccagacca tgccgctcct gctcggcggg cctgatatac acgtcattgc cctgggcatt 11940
catccgcttg agccatggcg tgttctggag cacttcggcg gctgaccatt cccggttcat 12000
catctggccg gtggtggcgt ccctgacgcc gatatcgaag cgctcacagc ccatggcctt 12060
gagctgtcgg cctatggcct gcaaagtcct gtcgttcttc atcgggccac caagcgcagc 12120
cagatcgagc cgtcctcggt tgtcagtggc gtcaggtcga gcaagagcaa cgatgcgatc 12180
agcagcacca ccgtaggcat catggaagcc agcatcacgg ttagccatag cttccagtgc 12240
cacccccgcg acgcgctccg ggcgctctgc gcggcgctgc tcacctcggc ggctacctcc 12300
cgcaactctt tggccagctc cacccatgcc gcccctgtct ggcgctgggc tttcagccac 12360
tccgccgcct gcgcctcgct ggcctgctgg gtctggctca tgacctgccg ggcttcgtcg 12420
gccagtgtcg ccatgctctg ggccagcggt tcgatctgct ccgctaactc gttgatgcct 12480
ctggatttct tcactctgtc gattgcgttc atggtctatt gcctcccggt attcctgtaa 12540
gtcgatgatc tgggcgttgg cggtgtcgat gttcagggcc acgtctgccc ggtcggtgcg 12600
gatgccccgg ccttccatct ccaccacgtt cggccccagg tgaacaccgg gcaggcgctc 12660
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tgcccggttg gcatggtcgg cccatgcctc gcgggtctgc tcaagccatg ccttgggctt 12780
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taacaatggg gtgtcaagat ggttaagggg agcaacaagg cggcggatcg gctggccaag 13500
ctcgaagaac aacgagcgcg aatcaatgcc gaaattcagc gggtgcgggc aagggaacag 13560
cagcaagagc gcaagaacga aacaaggcgc aaggtgctgg tgggggccat gattttggcc 13620
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ggggaaaggc cgctaaagcg gctaaaagcg ctccagcgta tttctgcggg gtttggtgtg 13860
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ctagcgcagc gaatagacca gctatccggc ctctggccgg gcatattggg caagggcagc 13980
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ggatttttcc aacaccccgc cagcccccgc ccctgctggg tttgcaggtt tgggggcgtg 14100
acagttattg caggggttcg tgacagttat tgcagggggg cgtgacagtt attgcagggg 14160
ttcgtgacag ttagtacggg agtgacgggc actggctggc aatgtctagc aacggcaggc 14220
atttcggctg agggtaaaag aactttccgc taagcgatag actgtatgta aacacagtat 14280
tgcaaggacg cggaacatgc ctcatgtggc ggccaggacg gccagccggg atcgggatac 14340
tggtcgttac cagagccacc gacccgagca aacccttctc tatcagatcg ttgacgagta 14400
ttacccggca ttcgctgcgc ttatggcaga gcagggaaag gaattgccgg gctatgtgca 14460
acgggaattt gaagaatttc tccaatgcgg gcggctggag catggctttc tacgggttcg 14520
ctgcgagtct tgccacgccg agcacctggt cgctttcagc tgtaagcgtc gcggtttctg 14580
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cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg 15180
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gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca 15360
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cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga 15480
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tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat agtggctcca agtagcgaag 15900
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gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata gtgactggcg atgctgtcgg 16020
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catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt gttagatttc atacacggtg 16140
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gctgtcaaac atga 16214
<210>9
<211>427
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>9
Met Ala Asp Thr Lys Ala Lys Leu Thr Leu Asn Gly Asp Thr Ala Val
1 5 10 15
Glu Leu Asp Val Leu Lys Gly Thr Leu Gly Gln Asp Val Ile Asp Ile
20 25 30
Arg Thr Leu Gly Ser Lys Gly Val Phe Thr Phe Asp Pro Gly Phe Thr
35 40 45
Ser Thr Ala Ser Cys Glu Ser Lys Ile Thr Phe Ile Asp Gly Asp Glu
50 55 60
Gly Ile Leu Leu His Arg Gly Phe Pro Ile Asp Gln Leu Ala Thr Asp
65 70 75 80
Ser Asn Tyr Leu Glu Val Cys Tyr Ile Leu Leu Asn Gly Glu Lys Pro
85 90 95
Thr Gln Glu Gln Tyr Asp Glu Phe Lys Thr Thr Val Thr Arg His Thr
100 105 110
Met Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Leu Phe His Ala Phe Arg Arg Asp
115 120 125
Ser His Pro Met Ala Val Met Cys Gly Ile Thr Gly Ala Leu Ala Ala
130 135 140
Phe Tyr His Asp Ser Leu Asp Val Asn Asn Pro Arg His Arg Glu Ile
145 150 155 160
Ala Ala Phe Arg Leu Leu Ser Lys Met Pro Thr Met Ala Ala Met Cys
165 170 175
Tyr Lys Tyr Ser Ile Gly Gln Pro Phe Val Tyr Pro Arg Asn Asp Leu
180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Asn Phe Leu Asn Met Met Phe Ser Thr Pro Cys Glu
195 200 205
Pro Tyr Glu Val Asn Pro Ile Leu Glu Arg Ala Met Asp Arg Ile Leu
210 215 220
Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Ala Ser Thr Ser Thr Val Arg
225 230 235 240
Thr Ala Gly Ser Ser Gly Ala Asn Pro Phe Ala Cys Ile Ala Ala Gly
245 250 255
Ile Ala Ser Leu Trp Gly Pro Ala His Gly Gly Ala Asn Glu Ala Ala
260 265 270
Leu Lys Met Leu Glu Glu Ile Ser Ser Val Lys His Ile Pro Glu Phe
275 280 285
Phe Arg Arg Ala Lys Asp Lys Asn Asp Ser Phe Arg Leu Met Gly Phe
