JP2001333769A - 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 低ｐＨ条件下でＬ−グルタミン酸を生産する
微生物を検索、育種し、得られた微生物を用いてＬ−グ
ルタミン酸を析出させながら発酵生産する方法を提供す
ること。 【解決手段】 特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グル
タミン酸及び炭素源を含む液体培地で炭素源を代謝する
ことができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタ
ミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積
する能力を有する微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が
析出する条件に調整された液体培地に培養し、該培養液
中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生成蓄積させる
ことにより、Ｌ−グルタミン酸を製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、析出を伴う発酵法
によるＬ−グルタミン酸の製造法に関する。Ｌ−グルタ
ミン酸は調味料原料等として広く用いられている。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−グルタミン酸は、主としてブレビバ
クテリウム属、コリネバクテリウム属、ミクロバクテリ
ウム属に属するいわゆるコリネ型Ｌ−グルタミン酸生産
菌またはそれらの変異株を用いた発酵法により製造され
ている（アミノ酸発酵、学会出版センター、１９５〜２
１５頁、１９８６年）。その他の菌株を用いた発酵法に
よるＬ−グルタミン酸の製造法としては、バチルス属、
ストレプトミセス属、ペニシリウム属等の微生物を用い
る方法（米国特許第３，２２０，９２９号）、シュード
モナス属、アースロバクター属、セラチア属、キャンデ
ィダ属等の微生物を用いる方法（米国特許第３，５６
３，８５７号）、バチルス属、シュードモナス属、セラ
チア属、アエロバクター・アエロゲネス（現エンテロバ
クター・アエロゲネス）等の微生物を用いる方法（特公
昭３２−９３９３号）、エシェリヒア・コリの変異株を
用いる方法（特開平５−２４４９７０号）等が知られて
いる。また、本発明者らは、クレブシエラ属、エルビニ
ア属又はパントテア属に属する微生物を用いたＬ−グル
タミン酸の製造法を提案している（特開２０００−１０
６８６９号）。

【０００３】また、組換えＤＮＡ技術によりＬ−グルタ
ミン酸の生合成酵素の活性を増強することによって、Ｌ
−グルタミン酸の生産能を増加させる種々の技術が開示
されている。例えば、コリネバクテリウム属またはブレ
ビバクテリウム属細菌において、エシェリヒア・コリ又
はコリネバクテリウム・グルタミクム由来のクエン酸シ
ンターゼをコードする遺伝子の導入が、Ｌ−グルタミン
酸生産能の増強に効果的であったことが報告されている
（特公平７−１２１２２８号）。また、特開昭６１−２
６８１８５号公報には、コリネバクテリウム属細菌由来
のグルタミン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含む組換え体
ＤＮＡを保有した細胞が開示されている。さらに、特開
昭６３−２１４１８９号公報には、グルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ遺伝
子、アコニット酸ヒドラターゼ遺伝子、及びクエン酸シ
ンターゼ遺伝子を増幅することによって、Ｌ−グルタミ
ン酸の生産能を増加させる技術が開示されている。

【０００４】上記のような微生物の育種や製造法の改良
により、Ｌ−グルタミン酸の生産性はかなり高まっては
いるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さ
らに安価かつ効率的なＬ−グルタミン酸の製造法の開発
が求められている。

【０００５】一方、培養液中に蓄積するＬ−アミノ酸を
晶析せしめながら発酵を行う方法が知られている（特開
昭６２−２８８号）。この方法は、培養液中に蓄積する
Ｌ−アミノ酸を析出させることにより、培養液中のＬ−
アミノ酸の濃度を一定量以下に維持するというものであ
る。具体的には、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン又
はＬ−ロイシンは、培養の温度及びｐＨの調整、又は界
面活性剤の培地への添加によって、発酵中に析出する。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】上記のように、Ｌ−ア
ミノ酸を析出せしめながら発酵を行う方法が知られてい
るが、同方法に好適なアミノ酸は、比較的水溶性の低い
アミノ酸であって、Ｌ−グルタミン酸のように水溶性の
高いアミノ酸に適用した例は知られていない。また、Ｌ
−グルタミン酸を析出させるためには培地を低ｐＨにす
る必要があるが、前記のようなＬ−グルタミン酸生産菌
は酸性条件下では生育できず、Ｌ−グルタミン酸発酵は
中性で行われており（米国特許第3,220,929号、第3,03
2,474号、K.C. Chao & J.W. Foster, J. Bacteriol., 7
7, 715-725 (1959)）、析出を伴うＬ−グルタミン酸の
発酵生産は知られていない。さらに、ほとんどの好酸菌
の生育が酢酸、乳酸、コハク酸等の有機酸により阻害さ
れることが知られている（大島泰郎監修「極限環境微生
物ハンドブック」第２３１頁、SCIENCE FORUM；R.M. Bo
richewski, J. Bacteriol., 93, 597-599 1967)等）。
したがって、同じく有機酸であるＬ−グルタミン酸に対
して多くの微生物が酸性条件下で感受性であると考えら
れ、酸性条件下でＬ−グルタミン酸生産能を有する微生
物の検索自体、試みられたという報告はない。

【０００７】本発明は、上記のような現状に対し、低ｐ
Ｈ条件下でＬ−グルタミン酸を生産する微生物を検索、
育種し、得られた微生物を用いてＬ−グルタミン酸を析
出させながら発酵生産する方法を提供することを課題と
するものである。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、発酵法に
よるＬ−グルタミン酸の生産性向上に関する研究の過程
で、培地中に蓄積された高濃度のＬ−グルタミン酸によ
る生産性の阻害が、生産性向上の障害の一つとなってい
ると考えた。例えば、微生物細胞はＬ−グルタミン酸の
排出系と取り込み系を有しているが、一旦培地中に排出
されたＬ−グルタミン酸が再び細胞内に取り込まれる
と、生産効率が低下するばかりでなく、Ｌ−グルタミン
酸の生合成反応が阻害される結果にもなる。そして、こ
のようなＬ−グルタミン酸の高濃度蓄積による生産性の
阻害を回避するために、酸性条件下、かつ、高濃度のＬ
−グルタミン酸存在下で増殖できる微生物をスクリーニ
ングしたところ、同性質を有する微生物を土壌から分離
することに成功し、本発明を完成するに至った。

【０００９】すなわち本発明は、以下のとおりである。 （１）特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グルタミン酸
及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝することが
でき、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グルタミン酸
の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄積する能
力を有する微生物。 （２）前記液体培地で生育できる（１）の微生物。 （３）前記ｐＨが５．０又はそれ以下である（１）又は
（２）の微生物。 （４）下記の性質の少なくとも一方を有する（１）〜
（３）のいずれかの微生物。 （ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の
活性が高められている。 （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生
合成経路から分岐してＬ−グルタミン酸以外の化合物を
生成する反応を触媒する酵素の活性が低下または欠損し
ている。 （５）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素
が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピルベー
トカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒドロゲナ
ーゼから選ばれる少なくとも一つである（４）の微生
物。 （６）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−
グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵
素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼである（４）
又は（５）の微生物。 （７）微生物がエンテロバクター属に属することを特徴
とする（１）〜（６）のいずれかの微生物。 （８）エンテロバクター・アグロメランスである（７）
の微生物。 （９）糖を含有する培地で培養したときに菌体外に生成
する粘液質が野生株よりも少ない変異を有する（８）の
微生物。 （１０）（１）〜（９）のいずれかの微生物を、ｐＨが
Ｌ−グルタミン酸が析出する条件に調整された液体培地
に培養し、該培地中にＬ−グルタミン酸を析出させなが
ら生成蓄積させることを特徴とする発酵法によるＬ−グ
ルタミン酸の製造法。 （１１）液体培地中にＬ−グルタミン酸を析出させなが
ら発酵生産するのに適した微生物をスクリーニングする
方法であって、飽和濃度のＬ−グルタミン酸及び炭素源
を含む酸性に調製された培地に微生物を含む試料を接種
し、前記炭素源を代謝できる菌株を選抜することを特徴
とする方法。 （１２）前記炭素源を代謝できる菌株として、前記培地
で生育することができる菌株を選抜することを特徴とす
る（１１）の方法。 （１３）前記培地のｐＨが５．０以下である（１１）又
は（１２）の方法。

【００１０】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。
本発明の微生物は、（１）特定のｐＨにおいて飽和濃度
のＬ−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で炭素源
を代謝することができ、かつ、（２）前記ｐＨの液体培
地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グ
ルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物である。

【００１１】「飽和濃度」とは、液体培地がＬ−グルタ
ミン酸で飽和しているときの液体培地に溶解しているＬ
−グルタミン酸の濃度をいう。

【００１２】以下に、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ
−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地で炭素源を代
謝することができる微生物のスクリーニング法を示す。
微生物を含む試料を、特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ
−グルタミン酸及び炭素源を含む液体培地に接種し、炭
素源を代謝する菌株を選抜する。特定のｐＨとは、特に
制限されないが、通常、約５．０以下、好ましくは約
４．５以下、さらに好ましくは約４．３以下である。本
発明の微生物はＬ−グルタミン酸を析出させながら発酵
生産するのに用いられるものであるが、前記ｐＨが高す
ぎると、析出させるのに十分なＬ−グルタミン酸を微生
物に生産させることが困難になる。したがってｐＨは前
記の範囲が好ましい。

