TW200427836A

TW200427836A - Method for producing L-glutamic acid by fermentation accompanied by precipitation

Info

Publication number: TW200427836A
Application number: TW093113152A
Authority: TW
Inventors: Mika Moriya; Yoshihiko Hara; Seiki Hirano; Hiroshi Izui; Hisao Ito; Kazuhiko Matsui
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1999-08-20
Filing date: 2000-08-17
Publication date: 2004-12-16
Also published as: KR20010050133A; BR0003695B1; KR20080083103A; EP1078989A2; CN100379871C; ATE335081T1; PE20010518A1; US20050227334A1; KR100866479B1; CN1292421A; RU2261272C2; TWI250211B; EP1078989B1; US20070134773A1; CN101230366A; DE60029701T2; KR20070106959A; EP1078989A3; DE60029701D1; US7015010B1

Description

200427836 (1) 玖、發明說明【發明所屬之技術領域】本發明係關於一種以醱酵兼倂沈澱方式生產L-麩胺酸的方法。L -麩胺酸通常係作爲調味料之用途。【先前技術】 L-麩胺酸主要係由可生產L -麩胺酸之棒狀桿菌以及短桿菌屬、棒狀桿菌屬或微桿菌屬、或其突變品系（ Amino Acid Fermenation， ρρ.195-215, Gakkai S hupp an Center，1 98 6 )以醱酵方法生產。其它種用以醱酵生產L-麩胺酸的細菌品系，有：使用桿菌屬、鏈黴菌屬、青霉屬等微生物醱酵之方法可參見美國專利第3,220,929號，使用假單胞菌屬、節桿菌屬、沙雷氏菌屬、假絲酵母等微生物醱酵之方法則可參見美國專利第3，5 6 3，8 5 7號，使用桿菌屬、假單胞菌、沙雷氏菌屬、產氣氣桿菌（目前稱爲產氣腸桿菌）等微生物醱酵之方法可參見日本專利公告（ Kokoku)第3 2-93 93號，使用大腸桿菌突變品系醱酵之方法可參見日本專利申請案Laid-open ( Kokai)第5-244970 號等。此外，本發明發明人亦曾提出使用克雷伯氏菌屬、歐文氏菌或潘氏菌（Pantoea)等微生物醱酵生產 L_麩胺酸之方法（參見日本專利申請案 Laid-open No.2000-1 0 6869 ) ° 此外，藉由DN A重組技藝來提高L -麩胺酸生合成的酵素活性，可改善已發表的各種L-麩胺酸之生產技藝， -5- (2) (2)200427836 例如引進源自大腸桿菌或麩胺酸棒桿菌之檸檬酸酯合成酶的編碼基因可使棒狀桿菌屬或短桿菌屬細菌（日本專利公告第7-121228號）生產L-麩胺酸之能力提高。此外，日本專利申請案Laid-open第6 1-2 6 8 1 8 5號亦揭示一種細胞內之重組DN A ’其內含源自棒狀桿菌屬細菌之麩胺酸酯去氫酶基因。此外，日本專利申請案Laid-open第63-2 1 4 1 8 9號亦揭示一種以放大麩胺酸酯去氫酶基因、異檸檬酸酯去氫酶基因、烏頭酸酯水合酶基因及檸檬酸酯合成酶基因來提高其生產L-麩胺酸之能力的技藝。雖然上述培植微生物或提高生產之方法已大幅增加 L -魅fl女酸之生產力（生產率），但仍有必要發展在較低價格下更有效地生產L-麩胺酸之方法以因應未來不斷增加的需求。目前已知有許多在培養液中使堆積的L _氨基酸結晶的醱酵方法（日本專利申請案Laid-open No.62-2 8 8 )。在此類方法中，必須使在培養液中累積的L-氨基酸沈澱以使L-氨基酸之濃度維持在特定量之下。明確言之，在醱酵期間必須調整培養物的溫度及酸鹼値或在培養液中添加表面活性劑以使L-色氨酸、L-酪氨酸或L-白氨酸沈澱〇雖然上述L-氨基酸的醱酵沈澱方法爲已知，不過適用此方法之氨基酸僅限於水溶性較低之氨基酸，且此方法尙未應用在局水溶性之氨基酸’如：L -變胺酸。此外’培養液之酸鹼値必須降低才能使L-麩胺酸沈澱。然而，生 -6- (3) (3)200427836 產 L-麩胺酸之上述細菌並不能在酸性條件下生長，因此 L-麩胺酸醱酵必須在中性條件下進行（美國專利第 3,2 20,929 以及 3,03 2,474 號；Chao K.C. & Foster J.W., J. Bacteriol·，77，ρρ·7 1 5 -725 ( 1 95 9 ))。因此，伴隨著沈澱之醱酵以生產L-麩胺酸並非爲已知的技藝。此外，目前已知大部分嗜酸細菌的生長都會被有機酸，如：乙酸、乳酸以及號ί白酸所抑制（Y a s u r 〇 0 s h i m a E d .，” E X t r e m e Environment Microorganism Handbook M? p .231，Science Forum; Borichewski R. M. ? J.Bacteriol” 93， p p .597-599 (1 967 )等）。同時，許多微生物在L-麩胺酸（其亦爲有機酸）的酸性條件下並不易生長，而且目前尙無任何有關於尋求在酸性條件下具有L-麩胺酸生產能力之微生物的報告。【發明內容】在上述的現況下，本發明的目的之一是尋求一種可在低酸鹼値條件下生產L-麩胺酸的微生物，並提供一種用尋得的微生物醱酵兼倂使L_麩胺酸沈澱以生產L-麩胺酸之方法。經過本發明之發明人硏究如何在醱酵中提高L-麩胺酸之生產率時，考慮到提高生產率之阻力之一是培養液中高濃度的L -麩胺酸在累積後會抑制l ·麩胺酸生產。例如，細胞內均有L-麩胺酸的分泌系統及攝入系統。然而，一旦分泌在培養液中的L-麩胺酸再度由細胞攝取時不僅 -7- (4) (4)200427836 會降低生產效率，也會抑制L -麩胺酸生的合成反應。爲了避免該高濃度下L-麩胺酸累積所生產的抑制作用，本發明之發明人篩選出可在酸性條件以及在高濃度L-麩胺酸存在下增殖之微生物。結果成功的從土壤中分離出具有該種性質之微生物，如此達成本發明。本發明提供如下。 (1 ) 一種微生物，其可在內含飽和濃度L -麩胺酸及碳源之特定酸鹼値的培養液中代謝碳源，並能在此酸鹼値之培養液中使L-麩胺酸的累積量超過L-麩胺酸的飽和濃度。 (2)如第（1)項之微生物，其可在培養液中生長。 (3 )如第（1 )或（2 )項之微生物，其酸鹼値不超過 5.0。 (4 )如第（1 )至（3 )項中任一項之微生物，其具有至少一種以下之特性： (a )將微生物催化L-麩胺酸生合成反應的酵素活性提高；以及 (b )將微生物催化在L_麩胺酸生合成路徑中生產非L -鍵胺酸化合物的分支反應之酵素活性減低或消除。 (5 )如第（4 )項之微生物，其中催化L-麩胺酸生合成反應之酵素至少爲下列中之一種：檸檬酸酯合成酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶與麩胺酸酯去氫酶。 (6 )如第（4 )或（5 )項之微生物，其中催化在L- -8 - (5) (5)200427836 麩胺酸生合成路徑中生產非L-麩胺酸化合物的副反應之酵素爲α -酮戊二酸酯去氫酶。 (7 )如第（1 )至（6 )項中任何一項之微生物’其中微生物屬於腸桿菌屬。 (8 )如第（7 )項之微生物，其係爲黏聚腸桿菌。 (9 )如第（8 )項之微生物，該微生物帶有一種突變，使其在含醣類培養液中分泌的細胞外黏性物質較野生品系少。 (10) —種以醱酵方式生產L-麩胺酸之方法，其包含在將酸鹼値調成可使L-麩胺酸沈澱之酸鹼値的培養液中培養如第（1 )至（9 )項中任何一項之微生物，生產及堆積L-麩胺酸並使L-麩胺酸在培養液中沈澱。 (1 1 ) 一種篩選適於在培養液中醱酵沈澱L -麩胺酸以生產L -麩胺酸之微生物的方法，其係包含將內含微生物之樣品接種在內含飽和濃度L-麩胺酸及碳源的酸性培養液中，並選取可代謝碳源之品系。 (1 2 )如第（1 1 )項之方法，其中選取在培養液中生長之品系作爲可代謝碳源之品系。 (1 3 )如第（1 1 )或（1 2 )項之方法，其中培養液之酸鹼値不超過5.0。依據本發明之方法，可用醱酵兼倂L _麩胺酸沈澱的方式生產L -麩胺酸。結果，將培養液中之L -麩胺酸維持在特定濃度以下，且在沒有高濃度麩胺酸之產物抑制下生產L -麩胺酸。 -9- (6) (6)200427836 發明之詳細說明本發明將詳細說明如下。本發明之微生物（1 )可於內含飽和濃度L -麩胺酸以及碳源且在特定酸鹼値下之培養液中代謝碳源及（2 )能在此酸鹼値之培養液中使L -麩胺酸的累積量超過l -麩胺酸的飽和濃度。本文中之 ''飽和濃度〃指L -鍵胺酸在培養液中之飽和濃度。以下將說明篩選可在內含飽和濃度L-麩胺酸和碳源及特定酸鹼値下之培養液中代謝碳源之微生物的方法。將內含微生物之樣品接種在特定酸鹼値下內含飽和濃度L· 麩胺酸及碳源之培養液中，並選取可代謝碳源的品系。所謂特定酸鹼値沒有一定的限制，但通常不超過5 · 0，較佳者不超過4.5，更佳者不超過4.3。本發明之微生物使用 L -麩胺酸之醱酵兼倂沈澱法生產L -麩胺酸。若其酸鹼値太高，則難以使微生物生產足夠的L-麩胺酸進行沈澱。因此較佳的酸鹼値是上述範圍。若內含 L-麩胺酸之水溶液的酸鹼値降低至r -殘基之 p K a ( 4 · 2 5，2 5 °C )附近，貝(J L ·麩胺酸的溶解度會顯著降低。溶解度在等電點（酸鹼値3 · 2 )時最低，l -麩胺酸會因超過飽和濃度而沈源。而此全取決於培養液組合物，通常在30°C時L-榖氨在酸酸鹼値3·2下之溶量爲10至20 克/升，在酸鹼値4.0下爲30至40克/升而在酸鹼値 -10- (7) (7)200427836 4.7下爲50至60克/升。通常酸鹼値不需要低於3.0，此乃因爲當酸鹼値低於特定値時，L-麩胺酸之沈澱效應到達高峰。然而pH可低於3.0 ° 此外，用 ''可代謝碳源〃形容微生物時係指可增殖或即使不能增殖亦可消耗碳源’即表示可同化碳源，如醣類或有機酸。尤其是指，例如，若微生物可在內含飽和濃度 L -麩胺酸的培養液中、酸鹼値5.0至4.0下（較佳者酸鹼値爲4。5至4。0，更佳者酸鹼値爲4.3至4.0，最佳者在酸鹼値4.0 )，於適當的溫度下（例如：28°C、37°C或50°C )生長2至4天，即表示此微生物可在培養液中代謝碳源。此外，例如，即使在內含飽和濃度L -麩胺酸、酸鹼値 5.0至4.0下（較佳者酸鹼値爲4 · 5至4.0，更佳者酸鹼値爲4.3至4.0，最佳者在酸鹼値4.0)於適當溫度（例如： 2 8 °C、3 7 °C或5 (TC下）的培養液中微生物不能生長2至4 天，但微生物可在培養液中消耗碳源，亦表示此微生物可在培養液中代謝碳源。可代謝碳源之微生物包括可在培養液中生長之微生物〇用 ''可生長〃形容微生物時係指可增殖、或雖然不能增殖但可生產L-麩胺酸。尤其是，例如：若微生物可於酸鹼値爲5.0至4.0(較佳者酸鹼値爲4.5至4.0，更佳者酸鹼値爲4.3至4.0，最佳者酸鹼値4.0)之內含飽和濃度 L-麩胺酸的培養液中、適當溫度下，例如：2 8 t、3 7 °C或 50 °C下生長2至4天，即表示此微生物可在培養液中生長 -11 - (8) (8)200427836 。此外，例如：即使當微生物不能在酸鹼値爲5.0至4.0 (較佳者酸驗値爲4.5至4.0，更佳者酸驗値爲4.3至4.0 ，最佳者酸鹼値4.0 )之內含飽和濃度L-麩胺酸的培養液中、適當溫度下，例如：28 °C、37 °C或501：下生長2至4 天，但微生物仍可使培養液中 L-麩胺酸之含量增加，即表示此微生物可在培養液中生長。上述之選取步驟可於相同條件下或改變酸鹼値或L-麩胺酸濃度下重覆二次或多次。首次選取時可在 L-麩胺酸濃度低於飽和濃度之培養液中進行，其後的選取步驟可在內含飽和濃度L-麩胺酸之培養液中進行。以外，可選取性質優良之品系，如：優越的增生速率。除上述性質之外，本發明之微生物可使L-麩胺酸之累積量高於 L-麩胺酸在培養液中的飽和濃度。上述培養液的酸鹼値以與在篩選具有上述性質（1 )之微生物時之培養液相同或接近較佳。通常若酸鹼値變得太低，微生物會不耐高濃度的L-麩胺酸。因此，就對L-麩胺酸之抗性而言，酸鹼値不宜過低，但低酸鹼値卻有利於將L-麩胺酸沈澱。爲了滿足此類條件，pH可介於3至5，較佳者4 至5，更佳者4.0至4.7，最佳者4.0至4.5，特佳者4.0 至 4.3 〇本發明之微生物或培養物可包含，例如：腸桿菌屬微生物、克雷伯氏菌、沙雷氏菌屬、潘氏菌（Panto ea )、歐文氏菌、埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、抗硫桿菌（ Alicyclobacillus)、桿菌、酵母菌等。在此類微生物之中 -12- 200427836 Ο) ’以腸桿菌屬微生物較佳。下列本發明微生物之說明主要是以腸桿菌屬微生物爲主’但本發明可應用至其它屬之微生物而不限於腸桿菌屬。腸桿菌屬微生物（尤其是黏聚腸桿菌）中較佳者爲黏聚腸桿菌AJ 1 3 3 5 5品系。此品系由Iwata_shi(shizu〇ka，

