CN102203274B - L‑氨基酸的制造方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及L‑氨基酸的制造方法，该方法在共存有N‑酰氨基酸消旋酶的条件下，使L‑琥珀酰酶作用于N‑琥珀酰氨基酸的对映体混合物，并通过L构型特异的水解来制得L‑氨基酸。特别是，本发明涉及以高收率制造L‑氨基酸的方法，该方法以溶解浓度特别低的N‑琥珀酰氨基酸为原料，一边使生成的L‑氨基酸析出到反应体系外，一边进行反应。根据本发明，可以高效率地制造光学纯度高的L‑氨基酸，特别是作为药品、农药等原料有用的L‑氨基酸。

Description

L-氨基酸的制造方法
技术领域
本发明涉及由N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物高效率地制造L-氨基酸的方法，该方法通过组合下述反应来制造L-氨基酸：1)使用N-酰基氨基酸消旋酶，使N-琥珀酰氨基酸进行外消旋化的反应，和2)使用L-琥珀酰酶，使N-琥珀酰-L-氨基酸进行特异性水解的反应。
背景技术
光学活性氨基酸、特别是光学活性非天然氨基酸，是作为农药、药品等的合成原料及中间体有用的化合物。如何高效率地制造具有光学活性的氨基酸、特别是非天然氨基酸，成为工业生产中重要的问题。
作为解决上述问题的方法之一，专利文献1中公开了下述方法：以N-乙酰氨基酸的外消旋体作为原料，通过使用D-酰化氨基酸水解酶(aminoacylase)或者L-酰化氨基酸水解酶来光学拆分D构型和L构型，从而得到具有较高光学纯度的氨基酸。在上述方法中，得到光学活性氨基酸的收率最高为50％，一半的外消旋体被浪费。因此，为了使残存的N-乙酰氨基酸发生外消旋化而组合使用N-酰基氨基酸消旋酶与酰化氨基酸水解酶，以试图提高收率。然而，将N-酰基氨基酸消旋酶与酰化氨基酸水解酶组合后的拆分反应性较低，氨基酸的收率停留在70～75％，另外，N-酰基体底物会残留，需要对其进行分离的步骤，由此会阻碍实用化(专利文献2、3、4、5)。
此外，公知N-酰基氨基酸消旋酶对N-酰基氨基酸的反应性较低(非专利文献1、2，专利文献6)，近年来，有报道称N-酰基氨基酸消旋酶对N-琥珀酰氨基酸的反应性高于对N-乙酰氨基酸的反应性(非专利文献1、2，专利文献6)。另有报道称L-琥珀酰酶对天然L-氨基酸的N-琥珀酰体产生作用(非专利文献1、2，专利文献6)。然而，通过将N-酰基氨基酸消旋酶与L-琥珀酰酶组合，由N-琥珀酰-氨基酸的对映体混合物高效率地制造L-氨基酸的方法是未知的。
此外，本制造方法中可以使用的原料即通式(III)代表的N-琥珀酰氨基酸或其盐，目前为止是未知的。
[化学式1]
(式中，R1代表任选具有取代基的碳原子数为5～20的烷基、任选具有取代基的碳原子数为5～20的烯基、任选具有取代基的碳原子数为2～20的炔基、任选具有取代基的茚满基、任选具有取代基的萘基甲基、或氟苄基、氯苄基或者溴苄基。)
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-254789号公报
专利文献2：日本特开2001-46088号公报
专利文献3：日本特开2001-314191号公报
专利文献4：日本特开2002-238581号公报
专利文献5：日本特开2007-82534号公报
专利文献6：日本特开2008-61642号公报
非专利文献
非专利文献1：Biochemistry、2004年、43卷、224页
非专利文献2：Biochemistry、2006年、45卷、4455页
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于提供一种与现有方法相比更为高效率地制造L-氨基酸的方法。
解决问题的方法
为了解决上述问题，本发明人等经过深入研究结果发现，通过在组合下述反应来进行反应时，使生成的氨基酸析出到反应体系外，从而可以提高反应性，并完成了本发明，上述反应为：使用N-酰基氨基酸消旋酶使N-琥珀酰氨基酸进行外消旋化的反应，和使用L-琥珀酰酶使得N-琥珀酰-L-氨基酸进行特异性水解的反应。
即，本发明是使L-琥珀酰酶作用于N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物，从而制造L-氨基酸的方法，其中，在共存有N-酰基氨基酸消旋酶的条件下，一边使生成的L-氨基酸析出，一边进行反应。