【００１３】Ｌ−グルタミン酸を含む水溶液のｐＨを低
下させると、Ｌ−グルタミン酸はγ−カルボキシル基の
ｐＫａ（４．２５、２５℃）付近で溶解度は著しく減少
し、等電点（ｐＨ３．２）で溶解度は最も低くなり、飽
和濃度を越えるＬ−グルタミン酸は析出する。培地組成
によっても異なるが、通常には、Ｌ−グルタミン酸は約
３０℃においては、ｐＨ３．２では１０〜２０ｇ／Ｌ、
ｐＨ４．０では３０〜４０ｇ／Ｌ、ｐＨ４．７では５０
〜６０ｇ／Ｌ溶解する。尚、ｐＨが一定の値を下回ると
Ｌ−グルタミン酸を析出させる効果は頭打ちになるの
で、通常３．０以下にする必要はない。しかし、ｐＨが
３．０以下であっても差し支えない。

【００１４】「炭素源を代謝できる」とは、増殖できる
か、あるいは増殖しなくても炭素源を消費することがで
きることをいい、すなわち、糖類、有機酸類等の炭素源
を異化することをいう。具体的には、例えば、飽和濃度
のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、好まし
くはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ４．３
〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体培地中で、
適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０℃にて、２
〜４日間培養したときに増殖する微生物は、同培地中で
炭素源を代謝できる微生物である。さらに、例えば、飽
和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ５．０〜４．０、
好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さらに好ましくはｐＨ
４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ４．０の液体合成
培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３７℃又は５０
℃にて、２〜４日間培養したときに増殖せずとも、培地
中の炭素源を消費する微生物は、同培地中で炭素源を代
謝できる微生物である。

【００１５】炭素源を代謝できる微生物は、上記液体培
地で生育できる微生物を包含する。「生育できる」と
は、増殖できるか、あるいは増殖しなくてもＬ−グルタ
ミン酸を生産することができることをいう。具体的に
は、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ
５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さら
に好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ
４．０の液体培地中で、適当な温度、例えば２８℃、３
７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに増殖す
る微生物は、同培地中で生育できる微生物である。さら
に、例えば、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含むｐＨ
５．０〜４．０、好ましくはｐＨ４．５〜４．０、さら
に好ましくはｐＨ４．３〜４．０、特に好ましくはｐＨ
４．０の液体合成培地中で、適当な温度、例えば２８
℃、３７℃又は５０℃にて、２〜４日間培養したときに
増殖せずとも、培地中のＬ−グルタミン酸の量を増加さ
せる微生物は、同培地中で生育できる微生物である。

【００１６】上記の選抜は、同じ条件で、又はｐＨもし
くはＬ−グルタミン酸の濃度を変えて２回又は３回以上
繰り返してもよい。また、初期の選抜は、飽和濃度より
低い濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行い、後の選
抜を飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む培地で行っても
よい。さらに、増殖速度に優れる菌株等、好ましい特性
を有する菌株を選抜する操作を行ってもよい。

【００１７】本発明の微生物は、上記性質に加えて、液
体培地中にＬ−グルタミン酸の飽和濃度を越える量のＬ
−グルタミン酸を蓄積する能力を有する微生物である。
前記液体培地のｐＨは、前記（１）の性質を有する微生
物のスクリーニングに用いた培地のｐＨと同じか、又は
それに近いｐＨであることが好ましい。通常、微生物は
ｐＨが低くなると高濃度のＬ−グルタミン酸に対して感
受性となるため、Ｌ−グルタミン酸に対する耐性という
観点からはｐＨは低くない方が好ましいが、Ｌ−グルタ
ミン酸を析出させながら生産させるという観点からは、
ｐＨは低い方が好ましい。これらの条件を満足するｐＨ
条件としては、３〜５、好ましくは４〜５、より好まし
くは４．０〜４．７、さらに好ましくは４．０〜４．
５、特に好ましくは４．０〜４．３が挙げられる。

【００１８】本発明の微生物又はその育種の材料として
は、例えば、エンテロバクター（Enterobacter）属、ク
レブシエラ（Klebsiella）属、セラチア（Serratia）
属、パントテア（Pantoea）属、エルビニア（Erwinia）
属、エシェリヒア（Escherichia）属、コリネバクテリ
ウム（Corynebacterium）属、アリサイクロバチルス（A
licyclobacillus）属、バチルス（Bacillus）属、サッ
カロマイセス（Saccharomyces）属等に属する微生物が
挙げられる。これらの中ではエンテロバクター属に属す
る微生物が好ましい。以下、本発明の微生物について、
エンテロバクター属に属する微生物を中心に説明する
が、本発明はエンテロバクター属に限られず他の属に属
する微生物にも同様に適用され得る。

【００１９】エンテロバクター属に属する微生物として
具体的には、エンテロバクター・アグロメランス（Ente
robacter agglomerans）が、好ましくはエンテロバクタ
ー・アグロメランスＡＪ１３３５５株が挙げられる。同
株は、静岡県磐田市の土壌から、低ｐＨでＬ−グルタミ
ン酸及び炭素源を含む培地で増殖できる株として分離さ
れた株である。

【００２０】ＡＪ１３３５５の生理的性質を記す。 （１）グラム染色性：陰性 （２）酸素に対する挙動：通性嫌気性 （３）カタラーゼ：ポジティブ （４）オキシダーゼ：ネガティブ （５）硝酸還元能：ネガティブ （６）フォゲス−プロスカウエル試験：ポジティブ （７）メチルレッド試験：ネガティブ （８）ウレアーゼ：ネガティブ （９）インドール生成：ポジティブ （１０）運動性：有り （１１）ＴＳＩ培地での硫化水素生成：微弱な活性あり （１２）β−ガラクトシダーゼ：ポジティブ

【００２１】（１３）糖資化性： アラビノース：ポジティブ シュークロース：ポジティブ ラクトース：ポジティブ キシロース：ポジティブ ソルビトール：ポジティブ イノシトール：ポジティブ トレハロース：ポジティブ マルトース：ポジティブ グルコース：ポジティブ アドニトール：ネガティブ ラフィノース：ポジティブ サリシン：ネガティブ メリビオース：ポジティブ

【００２２】（１４）グリセロール資化性：ポジティブ （１５）有機酸資化性： クエン酸：ポジティブ 酒石酸：ネガティブ グルコン酸：ポジティブ 酢酸：ポジティブ マロン酸：ネガティブ

【００２３】（１６）アルギニンデヒドラターゼ：ネガ
ティブ （１７）オルチンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１８）リジンデカルボキシラーゼ：ネガティブ （１９）フェニルアラニンデアミナーゼ：ネガティブ （２０）色素形成 黄色 （２１）ゼラチン液化能：ポジティブ （２２）生育ｐＨ ｐＨ４．０生育可、ｐＨ４．５〜７
生育良好 （２３）生育温度 ２５℃生育良好、３０℃生育良好、
３７℃生育良好、４２℃生育可、４５℃生育不可

【００２４】これらの菌学的性質からＡＪ１３３５５は
エンテロバクター・アグロメランスと判定された。

【００２５】エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１
３３５５は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術
院生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−
１６６４４として寄託され、平成１１年１月１１日にブ
ダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号Ｆ
ＥＲＭ ＢＰ−６６１４が付与されている。

【００２６】本発明の微生物は、元来Ｌ−グルタミン酸
生産能を有していてもよいし、変異処理又は組換えＤＮ
Ａ技術等による育種によってＬ−グルタミン酸生産能を
付与、又は増強したものであってもよい。

【００２７】Ｌ−グルタミン酸生産能は、例えば、Ｌ−
グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の活性を高め
ることによって、付与又は増強することができる。ま
た、Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−グ
ルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素
の活性を低下または欠損させることによっても、Ｌ−グ
ルタミン酸生産能を増強することができる。

【００２８】Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する
酵素としては、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（以下、
「ＧＤＨ」ともいう）、グルタミンシンセターゼ、グル
タミン酸シンターゼ、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ、
アコニット酸ヒドラターゼ、クエン酸シンターゼ（以
下、「ＣＳ」ともいう）、ホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（以下、「ＰＥＰＣ」ともいう）、ピル
ビン酸デヒドロゲナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、エノラ
ーゼ、ホスホグリセロムターゼ、ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、フルクトースビ
スリン酸アルドラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コースリン酸イソメラーゼ等が挙げられる。これらの酵
素の中では、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨのいずれか１
種または２種もしくは３種が好ましい。さらに、本発明
の微生物においては、ＣＳ、ＰＥＰＣおよびＧＤＨの３
種の酵素の活性がともに高められていることが好まし
い。特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
のＣＳは、α−ケトグルタル酸、Ｌ−グルタミン酸及び
ＮＡＤＨによる阻害を受けないため、好ましいものであ
る。

【００２９】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、例えば、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨをコードす
る遺伝子を適当なプラスミド上にクローニングし、得ら
れたプラスミドを用いて宿主微生物を形質転換すればよ
い。形質転換株の細胞内のＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨを
コードする遺伝子（以下、おのおのをこの順に「ｇｌｔ
Ａ遺伝子」、「ｐｐｃ遺伝子」、「ｇｄｈＡ遺伝子」と
略する）のコピー数が上昇し、その結果ＣＳ、ＰＥＰＣ
及びＧＤＨ活性が高められる。