Japan)自土壤中分離出，可在內含L_麩胺酸以及碳源之低酸鹼値培養液中增殖。 AJ 1 3 3 5 5的生理性質如下： (1 )革蘭氏染色：陰性 (2 )抗氧氣行爲：兼性厭氧性 (3 )過氧化氫酶：陽性 (4 )氧化酶：陰性 (5 )還原硝酸鹽能力：陰性 (6 )弗-波氏（Voges-Proskaue r )測試：陽性 (7 )甲基紅測試：陰性 (8 )尿素酶：陰性 (9 )吲哚之生產：陽性 (1 〇 )能動性：可移動 (1 1 ) TSI培養液中H2S生產：微弱的活性 (12)石-半乳糖苷酶：陽性 (1 3 )消化吸收糖類之性質：樹膠醛醣：陽性蔗糖：陽性乳糖：陽性 -13- (10) (10)200427836 木糖：陽性山梨糖醇：陽性肌醇：陽性漏蘆糖：陽性麥芽糖：陽性葡萄糖=陽性側金盞花醇=陰性蜜三糖：陽性水楊苷：陰性蜜二糖：陽性 (1 4 )消化吸收甘油之性質：陽性 (1 5 )消化吸收有機酸之性質：檸檬酸：陽性酒石酸：陰性葡萄糖酸：陽性乙酸：陽性丙二酸：陰性 (1 6 )精氨酸脫水酶：陰性 (1 7 )鳥胺酸脫羧酶：陰性 (1 8 )離氨酸脫羧酶：陰性 (1 9 )苯基丙氨酸脫胺酶：陰性 (20)色素形成：黃色 (2 1 )液化明膠之能力：陽性 (22)生長之pH:可在酸鹼値4.0下生長，在酸鹼値4.5 -14 - (11) (11)200427836 至7下生長良好

(23)生長之溫度：在25 t下生長良好，在30 °C下生長良好，在37 °C下生長良好，可42 °C下生長，無法在45 °C 下生長基於此類細菌學上的性質，AJ 1 3 3 5 5被測定爲黏聚腸桿菌。黏聚腸桿菌 AJ 1 3 3 5 5 寄存於 National Institute of Bioscience and human-Technology，Agency of Industrial Scienceand Technology, ministry of International Trade and Industry (郵遞區號：305-8566，1-3，Higashi 1-chome，Tsukuba-shi? Ibaraki，Japan )於 1998 年 2 月 19 日存入，寄存編號爲 FERM P- 1 6644。然後在 Budapest Treaty之條件下於1 999年1月1 1日轉移至國際寄存中心，寄存編號爲FERMBP-6614。本發明之微生物爲原本即具有生產L-麩胺酸能力之微生物，或爲藉由突變、DNA重組等技藝賦予或提高L-麩胺酸生產能力之微生物。將催化 L-麩胺酸生合成反應之酵素活性提高可賦予或提高生產 L-麩胺酸之能力，而將（或去除）催化L·麩胺酸生合成路徑之分支反應（生產非L-麩胺酸化合物）之酵素活性降低亦可提高生產L-麩胺酸酸之能力。催化L -麩胺酸生合成反應之酵素包括：魅胺酸酯去氫酶（此後亦稱爲GDH〃）、麩胺醯氨酸合成酶、麩胺酸酯合成酶、異檸檬酸酯去氫酶、烏頭酸酯水合酶、檸檬 -15- (12) (12)200427836 酸酯合成酶（此後亦稱爲'' C s 〃）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（此後亦稱爲'' PEPC〃 )、丙酮酸去氫酶、丙酮酸激酶、烯醇酶、磷酸甘油變位酶、磷酸甘油酸酯磷激酶、甘油醛磷酸酯去氫酶、丙糖磷酸酯異構酶、果醣二磷酸酯醛縮酶、磷酸果醣磷激酶、葡萄糖磷酸酯異構酶等。在此類酵素之中較佳者爲CS、PEPC以及GDH。此外，以提高本發明微生物所有三個酵素：CS、PEP C及GDH之活性較佳。其中以乳酸醱酵短桿菌之C S較佳，因爲它不會受到α -酮戊二酸、L-麩胺酸及NADH抑制。例如，爲了提高CS、PEPC或GDH之活性，可於適當的質體中選殖CS、PEPC或GDH之編碼基因並以得到的質體將寄主微生物轉形。增加轉形品系細胞中CS、 PEPC或GDH之編碼基因（以下分別縮寫爲'' gltA基因" 、''PPC基因〃以及、GDHA基因〃）套數可提高CS、 PEPC或GDH之活性。將選殖出的gltA基因、ppc基因及ODHA基因個別地或結合任二種或三種基因引入上述起始原生品系中。在引入二種或三種基因時，此二種或三種基因可用同一種選殖質體引入寄主中，或分別的選殖於可共存的二種或三種質體後再引入寄主中。亦可將二種或多種源自不同微生物之相同酵素的編碼基因引入相同之寄主中。上述之質體並無特別限制，只要彼可獨立自主地在寄主微生物（例如：腸桿菌屬）中複製即可，例如p U C 1 9、 (13) (13)200427836 pUC 1 8、 pBR3 22、 pHSG299 、pHSG298 、pHSG3 99 、 pHG 3 9 8 、 RSF1010 、 p M W 1 1 9 、 p M W 1 1 8 、 p M W 2 1 9 、 pMW218、PACYC177、pACYC184 等。此外，亦可使用噬菌體DNA之載體。進行轉形之方法可依例如：D.M· Morrison之方法（ Method in Enzymology，68，326 ( 1979));用氯化金丐處理細菌受體細胞以提高DNA可透性之方法（Mandel Μ. 以及 HigaA.，J. Mol。Biol.，53，159(1970));電穿透作用（Miller J.H·， ” A Short Course in Bacterial