290 295 300
Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Thr Val Met Arg
305 310 315 320
Glu Thr Cys His Glu Val Leu Lys Glu Leu Gly Thr Lys Asp Asp Leu
325 330 335
Leu Glu Val Ala Met Glu Leu Glu Asn Ile Ala Leu Asn Asp Pro Tyr
340 345 350
Phe Ile Glu Lys Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Ser Gly Ile
355 360 365
Ile Leu Lys Ala Met Gly Ile Pro Ser Ser Met Phe Thr Val Ile Phe
370 375 380
Ala Met Ala Arg Thr Val Gly Trp Ile Ala His Trp Ser Glu Met His
385 390 395 400
Ser Asp Gly Met Lys Ile Ala Arg Pro Arg Gln Leu Tyr Thr Gly Tyr
405 410 415
Glu Lys Arg Asp Phe Lys Ser Asp Ile Lys Arg
420 425
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<211>447
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>10
Met Asp Gln Thr Tyr Ser Leu Glu Ser Phe Leu Asn His Val Gln Lys
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Arg Asp Pro Asn Gln Thr Glu Phe Ala Gln Ala Val Arg Glu Val Met
20 25 30
Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Glu Gln Asn Pro Lys Tyr Arg Gln Met
35 40 45
Ser Leu Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Gln Phe Arg
50 55 60
Val Val Trp Val Asp Asp Arg Asn Gln Ile Gln Val Asn Arg Ala Trp
65 70 75 80
Arg Val Gln Phe Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Met Arg
85 90 95
Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu
100 105 110
Gln Thr Phe Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys
115 120 125
Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu Gly Glu Val Met
130 135 140
Arg Phe Cys Gln Ala Leu Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Leu Gly Ala
145 150 155 160
Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Val
165 170 175
Gly Phe Met Ala Gly Met Met Lys Lys Leu Ser Asn Asn Thr Ala Cys
180 185 190
Val Phe Thr Gly Lys Gly Leu Ser Phe Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro
195 200 205
Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Thr Glu Ala Met Leu Lys
210 215 220
Arg His Gly Met Gly Phe Glu Gly Met Arg Val Ser Val Ser Gly Ser
225 230 235 240
Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Met Glu Phe Gly Ala
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Arg Val Ile Thr Ala Ser Asp Ser Ser Gly Thr Val Val Asp Glu Ser
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Gly Phe Thr Lys Glu Lys Leu Ala Arg Leu Ile Glu Ile Lys Ala Ser
275 280 285
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Leu Glu Gly Gln Gln Pro Trp Ser Leu Pro Val Asp Ile Ala Leu Pro
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Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met
370 375 380
Pro Gln Asn Ala Ala Arg Leu Gly Trp Lys Ala Glu Lys Val Asp Ala
385 390 395 400
Arg Leu His His Ile Met Leu Asp Ile His His Ala Cys Val Glu His
405 410 415
Gly Gly Glu Gly Glu Gln Thr Asn Tyr Val Gln Gly Ala Asn Ile Ala
420 425 430
Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile
435 440 445
<210>1l
<211>883
<212>PRT
<213>Pantoea ananatis
<400>11
Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly
1 5 10 15
Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu
20 25 30
Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly
35 40 45
Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser
50 55 60
Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn
65 70 75 80
Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu
85 90 95
Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys
100 105 110
Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser
115 120 125
Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg
130 135 140
Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln
145 150 155 160
Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg
165 170 175
Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg
180 185 190
Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val
195 200 205
Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu
210 215 220
Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe
225 230 235 240
Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn
245 250 255
Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg
260 265 270
Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser
275 280 285
Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly
290 295 300
Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg
305 310 315 320
Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly
325 330 335
Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Asn Glu Glu Leu
340 345 350
Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met
355 360 365
Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys
370 375 380
Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr
385 390 395 400
Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly
405 410 415
Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg
420 425 430
Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser
435 440 445
Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala
450 455 460
Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro
465 470 475 480
Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly
485 490 495
Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn
500 505 510
Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg
515 520 525
Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser
530 535 540
Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala
545 550 555 560
Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr
565 570 575
Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala
580 585 590
His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu
595 600 605
Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro
610 615 620
Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu
625 630 635 640
Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile
645 650 655
Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val
660 665 670
Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu
675 680 685
Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg
690 695 700
Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala
705 710 715 720
Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr
725 730 735
Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala
740 745 750
Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu
755 760 765
Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln
770 775 780
Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn
785 790 795 800
Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser
805 810 815
His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg
820 825 830
Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His
835 840 845
Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val
850 855 860
Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg
865 870 875 880
Asn Thr Gly
<210>12
<211>6038
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>人工序列说明：质粒pSTVCB
<220>
<221>CDS
<222>(2129)..(3439)
<400>12
cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc 60
gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc 120
cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat 180
ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc 240
accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg 300
ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat 360
gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat 420
gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt 480
gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgaaa gcaaattcga 540
cccggtcgtc ggttcagggc agggtcgtta aatagccgct tatgtctatt gctggtttac 600
cggtttattg actaccggaa gcagtgtgac cgtgtgcttc tcaaatgcct gaggccagtt 660
tgctcaggct ctccccgtgg aggtaataat tgacgatatg atcatttatt ctgcctccca 720
gagcctgata aaaacggtta gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc 780
cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgcttg tttcggcgtg 840
ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ctgccggcac ctgtcctacg 900
agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac 960
cggaaggagc taccggacag cggtgcggac tgttgtaact cagaataaga aatgaggccg 1020
ctcatggcgt tccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1080
gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 1140
gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 1200
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca 1260
agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccgtc gacaatagcc tgaatctgtt 1320
ctggtcgaac cttggaaggt ccgcagccga aacggccgtc gccagggatg aactcagagg 1380
gcagggtggg gaagtcggtc atgtcttcgg gcaactttct gcgcttggaa gtaaaagggc 1440
cagggatcgt taacgatctg acccaacaac tataaccctg aagctgtcag ttcctagcac 1500
cctagattct tcacgcagtc tcccaaacga tgaaaaacgc ccaaaactgg cgacaccgaa 1560
ctattgaaaa cgcggggatt agttgaccag ccaccaattt gggggtagct caaagttttg 1620
caaagttttc aatttctagg ttgttaatat cccctgaggt tgcgttatag ggtggcgaat 1680
tgcatgggga aagctactcg gcacccatcc ttgtcgcgtg catcacaaac tttgctaaac 1740
tgtgcaccag tccacttatt gtgggatttt taatgcctta aaggccagca tttttcaccc 1800
tctagcgggg ttgaatgctg gccttgaggg tgcagaacta aatagcagca catcggcaca 1860
attgatctga gttctattgg cgtgaccgtg gctactgatt acggtggctg tgggtggtcg 1920
ggaatgatgt aaccaacgtg attgtggggg aattggctct cacttcggat atggctaaac 1980
cgcatttatc ggtatagcgt gttaaccgga ccagattggg aaagaaatgt gtcgagtaac 2040
aaaaactgac atgcgcttgg cgcatcccag ttggtaagaa taaacgggac tacttccgta 2100
atccggaaga gtttttttcc gaacaaat atg ttt gaa agg gat atc gtg gct 2152