【００３０】クローニングされたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、単独または任意の
２種または３種の組合わせで、上記出発親株に導入され
る。２種または３種の遺伝子を導入する場合には、一種
類のプラスミド上に２種又は３種の遺伝子がクローン化
されて宿主に導入されるか、あるいは共存可能な２種類
または３種類のプラスミド上に別々にクローン化されて
宿主に導入される。

【００３１】尚、同種の酵素をコードする遺伝子であっ
て、由来が異なる２又は３以上の遺伝子を同一の宿主に
導入してもよい。

【００３２】上記プラスミドとしては、例えばエンテロ
バクター属等に属する微生物の細胞中で自律複製可能な
プラスミドであれば特に制限されないが、例えばpUC1
9、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG3
98、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC
177、pACYC184等が挙げられる。他にもファージＤＮＡ
のベクターも利用できる。

【００３３】形質転換は、例えば、D.M.Morrisonの方法
（Methods in Enzymology 68, 326(1979)）、受容菌細
胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過性を増す方
法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,53,159(197
0)）、あるいはエレクトロポレーション法（Miller J.
H., “A Short Course in Bacterial Genetics”,Cold
Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 1992）等に
より行うことができる。

【００３４】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
ことは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ
遺伝子を、宿主となる上記出発親株の染色体ＤＮＡ上に
多コピー存在させることによっても達成できる。エンテ
ロバクター属等に属する微生物の染色体ＤＮＡ上にｇｌ
ｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子を多
コピーで導入するには、レペッティブＤＮＡ、転移因子
の端部に存在するインバーティッド・リピート等、染色
体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列が利用できる。ある
いは、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ
遺伝子をトランスポゾンに搭載して、これを転移させて
染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。
形質転換株の細胞内のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、
またはｇｄｈＡ遺伝子のコピー数が上昇し、その結果Ｃ
Ｓ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性が高められる。

【００３５】コピー数を上昇させるｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子の供給源となる生物
としては、ＣＳ、ＰＥＰＣ及びＧＤＨ活性を有する生物
ならいかなる生物でも良い。なかでも原核生物である細
菌、たとえばエンテロバクター属、クレブシェラ属、エ
ルビニア属、パントエア属、セラチア属、エシェリヒア
属、コリネバクテリウム属、ブレビバクテリウム属、バ
チルス属に属する細菌が好ましい。具体的な例として
は、エシェリヒア・コリ、ブレビバクテリウム・ラクト
ファーメンタム等が挙げられる。ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐ
ｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子は、上記のような微生
物の染色体ＤＮＡより得ることができる。

【００３６】ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇ
ｄｈＡ遺伝子は、おのおのＣＳ、ＰＥＰＣもしくはＧＤ
Ｈ活性を欠失した変異株を用いてその栄養要求性を相補
するＤＮＡ断片を上記微生物の染色体ＤＮＡから単離す
ることによって取得できる。またエシェリヒア属のこれ
ら遺伝子、コリネバクテリウム属細菌のこれら遺伝子は
既に塩基配列が明らかにされていることから（Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２２巻、５２４３〜５２４９頁、
１９８３年；Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、第９５巻、９０９
〜９１６頁、１９８４年；Ｇｅｎｅ、第２７巻、１９３
〜１９９頁、１９８４年；Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、
第１４０巻、１８１７〜１８２８頁、１９９４年；Ｍｏ
ｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、第２１８巻、３３０〜３３
９頁、１９８９年；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇｙ、第６巻、３１７〜３２６頁、１９９２
年）それぞれの塩基配列に基づいてプライマーを合成
し、染色体ＤＮＡを鋳型にしてＰＣＲ法により取得する
ことが可能である。

【００３７】ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を高める
には、上記の遺伝子増幅による以外にも、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子の発現が強化
されることによって達成される。例えば、ｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子、またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモータ
ーをそれよりも強力な他のプロモーターに置換すること
によって発現が強化される。たとえば、ｌａｃプロモー
ター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａ
ｃプロモーター、ラムダファージのＰ_Rプロモーター、
Ｐ_Lプロモーター等が強力なプロモーターとして知られ
ている。プロモーターが置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子またはｇｄｈＡ遺伝子は、プラスミド上にク
ローニングされて宿主微生物に導入されるか、またはレ
ペッティブＤＮＡ、インバーティッド・リピート、また
はトランスポゾン等を用いて宿主微生物の染色体ＤＮＡ
上に導入される。

【００３８】また、ＣＳ、ＰＥＰＣまたはＧＤＨ活性を
高めるには、染色体上のｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子
またはｇｄｈＡ遺伝子のプロモーターを、それらよりも
強力なプロモーターで置換する（ＷＯ８７／０３００６
号、特開昭６１−２６８１８３号参照）か、またはそれ
ぞれの遺伝子のコード配列の上流に、強力なプロモータ
ーを挿入すること（Gene, 29, (1984) 231-241 参照）
によっても達成することができる。具体的には、強力な
プロモーターに置換されたｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝
子もしくはｇｄｈＡ遺伝子またはそれらの一部を含むＤ
ＮＡと、染色体上の対応する遺伝子との間で相同組換え
を起こさせればよい。

【００３９】Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐し
てＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒
する酵素としては、α−ケトグルタル酸デヒドロゲナー
ゼ（以下、「αＫＧＤＨ」ともいう）、イソクエン酸リ
アーゼ、リン酸アセチルトランスフェラーゼ、酢酸キナ
ーゼ、アセトヒドロキシ酸シンターゼ、アセト乳酸シン
ターゼ、ギ酸アセチルトランスフェラーゼ、乳酸デヒド
ロゲナーゼ、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、１−ピ
ロリンデヒドロゲナーゼ等がある。これらの酵素の中で
は、αＫＧＤＨが好ましい。

【００４０】エンテロバクター属等に属する微生物にお
いて、上記のような酵素の活性を低下または欠損させる
には、通常の変異処理法によって、あるいは遺伝子工学
的手法によって、上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵
素の活性が低下または欠損するような変異を導入すれば
よい。

【００４１】変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外
線を照射する方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−
Ｎ−ニトロソグアニジン等の変異剤で処理する方法等が
ある。遺伝子に変異が導入される部位は、酵素タンパク
質をコードするコード領域であってもよく、プロモータ
ー等の発現制御領域であってもよい。

【００４２】また、遺伝子工学的手法には、例えば遺伝
子組換え法、形質導入法、細胞融合法等を用いる方法が
ある。例えば、クローン化された目的遺伝子の内部に薬
剤耐性遺伝子を挿入し、機能を失った遺伝子（欠失型遺
伝子）を作製する。次いで、この欠失型遺伝子を宿主微
生物の細胞に導入し、相同組み換えを利用して染色体上
の目的遺伝子を前記欠失型遺伝子に置換する（遺伝子破
壊）。

【００４３】細胞中の目的酵素の活性が低下または欠損
していること、および活性の低下の程度は、候補株の菌
体抽出液または精製画分の酵素活性を測定し、野生株と
比較することによって確認することができる。例えば、
αＫＧＤＨ活性は、Reedらの方法（L.J.Reed and B.B.M
ukherjee, Methods in Enzymology 1969, 13, p.55-6
1）に従って測定することができる。

【００４４】また、目的とする酵素によっては、変異株
の表現型によって目的変異株を選択することができる。
例えば、αＫＧＤＨ活性が欠損もしくは低下した変異株
は、好気的培養条件ではグルコースを含む最少培地、あ
るいは、酢酸やＬ−グルタミン酸を唯一の炭素源として
含む最少培地で増殖できないか、または増殖速度が著し
く低下する。ところが、同一条件でもグルコースを含む
最少培地にコハク酸またはリジン、メチオニン、及びジ
アミノピメリン酸を添加することによって通常の生育が
可能となる。これらの現象を指標としてαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の選抜が可能である。

【００４５】相同組換えを利用したブレビバクテリウム
・ラクトファーメンタムのαＫＧＤＨ遺伝子欠損株の作
製法は、ＷＯ９５／３４６７２号に詳述されており、他
の微生物にも同様の方法を適用することができる。

【００４６】その他、遺伝子のクローニング、ＤＮＡの
切断、連結、形質転換法等の技術については、Molecula
r Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press
(1989)）等に詳述されている。

【００４７】以上のようにして得られるαＫＧＤＨ活性
が欠損もしくは低下した変異株の具体例としては、エン
テロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５６が挙げ
られる。エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３
３５６は、平成１０年２月１９日に、通産省工業技術院
生命工学工業技術研究所に、受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１
６６４５として寄託され、平成１１年１月１１日にブダ
ペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号ＦＥ
ＲＭ ＢＰ−６６１５が付与されている。エンテロバク
ター・アグロメランス ＡＪ１３３５６は、αＫＧＤＨ
−Ｅ１サブユニット遺伝子（ｓｕｃＡ）が破壊された結
果、αＫＧＤＨ活性を欠損している。