Genetics’’，Cold Spring Harbor Laboratory Press, U.S.A. 1 9 92 )等。增加上述的起始原生品系寄主染色體DNA上gltA基因、ppc基因或GDHA的基因套數亦可提高CS、PEPC或 GDH之活性。爲了在腸桿菌屬微生物之染色體DNA上引進數套gltA基因、ppc基因或GDHA基因，可採用在染色體上帶有數套DNA的序列，例如末端有重覆性及重複反轉的DNA之轉位元件。此外，利用內含gltA基因、 ppc基因或 GDHA基因之轉位子的轉移作用可在染色體 DN A上引進數套基因。結果可增加轉形品系細胞中之 gltA基因、ppc基因或GDHA基因的套數，並提高CS、 PEPC或GDH之活性。右生物體爲gltA基因、ppc基因或GDHA基因（套數增加）之來源，則任何具有CS、PEPC或GDH活性之生物體均可使用。尤其是原核生物之細菌，例如：腸桿菌 -17- (14) (14)200427836 屬、克雷伯氏菌、歐文氏菌、潘氏菌（Panto ea )、沙雷氏菌屬、埃希氏菌屬、棒狀桿菌屬、短桿菌屬，以桿菌較佳。特定實施例爲大腸桿菌、乳酸醱酵短桿菌等。可自上述微生物之染色體DNA中取得gltA基因、ppc基因及 GDHA基因。使用缺乏CS、PEPC或GDH活性的突變品系可分離出gltA基因、ppc基因及GDHA基因之DNA片段，其可彌補上述微生物染色體DNA的營養缺陷。由於埃希氏菌屬及棒狀桿菌屬細菌的上述基因之核苷酸序列已被發表（ Biochemistry, 22, pp.5243 -5 249 ( 1 9 83 ) ; J · Biochem.， 95，pp.909-916 ( 1984) ; gene、27，pp.193-199 ( 1984);

Microbiology, 1409 pp.1 8 1 7 1 828 ( 1 994 ) ; Mol. Gen.

Genet” 218? pp.330-339(1989); Molecular Microbiology, 6，pp · 3 1 7 - 3 2 6 ( 1 9 9 2 ))，彼亦可以各個核苷酸序列爲基礎合成的引子及以染色體D N A作爲模板用p c R方法取得〇除了放大上述基因一途之外，加強gltA基因、ppc基因或GDHA基因之表現亦可提高CS、PEPC或GDH之活性。例如’用其它較強的啓動子取代gltA基因、ppc基因或G D Η A基因之啓動子可增強表現。例如：1 a c啓動子、 trp啓動子、trc啓動子、tac啓動子、pr啓動子及λ噬菌體之Pl啓動子等已知的強啓動子。將gltA基因、ppc基因及GDHA基因之啓動子取代後可以質體選殖並藉由重複性 DN A、反轉重覆序列、轉位子等引入寄主微生物中， (15) (15)200427836 或引入寄主微生物的染色體DNA中。染色體上gltA基因、ppc基因或GDHA基因之啓動子亦可用其它較強的啓動子取代以提高CS、PEPC或GDH 之活性（參見 WO 8 7 / 03 006以及日本專利申請案Laid-open第6 1 -2 6 8 1 83號），或在各編碼基因序列之上游插入強啓動子（參見基因、29，ρρ·231-241 (1984))。明確言之，內含gltA基因、ppc基因或GDHA基因的DNA之間可進行同源重組，其啓動子可被對應於染色體基因之其他強啓動子或其部分取代。催化L-麩胺酸生合成旁枝路徑反應（生產非L-麩胺酸化合物）的酵素之實施例，包括：α -酮戊二酸酯去氫酶（以下亦稱爲'' a KGDH〃）、異檸檬酸酯裂解酶、磷酸酯乙醯基轉移酶、乙酸酯磷激酶、乙醯羥基酸合成酶、乙醯乳酸酯合成酶、甲酸酯乙醯基轉移酶、乳酸酯去氫酶、麩胺酸酯脫羧酶、1 -窬鏈沲去氫酶等。在此類酵素之中，以a KGDH較佳。爲了取得上述酵素活性降低或缺少的腸桿菌屬微生物，可用一般的突變或基因工程的方法將因突變造成酵素活性降低或缺少的上述酵素基因引入細胞內。突變方法之實施例，包括例如··利用X-射線或紫外線照射之方法、利用突變劑如·· Ν·甲基-Ν:硝基-Ν亞硝基胍處理之方法等。在基因上引入突變的位點可爲酵素蛋白質之編碼基因的編碼區域或調節表現區域（如啓動子） -19- (16) (16)200427836 基因工程方法之實施例，包括例如：使用基因重組、轉導、細胞融合等三種方法。例如將抗藥基因插入選殖出的目標基因以製備喪失功能之基因（有缺陷的基因）。接著，將此有缺陷的基因引入寄主微生物細胞中，並利用同源重組將此染色體上的目標基因用上述的缺陷基因取代（破壞基因）。判定目標酵素在細胞內降低或喪失活性以及活性之降低程度時，可測量細胞萃取物或自候選品系純化出之片段的酵素活性，並與野生品系比較而知。例如：α κ G D Η活性可用 Reed et al.之方法測量（Reed L.J. and Mukherjee B · B ·，Metho d in Enzymology，1 3 ? pp . 5 5 - 6 1 ( 1 9 6 9 ))。視目標酵素而定，可依據突變品系之表現型選取目標突變之品系。例如，缺乏a KGDH活性或a KGDH活性減低之突變品系在內含葡萄糖之基本培養基中或內含乙酸或 L - _胺酸作爲唯一碳源的基本培養基中、有氧的條件下，並不能增殖或其增生速率顯著地降低。然而在相同條件下 ’在內含葡萄糖之基本培養基中添加琥珀酸或離氨酸、甲硫氨酸及二氨基庚二酸則可造成一般之增生。利用此類現象作爲指標，可選取α KGDH活性減低或缺乏活性的突變品系。製備乳酸醱酵短桿菌a KGDH基因缺乏品系之方法係利用詳細敘述於WO 95 / 3 46 72之同源重組方法。相似的方法可應用至其它的微生物。此外，基因選殖和切除及聯結DNA、轉化等技藝則 (17) 200427836 詳細敘述於 Molecular Cloning，2nd Edition，Cold Spring