在本发明的制造方法中，优选所述L-氨基酸的溶解浓度为1重量％以下。
此外，在本发明的制造方法中，优选作为底物的N-琥珀酰氨基酸为通式(I)代表的N-琥珀酰氨基酸，
[化学式2]
(式中，R代表任选具有取代基的碳原子数为1～20的烷基、任选具有取代基的碳原子数为2～20的烯基、任选具有取代基的碳原子数为2～20的炔基、任选具有取代基的碳原子数为4～20的芳基、或者任选具有取代基的碳原子数为5～20的芳烷基。)
制造的L-氨基酸为通式(II)代表的L-氨基酸。
[化学式3]
(式中，R表示与上述相同的取代基。)
在本发明更优选的实施方式中，上述式(I)和(II)中的R为4-溴苄基、3-氟苄基、萘基甲基、茚满基或6-庚烯基。
此外，在本发明优选的实施方式中，使用包含编码N-酰基氨基酸消旋酶的DNA和编码L-琥珀酰酶的DNA的载体转化得到的转化体来作为N-酰基氨基酸消旋酶和L-琥珀酰酶。
此外，本发明也包括通式(III)代表的N-琥珀酰氨基酸或其盐。
[化学式4]
(式中，R1代表任选具有取代基的碳原子数为5～20的烷基、任选具有取代基的碳原子数为5～20的烯基、任选具有取代基的碳原子数为2～20的炔基、任选具有取代基的茚满基、任选具有取代基的萘基甲基、或氟苄基、氯苄基或者溴苄基。)
在本发明优选的实施方式中，上述式(III)中的R为4-溴苄基、3-氟苄基、2-萘基甲基、2-茚满基或6-庚烯基。
发明的效果
根据本发明明确：通过以溶解浓度较低的N-琥珀酰氨基酸作为原料进行反应，可以使生成的氨基酸排出到反应体系外，从而能够避免对反应的阻碍，并高效率地制造L-氨基酸。
具体实施方式
以下将通过实施方式对本发明进行详细说明。本发明并不限定于所述实施方式。
本发明的“对映体混合物”是指，含有大于0％～小于100％范围的D构型体的L构型体和D构型体的混合物。作为本发明原料的N-琥珀酰氨基酸为通式(I)代表的化合物，
[化学式5]
其可以通过各种公知的方法来合成。例如，可以通过下述方法等来获得：
1)在乙酸中，使氨基酸与氨基酸当量以上的琥珀酸酐进行反应，然后蒸馏除去溶剂，并在乙酸乙酯-甲醇中重结晶的方法；
2)在水中，使氨基酸与氨基酸当量以上的琥珀酸酐进行反应并同时保持pH为碱性，然后调节pH为酸性，析出结晶的方法。
在上述式(I)中，R代表任选具有取代基的碳原子数为1～20的烷基、任选具有取代基的碳原子数为2～20的烯基、任选具有取代基的碳原子数为4～20的芳基、或者任选具有取代基的碳原子数为5～20的芳烷基。
作为上述碳原子数为1～20的烷基，可以是直链状，也可以是支链状，可以列举如下，例如：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、庚基、辛基等。作为上述碳原子数为2～20的烯基，可以列举如下，例如：乙烯基、丙烯基、丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
作为上述碳原子数为2～20的炔基，可以列举如下，例如：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
作为上述碳原子数为4～20的芳基，可以列举如下，例如：苯基、萘基、蒽基(アントラニル基)、吡啶基、嘧啶基、茚满基、茚基等。
作为上述碳原子数为5～20的芳烷基，可以列举如下，例如：苄基、萘基甲基、蒽基甲基、吡啶基甲基、嘧啶基甲基、茚满基甲基、茚基甲基等。
上述烷基、烯基、炔基、芳基和芳烷基任选具有取代基，作为取代基，可以列举如下，例如：卤原子、羟基、氨基、硝基等。
作为上述式(I)代表的N-琥珀酰氨基酸，具体而言，可以列举如下，例如：N-琥珀酰-DL-4-溴代苯丙氨酸、N-琥珀酰-DL-3-氟代苯丙氨酸、N-琥珀酰-DL-2-萘基丙氨酸、N-琥珀酰-DL-2-茚满基甘氨酸、N-琥珀酰-DL-6-庚烯基甘氨酸等。
本发明中使用的L-琥珀酰酶，是指L构型体选择性地对通式(I)代表的N-琥珀酰氨基酸的琥珀酰基进行水解(脱琥珀酰化)的酶，N-酰基氨基酸消旋酶是指对通式(I)代表的N-琥珀酰氨基酸的对映体进行外消旋化的酶。