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala
1 5
act gat aac aac aag gct gtc ctg cac tac ccc ggt ggc gag ttc gaa 2200
Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu
10 15 20
atg gac atc atc gag gct tct gag ggt aac aac ggt gtt gtc ctg ggc 2248
Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly
25 30 35 40
aag atg ctg tct gag act gga ctg atc act ttt gac cca ggt tat gtg 2296
Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val
45 50 55
agc act ggc tcc acc gag tcg aag atc acc tac atc gat ggc gat gcg 2344
Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala
60 65 70
gga atc ctg cgt tac cgc ggc tat gac atc gct gat ctg gct gag aat 2392
Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn
75 80 85
gcc acc ttc aac gag gtt tct tac cta ctt atc aac ggt gag cta cca 2440
Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro
90 95 100
acc cca gat gag ctt cac aag ttt aac gac gag att cgc cac cac acc 2488
Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr
105 110 115 120
ctt ctg gac gag gac ttc aag tcc cag ttc aac gtg ttc cca cgc gac 2536
Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp
125 130 135
gct cac cca atg gca acc ttg gct tcc tcg gtt aac att ttg tct acc 2584
Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr
140 145 150
tac tac cag gac cag ctg aac cca ctc gat gag gca cag ctt gat aag 2632
Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys
155 160 165
gca acc gtt cgc ctc atg gca aag gtt cca atg ctg gct gcg tac gca 2680
Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala
170 175 180
cac cgc gca cgc aag ggt gct cct tac atg tac cca gac aac tcc ctc 2728
His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu
185 190 195 200
aat gcg cgt gag aac ttc ctg cgc atg atg ttc ggt tac cca acc gag 2776
Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu
205 210 215
cca tac gag atc gac cca atc atg gtc aag gct ctg gac aag ctg ctc 2824
Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu
220 225 230
atc ctg cac gct gac cac gag cag aac tgc tcc acc tcc acc gtt cgt 2872
Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg
235 240 245
atg atc ggt tcc gca cag gcc aac atg ttt gtc tcc atc gct ggt ggc 2920
Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly
250 255 260
atc aac gct ctg tcc ggc cca ctg cac ggt ggc gca aac cag gct gtt 2968
Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val
265 270 275 280
ctg gag atg ctc gaa gac atc aag agc aac cac ggt ggc gac gca acc 3016
Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr
285 290 295
gag ttc atg aac aag gtc aag aac aag gaa gac ggc gtc cgc ctc atg 3064
Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met
300 305 310
ggc ttc gga cac cgc gtt tac aag aac tac gat cca cgt gca gca atc 3112
Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile
315 320 325
gtc aag gag acc gca cac gag atc ctc gag cac ctc ggt ggc gac gat 3160
Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp
330 335 340
ctt ctg gat ctg gca atc aag ctg gaa gaa att gca ctg gct gat gat 3208
Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp
345 350 355 360
tac ttc atc tcc cgc aag ctc tac ccg aac gta gac ttc tac acc ggc 3256
Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly
365 370 375
ctg atc tac cgc gca atg ggc ttc cca act gac ttc ttc acc gta ttg 3304
Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu
380 385 390
ttc gca atc ggt cgt ctg cca gga tgg atc gct cac tac cgc gag cag 3352
Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln
395 400 405
ctc ggt gca gca ggc aac aag atc aac cgc cca cgc cag gtc tac acc 3400
Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr
410 415 420
ggc aac gaa tcc cgc aag ttg gtt cct cgc gag gag cgc taaatttagc 3449
Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val Pro Arg Glu Glu Arg
425 430 435
ggatgattct cgttcaactt cggccgaagc cacttcgtct gtcataatga cagggatggt 3509
ttcggccgtt tttgcatgaa accaaaaaat acgattttca aggagcatgt acagcacatg 3569
gaaaagccac agattgagct accggtcggt ccagcaccgg aagatctcgt aatctctgac 3629
atcatcgttg gcgaaggagc agaagcccgc ccaggtggag aagttgaggt ccactatgtg 3689
ggcgttgact ttgaaaccgg cgaggagttt gactcttcct gggatcgtgg acagaccagc 3749
cagttcccac tcaacggcct cattgcaggt tggcaagagg gaattccagg catgaaggtc 3809
ggcggacgtc gtcagctgac cattccgcca gaggctgctt acggccctga gggttccggc 3869
cacccactgt ctggccgtac cctggtgttc atcatcgatt tgatcagcgc ataattttct 3929
ttactgcgct aaacgctcaa atcgtgtgaa gcgactgtcg cgtcccgccc tctccggatt 3989
gttatccaat tcggagaggg cgttgctgat tgtgccgaga atttcttcaa caaagtgctc 4049
ggtttcggcg acgatcccgt cgataagccc ttggcttaaa agtgcgtgcg cctgcacgcc 4109
ttgtcgctct atgatttccg cggcgtggtt ggtgtcgcgg aagaggatgg ccgaggcgcc 4169
ctctggtggc aatgcggaca gccacgcgtt ttcggccgcg tagaccagat cggcgggcag 4229