Harbor Press，1 9 8 9 等。

上述方法得到之a KGDH活性缺乏或a KGDH的活性減低之突變品系的特定實施例爲黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 6。黏聚腸桿菌 AJ13356 寄存於 National Institute of Bioscience and human-Technology, Agency of Industrial Scienceand Technology，ministry of International Trade and Industry (郵遞區號：305-8566，1-3 ’ Higashi 1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)於1998年二月19日存入，寄存編號爲 FERM P- 1 6645。然後在 Budapest Treaty之條件下於 1 9 99年1月11日轉移至國際寄存中心，寄存編號爲 FERM BP-6615。黏聚腸桿菌 AJ 1 3 3 5 6 中因爲破壞α KGDH- E L次單元基因（sucA )所以缺乏a KGDH的活性在內含醣類的培養液中培養黏聚腸桿菌（用於本發明微生物之實施例）時，細胞外會分泌出黏性物質，造成操作效率低。因此，在使用會分泌該黏性物質的黏聚腸桿菌時，宜使用分泌黏性物質比野生品系少的突變品系。突變方法之實施例包括，例如：X射線或紫外線照射方法、利用突變劑如 Ν-甲基-ΝΙ-硝基·Ν-亞硝基胍等處理之方法。篩選降低分泌黏性物質的突變品系是將突變的細菌接種在其中內含醣類之培養基，例如其中內含5克/升葡萄糖之 L Β培養板，在培養時將培養板傾斜約4 5度並選取不會向下流動之菌落。 -21 - (18) (18)200427836 本發明中，在進行賦予或增強生產L-麩胺酸之能力和賦予其它有利性質（如以突變降低上述黏性物質的分泌 )時其先後順序可隨意。在培養液中培養本發明之微生物時，將其酸鹼値調至沈澱L-麩胺酸之酸鹼値可在培養液中生產並沈澱所累積的L-麩胺酸。亦可先在中性pH下培養，最後再調成使L-麩胺酸酸沈澱之酸鹼値以便沈澱L-麩胺酸。使L-麩胺酸之沈澱酸鹼値是指在微生物生產並累積 L-麩胺酸時使L-麩胺酸沈澱之酸鹼値。上述的培養液爲一般的營養素培養液，其中內含碳源、氮源、礦物鹽類以及微量有機營養物如氨基酸和維生素 ’視須要可將酸驗値調至沈M L -變胺酸之酸驗値。其可爲合成的培養液或天然的培養液。培養液中之碳源和氮源可爲任何適用於培養品系的碳源以及氮源。所使用之碳源包含醣類，如：葡萄糖、甘油、果醣、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳醣、澱粉水解產物以及糖蜜。此外有機酸，如：乙酸和檸檬酸可各自單獨或與另一種碳源合倂使用。所使用之氮源包含氨水、銨鹽，如：硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨以及乙酸銨、硝酸鹽等。可使用內含有機微量營養物、氨基酸、維生素、脂肪酸、核酸之物負’如·蛋白腺、卡氨基酸（casamino acid )、酵母菌萃取物及大豆蛋白質降解產物。在使用須要氨基酸等代謝或生長之自營性的突變體品系時，須要補充營 -22- (19) (19)200427836 養素。可使用礦物鹽類、磷酸鹽、鎂鹽類、鈣鹽類、鐵鹽類、猛鹽類等。至於培養方法，通常是以通氣培養將醱酵溫度控制在 20至42 °C之間及酸鹼値爲3至5，較佳者爲4至5，更佳者爲4至4 · 7，尤佳者爲4至4 · 5。因此，在培養約1 〇小時至4天之後，大量的L-麩胺酸可累積在培養液中。當培養液中累積的L-麩胺酸超過飽和濃度時即開始沈澱。於完成培養之後，培養液中沈澱的L -麩胺酸可用離心、過濾等方法收集。可依據已知的方法收集溶於培養液中之L-麩胺酸酸。例如將培養液濃縮以結晶分離出L-麩胺酸或用離子交換色層分析等方法分離。經過濃縮結晶後，在培養液中可一倂分離出L -麩胺酸沈澱及溶於培養基中之L·麩胺酸。依據本發明之方法，當L -麩胺酸的含量超過飽和濃度時即開始沈澱，而溶於培養液中之L _麩胺酸濃度則維持在固疋的水準。因此可減少高濃度L •麩胺酸對微生物之影響。因此可培育出其它種L_麩胺酸生產能力較佳之微生物品種。此外，由於L_麩胺酸之沈澱爲結晶，可抑制由於L-麩胺酸在培養液中累積所造成的酸化現象，因此可顯者的降低在培養基中維持酸鹼値的鹼用量。【實施方式】實施例 -23- (20) (20)200427836 本發明將以下列實施例詳細說明。 < 1 >篩選在酸性環境下具有L-麩胺酸抗性之微生物篩選在酸性環境下具有L-麩胺酸抗性之微生物，其進行方法如下。將各約5 0 0個取自土壤、果實、農作物、河流之天然樣品，每公克懸浮於5毫升之滅菌水，取出 200 ul塗在20毫升之固體培養基（其酸鹼値用HC1調至 4 · 0 )上。培養液之組成如下：3克/升葡萄糖，1克/升 (NH4 ) 2S04，0.2 克 / 升 MgS04-7H20，0.5 克 / 升 KH2P〇4，0.2 克 / 升 NaCl，0.1 克 / 升 CaCl2-7H20，〇·〇1 克 / 升 F e S04-7H20，0.01 克 / 升 MnS04-4H20，0.72 毫克 / 升 ZnS04_2H20，0.64 毫克 / 升 CuS04-5H20，0.72 毫克/升COC12-6H20，0.4毫克/升硼酸。1.2毫克/升 Na2M004-2H20，50微克/升生物素，50微克/升泛酸鈣，50微克/升葉酸，50微克/升肌醇，50微克/升菸鹼酸，50微克/升對-氨基苯甲酸，50微克/升吡哆醇氯化氫，50微克/升核黃素，50微克/升硫胺素氯化氫，50 毫克/升環己醯亞胺，20克/升瓊脂。以上述樣品種植之培養基在2 8 °C、3 7 °C或 5 0 °C下培養2至4天，得到3 7 8個品系菌落。接著將上述之品系接種於含有3毫升培養液（內含飽和濃度之L-麩胺酸，酸鹼値用HC1調至4.0)之16.5公分長、1 4公厘直徑之測試管內，在2 8 °C、3 7 °C或5 0 X：下搖動培養2 4小時至3天。然後選取生長的品系。上述培養液內含的組合物如下：40克/升葡萄糖、20克/升（ -24- (21) (21)200427836 NH4) 2SCU、〇·5 克 / 升 MgS04-7H20、2 克 / 升 KH2P〇4 、0.5 克 / 升 NaC卜〇·25 克 / 升 CaC12-7H20、0.02 克 / 升 F e S04-7H20、〇·〇2 克 / 升 MnS04-4H20、0.72 毫克 / 升 ZnS〇4-2H2〇、0.64 毫克 / 升 CuS04-5H20、0.72 毫克/升C0C12-6H20、〇·4毫克/升硼酸、；1.2毫克/升 Na2M004-2H2O、2克/升酵母菌萃取物。如此成功地得到在酸性環境下具有L -麩胺酸抗性之 7 8個微生物品系。 < 2 >在酸性環境下具有L-麩胺酸抗性之微生物中選取生長速率優良之品系將上述得到之在酸性環境中具有L-麩胺酸抗性之各種微生物各自接種於含3毫升培養液（在M9培養液中加入20克/升變胺酸以及2克/升葡萄糖（Sambrook，J.， Fritsh，E.F·以及 Maniatis，T.，’’Molecular cloning，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1 9 8 9 )，酸驗値用 H C 1 調至4·0 ) 1 6.5公分長、14公厘直徑之測試管內，在一定的時間內測量培養液之濁度以選取生長速率較佳之品系。結果發現生長速率速率較佳之品系爲A J 1 3 3 5 5品系，其係得自土壤（Iwata-shi，Shizuoka，Japan )。此品系經上述細菌學性質測定後證實爲黏聚腸桿菌。 <3>從黏聚腸桿菌AJ 1 3 3 5 5品系得到分泌較少黏性物質的品系 -25- (22) (22)200427836 由於黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系在內含醣類之培養液中培養時會在細胞外分泌出黏性物質，所以操作效率不佳。因此可用紫外線照射方法（Miller，J.H. et al·，’’A Short Course in Bacterial G e n e t i c s ; L a b o r a t o r y Manual，，，p.150, Cold Spring Harbor Laboratory Press，1992)得到黏性物質分泌較少的品系。將黏聚腸桿菌 A J 1 3 3 5 5品系用相距6 0公分以外的 60-W紫外燈以紫外線照射2分鐘，在LB培養液中培養過夜以固定突變。稀釋突變的品系並接種至內含5克/升葡萄糖及20克/升瓊脂的LB培養液中（大約100個菌落 /板）並在3 0 °C下培養過夜，培養板傾斜約4 5度，選取 2 〇個無黏性物質流下的菌落。選取在內含5克/升葡萄糖以及20克/升瓊脂的 L B培養液中培養5次之後仍能滿足上述條件而無反突變現象且在L B培養液之生長情形與原生品系相等之品系，於內含5克/升葡萄糖的LB培養液中添加20克/升L-鍵胺酸及2克/升葡萄糖，酸驗値用HC1調至4.5形成的 M9 培養液（Sambrook，J· et al·，分子選殖，2nd Edition， Cold Spring Harbor Press，1989)中培養，從以上的品系中篩選出S C 1 7品系。 < 4 >從黏聚腸桿菌S C 1 7品系構築生產鍵胺酸之細菌。 (1 )從黏聚腸桿菌SC17品系製備α Kgdh缺乏的品 (23) (23)200427836 系從黏聚腸桿菌SC 1 7品系中製備出缺乏α KGDH且L-鍵胺酸生合成系統增強的品系。 (1 )選殖黏聚腸桿菌A J 1 3 3 5 5品系的α K G D Η基因 (以下稱爲、' s u c A Β）選殖黏聚腸桿菌Aj 1 3 3 5 5品系sucA B基因的方法是從黏聚腸桿菌AJ 1 3 3 5 5品系的染色體DNA中選取可在α KGDH-E 1次單元基因（以下稱爲、、sucA〃）缺乏的大腸桿菌品系中彌補不消化吸收乙酸性質的DNA片段。使用萃取大腸桿菌染色體DNA的一般方法（Text for Bi〇engineering 實驗，Edited by the Society for

Bioscience 以及 Bioengineering， Japan，pp.97-9 8 ， Baifukan’ 1 992 )分離黏聚腸桿菌AJ 1 3 3 5 5品系的染色體 DNA。用市售之p TWV 228(抗氨比西林）作爲載體（ T akara Shuz o Co.，Ltd.)。將經EcOT221水解過之AJ 1 3 3 5 5品系的染色體DNA 與經PstI水解過之PTWV22 8用T4連接酶連結並將缺乏 sucA的大腸桿菌JRG465品系轉形（Herbert，J· et al.， Mol· Gen. Genetics，105，182 ( 1969))。將轉形品系

(其係运自以上方法得到之轉形品系）於含有乙酸酯之基本培養基中生長，萃取其質體並稱爲pTWVEKlOl。大腸桿菌JRG46 5品系帶有PTWVEK101後可恢復除了乙酸消化吸收性質以外之琥珀酸或L-離氨酸以及L-甲硫氨酸之營養缺陷。此顯示PTWVEK101含有黏聚腸桿菌之sucA (24) (24)200427836 基因。圖1爲pTWVEKlOl中源自黏聚腸桿菌DNA片段之限制酶水解圖。圖1中斜線方框部份的核脊酸序列如SEQ 識別號碼：1所示◦在此序列中，有二個完整的〇RFs核苷酸序列和二個ORFs之部份核苷酸序列。由SEQ識別號碼：2至5顯示由此類ORF s編碼的氨基酸序列或從5 ’ 端依序開始的部份序列。此類序列同源比對的結果顯示其琥珀酸酯去氫酶鐵-硫蛋白質基因（sdHB ) 3’端之部分核苷酸序列、完整sucA以及a KGDH- E 2次單元基因（ sucB )、以及琥珀醯基COA合成酶冷次單元基因（sucC )5 ’端之部份序列。由此類核苷酸序列推演出之氨基酸序列在與大腸桿菌（Eur· J· Biochem·，141，pp.351_359 ( 1984) ； Eur. J. Biochem. 5 141, pp.361-374 ( 1984)

Biochemistry ? 24, pp.6245 -62 5 2 ( 1 9 8 5 ))比較後結果如圖2至5。各氨基酸序列顯示有非常高的同源相似性。此外，在黏聚腸桿菌之染色體上亦發現與大腸桿菌上之一串 s d HB-sucA-sucB-sucC 基因相同（Eur. J. Biochem.’ 141，pp.351-359 ( 1 9 84 ) ； Eur. J. Biochem.，141，pp· 3 6 1 -374 ( 1 98 4 ) ; Biochemistry，24，ρρ·6245 -6252 ( 1985) ) 〇 (ii )自黏聚腸桿菌SC 1 7品系得到缺乏a KGDH的品系使用上述得到之黏聚腸桿菌sucAB基因進行同源重組而得到a KGDH缺乏的黏聚腸桿囷品系。 (25) (25)200427836 將pTWVEKlOl用SpHI水解之後切出內含sucA之片段，片段用Klenow片段（Takara Shuzo Co·，公司）鈍端化後再使用 T4 DNA黏合酵素（Takara Shuzo Co.，公司 )而與經E c O RI水解且K1 e η o w片段鈍端化的p b R 3 2 2進行連結。所得到的質體用限制酵素Bglll水解（辨視位點大體上位於sucA中心）、KlenOw片段鈍端化、然後再一次的使用T4 DNA黏合酵素連結。經由上述步驟可構築使 sucA基因喪失功能之框架位移突變的質體。將上述構築之質體用限制酵素ApaLI水解，以及用瓊脂糖凝膠電泳回收其中內含框架位移突變的sue A DNA以及源自pBR3 22之抗四環素基因片段。回收的DNA片段再一次的使用 T4 DNA黏合酵素連結以構築破壞a KGDH 基因之質體。將上述方法得到之破壞a KGD Η基因之質體用電穿透