在本发明的反应中，N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物中，仅L构型体被L-琥珀酰酶特异性地水解(脱琥珀酰化)，生成目标化合物L-氨基酸。此时，N-琥珀酰-D-氨基酸过剩，因此，通过N-酰基氨基酸消旋酶发生外消旋化反应，使N-琥珀酰-D-氨基酸转化为N-琥珀酰-DL-氨基酸。通过L-琥珀酰酶，将利用N-酰基氨基酸消旋酶生成的N-琥珀酰-L-氨基酸变换为目标化合物L-氨基酸。
通过组合上述对L构型体进行特异性水解反应和外消旋化反应，可以将N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物转变为由实质上单一的对映体构成的L-氨基酸。进一步地，在本发明优选的实施方式中，在上述反应过程中或者反应结束后，如果L-氨基酸的积累浓度在其溶解浓度以上，则L-氨基酸会析出到反应体系外，反应可以高效率地进行。
需要说明的是，如果使用高活性的D-琥珀酰酶(选择性地对D构型体进行脱琥珀酰化)，通过适用本发明的上述原理，可以将N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物高效率地转换为由实质上单一的对映体构成的D-氨基酸。但是，作为选择性地水解N-琥珀酰氨基酸D构型体的酶，已知的有D-酰化氨基酸水解酶(日本特开2008-61642)，但未显示出其获得能够实用的活性。
在此所述的溶解浓度是指，反应结束后的反应液中可以溶解的氨基酸的重量％，可以通过下述方法测定。添加L-氨基酸直至反应结束后的反应液中不能溶解为止，然后进行离心处理，用过滤器对其上清液进行过滤，之后通过高效液相色谱对溶液中生成的氨基酸进行定量分析测定，并进行计算。
此外，反应结束后的反应液中生成的氨基酸(包括析出生成的氨基酸和溶解生成的氨基酸)的重量％，可以按照下述方法进行测定。进行均匀地取样以包括反应结束后的反应液析出生成的氨基酸，使用适当的溶剂溶解析出生成的氨基酸，然后使用高效液相色谱对该溶液中的氨基酸进行定量分析测定，并进行计算。
上述溶解浓度，优选为3重量％以下，进一步优选为1重量％以下。如果生成的L-氨基酸超过上述溶解浓度，则L-氨基酸会析出，此时，反应结束后的反应液中生成的氨基酸的重量％越高越好，优选为溶解浓度的2倍以上，进一步优选为5倍以上。
本发明的L-氨基酸的制造方法，是在适当的溶剂中，通过使作为底物的N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物、L-琥珀酰酶和N-酰基氨基酸消旋酶共存来实施的。
反应中可以使用水系溶剂，也可以将水系溶剂和有机溶剂混合使用。作为有机溶剂，可以列举如下，例如：甲苯、乙酸乙酯、乙酸正丁酯、己烷、异丙醇、二异丙醚、甲醇、丙酮、二甲亚砜等。反应在例如10℃～70℃、优选在30℃～55℃的温度条件下进行。反应液的pH保持在例如4～10、优选6～9。
反应可以按照分批方式或者连续方式来实施。在分批方式的情况下，反应底物可以按照例如0.1％～70％(w/v)、优选3％～50％(w/v)的投料浓度添加。
反应生成的L-氨基酸，可以按照常规方法分别进行分离、纯化。含有反应生成的L-氨基酸的反应液，可以通过色谱等的处理进行分离、纯化。或者可以使用盐酸等，对从反应液中除去了微生物菌体的滤液进行中和结晶析出，并通过过滤析出的目标产物，来进行分离、纯化。此外，从反应液中除去了微生物菌体的滤液可以直接用于后续步骤的反应中。
本发明中使用的N-酰基氨基酸消旋酶，具有外消旋化上述式(I)所示的N-琥珀酰氨基酸的能力。对于这样的酶，没有特别地限定，具体而言，可以列举如下，例如：属于地芽孢杆菌属(GeobaciLLus)和栖热菌属(Thermus)等微生物来源的酶，优选嗜热地芽孢杆菌(GeobaciLLus kaustophiLus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophiLus)等微生物来源的酶。进一步优选嗜热地芽孢杆菌NBRC102445、嗜热栖热菌HB8来源的酶。编码嗜热地芽孢杆菌NBRC102445来源的N-酰基氨基酸消旋酶的氨基酸序列的基因如SEQ ID NO：2所示。