【００４８】また、本発明に用いられる微生物の一例で
あるエンテロバクター・アグロメランスは、糖を含有す
る培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成するため
に、操作効率がよくないことがある。したがって、この
ような粘液質を生成する性質を有するエンテロバクター
・アグロメランスを用いる場合には、粘液質の生成量が
野生株よりも低下した変異株を用いることが好ましい。
変異処理法としては、たとえばＸ線や紫外線を照射する
方法、またはＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソ
グアニジン等の変異剤で処理する方法等がある。また、
粘液質の生成量が低下した変異株は、変異処理した菌株
を、糖を含む培地、例えば５ｇ／Ｌのグルコースを含む
ＬＢ培地プレートに撒き、プレートを約４５°傾けて培
養したときに、液質が流れ落ちないようになったコロニ
ーを選抜することによって選択することができる。

【００４９】本発明において、Ｌ−グルタミン酸生産能
の付与又は増強、及び上記の粘液質低生産変異等の好ま
しい性質の付与は、任意の順序で行うことができる。

【００５０】本発明の微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン
酸が析出する条件に調整された液体培地に培養すること
により、培地中にＬ−グルタミン酸を析出させながら生
成蓄積させることができる。また、中性ｐＨにて培養を
開始し、培養終了時にＬ−グルタミン酸が析出する条件
となるようにしてもよい。

【００５１】ここで「Ｌ−グルタミン酸が析出する条
件」とは、本発明の微生物がＬ−グルタミン酸を生成蓄
積したときにＬ−グルタミン酸が析出する条件をいう。

【００５２】前記培地としては、ｐＨがＬ−グルタミン
酸が析出する条件に調整されること以外は、炭素源、窒
素源、無機塩類、その他必要に応じてアミノ酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養素を含有する通常の栄養培地を用い
ることができる。合成培地または天然培地のいずれも使
用可能である。培地に使用される炭素源および窒素源
は、培養する菌株の利用可能なものならばよい。

【００５３】炭素源としてはグルコース、グリセロー
ル、フラクトース、シュークロース、マルトース、マン
ノース、ガラクトース、でんぷん加水分解物、糖蜜等の
糖類が使用され、その他、酢酸、クエン酸等の有機酸等
も単独あるいは他の炭素源と併用して用いられる。

【００５４】窒素源としてはアンモニア、硫酸アンモニ
ウム、炭酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム等のアンモニウム塩また
は硝酸塩等が使用される。

【００５５】有機微量栄養素としては、アミノ酸、ビタ
ミン、脂肪酸、核酸、さらにこれらのものを含有するペ
プトン、カザミノ酸、酵母エキス、大豆蛋白分解物等が
使用され、代謝又は生育にアミノ酸等を要求する栄養要
求性変異株を使用する場合には要求される栄養素を補添
する事が必要である。

【００５６】無機塩類としてはリン酸塩、マグネシウム
塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩等が使用される。

【００５７】培養方法は、通常には、発酵温度２０ない
し４２℃、ｐＨを３〜５、好ましくは４〜５、より好ま
しくは４〜４．７、特に好ましくは４〜４．５に制御し
つつ通気培養を行う。かくして１０時間ないし４日間程
度培養することにより培養液中に著量のＬ−グルタミン
酸が蓄積される。蓄積されたＬ−グルタミン酸のうち、
飽和濃度を越えるものは、培地中に析出する。

【００５８】培養終了後、培養液中に析出したＬ−グル
タミン酸は、遠心分離又は濾過等により採取することが
できる。また、培地中に溶解しているＬ−グルタミン酸
は、公知の方法に従って採取することができる。例え
ば、濃縮晶析する方法、あるいはイオン交換クロマトグ
ラフィー等によって単離することができる。培養液中に
析出したＬ−グルタミン酸は、培地中に溶解しているＬ
−グルタミン酸を晶析した後に、併せて単離してもよ
い。

【００５９】本発明の方法によれば、飽和濃度を超える
Ｌ−グルタミン酸は析出するので、培地中に溶解してい
るＬ−グルタミン酸の濃度は一定量に保たれ、微生物が
高濃度のＬ−グルタミン酸から受ける影響を低減するこ
とができる。したがって、Ｌ−グルタミン酸生産能が一
層向上した微生物を育種することも可能となる。また、
Ｌ−グルタミン酸は結晶として析出してくるため、Ｌ−
グルタミン酸の蓄積に伴う培養液の酸性化が少なく、培
養液のｐＨを維持するために使用されるアルカリの量が
大幅に削減することが可能となる。

【００６０】

【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に
説明する。

【００６１】＜１＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐
性を有する微生物の探索 酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐性を有する微生物の
探索は、以下のようにして行った。1gの土壌、果実、植
物体、河川水などの自然界より得られたサンプルおよそ
500点を、それぞれ5mLの滅菌水に懸だくし、そのうち20
0μLを塩酸にてpHを4.0に調製した固体培地20mLに塗布
した。同培地の組成は、以下のとおりである。グルコー
ス3g/L、硫酸アンモニウム1g/L、硫酸マグネシウム７水
塩0.2g/L、リン酸２水素カリウム0.5g/L、塩化ナトリウ
ム0.2g/L、塩化カルシウム７水塩0.1g/L、硫酸第一鉄７
水塩0.01g/L、硫酸マンガン４水塩0.01g/L、硫酸亜鉛２
水塩0.72mg/L、硫酸銅５水塩0.64mg/L、塩化コバルト６
水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウ
ム２水塩1.2mg/L、ビオチン50μg/L、パントテン酸カル
シウム50μg/L、葉酸50μg/L、イノシトール50μg/L、
ナイアシン50μg/L、パラアミノ安息香酸50μg/L、ピリ
ドキシン塩酸塩50μg/L、リボフラビン50μg/L、チアミ
ン塩酸塩50μg/L、シクロヘキシミド50mg/L、寒天20g/
L。

【００６２】上記のサンプルを塗布した培地を、28℃、
37℃又は50℃にて、２〜４日間培養し、コロニーを形成
する菌株を378株取得した。

【００６３】続いて、上記のようにして得られた菌株
を、飽和濃度のＬ−グルタミン酸を含む液体培地（塩酸
にてpH4.0に調整）3mLを注入した長さ16.5cm、径14mmの
試験管に植菌し、24時間〜３日間、28℃、37℃又は50℃
にて振とう培養を行い、増殖する菌株を選抜した。前記
培地の組成は、以下のとおりである。グルコース40g/
L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグネシウム７水塩0.
5g/L、リン酸２水素カリウム2g/L、塩化ナトリウム0.5g
/L、塩化カルシウム７水塩0.25g/L、硫酸第一鉄７水塩
0.02g/L、硫酸マンガン４水塩0.02g/L、硫酸亜鉛２水塩
0.72mg/L、硫酸銅５水塩0.64mg/L、塩化コバルト６水塩
0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナトリウム２
水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L。

【００６４】このようにして、酸性環境下にてＬ−グル
タミン酸耐性を有する微生物７８株を取得することに成
功した。

【００６５】＜２＞酸性環境下にてＬ−グルタミン酸耐
性を有する微生物からの増殖速度に優れた菌株の選抜 上記のようにして得られた、酸性環境下にてＬ−グルタ
ミン酸耐性を有する種々の微生物を、M9培地（J. Sambr
ook, E.F.Fritsh, T.Maniatis “Molecular Cloning”,
Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A., 198
9）に20g/Lのグルタミン酸と2g/Lのグルコースを加え、
pHを塩酸で4.0に調整した培地3mLを注入した長さ16.5c
m、径14mmの試験管に植菌し、培地の濁度を経時的に測
定することによって、増殖速度の良好な菌株の選抜を行
った。その結果、生育が良好な菌株として、静岡県磐田
市の土壌より採取されたAJ13355株が得られた。本菌株
は、前記の菌学的性質から、エンテロバクター・アグロ
メランスと判定された。

【００６６】＜３＞エンテロバクター・アグロメランス
AJ13355株からの粘液質低生産株の取得 エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株は糖を含
有する培地で培養を行うと、菌体外に粘液質を生成する
ために、操作効率がよくない。そこで、粘液質低生産株
の取得を、紫外線照射法（Miller, J.H. et al., "A Sh
ort Cource inBacterial Genetics; Laboratory Manua
l", Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A.,
p.150, 1992）により行った。

【００６７】６０Ｗの紫外線ランプから６０ｃｍ離した
位置で、エンテロバクター・アグロメランスAJ13355株
に紫外線を２分間照射した後、ＬＢ培地で終夜培養して
変異を固定した。変異処理した菌株を、５ｇ／Ｌのグル
コースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地に、プレート
当たり約１００個程度のコロニーが出現するように希釈
して撒き、プレートを約４５°傾けて３０℃で終夜培養
を行い、粘液質が流れ落ちないようになったコロニーを
２０個選抜した。

【００６８】選抜された株の中から、５ｇ／Ｌのグルコ
ースと２０ｇ／Ｌの寒天を含むＬＢ培地で５回継代培養
を行っても復帰変異株が出現せず、さらに、ＬＢ培地及
び５ｇ／Ｌのグルコースを含むＬＢ培地ならびにＭ９培
地（Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, 2nd ed
ition, Cold Spring Harbor press, U.S.A. (1989)）に
２０ｇ／ＬのＬ−グルタミン酸と２ｇ／Ｌのグルコース
を加え、ｐＨを塩酸で４．５に調製した培地で親株と同
等の生育を示すという条件を満たす菌株として、ＳＣ１
７株を選抜した。