作用（ Miller, J . H . ” A Short Course i ] n B acter i a 1 G e neti c s; 5 Handbook” ， p.279 ， Cold S p r ing Harl b o r La b or at ο ry Press, U . S >.A .，1992) 將黏聚腸桿菌 SC 1 7 品系轉形，用四環素抗性作「爲指標挑選出已用同源: 重組方式將染色體 S l： icA以質體上: 突變的s u c A取代的品系 0所得到的品系稱爲 SC17sucA 品系。爲了證實 SC17su c A 品系中缺乏 a KGDH 的活性，用 Re e d e t al · (Reed，L .J. and Mukh l e r j e e ? B . B · 5 N 1 etho d in En zymo1< 〕gy ，13, pp. 55- .61， ( 1 9 69 ))的方法測量 LB 培養液之對數生長相中該品系細菌之酵素活性。結果在 (26) (26)200427836 SC17品系中偵測到的a KGDH活性爲〇·073 (△ ABS// Min /毫克蛋白質），而在SC 1 7sucA品系則無法偵測到 a KGDH活性，因此証實sucA的缺乏。 (2 )增強黏聚腸桿菌S C 1 7 s u c A品系的L -麩胺酸生合成系統接著，將源自大腸桿菌之檸檬酸酯合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸殘化酶基因及胺酸酯去氫酶基因引人 S C 1 7suc A品系中。 (i )製備具有源自大腸桿菌gltA基因、ppc基因及 GDHA基因之質體製備具有gltA基因、a ppc基因及GDHA基因之質體的方法將說明於圖6以及7。將具有源自大腸桿菌GDHA基因之質體，pBRGDH ( 日本專利申請案 Laid-open No.7-203980)，用 Hindlll 以及SpHI水解，兩端用T4 DNA聚合酶鈍端化，然後將具有GDHA基因之DNA片段純化及回收。同時將具有gltA 基因及源自大腸桿菌PPC基因之質體，pMWCP(WO 97/ 08294)，用Xbal水解，然後將兩端用T4 DNA聚合酶鈍端化。將上述具有GDHA基因的純化之DNA片段與此質體混合，使用T4連接酶連結以得到質體pMWCPG，其爲進一步的內含GDHA基因之pMWCP質體（圖6)。同時，將具有大寄主範圍質體RSF 1010複製起點之質體 pVIC40(日本專利申請案 Laid-open No.8-047397) 用NOT I水解’ T4 DNA聚合酶處理以及用PsTI水解。 (27) (27)200427836 將pBR322用EcOT141水解，以T4 DNA聚合酶處理並用 P s T I水解。混合上述之產物並以T4連接酶連結而得到其具有複製起點R S F丨〇1〇及抗四環素基因之質體rsf-TeT (圖 7)。接著，將pMWCPG用EcORI及PsTI水解，並純化及回收具有gltA基因、ppc基因及GDHA基因之〇ΝΑ片段。同樣地將R S F - T e T用E c Ο RI及P s TI水解，純化及回收具有複製起點RSF1010之DNA片段。將此二產物混合及使用T4連接酶連結以得到質體RSFCPG，其爲內含gitA 基因、ppc基因及GDHA基因之RSF-TeT (圖8)。証實所得到之質體RSFCPG可表現gltA基因、ppc基因及 GDHA基因、可互補源自大腸桿菌品系之gltA、ppc或 GD ΗA基因缺乏的營養缺陷以及測量各酵素活性。 (ϋ )製備具有源自乳酸醱酵短桿菌gltA基因之質體具有源自乳酸醱酵短桿菌git A基因之質體其構築方法如下。使用具有代表S E Q識別號碼：6以及7之核脊酸序列（其製備係基於麩胺酸棒桿菌 gltA基因（ Microbiology，140，ρρ·1817-1828 ( 1994))的核：g：酸序列）的引子 DNA進行PCR，以及用乳酸醱酵短桿菌 ATCC13869的染色體DN A作爲模板以得到約3 kb的git A 基因片段。將此片段插入事先用 SMal水解的質體 PHSG3 9 9 (購自 Takara Shuzo Co·公司）以得到質體 pHSGCB (圖9 )。接著將pH SGCB用Hind III水解，切出 (28) (28)200427836 約3kb的gltA基因片段，插入事先用Hindlll水解的質體 pSTV29 ( P焉自 Takara Shuzo Co.，公司）以得到質體 pSTVCB (圖 9 )。測量黏聚腸桿菌AJ 1 3 3 5 5品系中之酵素活性証實得到質體pSTVCB可表現gltA基因。 (iii )將 RSFCPG 以及 pSTVCB 弓[入 SC17sucA 品系用電穿透作用將 RSFCPG 轉形入黏聚腸桿菌 SC17SUCA 品系以得到具有四環素抗性轉形株之 SC17sucA/RSFCPG 品系。再將 SC17sucA/RSFCPG 品系用電穿透作用進一步的轉形入pSTVCB以得到具有氯黴素抗性之轉形株SCI 7sucA / RSFCPG + pSTVCB品系。 < 4 >得到在低酸鹼値環境下改進L-麩胺酸抗性的品系在低酸鹼値環境下改進對高L-麩胺酸濃度抗性的品系（以下亦稱爲 ''低酸鹼値下抗高濃度G L u品系〃）係分離自黏聚腸桿菌SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB品系。將 SC17sucA/RSFCPG + pSTVCB 品系在 30。(：下於 LBG培養液（10克/升胰腺、5克/升酵母菌萃取物、1〇克/升NaCl、5克/升葡萄糖）中培養過夜，用生理食鹽水淸洗細胞，經適當稀釋後種植入Μ 9 _ E培養基（4克/ 升葡萄糖、17 克 / 升 Na2HP04-12H20、3 克 / 升 ΚΗ2Ρ04 、〇·5克/升NaCl'l克/升NH4 C L、10毫莫耳濃度之 MgS04、10微莫耳濃度之CaCl2、50毫克/升L-離氨酸、50毫克/升L甲硫氨酸、50毫克/升DL -二氨基庚二酸、25¾克/升四環素、25毫克/升氯黴素、3〇克/升 -32· (29) 200427836 L -鍵胺酸，酸鹼値用氨水調至4.5 )。於菌落出現之後在 3 2 t：下培養2天得到在低酸鹼値下抗高濃度g 1 u之品系。