本发明中使用的L-琥珀酰酶，具有水解上述式(I)所示的N-琥珀酰氨基酸的L构型体的能力。对于这样的酶，没有特别地限定，作为具有代表性的酶，可以列举如下，例如：属于地芽孢杆菌属等微生物来源的酶，优选嗜热地芽孢杆菌等微生物来源的酶。进一步优选嗜热地芽孢杆菌NBRC102445来源的酶，编码其氨基酸序列的基因如SEQ ID NO：1所示。
关于所述微生物，本领域技术人员可以从各种保藏机构获得。作为保藏机构，可以列举各种特定微生物的保藏编号所对应的机构。具体而言，由NBRC编号特定微生物，可以从位于日本国千叶县木更津市Kazusa镰足2-5-8的独立行政法人制品评价技术基础机构生物遗传资源部门获得。此外，也可以从自然界分离得到。需要说明的是，可以通过使这些微生物发生变异，得到具有对本反应有利的性质的菌株。此外，也可以使用按照常规方法，将由上述微生物分离的酶基因导入到各种宿主载体体系中得到的转化体。
在本发明中，作为酶，除了可以使用将上述微生物或转化体在培养基中进行适当培养得到的微生物培养液以外，还可以使用培养物的处理物。作为该处理物，可以列举如下，例如：通过进行离心分离等集菌操作由微生物培养液得到培养上清液、微生物菌体、微生物菌体的破碎物、由该破碎物得到的无细胞提取物、固定化菌体、经纯化的纯化酶、固定化酶等。
如果无特别说明，本说明书中所述的DNA分离、载体的制备、转化等的基因操作，可以按照Molecular Cloning 2nd Edition(Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)、Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience)等书籍中所记载的方法来实施。
作为本说明书中所述的“宿主”，可以列举如下，例如：细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞等，从导入和表达效率的观点来看，优选细菌，特别优选大肠杆菌。可以按照公知的方法，将含有DNA的载体导入至宿主细胞。使用大肠杆菌作为宿主细胞时，可以通过使用例如市售的大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara-bio公司制造)，将该载体导入至宿主。
本说明书中所述的“载体”，只要在适当的宿主内可以表达DNA编码的基因即可，没有特别限定。作为所述载体，可以列举如下，例如：质粒载体、噬菌体载体、黏粒载体等，另外，也可以使用能够与其他宿主株进行基因交换的穿梭载体。
这样的载体可以作为表达载体使用，所述表达载体通常含有lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等调控因子，以及含有与DNA可操作连接的表达单元。例如，优选使用pUCN18。质粒pUCN18是指，通过PCR法将pUC18(Takara-bio公司制造、GenBank登录号L09136)185位的T修饰为A，从而破坏NdeI位点，并进一步将471-472位的GC修饰为TG，从而导入新的NdeI位点而得到的质粒。
上述调控因子，是指具有功能性启动子和任意相关转录要素(例如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部位等)的碱基序列。上述的“可操作连接”这一用语是指调节基因表达的启动子、增强子等各种调控元件和基因在宿主细胞中以能够发挥作用的状态连接。调控因子的类型和种类，可以根据宿主而改变，这一点是本领域技术人员公知的事项。
本说明书中所述的“转化体”，可以通过将编码多肽的DNA整合至载体，并将其导入到宿主细胞中得到。需要说明的是，本说明书中所述的“转化体”，不仅是指培养菌体，还包括其处理物。在此所述的处理物是指，例如，使用表面活性剂或有机溶剂处理的细胞、干燥细胞、经破碎处理的细胞、细胞的粗提取液等，除此之外，还包括通过公知的方法，将上述物质固定化得到的产物。只要能够使转化体增殖，本说明书中所述的转化体的培养是使用下述液体营养培养基来实施的，所述液体营养培养基可以含有常规碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等。
在实施本发明的制造方法时，可以使用同时导入有编码N-酰基氨基酸消旋酶的DNA和编码L-琥珀酰酶的DNA，并具有N-酰基氨基酸消旋酶和L-琥珀酰酶两种活性的转化体。如果使用这样的转化体，则不需要分别制备N-酰基氨基酸消旋酶和L-琥珀酰酶，可以更简便地实施本发明的制造方法。