【００６９】＜４＞エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７株からのグルタミン酸生産菌の構築 （１）エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株か
らのαＫＧＤＨ欠損株の作製 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７株から、α
ＫＧＤＨを欠損し、さらにＬ−グルタミン酸生合成系が
強化された株を作製した。

【００７０】（ｉ）エンテロバクター・アグロメランス
ＡＪ１３３５５株のαＫＧＤＨ遺伝子（以後「ｓｕｃＡ
Ｂ」という）のクローニング エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株
のｓｕｃＡＢ遺伝子は、エシェリヒア・コリのαＫＧＤ
Ｈ−Ｅ１サブユニット遺伝子（以後「ｓｕｃＡ」とい
う）欠損株の酢酸非資化性を相補するＤＮＡ断片を、エ
ンテロバクター・アグロメランス ＡＪ１３３５５株染
色体ＤＮＡより選択することによって、クローニングし
た。

【００７１】エンテロバクター・アグロメランス ＡＪ
１３３５５株の染色体ＤＮＡは、エシェリヒア・コリに
おいて通常染色体ＤＮＡを抽出するのに使用されるのと
同様の方法（生物工学実験書、日本生物工学会偏、９７
−９８頁、培風館、１９９２年）で単離した。ベクター
として使用したｐＴＷＶ２２８（アンピシリン耐性）は
宝酒造社製の市販品を用いた。

【００７２】ＡＪ１３３５５株の染色体ＤＮＡをＥｃｏ
Ｔ２２１で消化したもの、およびｐＴＷＶ２２８をＰｓ
ｔＩで消化したものをＴ４リガーゼにより連結し、ｓｕ
ｃＡ欠損のエシェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株（Ｈｅ
ｒｂｅｒｔ Ｊ．ら Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ １９６９，１０５巻、１８２頁）を形質転換した。
こうして得た形質転換株より、酢酸最少培地にて増殖す
る株を選択し、これよりプラスミドを抽出してｐＴＷＶ
ＥＫ１０１と命名した。ｐＴＷＶＥＫ１０１を持つエシ
ェリヒア・コリ ＪＲＧ４６５株は酢酸非資化性という
形質の他にコハク酸もしくはＬ−リジンおよびＬ−メチ
オニンの要求性も回復していた。このことよりｐＴＷＶ
ＥＫ１０１にはエンテロバクター・アグロメランスのｓ
ｕｃＡ遺伝子が含まれていると考えられる。

【００７３】ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・
アグロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図を図１に
示した。図１の斜線にて示した部分の塩基配列を決定し
た結果を配列番号１に示した。この配列の中には、２つ
の完全長のＯＲＦと、２つのＯＲＦの部分配列と思われ
る塩基配列が見いだされた。これらのＯＲＦまたはその
部分配列がコードし得るアミノ酸配列を、５’側から順
に配列番号２〜５に示す。これらのホモロジー検索をし
た結果、塩基配列を決定した部分は、サクシネートデヒ
ドロゲナーゼアイロン−スルファープロテイン遺伝子
（ｓｄｈＢ）の３’末端側の部分配列、完全長のｓｕｃ
ＡとαＫＧＤＨ−Ｅ２サブユニット遺伝子（ｓｕｃ
Ｂ）、サクシニルＣｏＡシンセターゼβサブユニット遺
伝子（ｓｕｃＣ）の５’末端側の部分配列を含んでいる
ことが明らかとなった。これらの塩基配列から推定され
るアミノ酸配列をそれぞれエシェリヒア・コリのもの
（Eur.J. Biochem., 141, 351-359 (1984)、Eur.J. Bio
chem., 141, 361-374 (1984)、Biochemistry, 24, 6245
-6252 (1985)）と比較した結果を図２〜５に示す。この
ように各アミノ酸配列は非常に高い相同性を示した。ま
た、エンテロバクター・アグロメランス染色体上でもエ
シェリヒア・コリと同様に（Eur.J. Biochem., 141,351
-359 (1984)、Eur.J. Biochem., 141, 361-374 (198
4)、Biochemistry, 24,6245-6252 (1985)）、ｓｄｈＢ
−ｓｕｃＡ−ｓｕｃＢ−ｓｕｃＣとクラスターを構成し
ていることが判明した。

【００７４】（ii）エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７株由来のαＫＧＤＨ欠損株の取得 上記のようにして取得されたエンテロバクター・アグロ
メランスのｓｕｃＡＢ遺伝子を用い、相同組換えにより
エンテロバクター・アグロメランスのαＫＧＤＨ欠損株
の取得を行った。

【００７５】ｐＴＷＶＥＫ１０１をＳｐｈＩで切断して
ｓｕｃＡを含む断片を切り出した後、クレノーフラグメ
ント（宝酒造（株））で平滑末端化した断片を、Ｅｃｏ
ＲＩで切断しクレノーフラグメントで平滑末端化したｐ
ＢＲ３２２（宝酒造（株））とを、Ｔ４ ＤＮＡリガー
ゼ（宝酒造（株））を用いて結合した。得られたプラス
ミドを、ｓｕｃＡのほぼ中央部分に位置する制限酵素Ｂ
ｇｌＩＩ認識部位で同酵素を用いて切断し、クレノーフ
ラグメントで平滑末端化し、再びＴ４ ＤＮＡリガーゼ
で結合した。以上の操作によって、新たに構築されたプ
ラスミド中のｓｕｃＡにはフレームシフト変異が導入さ
れ、同遺伝子は機能しなくなると考えられた。

【００７６】上記のようにして構築されたプラスミドを
制限酵素ＡｐａＬＩで切断した後、アガロースゲル電気
泳動を行い、フレームシフト変異が導入されたｓｕｃＡ
及びｐＢＲ３２２由来のテトラサイクリン耐性遺伝子を
含むＤＮＡ断片を回収した。回収したＤＮＡ断片を再び
Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで結合し、αＫＧＤＨ遺伝子破壊
用プラスミドを構築した。

【００７７】上記のようにして得られたαＫＧＤＨ遺伝
子破壊用プラスミドを用いて、エンテロバクター・アグ
ロメランスＳＣ１７株を、エレクトロポレーション法
（Miller J.H., “A Short Course in Bacterial Genet
ics; Handbook”, Cold SpringHarbor Laboratory Pres
s, U.S.A., p.279, 1992）によって形質転換し、テトラ
サイクリン耐性を指標にプラスミドが相同組換えによっ
て染色体上のｓｕｃＡが変異型に置換された菌株を取得
した。取得された株をＳＣ１７ｓｕｃＡ株を命名した。

【００７８】ＳＣ１７ｓｕｃＡ株がαＫＧＤＨ活性を欠
損していることを確認するために、ＬＢ培地で対数増殖
期まで培養した同株の菌体を用いて、Reedらの方法（L.
J.Reed and B.B.Mukherjee, Methods in Enzymology 19
69, 13, p.55-61）に従って酵素活性を測定した。その
結果、ＳＣ１７株からは０．０７３（ΔＡＢＳ／min／m
gタンパク）のαＫＧＤＨ活性が検出されたのに対し、
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株ではαＫＧＤＨ活性を検出できず、
目的通りｓｕｃＡが欠損していることが確かめられた。

【００７９】（２）エンテロバクター・アグロメランス
ＳＣ１７ｓｕｃＡ株のＬ−グルタミン酸生合成系の強化 続いてＳＣ１７ｓｕｃＡ株に、エシェリヒア・コリ由来
のクエン酸シンターゼ遺伝子、ホスホエノールピルビン
酸カルボキシラーゼ遺伝子、およびグルタミン酸デヒド
ロゲナーゼ遺伝子を導入した。

【００８０】（ｉ）エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ
遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子を有する
プラスミドの作製 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドの作成の手順を、図６、７に基づい
て説明する。

【００８１】エシェリヒア・コリ由来のｇｄｈＡ遺伝子
を有するプラスミドｐＢＲＧＤＨ（特開平７−２０３９
８０号）をＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｐｈＩ消化し、Ｔ４ＤＮ
Ａポリメラーゼ処理で両末端を平滑末端にした後、ｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収した。一方、
エシェリヒア・コリ由来のｇｌｔＡ遺伝子およびｐｐｃ
遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰ（ＷＯ９７／０８
２９４号）をＸｂａＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラー
ゼで両末端を平滑末端にした。これに、上で精製したｇ
ｄｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を混合後、Ｔ４リガー
ゼにより連結し、ｐＭＷＣＰに更にｇｄｈＡ遺伝子を搭
載したプラスミドｐＭＷＣＰＧを得た（図６）。

【００８２】同時に、広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１
０の複製起点を有するプラスミドｐＶＩＣ４０（特開平
８−０４７３９７号）をＮｏｔＩで消化し、Ｔ４ＤＮＡ
ポリメラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものと、ｐ
ＢＲ３２２をＥｃｏＴ１４Ｉ消化し、Ｔ４ＤＮＡポリメ
ラーゼ処理した後、ＰｓｔＩ消化したものとを混合後、
Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ１０１０の複製起点
及びテトラサイクリン耐性遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦ−Ｔｅｔを得た（図７）。