將得到之品系，於Μ 9 - E培養液中生長，在內含5毫升之L-麩胺酸生產測試培養液（40克/升葡萄糖、2()克 / 升（NH4) 2S〇4、0.5 克 / 升 MgS〇4-7H2〇、2 克 / 升 KH2P04、〇· 5 克 / 升 NaCl、0.25 克 / 升 CaCl2-7H20、 0.02 克 / 升 F e S04-7H20、0.02 克 / 升 MnS04-4H201 0.72 毫克 / 升 ZnS04-2H20，〇·64 毫克 / 升 CuS04-5H20 、〇·72毫克/升C0C12-6H20、0.4毫克/升硼酸、1.2毫克/升Na2M004-2H20、2克/升酵母菌萃取物、200毫克/升L -離氨酸氯化氫、200毫克/升L-甲硫氨酸、200 毫克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸、25毫克/升四環素氯化氫、25毫克/升氯黴素）之50-毫升體積的大測試管中測量L-麩胺酸之生產能力。將展現最佳生長能力且其 L-麩胺酸生產能力與原生品系（SC17/RSFCPG+pSTVCB 品系）相同之品系稱爲黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1。AJ 1 3 60 1品系於 1 999 年 8月十八日寄存於 National Institute of Bioscience and human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology，Ministry of International Trade and Industry (郵遞區號：3 0 5 - 8 5 6 6，1-3，則8&51^1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki，Japan)，寄存編號爲 FERM P-17516。然後於2000年七月六日依Budapest Treaty轉移至國際保存中心，寄存編號爲FERM BP-720 7。 -33- (30) (30)200427836 < 5 >培養黏聚腸桿菌AJ 1 3 6 0 1品系生產L-麩胺酸（1 ) 將黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1品系接種至內含3 00毫升之培養液的1-L小型醱酵槽，其中內含40克/升葡萄糖、20 克 / 升（NH4) 2S04、0.5 克 / 升 MgS04-7H20、2 克 / 升 KH2P04、（K 5 克 / 升 NaCl、0·25 克 / 升 CaCl2-7H20、 0.02 克 / 升 F e S04-7H20、0.02 克 / 升 MnS04-4H20、 0.72 毫克 / 升 ZnS04-2H20、0.64 毫克 / 升 CuS04-5H20 、〇·72毫克/升C0C12-6H20、0.4毫克/升硼酸、1.2毫克/升Na2M004-2H20、2克/升酵母菌萃取物、200毫克/升L -離氨酸氯化氫、200毫克/升L -甲硫氨酸、200 毫克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸、25毫克/升四環素氯化氫以及25毫克/升氯黴素，在34 °C、酸驗値6.0之下培養1 4小時。引入氨氣來控制培養液之酸鹼値。將上述得到之培養物在5 0 0 0 r p Μ下離心1 〇分鐘，收集細胞接種入內含3 0 0毫升之培養液之1 _ l小型醱酵槽，其中內含40克/升葡萄糖、5克/升（NH4 ) 2S04、 1·5 克 / 升 MgS04-7H20、6 克 / 升 KH2P04、1 .5 克 / 升 NaCl、0.75 克 / 升 CaCl2-7H20、0.06 克 / 升 F e S04-7 Η 2 〇 ' 0.06 克 / 升 MnS〇4-4H20、2· 1 6 毫克 / 升 ZnS04-2H20、1·92 毫克 / 升 CuS04-5H Z 0、2.16 毫克 / 升 C0C12-6H20、1.2 毫克 / 升硼酸 ' 3·6 毫克 /升 Na2M〇〇4· 2H2〇、6克/升酵母菌萃取物、600毫克/升L -離氨酸氯化氫、600毫克/升L -甲硫氨酸、600毫克/升DL-α， ε _ 一氨基庚一酸、25耄克/升四環素氯化氫以及25毫 -34- (31) 200427836 克/升氯黴素，在34 °C、酸鹼値45之下培養生產L -麩胺酸。引入氨氣控制培養液之酸鹼値。當最初加入之葡萄糖耗盡後’連繪地加入6 0 0克/升葡萄糖。結果在上述之培養液生產L -麩胺酸進行5 0小時後，小型醱酵槽有大量的L-麩胺酸結晶沈澱出現。表1顯示溶於培養液中L -麩胺酸之濃度及用2 Μ氫氧化鉀溶解結晶後測量之L -麩胺酸濃度。將培養液靜置後倒掉培養液，收集L-麩胺酸酸結晶。表1 擦於培養液中之L-麩胺酸濃度 51克/升释晶沈澱的L-麩胺酸量 67克/升资解結晶後測量之L-麩胺酸濃度 1118克/升 < 6 >培養黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系生產L -麩胺酸（2 ) 以下實驗係爲了證實黏聚腸桿菌A J 1 3 6 0 1品系即使於 L-麩胺酸結晶的情況下仍具有生產L-麩胺酸之能力。將黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1品系接種於內含3 00毫升之培餐液的1-L小型醱酵槽，其中內含40克/升葡萄糖、20 克 / 升（NH4) 2S04、0.5 克 / 升 MgS04-7H20、2 克 / 升 KH2P〇4、0.5 克 / 升 NaCl、0.25 克 / 升 CaCl2-7H20、〇·02 克 / 升 F e S04-7H20、0.02 克 / 升 MnS04-4H20、 0.72 毫克 / 升 ZnS04-2H20、0.64 毫克 / 升 CuS04-5H20 、0.72毫克/升C0C12-6H20、0.4毫克/升硼酸、1.2毫 -35- (32) (32)200427836 克/升Na2M004-2H20、2克/升酵母菌萃取物、2 0 0毫克/升L -離氨酸氯化氫、200毫克/升L-甲硫氨酸、200 毫克/升 DL-α，ε-二氨基庚二酸、25毫克/升四環素氯化氫以及25毫克/升氯黴素，在34 °C、酸鹼値6.0之下培養1 4小時。引入氨氣控制培養液之酸鹼値。將上述得到之培養物在5 0 0 0 r p Μ下離心1 〇分鐘，然後將收集的細胞在內含L-變胺酸結晶的培養液中培養。培養液內含40克/升葡萄糖、5克/升（nH4) 2S04、1·5克/ 升 MgS04-7H20、6 克 / 升 ΚΗ2Ρ〇4、1.5 克 / 升 NaCl、〇·75 克 / 升 CaCl2-7H20、0.06 克 / 升 F e S04-7H20、 0.06 克 / 升 MnS04-4H20、2.16 毫克 / 升 ZnS04-2H20、 1.92 毫克 / 升 CuS04_5H20、2.16 毫克 / 升 C0C12-6H20 、1.2毫克/升硼酸、3.6毫克/升Na2M004-2H20、6克 /升酵母菌萃取物、600毫克/升L-離氨酸氯化氫、600 毫克/升L -甲硫氨酸、600毫克/升DL-α，ε-二氨基庚_、25笔克/升四環素氯化氫以及25毫克/升氯黴素以及添加40克/升L-麩胺酸結晶。將細胞接種入內含 3 0 0毫升之此培養液的：[-L小型醱酵槽，在34°C以及酸鹼値4。3下培養生產L-麩胺酸。引入氨氣控制培養液之酸鹼値。待最初加入之葡萄糖耗盡後，連續地加入6 〇〇克/升葡萄糖。此培養液中，於酸鹼値4.3下僅溶解3 9克/升加入的L -麩胺酸，殘留1克/升結晶。結果當上述之培養生產L -麩胺酸進行5 3小時後，在小型醱酵槽有大量的L-麩胺酸結晶沈澱。表2顯示溶於 -36- (33) 200427836 培養液中L-麩胺酸之濃度以及用2M氫氧化鉀溶解結晶後測量之L-麩胺酸濃度。培養液靜置後倒掉培養液，收集 L -魅fe：酸酸結晶。結果顯示黏聚腸桿菌a J 1 3 6 0 1品系在 L-變胺酸結晶存在下可累積L_麩胺酸以及使其沈澱結晶表2 溶於培養液中L-麩胺酸之濃度 39克/升 L -麩胺酸沈澱結晶的量 119克/升溶解結晶後測量之L ·麩胺酸濃度 158克/升主要的培養新生產之L-麩胺酸結晶量 1 18克/升 < 7 >培養黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1品系生產L-麩胺酸（3 ) 黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1品系不僅可在酸性的pH下生長 ’且亦可在中性的pH下生長。因此以下之實驗証實L-麩胺酸亦可在中性pH的起始培養液中沈澱結晶並可於培養鲁期間生產L-麩胺酸而使培養酸鹼値自然的降低。將黏聚腸桿菌AJ 1 3 60 1品系的細胞在一盤（直徑8.5 公分）內含25毫克/升四環素氯化氫以及25毫克/升氯黴素的LBG瓊脂培養基（1〇 g/L胰腺、5克/升酵母菌萃取物、10克/升NaCl、5克/升葡萄糖、15克/升 . 瓊脂）中於30°C下培養14小時後，再接種至內含3 00毫升之培養液之1 -L小型醱酵槽中，其中內含40克/升葡萄糖、5 克 / 升（NH4) 2S04、1.5 克 / 升 MgS04-7H20、 -37- (34) (34)200427836 6 克 /升 KH2P〇4、克 / 升 NaC 卜〇·75 克 / 升 CaC12-7H20、〇.06 克 / 升 f e s〇4_7H2〇、0·06 克 / 升 MnS〇4-4H20、2.16 毫克 / 升 ZnS04-2H20、1·92 毫克 / 升 CuS04-5H20、2· 16 毫克 / 升 COC 1 2-όΗ20、1 .2 毫克 / 升硼酸、3.6毫克/升Na2M004-2H20、6克/升酵母菌萃取物、600毫克/升^離氨酸氯化氫、6〇〇毫克/升L•甲硫氨酸、600毫克/升DL-α，ε-二氨基庚二酸、25毫克 /升四環素氯化氫以及25毫克/升氯黴素，先在3 4 °C以及酸驗値7·0下培養。引入氨氣控制培養液之酸鹼値。待最初加入之葡萄糖耗盡後，連續地加入60〇克/升葡萄糖〇當L-懸胺酸累積後，酸鹼値自然的降低。控制引入的氨氣以便在開始培養後1 5小時至24小時內酸鹼値逐步地從7.0降低至4.5，再於開始培養24小時之後將酸鹼値變成4 · 5，然後繼續培養丨2小時。結果在上述之培養生產L _麩胺酸進行3 6小時後，小型醱酵槽內有大量的L·麩胺酸結晶沈澱。表3顯示溶於培養液中L -麩胺酸之濃度以及用2 M氫氧化鉀溶解結晶後測量之L-駿胺酸濃度。待培養液靜置後倒掉培養液，收集L -麩胺酸酸結晶。 -38- (35) (35)200427836 表3 L-麩胺酸溶於培養液中之濃度 45克/升結晶沈澱的L-麩胺酸量 31克/升溶解結晶測量之L-麩胺酸濃度 76克/升【圖式簡單說明】圖1爲源自黏聚腸桿菌PTWVEK101 DNA片段之限制酶水解圖。圖2顯示源自黏聚腸桿菌及源自大腸桿菌sucA基因之核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。上方序列：黏聚腸桿菌，下方序列：大腸桿菌（此後亦同）。圖3顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌sucB基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。圖4顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌sucC基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。圖5顯示源自黏聚腸桿菌以及源自大腸桿菌s d Η Β基因基因核苷酸序列推演之氨基酸序列的比較。。圖6顯示構築具有gltA基因、ppc基因及 GDHA基因之質體p MWC P G。圖7顯示構築具有寬廣寄主範圍質體RSF 1〇1〇之複製起點、以及四環素抗性基因之質體R S F -T e T。圖8顯示構築具有寬廣寄主範圍質體RSF 1010之複製起點、四環素抗性基因、gltA基因、ppc基因及 GDHA基因之質體RSFCPG。 (36)200427836 圖9顯示構築具有git A基因之質體PS TV CB。

-40- 200427836 序列表 <11 0> Aj inomoto Co., Inc. <120>伴隨沈澱法之醱酵生產L-麩胺酸的方法 <1 3 0> < 1 5 0>JP 1 1 - 23 4806 <1 5 1> 1 999-0 8-20

<150>JP 2000-78771 <1 5 1>2000-0 3 -2 1 <160>7 <1 70>PatentIn Ver. 2.0 <2 1 0>1 <2 1 1>4 5 5 6 <2 1 2>DNA <2 1 3>黏聚腸桿菌 <2 20> <221>CDS 200427836 <222>(2)...(12 1) <2 20> <221>CDS <222>(3 22)。,.（3 129) <220>

<22 1>CDS <222>(3 1 4 5 ) ... (43 68) <220>

<221>CDS <222>(443 7) ... (4556) <4 00>1 t gca ttc age gtt ttc ege tgt cac age ate atg aac tgt gta agt gtt

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Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu 230 235 240 ege gag atg att cgt cat geg ggc aaa age ggc aca cgt gaa gtg gta

Arg Glu Met-*Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val 245 250 255 208 268 324 372 420 468 516 564 612 660 708 756 804 852 900 948 996 1044 1092 1140 200427836 ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg

Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu lie Asn Val Leu 260 265 270 ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc'tcc ggt aaa cac aaa

Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys 275 280 285 gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct teg

Glu His Leu Gly Th「Gly Asp Val Lys Ty「His Met Gly Phe Se「Se「 290 295 300 305 gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac

Asp lie Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn 310 315 320 ccg tct cac ctg gaa att gtc age ccg gtg gtc atg gga teg gta cgt

Pro Se「H*is Leu Glu lie Val Se「Pro Val Val Met Gly Se「Val Arg 325 330 335 gca cgt etc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc age aat aaa gtg ttg cct

Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro 340 345 350 ate acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag lie Thr lie His 01y Asp Ala Ala Val lie Gly Gin Gly Val Val Gin 355 360 365 gaa acc ctg aac atg tct cag gcg ege ggc tac gaa gtg ggc ggc aeg

Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr 370 375 380 385 gta cgt ate gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg

Val A「g lie lie Asn Asn Gin Val Gly Phe Th「Thr Ser Asn Pro 390 395 400 aaa gat gcg cgt tea acc ccg tac tgt act gac ate ggc aag atg gtg

Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp lie Gly Lys Met Val 405 410 415 ctg gca ccg att ttc cac gtc aat get gac gat ccg gaa gcg gtg gcc

Leu Ala Pro lie· Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala 420 425 430 ttt gtt acc ege ctg gcg ctg gac tat ege aac acc ttc aaa ege gat

Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp 435 440 445 gtg ttt ate gat ctg gtg tgc tat ege cgt cat ggt cac aac gag gcg

Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala 450 455 460 465 gat gag cca agt get acc cag ccg ttg atg tac cag aaa ate aaa aag

Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys lie Lys Lys 470 475 480 cat ccg aeg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt

His Pro Thr Pro Arg Lys lie Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly 485 490 495 gtc gcg teg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac ege gat

Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr Uu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp 500 505 510 “· gcg etc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg age

Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser 515 520 525 ctg cac tcc ttc aeg tgg teg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag

Leu Hi.S一Ser- Phe Thr T卬 Ser Pro Ty「Leu Asn His Glu Trp Asp Glu 530 535 540 545 1188 1236 1284 1332 1380 1428 1476 1524 1572 1620 1668 1716 1764 1812 1860 1908 1956 200427836 cct tat ccg Pro Tyr Pro cgt ate age Arg lie Ser aag ate tat Lys lie Tyr 580 gac tgg ggc Asp Trp Gly 595 ggt att ccg Gly He Pro 610 ttc cat ege Phe His Arg aeg ccg ctg Thr Pro Leu gat teg gtg Asp Se「 Val 660 gee aeg get Ala Thr Ala 675 gac ttt gee Asp Phe Ala 690 ggc gaa cag G1 y G1 u G1 n cat ggc tac His Gly Tyr ege tat ctg Arg Tyr Leu 740 teg aeg ccg • Ser Thr Pro 755 999 atg ege Gly Met Arg 770 cat cca ctg His Pro Leu cag ccg gee Gin Pro Ala ege gtc gtg Arg VaT Val 820 gca cag gtt Ala Gin Val 550 cag gtc cct Gin Val Pro 565 aac gat ege Asn Asp Arg ggt gee gag Gly Ala Glu gtt ege etc Val Arg Leu 615 cac geg gtc His Ala Val 630 cac cat His His 645 ctg tet gaa att lie

Leu Ser Glu gag ccg ege Glu Pro Arg aac ggt get Asn Gly Ala 695 aag tgg ggc Lys Trp Gly 710 gaa ggt cag Glu Gly Gin 725 caa ett tg〇 Gin Leu Cys get cag gtg Ala Gin Val cgt ccg ctg Arg Pro Leu 775 geg ate teg Ala lie Ser 790 att ggt gag He Gly Glu 805Ttg tgc tee Leu Cys Ser gac atg Asp Met gag cag Glu Gin aag ctg Lys Leu 585 aat ctg Asn Leu 600 teg ggt Ser Gly gtg cac Val His cat aac His Asn gaa geg Glu Ala 665 gtg ctg Val Leu 680 cag gtg Gin Val cgt atg Arg Met gga ccg Gly Pro 9cc gag Ala Glu 745 tat cac Tyr His 760 gtg gtg Val Val teg ctg Ser Leu ate gac He Asp 99t aag Gly Lys 825 aaa ege Lys Arg -555 att gaa lie Glu 570 atg gee Met Ala geg tac Ala Tyr gaa gac Glu Asp aac cag Asn Gin 635 age cag Ser Gin 650 gtg ctg Val Leu acc ate Th「 lie gtg att Val lie tgt ggc Cys Gly 715 gaa cac Glu His 730 cag aac Gin Asn atg ctg Met Leu atg teg Met Ser gat gaa Asp Glu 795 gat ctg Asp Leu 810 gtt tac Val Tyr ctg aag gaa ctg Leu Lys Glu Leu gtg cag Val Gin gaa ggc Glu Gly gee aeg Ala Thr 605 tee ggt Ser Gly 620 get aac Ala Asn ggc gag Gly Glu geg ttt Ala Phe tgg gaa Trp Glu 685 gac cag Asp Gin 700 ctg gtg Leu Val tee tet Ser Ser atg cag Met Gin ege cgt Arg Arg 765 ccg aag Pro Lys 780 ctg gca Leu Ala teg ege Ser Arg 575 gag aaa Glu Lys 590 ctg gtg Leu Val cgt gga Arg Gly ggt tea Gly Ser ttc aaa Phe Lys 655 gaa tac Glu Tyr 670 geg cag Ala Gin ttc ate Phe lie atg ttg Met Leu gee cgt Ala Arg 735 gtt tgc Val Cys 750 cag geg Gin Ala teg ctg Se「 Leu aac ggc Asn Gly gca ttg Ala Leu 560 gtg gee Val Ala geg ttc Ala Phe gat gaa Asp Glu acc ttc Thr Phe 625 acc tat Thr Tyr 640 gtc tgg Val Trp ggt tac Gly Tyr ttt ggt Phe Gly age Ser ctg Leu 720 ctg Leu tet Ser 705 ccg Pro gaa Glu gat ccg cag ggc Asp Pro Gin Gly 815 tac gat ctg ctg Ty「 Asp Leu Leu 830 gtc ccg Val Pro ctg ege Leu Arg tta ege Leu Arg 785 agt ttc Ser Phe 800 gtg aaa Val Lys gaa cag Glu Gin 2004 2052 2100 2148 2196 2244 2292 2340 2388 2436 2484 2532 2580 2628 2676 2724 2772 2820 -5- 200427836 cgt cgt aaa gac gag Arg A「g Lys Asp Glu 835 ctt tac ccg ttc ccg Leu Ty「Pro Phe Pro 850 tct cac gta cag gac Ser His Val G1 n Asp 870 ggc gcc tgg tac tgt Gly Ala T卬 Tyr Cys 885 ggt gcc acc ctg cgt Gly Ala Th「Leu A「g 900 gtg ggt tat atg tcc Val Gly Tyr Met Ser 915 gac gca ctg aac gtc Asp Ala Leu Asn Val 930 att etc gtt ccc gac lie Leu Val Pro Asp 10 acc tgg cac aag aaa Thr Trp His Lys Lys 25 gtc gaa att gaa act Val Glu lie Glu Thr 40 gat-ggc gtg ctg gaa Asp Gly Val Leu Glu 55 tcc ege cag ate ctg Ser Arg Gin lie Leu 70 gaa age agt gcc aaa Glu Ser Ser Ala Lys 90 cag aca geg teg ctt Gin Thr Ala Ser Leu 105 ate cgt ege ctg att lie Arg Arg Leu lie 120 ggc acc ggc gta ggc Gly Thr Gly Val Gly 135 ctg geg aac aaa ccg Leu Ala Asn Lys Pro 150 gca^gpa ^cg get cag Ala Ala Thr Ala Gin 170 aaa acc gat gtt gcc ate Lys Thr Asp Val Ala lie 840 cat cag geg gta cag gaa His Gin Ala Val Gin Glu 855 860 ttt gtc tgg tgc cag gaa Phe Val Trp Cys Gin Glu 875 age cag cat cat ttc cgt Se「 Gin His His Phe Arg 890 tat gca ggt ege ccg gca Tyr Ala όΐy Arg Pro Ala 905 gta cac caa caa cag cag Val His Gin Gin Gin Gin 920 aat taattaaaag gaaagata

Asn 935 ctg cct gaa teg gtt gca Leu Pro Glu Ser Val Ala 15 cca ggc gat gca gtc age Pro My 入sp Ala Val Ser 30 gac aaa gtc gtg ctg gaa Asp Lys Val Val Leu Glu 45 gcc gtg ctg gaa gac gaa Ala Val Leu Glu Asp Glu 60 ggt ege ctg aaa gaa ggc Gly Arg Leu Lys Glu Gly 75 80 geg gaa age aat gac acc Ala Glu Ser Asn Asp Thr 95 gaa gaa gag age age gat Glu Glu Glu Ser Ser Asp 110 geg gag cat aat ctt gac Ala Glu His Asn Leu Asp 125

gga cgt tta aeg cgt gaa Gly Arg Leu Thr Arg Glu HO cag get gag aaa gcc gcc Gin Ala Glu Lys Ala Ala 155 160 cag cct gtt gcc aac ege Gin Pro Val Ala Asn Arg 175 9tg ege ate gaa cag Val Arg He Glu Gin 845 gca ttg aaa gcc tat Ala Leu Lys Ala Tyr 865 9ag cct ctg aac cag Glu Pro Leu Asn Gin 880 gat gtc gtg ccg ttt Asp Val Val Pro Phe 895 teg get tct ccg gcc Ser Ala Se「Pro Ala 910 caa gac ctg gtt aat Gin Asp Leu Val Asn 925 atg agt age gta gat Met Ser Ser Val Asp 1 5 gat gcc aca gta gca Asp Ala Thr Val Ala 20 ege gat gaa gtc ate Arg Asp Glu Val lie 35 9tg ccg gca tct gcc Val Pro Ala Se「Ala 50 999 gca acc gtt aeg Gly Ala Thr Val Thr 65 aac agt geg ggt aaa Asn Ser Ala Gly Lys 85 aeg cca gcc cag cgt Thr Pro Ala Gin A「g 100 geg etc age ccg geg Ala Leu Ser.Pro Ala 115 get geg cag ate aaa Ala Ala Gin He Lys 130 gac gtt gaa aaa cat Asp Val Glu Lys His 145 geg cca geg geg ggt Ala Pro Ala Ala Gly 165 age gaa aaa cgt gtt Ser Glu Lys Arg Val 180 2868 2916 2964 3012 3060 3108 3159 3207 3255 3303 3351 3399 3447 3495 3543 3591 3639 3687 -6- 200427836 ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc 3735

Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu AT a 185 190 195 aag aac age acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa ate aac atg aag 3783

Lys Asn Se「Th「Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu lie Asn Met Lys 200 205 210 ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt 3831

Pro He Met Asp Leu Arg Lys Gin Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg 215 220 225 cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tet ttc tac ate aag gcc gtg gtc 3879

His Gly Val A「g Leu Gly Phe Met Se「Phe Ty「He Lys Ala Val Val 230 235 240 245 gaa gcg ctg aag cgt tat cca gaa gtc aac gcc tet ate gat ggc gaa 3927

Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser lie Asp Gly GTu 250 255 260 gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tet acg 3975

Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser lie Ala Val Ser Thr

265 270 275 cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg age 4023

Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser 280 285 290 atg get gac ate gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt 4071

Met Ala Asp lie Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg 295 300 305 gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc ate 4119

Asp My Lys Leu Th「Val Asp Asp Leu Th「Gly Gly Asn Phe Thr lie 310 315 320 325 acc aac ggt ggt gtg ttc ggt teg ctg atg tet acg cca ate ate aac 4167

Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro lie lie Asn 330 335 340 ccg cca cag age gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct 4215 Pro Pro Gin Ser Ala lie Leu Gly Met His Ala He Lys Asp Arg Pro 345 350 355 atg 9cg gtc aat ggt cag gtt gtg ate ctg cca atg atg tac ctg get 4263 Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val lie Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala 360 365 370

etc tcc tac gat cac cgt tta ate gat ggt cgt gaa tet gtc ggc tat 4311

Leu Ser Ty「Asp His Arg Leu lie Asp Gly Arg Glu Ser Val My Tyr 375 380 385 ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg' ctg ctg 4359 Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu 390 395 400 405 gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca 4415 Asp Val gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag get aaa cag 4466

Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin 1 5 10 ctg ttt gca egg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act 45U Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr 15 20 25 aca cca cgt* gaa gca gaa gaa gcg gca teg aaa ate ggt gca 4556

Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Πθ Gly Ala 30 35 40 200427836

<210>2 <21 1>39 <212>PRT <213>黏聚腸桿菌 < 4 Ο 0 > 2

Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser He Met Asn Cys Val Ser Val 5 1 〇 °l c

Cys Pro Lys Leu Asn P「〇 Th「Arg Ala lie Gly His lie Lyg Se厂 25 on

Met Leu Leu Gin Arg Ser Ala JU 35

<2 1 0>3 <2 1 1>935 <212>PRT <2 1 3>黏聚腸桿菌 <4 00>3

Met Gin Asn Ser Ala Met Lys Pro T「p Leu Asp Ser Ser T「p Leu Ala 15 10 15

Gly Ala Asn Gin Se「Tyr lie Glu Gin Leu Ty「Glu Asp Phe Leu Th「 20 25 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val T「p Arg Ser Met Phe Gin Gin Leu 35 40 45

Pro Gly Thr GTy Val Lys Pro Glu Gin Phe His Ser Ala Thr Arg Glu 50 55 60

Ty「 Phe Arg A「g Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val 65 70 75 80

Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gin Val Lys Val Leu Gin Leu lie 85 90 95

Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gin Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu 100 105 110

Gly Leu*'Trp Lys Gin Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe H-is 一一 -115 120 125

Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gin Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe 130 135 U0 200427836

Ala lie Gly Lys Glu Thr Met Lys'Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu 145 150 155 160

Lys Gin Thr Tyr Cys Gly Ser lie Gly ATa Glu Tyr Met His lie Asn 165 170 175

Asn Thr Glu Glu Lys A「g Trp lie Gin Gin Arg He Glu Ser Gly Ala 180 185 190

Se「Gin Thr Se「Phe Se「Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys-Glu 195 200 205

Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu GTu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro 210 215 220

Gly Ala Lys Arg Phe Se「Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met 225 230 235 240

Leu A「g Glu Met lie A「g His Ala Gly Lys Se「Gly Th「Arg Glu Val 245 250 255

Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu lie Asn Val 260 265 270

Leu Gly Lys Lys Pro Gin Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His 275 280 285

Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser 290 295 300

Ser Asp lie Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe 305 310 315 320

Asn Pro Ser His Leu Glu He Val Ser Pro Val Val Met GTy Ser Val 325 330 335

Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu 340 345 350

Pro He Thr lie His Gly Asp Ala Ala Val lie Gly Gin Gly Val Val 355 · 360 365

Gin Glu Thr Leu Asn Met Ser Gin Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly 370 375 380

Thr Val Arg He Val lie Asn Asn Gin Val Gly Phe Thr* Thr Ser Asn 385 390 395 400

Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp lie Gly Lys Met

405 410 415

Val Leu Ala Pro lie Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val 420 425 430

Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg 435 440 445

Asp Val Phe lie Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu 450 455 460

Ala Asp Glu Pro Se「Ala Thr Gin Pro Leu Met Tyr Gin Lys lie Lys 465 470 475 480

Lys His Pro Thr Pro Arg Lys lie Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu 485 490 495

Gly Val Ala Ser Gin Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg 500 505 510

Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met 515 520 525

Ser Leu His Ser Phe Thr T「p Se「Pro Tyr Leu Asn His Glu TYp Asp 53Θ- 一 535 540

Glu Pro Tyr Pro Ala Gin Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala 545 550 555 560 200427836

Leu A「g lie Se「Gin Val Pro Glu Gin lie Glu Val Gin Se「A「g Val 565 570 575

Ala Lys lie Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala 580 585 590

Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp 595 600 605

Glu Gly He Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr 610 615 620

Phe Phe His A「g His Ala Val Val His Asn Gin Ala Asn Gly Se「Th「 625 630 635 640

Ty「Th「Pro Leu His His lie His Asn Ser Gin Gly Glu Phe Lys Val 645 650 655

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Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gin Val Val lie Asp Gin Phe lie Ser 690 695 700

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Pro His Gly Ty「Glu Gly Gin Gly Pro Glu His Ser Se「Ala Arg Leu 725 730 735

Glu Arg Tyr Leu Gin Leu Cys Ala Glu Gin Asn Met Gin Val Cys Val 740 745 750

Pro Ser Thr Pro Ala Gin Val Tyr His Met Leu Arg A「g Gin Ala Leu 755 760 765 A「g Gly Met A「g Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu 770 775 780 A「g His Pro Leu Ala lie Ser Se「Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser 785 790 795 800

Phe Gin Pro Ala He Gly Glu lie Asp Asp Leu Asp Pro Gin Gly Val 805 810 815

Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu

820 825 830

Gin Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala lie Val Arg lie Glu 835 840 845

Gin Leu Tyr Pro Phe Pro His Gin Ala Val Gin Glu Ala Leu Lys Ala 850 855 860

Ty「Ser His Val Gin Asp Phe Val Trp Cys Gin Giu Glu Pro Leu Asn 865 870 875 880

Gin Gly Ala Trp Tyr Cys Se「Gin His His Phe A「g Asp Val Val Pro 885 890 895

Phe Gly Ala Thr Leu A「g Ty「Ala Gly Arg Pro Ala Se「Ala Ser Pro 900 905 910

Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gin Gin Gin Gin Gin Asp Leu Val 915 920 925

Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn 930 935 -10- 200427836

<210>4 <21 1>407 <212>PRT <2 1 3>黏聚腸桿菌 <400>4

Met Ser Se「Val Asp lie Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Se「Val Ala

15 10 15

Asp Ala Th「Val Ala Th「T「p His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser 20 25 30

Arg Asp Glu Val He Val Glu lie Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu 35 40 45

Val Pro Ala Se「Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu 50 55 60

Gly Aia Th「Val Thr Se「Arg Gin lie Leu Gly A「g Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80

Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Se「Ala Lys Ala Glu Se「Asn Asp Th「 • 85 90 .95

Th「Pro Ala Gin A「g Gin Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Se「Asp 100 105 110

Ala Leu Ser Pro Ala He Arg Arg Leu lie Ala Glu His Asn Leu Asp 115 120 125

Ala Ala Gin lie Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu 130 135 140

Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gin Ala Glu Lys Ala Ala

145 150 155 160

Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gin Gin Pro Val Ala Asn Arg 165 170 175

Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu 180 185 190

Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Th「Phe Asn 195 200 205

Glu lie Asn Met Lys Pro lie Met Asp Leu Arg Lys Gin Ty「Gly Asp 210 215 220

Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Ty「 225 230 235 240 lie Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala 245 250 255

Ser lie Asp Gly Glu Asp Val Val Ty「His Asn Tyr Phe Asp Val Ser 260 265 270 -11 - 200427836 lie Ala Val Se「Th「Pro Arg Gl) Leu Val Th「Pro Val Leu Arg Asp 275 280 285

Val Asp Ala Leu Se「Met Ala Asp lie Glu Lys Lys lie Lys Glu Leu 290 295 300

Ala Val Lys Gly A「g Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Th「 Gly 305 310 315 320

Gly Asn Phe Th「lie Th「Asn Gly Gly Val Phe Gly Se「Leu Met Se「 325 330 335

Th「Pro lie lie Asn Pro Pro Gin Ser Ala He Leu Gly Met His Ala 340 345 350 lie Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gin Val Val lie Leu Pro 355 360 365

Met Met Ty「 Leu Ala Leu Ser Ty「 Asp His A「g Leu lie Asp Gly A「g 370 375 380

Glu Se「Val Gly Ty「Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro 385 390 395 400

Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val 405

<2 1 0>5 <2 1 1>40 <212>PRT <2 1 3>黏聚腸桿菌 <4 00>5

Met Asn Leu His Glu Tyr Gin Ala Lys Gin Leu Phe Ala Arg Tyr Gly 1 5 10 15

Met Pro Ala Pro Thr Gly Ty「Ala Cys Thr Thr Pro A「g Glu Ala Glu 20 25 30

Glu Ala Ala Se「Lys lie Gly Ala 35 40 <2 1 0>6 <2 1 1>3 0 <2 1 2>DNA <2 13>人造序列 -12- <220> <220>200427836 <2 23>人造序列之描述：引子 <4 00>6 gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg <2 1 0>7 <2 1 1>30 <212>DNA <2 13>人造序列 <220> <2 23>人造序列之描述：引子 <4 00>7 aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt

Claims

200427836 Π) 拾、申請專利範圍 L 一種篩選適於在培養液中醱酵生產L-麩胺酸並沈澱 L·麩胺酸之微生物之方法，其包含將內含微生物之樣品接種至內含飽和濃度L -麩胺酸和碳源的酸性培養液中 ’及選取可代謝該碳源之菌株。 2 ·如申請專利範圍第1項之方法，其中係選取可在該培養液中生長之菌株作爲可代謝該碳源之菌株。 3 ·如申請專利範圍第丨項之方法，其中該培養液之酸驗値不高於5 · 〇。

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