catggccagc gcgccaccgc caacgccctg accaataatg accgaaacgg tggggagggg 4289
agcgtcgata agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccggg taccgagctc 4349
gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 4409
taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 4469
cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgagcttatc gatgataagc 4529
tgtcaaacat gagaattaca acttatatcg tatggggctg acttcaggtg ctacatttga 4589
agagataaat tgcactgaaa tctagaaata ttttatctga ttaataagat gatcttcttg 4649
agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac gaaaaaaccg ccttgcaggg 4709
cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact ggcttggagg 4769
agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa ccggcgcatg acttcaagac 4829
taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg tgcttttgca tgtctttccg 4889
ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcggactga acggggggtt 4949
cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga actgagtgtc aggcgtggaa 5009
tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa accgaaaggc aggaacagga 5069
gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 5129
gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg agcctatgga 5189
aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt atcttcctgg catcttccag 5249
gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc agtcgaacga ccgagcgtag 5309
cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac atattctgct gacgcaccgg 5369
tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga caccctcatc agtgccaaca 5429
tagtaagcca gtatacactc cgctagcgct gatgtccggc ggtgcttttg ccgttacgca 5489
ccaccccgtc agtagctgaa caggagggac agctgataga aacagaagcc actggagcac 5549
ctcaaaaaca ccatcataca ctaaatcagt aagttggcag catcacccga cgcactttgc 5609
gccgaataaa tacctgtgac ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct 5669
gttgataccg ggaagccctg ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta 5729
agaggttcca actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta 5789
tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 5849
gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 5909
tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 5969
aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 6029
ccggaattt 6038
<210>13
<211>437
<212>PRT
<213>乳发酵短杆菌
<400>13
Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu
1 5 10 15
His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu
20 25 30
Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr 6ly Leu
35 40 45
Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys
50 55 60
Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr
65 70 75 80
Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr
85 90 95
Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe
100 105 110
Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser
115 120 125
Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala
130 135 140
Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro
145 150 155 160
Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys
165 170 175
Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro
180 185 190
Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg
195 200 205
Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met
210 215 220
Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln
225 230 235 240
Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn
245 250 255
Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu
260 265 270
His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys
275 280 285
Ser Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Glu Phe Met Asn Lys Val Lys Asn
290 295 300
Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys
305 310 315 320
Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile
325 330 335
Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu
340 345 350
Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr
355 360 365
Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe
370 375 380
Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly
385 390 395 400
Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile
405 410 415
Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Asn Glu Ser Arg Lys Leu Val
420 425 430
Pro Arg Glu Glu Arg
435
Claims (5)
1.发酵生产L-谷氨酸的方法，其包括：
在pH3.0-5.0的液体培养基中培养微生物，所述培养基包含在培养基至少被L-谷氨酸饱和时能被所述微生物代谢的碳源，所述微生物是选自泛菌属、肠杆菌属、克雷白氏菌属的产L-谷氨酸微生物，
当培养基中的L-谷氨酸浓度低于发生L-谷氨酸的自然结晶的浓度时，向培养基中加入L-赖氨酸，从而沉淀出L-谷氨酸的α-型晶体；并且
收集L-谷氨酸的α-型晶体。
2.如权利要求1的方法，其中微生物属于泛菌属。
3.如权利要求2的方法，其中微生物是Pantoea ananatis。
4.如权利要求1至3中的任一项的方法，其中加入的L-赖氨酸的量是900mg/L或更多。
5.如权利要求1至3中的任一项的方法，其中在发生L-谷氨酸的自然结晶之前进行添加作为种晶的L-谷氨酸的α-型晶体的操作。
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