【００８３】次に、ｐＭＷＣＰＧをＥｃｏＲＩ、Ｐｓｔ
Ｉ消化し、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄ
ｈＡ遺伝子を有するＤＮＡ断片を精製回収し、ＲＳＦ−
Ｔｅｔを同様にＥｃｏＲＩ、ＰｓｔＩ消化し、ＲＳＦ１
０１０の複製起点を有するＤＮＡ断片を精製回収したも
のと混合後、Ｔ４リガーゼにより連結し、ＲＳＦ−Ｔｅ
ｔ上にｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子、およびｇｄｈＡ
遺伝子を搭載したプラスミドＲＳＦＣＰＧを得た（図
８）。得られたプラスミドＲＳＦＣＰＧがｇｌｔＡ遺伝
子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を発現している
ことは、エシェリヒア・コリのｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ
遺伝子、あるいはｇｄｈＡ遺伝子欠損株の栄養要求性の
相補と各酵素活性の測定によって確認した。

【００８４】（ii）ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタム由来のｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドの作
製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来のｇｌ
ｔＡ遺伝子を有するプラスミドは、以下のようにして構
築した。コリネバクテリウム・グルタミカムのｇｌｔＡ
遺伝子の塩基配列（Microbiology, 1994, 140, 1817-18
28）をもとに、配列番号６及び７に示す塩基配列を有す
るプライマーＤＮＡを用い、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタム ＡＴＣＣ１３８６９の染色体ＤＮＡ
を鋳型としてＰＣＲを行い、約３ｋｂのｇｌｔＡ遺伝子
断片を得た。この断片をＳｍａＩ消化したプラスミドｐ
ＨＳＧ３９９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＨＳＧＣＢを得た（図９）。次に、ｐＨＳＧＣ
ＢをＨｉｎｄＩＩＩで切断し切り出された約３ｋｂのｇ
ｌｔＡ遺伝子断片をＨｉｎｄＩＩＩ消化したプラスミド
ｐＳＴＶ２９（宝酒造（株）より購入）に挿入し、プラ
スミドｐＳＴＶＣＢを得た（図９）。得られたプラスミ
ドｐＳＴＶＣＢがｇｌｔＡ遺伝子を発現していること
は、エンテロバクター・アグロメランスＡＪ１３３５５
株中での酵素活性の測定によって確認した。

【００８５】(iii)ＲＳＦＣＰＧ及びｐＳＴＶＣＢのＳ
Ｃ１７ｓｕｃＡ株への導入 エンテロバクター・アグロメランスＳＣ１７ｓｕｃＡ株
を、ＲＳＦＣＰＧを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、テトラサイクリン耐性を示す形質転換体
SC17sucA/RSFCPG株を取得した。さらにSC17sucA/RSFCPG
株をｐＳＴＶＣＢを用いてエレクトロポレーション法に
て形質転換し、クロラムフェニコール耐性を示す形質転
換体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株を取得した。

【００８６】＜４＞低ｐＨ環境下でＬ−グルタミン酸に
対する耐性が向上した菌株の取得 エンテロバクター・アグロメランスSC17sucA/RSFCPG+pS
TVCB株から、低ｐＨ環境下で高濃度のＬ−グルタミン酸
に対する耐性が向上した菌株（以下、「低pH下高濃度Gl
u耐性株」ともいう）の分離を行った。

【００８７】SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB株をＬＢＧ培地
（トリプトン10g/L、酵母エキス5g/L、NaCl 10g/L、グ
ルコース5g/L）にて30℃一夜培養後、生理食塩水にて洗
浄した菌体を適宜希釈して、Ｍ９−Ｅ培地（グルコース
4g/L、Na₂HPO₄・12H₂O 17g/L、KH₂PO₄ 3g/L、NaCl 0.5g/
L、NH₄Cl 1g/L、10mM MgSO₄、10μM CaCl₂、L-リジン 5
0mg/L、L-メチオニン 50mg/L、DL-ジアミノピメリン酸
50mg/L、テトラサイクリン 25mg/L、クロラムフェニコ
ール 25mg/L、L-グルタミン酸 30g/L、アンモニア水に
てpH4.5に調整）プレートに塗布した。32℃、２日間培
養後出現したコロニーを低pH下高濃度Glu耐性株として
取得した。

【００８８】得られた株について、Ｍ９−Ｅ液体培地で
の増殖度の測定、及びＬ−グルタミン酸生産試験培地
（グルコース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグ
ネシウム７水塩0.5g/L、リン酸２水素カリウム2g/L、塩
化ナトリウム0.5g/L、塩化カルシウム７水塩0.25g/L、
硫酸第一鉄７水塩0.02g/L、硫酸マンガン４水塩0.02g/
L、硫酸亜鉛２水塩0.72mg/L、硫酸銅５水塩0.64mg/L、
塩化コバルト６水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブ
デン酸ナトリウム２水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、L-
リジン塩酸塩200mg/L、L-メチオニン200mg/L、DL-α,ε
-ジアミノピメリン酸200mg/L、テトラサイクリン塩酸塩
25mg/L、クロラムフェニコール25mg/L）5mlを注入した5
0ml容大型試験管におけるＬ−グルタミン酸生産能の検
定を実施し、増殖度が最もよく、Ｌ−グルタミン酸生産
能が親株SC17/RSFCPG+pSTVCB株と変わらなかった株は、
エンテロバクター・アグロメランスAJ13601と命名され
た。AJ13601株は、１９９９年８月１８日に、通商産業
省工業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号305-85
66 日本国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に受託番
号FERM P-17516として寄託され、２０００年７月６日に
ブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、受託番号
FERM BP-7207が付与されている。

【００８９】＜５＞エンテロバクター・アグロメランス
AJ13601株のＬ−グルタミン酸生産培養−１ エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株を、グル
コース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸マグネシウ
ム７水塩0.5g/L、リン酸２水素カリウム2g/L、塩化ナト
リウム0.5g/L、塩化カルシウム７水塩0.25g/L、硫酸第
一鉄７水塩0.02g/L、硫酸マンガン４水塩0.02g/L、硫酸
亜鉛２水塩0.72mg/L、硫酸銅５水塩0.64mg/L、塩化コバ
ルト６水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリブデン酸ナ
トリウム２水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、 L-リジン塩
酸塩200mg/L、L-メチオニン200mg/L、DL-α,ε-ジアミ
ノピメリン酸200mg/L、テトラサイクリン塩酸塩25mg/
L、クロラムフェニコール25mg/Lを含有する培地300mlを
注入した1L容のジャーファーメンターに植菌し、34℃、
pH6.0にて14時間培養を行った。培養pHの制御は、培地
にアンモニアガスを注入することによって行った。

【００９０】以上のようにして得られた培養液を5000回
転/分にて10分間の遠心分離を行い、集めた菌体をグル
コース40g/L、硫酸アンモニウム5g/L、硫酸マグネシウ
ム７水塩1.5g/L、リン酸２水素カリウム6g/L、塩化ナト
リウム1.5g/L、塩化カルシウム７水塩0.75g/L、硫酸第
一鉄７水塩0.06g/L、硫酸マンガン４水塩0.06g/L、硫酸
亜鉛２水塩2.16mg/L、硫酸銅５水塩1.92mg/L、塩化コバ
ルト６水塩2.16mg/L、ホウ酸1.2mg/L、モリブデン酸ナ
トリウム２水塩3.6mg/L、酵母エキス6g/L、L-リジン塩
酸塩600mg/L、L-メチオニン600mg/L、DL-α,ε-ジアミ
ノピメリン酸600mg/L、テトラサイクリン塩酸塩25mg/
L、クロラムフェニコール25mg/Lを含有する培地300mlを
注入した1L容のジャーファーメンターに植菌し、34℃、
pH4.5にて培養を行い、Ｌ−グルタミン酸生産培養を行
った。培養pHの制御は、培地にアンモニアガスを注入す
ることによって行った。また、最初に加えたグルコース
の枯渇に伴い、600g/Lのグルコースを連続的に添加し
た。

【００９１】以上のようにしてＬ−グルタミン酸生産培
養を50時間行った結果、ジャーファーメンター内には著
量のＬ−グルタミン酸結晶が析出した。このとき、培養
液に溶解しているＬ−グルタミン酸濃度と、結晶を2 M
の水酸化カリウム溶液にて溶解させることによって測定
したＬ−グルタミン酸濃度を表１に示す。尚、Ｌ−グル
タミン酸の結晶は、培養液を静置し、デカントにより培
養液から採取した。

【００９２】

【表１】 表１ ──────────────────────────── 培養液に溶解しているＬ−グルタミン酸濃度 51g/L 結晶として析出したＬ−グルタミン酸量 67g/L 結晶を溶解させ測定したＬ−グルタミン酸濃度 118g/L ────────────────────────────

【００９３】＜６＞エンテロバクター・アグロメランス
AJ13601株のL-グルタミン酸生産培養−２ 続いてエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株がL
-グルタミン酸の結晶が存在する条件においてもなおL-
グルタミン酸生産能を有することを確認する為に、以下
に示す実験を行った。

【００９４】エンテロバクター・アグロメランスAJ1360
1株をグルコース40g/L、硫酸アンモニウム20g/L、硫酸
マグネシウム７水塩0.5g/L、リン酸２水素カリウム2g/
L、塩化ナトリウム0.5g/L、塩化カルシウム７水塩0.25g
/L、硫酸第一鉄７水塩0.02g/L、硫酸マンガン４水塩0.0
2g/L、硫酸亜鉛２水塩0.72mg/L、硫酸銅５水塩0.64mg/
L、塩化コバルト６水塩0.72mg/L、ホウ酸0.4mg/L、モリ
ブデン酸ナトリウム２水塩1.2mg/L、酵母エキス2g/L、
L-リジン塩酸塩200mg/L、L-メチオニン200mg/L、DL-α,
ε-ジアミノピメリン酸200mg/L、テトラサイクリン塩酸
塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/Lを含有する培地
300mlを注入した1L容のジャーファーメンターに植菌
し、34℃、pH6.0にて14時間培養を行った。培養pHの制
御はアンモニアガスを注入することによって行った。以
上のようにして得られた培養液を5000回転/分にて10分
間の遠心分離を行い、集めた菌体をL-グルタミン酸が結
晶として存在する培地にて培養を行った。用いた培地
は、グルコース40g/L、硫酸アンモニウム5g/L、硫酸マ
グネシウム７水塩1.5g/L、リン酸２水素カリウム6g/L、
塩化ナトリウム1.5g/L、塩化カルシウム７水塩0.75g/
L、硫酸第一鉄７水塩0.06g/L、硫酸マンガン４水塩0.06
g/L、硫酸亜鉛２水塩2.16mg/L、硫酸銅５水塩1.92mg/
L、塩化コバルト６水塩2.16mg/L、ホウ酸1.2mg/L、モリ
ブデン酸ナトリウム２水塩3.6mg/L、酵母エキス6g/L、L
-リジン塩酸塩600mg/L、L-メチオニン600mg/L、DL-α,
ε-ジアミノピメリン酸600mg/L、テトラサイクリン塩酸
塩25mg/L、クロラムフェニコール25mg/Lを含有し、さら
にL-グルタミン酸の結晶を40g/Lとなるように添加した
ものである。本培地300mlを注入した1L容のジャーファ
ーメンターに植菌し、34℃、pH4.3にて培養を行い、L-
グルタミン酸生産培養を行った。培養pHの制御はアンモ
ニアガスを注入することによって行った。また、最初に
加えたグルコースの枯渇に伴い、600g/Lのグルコースを
連続的に添加した。本培地中、pH4.3では添加したL-グ
ルタミン酸は39g/Lしか溶解せず、残りの1g/L分は結晶
として存在する。

【００９５】以上のようにしてL-グルタミン酸生産培養
を５３時間行った結果、ジャーファーメンター内には著
量のL-グルタミン酸結晶が析出した。このとき、培養液
に溶解しているL-グルタミン酸濃度と、結晶を2 Mの水
酸化カリウム溶液にて溶解させることによって測定した
L-グルタミン酸濃度を表２に示す。尚、L-グルタミン酸
の結晶は、培養液を静置し、デカントにより培養液から
採取した。この結果、L-グルタミン酸結晶が存在する条
件でもエンテロバクター・アグロメランスAJ13601株はL
-グルタミン酸を蓄積し、結晶を蓄積せしめることが示
された。

【００９６】

【表２】 表２ ──────────────────────────── 培養液に溶解しているL-グルタミン酸濃度 39g/L 結晶として存在するL-グルタミン酸量 119g/L 結晶を溶解させ測定したL-グルタミン酸濃度 158g/L 本培養により新たに生成したL-グルタミン酸結晶量 118g/L ────────────────────────────

【００９７】＜６＞エンテロバクター・アグロメランス
AJ13601株のL-グルタミン酸生産培養−３ エンテロバクター・アグロメランスAJ13601株は酸性ｐH
のみならず、中性ｐHでも生育することができる。そこ
で、中性ｐHにて培養を開始し、培養途中にL-グルタミ
ン酸を生成することによって培養液のｐHを自然と低下
させることによっても、L-グルタミン酸の結晶を析出せ
しめることができることを以下のようにして確認した。

【００９８】エンテロバクター・アグロメランスAJ1360
1株をテトラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェニ
コール25mg/Lを含有するLBG寒天培地（トリプトン 10g/
L、酵母エキス 5g/L、NaCl 10g/L、グルコース5g/L、寒
天15g/L）にて１４時間、３０℃にて培養した菌体シャ
ーレ１枚分（直径8.5cm）をグルコース40g/L、硫酸アン
モニウム5g/L、硫酸マグネシウム７水塩1.5g/L、リン酸
２水素カリウム6g/L、塩化ナトリウム1.5g/L、塩化カル
シウム７水塩0.75g/L、硫酸第一鉄７水塩0.06g/L、硫酸
マンガン４水塩0.06g/L、硫酸亜鉛２水塩2.16mg/L、硫
酸銅５水塩1.92mg/L、塩化コバルト６水塩2.16mg/L、ホ
ウ酸1.2mg/L、モリブデン酸ナトリウム２水塩3.6mg/L、
酵母エキス6g/L、L-リジン塩酸塩600mg/L、L-メチオニ
ン600mg/L、DL-α,ε-ジアミノピメリン酸600mg/L、テ
トラサイクリン塩酸塩25mg/L、クロラムフェニコール25
mg/Lを含有する培地300mlを注入した1L容のジャーファ
ーメンターに植菌し、34℃、pH7.0にて培養を開始し
た。培養pHの制御はアンモニアガスを注入することによ
って行った。また、最初に加えたグルコースの枯渇に伴
い、600g/Lのグルコースを連続的に添加した。

【００９９】L-グルタミン酸の蓄積に伴い、自然にpHが
低下してゆくが、この時培養開始後１５時間目から２４
時間目にかけて徐々にpHが7.0から4.5となるようにアン
モニアガスの注入量を調節し、培養開始後２４時間目に
pH4.5に至った後に培養を12時間継続した。

【０１００】以上のようにしてL-グルタミン酸生産培養
を３６時間行った結果、ジャーファーメンター内には著
量のL-グルタミン酸結晶が析出した。このとき、培養液
に溶解しているL-グルタミン酸濃度と、結晶を2 Mの水
酸化カリウム溶液にて溶解させることによって測定した
L-グルタミン酸濃度を表３に示す。尚、L-グルタミン酸
の結晶は、培養液を静置し、デカントにより培養液から
採取した。

【０１０１】

【表３】 表３ ──────────────────────────── 培養液に溶解しているL-グルタミン酸濃度 45g/L 結晶として存在するL-グルタミン酸量 31g/L 結晶を溶解させ測定したL-グルタミン酸濃度 76g/L ────────────────────────────

【０１０２】

【発明の効果】本発明の方法によれば、Ｌ−グルタミン
酸の析出を伴いながらＬ−グルタミン酸を発酵生産させ
ることができる。その結果、培地中から直接Ｌ−グルタ
ミン酸の結晶が得られる。また、培地中のＬ−グルタミ
ン酸は一定濃度以下に保たれ、高濃度のＬ−グルタミン
酸による生産物阻害を受けずにＬ−グルタミン酸を製造
することができる。

【０１０３】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.) <120> 析出を伴う発酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法 <130> P-7826 <150> JP 11-234806 <151> 1999-08-20 <150> JP 2000-78771 <151> 2000-03-21 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 4556 <212> DNA <213> Enterobacter agglomerans <220> <221> CDS <222> (2)..(121) <220> <221> CDS <222> (322)..(3129) <220> <221> CDS <222> (3145)..(4368) <220> <221> CDS <222> (4437)..(4556) <400> 1 t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt 49 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val 1 5 10 15 tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg 97 Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser 20 25 30 atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc 148 Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala 35 ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac 208 gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga 268 aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg 324 Met 1 cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc 372 Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly 5 10 15 gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat 420 Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp 20 25 30 cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca 468 Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro 35 40 45 ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat 516 Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr 50 55 60 65 ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc 564 Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr 70 75 80 gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac 612 Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn 85 90 95 gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc 660 Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly 100 105 110 ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat 708 Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp 115 120 125 ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc 756 Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala 130 135 140 145 att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag 804 Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys 150 155 160 cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac atc aat aac 852 Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn 165 170 175 acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc 900 Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser 180 185 190 cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg 948 Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu 195 200 205 acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt 996 Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly 210 215 220 225 gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg 1044 Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 230 235 240 cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta 1092 Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val 245 250 255 ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg 1140 Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu 260 265 270 ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa 1188 Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys 275 280 285 gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg 1236 Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser 290 295 300 305 gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac 1284 Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn 310 315 320 ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt 1332 Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg 325 330 335 gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct 1380 Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro 340 345 350 atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag 1428 Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val Gln 355 360 365 gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg 1476 Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr 370 375 380 385 gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg 1524 Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro 390 395 400 aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg 1572 Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val 405 410 415 ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc 1620 Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala 420 425 430 ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat 1668 Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp 435 440 445 gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg 1716 Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala 450 455 460 465 gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag 1764 Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys 470 475 480 cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt 1812 His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly 485 490 495 gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat 1860 Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp 500 505 510 gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc 1908 Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser 515 520 525 ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag 1956 Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 530 535 540 545 cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg 2004 Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu 550 555 560 cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc 2052 Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala 565 570 575 aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc 2100 Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe 580 585 590 gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa 2148 Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu 595 600 605 ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc 2196 Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe 610 615 620 625 ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat 2244 Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr 630 635 640 acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg 2292 Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp 645 650 655 gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac 2340 Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr 660 665 670 gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt 2388 Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly 675 680 685 gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct 2436 Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser 690 695 700 705 ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg 2484 Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro 710 715 720 cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa 2532 His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu 725 730 735 cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg 2580 Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro 740 745 750 tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc 2628 Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg 755 760 765 ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc 2676 Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg 770 775 780 785 cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc 2724 His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe 790 795 800 cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa 2772 Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys 805 810 815 cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag 2820 Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln 820 825 830 cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag 2868 Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln 835 840 845 ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat 2916 Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr 850 855 860 865 tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag 2964 Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln 870 875 880 ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt 3012 Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe 885 890 895 ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc 3060 Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala 900 905 910 gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat 3108 Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn 915 920 925 gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat 3159 Asp Ala Leu Asn Val Asn Met Ser Ser Val Asp 930 935 1 5 att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca 3207 Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala 10 15 20 acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc 3255 Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile 25 30 35 gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc 3303 Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala 40 45 50 gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg 3351 Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr 55 60 65 tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa 3399 Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys 70 75 80 85 gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt 3447 Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg 90 95 100 cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg 3495 Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala 105 110 115 atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa 3543 Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys 120 125 130 ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat 3591 Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His 135 140 145 ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt 3639 Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly 150 155 160 165 gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt 3687 Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val 170 175 180 ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735 Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala 185 190 195 aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag 3783 Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831 Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc 3879 His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa 3927 Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu 250 255 260 gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg 3975 Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr 265 270 275 cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc 4023 Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071 Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc 4119 Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile 310 315 320 325 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac 4167 Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn 330 335 340 ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215 Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct 4263 Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370 ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat 4311 Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr 375 380 385 ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg 4359 Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405 gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415 Asp Val gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag 4466 Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln 1 5 10 ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 4514 Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr 15 20 25 aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca 4556 Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala 30 35 40 <210> 2 <211> 39 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 2 Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val 1 5 10 15 Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser 20 25 30 Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala 35 <210> 3 <211> 935 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 3 Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 15 Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr 20 25 30 Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu 35 40 45 Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu 50 55 60 Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val 65 70 75 80 Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile 85 90 95 Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110 Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His 115 120 125 Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 140 Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu 145 150 155 160 Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn 165 170 175 Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala 180 185 190 Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu 195 200 205 Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro 210 215 220 Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met 225 230 235 240 Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val 245 250 255 Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val 260 265 270 Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His 275 280 285 Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300 Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe 305 310 315 320 Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val 325 330 335 Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu 340 345 350 Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val 355 360 365 Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly 370 375 380 Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn 385 390 395 400 Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met 405 410 415 Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val 420 425 430 Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 435 440 445 Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu 450 455 460 Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys 465 470 475 480 Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu 485 490 495 Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg 500 505 510 Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met 515 520 525 Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp 530 535 540 Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala 545 550 555 560 Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val 565 570 575 Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala 580 585 590 Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp 595 600 605 Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr 610 615 620 Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr 625 630 635 640 Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val 645 650 655 Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly 660 665 670 Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe 675 680 685 Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser 690 695 700 Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu 705 710 715 720 Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu 725 730 735 Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val 740 745 750 Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu 755 760 765 Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu 770 775 780 Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser 785 790 795 800 Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val 805 810 815 Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu 820 825 830 Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu 835 840 845 Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala 850 855 860 Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn 865 870 875 880 Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro 885 890 895 Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro 900 905 910 Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val 915 920 925 Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935 <210> 4 <211> 407 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 4 Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala 1 5 10 15 Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser 20 25 30 Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu 35 40 45 Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60 Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80 Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr 85 90 95 Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp 100 105 110 Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125 Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140 Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala 145 150 155 160 Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg 165 170 175 Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu 180 185 190 Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn 195 200 205 Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp 210 215 220 Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr 225 230 235 240 Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 245 250 255 Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 260 265 270 Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp 275 280 285 Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu 290 295 300 Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly 305 310 315 320 Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser 325 330 335 Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala 340 345 350 Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro 355 360 365 Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg 370 375 380 Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro 385 390 395 400 Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405 <210> 5 <211> 40 <212> PRT <213> Enterobacter agglomerans <400> 5 Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly 1 5 10 15 Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu 20 25 30 Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala 35 40 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 6 gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg 30 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: primer <400> 7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt 30

【図面の簡単な説明】

【図１】 ｐＴＷＶＥＫ１０１のエンテロバクター・ア
グロメランス由来ＤＮＡ断片の制限酵素地図。

【図２】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＡ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。
上段：エンテロバクター・アグロメランス、下段：エシ
ェリヒア・コリ（以下、同様）。

【図３】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【図４】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【図５】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【図６】 ｇｌｔＡ遺伝子、ｐｐｃ遺伝子およびｇｄｈ
Ａ遺伝子を有するプラスミドｐＭＷＣＰＧの構築を示す
図。

【図７】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点とテトラサイクリン耐性遺伝子を含むプラスミドＲＳ
Ｆ−Ｔｅｔの構築を示す図である。

【図８】 広宿主域プラスミドＲＳＦ１０１０の複製起
点、テトラサイクリン耐性遺伝子、ｇｌｔＡ遺伝子、ｐ
ｐｃ遺伝子およびｇｄｈＡ遺伝子を有するプラスミドＲ
ＳＦＣＰＧの構築を示す図。

【図９】 ｇｌｔＡ遺伝子を有するプラスミドｐＳＴＶ
ＣＢの構築を示す図。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成１３年８月２２日（２００１．８．２
２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図４

【補正方法】変更

【補正内容】

【図４】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｕｃＣ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図５

【補正方法】変更

【補正内容】

【図５】 エンテロバクター・アグロメランス由来のｓ
ｄｈＢ遺伝子の塩基配列から予想されるアミノ酸配列
と、エシェリヒア・コリ由来のものとの比較を示す図。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｔ (Ｃ１２Ｎ 1/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｅ (Ｃ１２Ｐ 13/14 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） ） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 平野 聖子 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 原 吉彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 伊藤 久生 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 (72)発明者 松井 和彦 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１味の素 株式会社発酵技術研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 AA11 BA74 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 HA20 4B064 AE19 CA02 CA19 CC03 CC07 CC09 CC24 CD13 CE15 DA10 DA13 4B065 AA01X AA01Y AB01 AC04 AC07 AC14 AC15 BA02 BA18 BA22 BB12 CA17 CA41 CA46

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 特定のｐＨにおいて飽和濃度のＬ−グル
   タミン酸及び炭素源を含む液体培地で同炭素源を代謝す
   ることができ、かつ、前記ｐＨの液体培地中にＬ−グル
   タミン酸の飽和濃度を越える量のＬ−グルタミン酸を蓄
   積する能力を有する微生物。
2. 【請求項２】 前記液体培地で生育できる請求項１記載
   の微生物。
3. 【請求項３】 前記ｐＨが５．０又はそれ以下である請
   求項１又は２に記載の微生物。
4. 【請求項４】 下記の性質の少なくとも一方を有する請
   求項１〜３のいずれか一項に記載の微生物。 （ａ）Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒する酵素の
   活性が高められている。 （ｂ）Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐してＬ−
   グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触媒する酵
   素の活性が低下または欠損している。
5. 【請求項５】 Ｌ−グルタミン酸の生合成反応を触媒す
   る酵素が、クエン酸シンターゼ、フォスフォエノールピ
   ルベートカルボキシラーゼ、およびグルタミン酸デヒド
   ロゲナーゼから選ばれる少なくとも１つである請求項４
   記載の微生物。
6. 【請求項６】 Ｌ−グルタミン酸の生合成経路から分岐
   してＬ−グルタミン酸以外の化合物を生成する反応を触
   媒する酵素がα−ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼであ
   る請求項４又は５に記載の微生物。
7. 【請求項７】 微生物がエンテロバクター属に属するこ
   とを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の微
   生物。
8. 【請求項８】 エンテロバクター・アグロメランスであ
   る請求項７記載の微生物。
9. 【請求項９】 糖を含有する培地で培養したときに菌体
   外に生成する粘液質が野生株よりも少ない変異を有する
   請求項８記載の微生物。
10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    微生物を、ｐＨがＬ−グルタミン酸が析出する条件に調
    整された液体培地に培養し、該培地中にＬ−グルタミン
    酸を析出させながら生成蓄積させることを特徴とする発
    酵法によるＬ−グルタミン酸の製造法。
11. 【請求項１１】 液体培地中にＬ−グルタミン酸を析出
    させながら発酵生産するのに適した微生物をスクリーニ
    ングする方法であって、飽和濃度のＬ−グルタミン酸及
    び炭素源を含む酸性に調製された培地に微生物を含む試
    料を接種し、前記炭素源を代謝できる菌株を選抜するこ
    とを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 前記炭素源を代謝できる菌株として、
    前記培地で生育することができる菌株を選抜することを
    特徴とする請求項１１記載の方法。
13. 【請求項１３】 前記培地のｐＨが５．０以下である請
    求項１１又は１２に記載の方法。