包含编码本发明N-酰基氨基酸消旋酶的DNA和编码L-琥珀酰酶的DNA两者的转化体，可以通过下述方法获得：将编码N-酰基氨基酸消旋酶的DNA和编码L-琥珀酰酶的DNA两者整合在同一载体中，并将其导入到宿主细胞中制得，另外，也可以将上述2种DNA分别整合到不相容性组不同的2种载体中，并将上述2种载体导入到同一宿主细胞中而制得。作为包含编码本发明N-酰基氨基酸消旋酶的DNA和编码L-琥珀酰酶的DNA两者的转化体的例子，可以列举后述的大肠杆菌HB101(pNIGHK)。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细地说明，然而，本发明并不限定于所述实施例。此外，如果无特殊说明，以下所述的“％”是指“重量％”。
(参考例1)L-琥珀酰酶的制备
实施使用DNA聚合酶PrimeSTAR(宝酒造公司制造)的PCR，可以得到在嗜热地芽孢杆菌NBRC102445菌株来源的L-琥珀酰酶基因(SEQ ID NO：1)中添加有EcoRI识别位点和BamHI识别位点的基因。将上述通过PCR得到的DNA片段插入质粒pUCN18(通过PCR法将pUC18(Takara-bio公司制造、GenBank登录号L09136)185位的T修饰为A，破坏NdeI位点，并且将471-472号的GC修饰为TG，并重新导入NdeI位点而得到的质粒)的lac启动子下游的EcoRI识别位点与BamHI识别位点之间，构建重组载体pNHK。使用重组载体pNHK，转化大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara-bio公司制造)，得到大肠杆菌HB101(pNHK)。将得到的转化体接种在5mL含200μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl0.5％、pH7.0)中，并于37℃振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，并混悬于5mL的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。使用UH-50型超声波匀浆器(SMT公司制造)将上述菌体破碎后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞的提取液。测定所述无细胞提取液的琥珀酰酶活性，确定表达了活性5U的琥珀酰酶。
(参考例2)L-琥珀酰酶的活性测定
按照下述方法测定L-琥珀酰酶的琥珀酰酶活性。将作为底物的N-琥珀酰-DL-苯丙氨酸溶液250μL(终浓度50mM)、Tris-HCL(0.5M/pH7.5)230μL混合，并在该反应液中加入酶液20μL，于30℃进行反应，并在适当的时间添加1N HCL使反应停止。通过高效液相色谱测定生成的L-苯丙氨酸的含量，计算出酶活性。酶活性定义如下：将在1分钟内由N-琥珀酰-DL-苯丙氨酸生成1微摩尔的L-苯丙氨酸的情况，定义为1单位(U)。
(参考例3)N-酰基氨基酸消旋酶的制备
通过实施使用DNA聚合酶PrimeSTAR(宝酒造公司制造)的PCR，可以得到在嗜热地芽孢杆菌NBRC102445菌株来源的N-酰基氨基酸消旋酶基因(SEQ ID NO：2)中添加有EcoRI识别位点和SacI识别位点的基因。将通过上述PCR得到的DNA片段插入质粒pUCN18的lac启动子下游的EcoRI识别位点与SacI识别位点之间，构建重组载体pNIG。使用重组载体pNIG，转化大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara-bio公司制造)，得到大肠杆菌HB101(pNIG)。将得到的转化体接种至5mL含200μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)中，并于37℃振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，并混悬于5mL的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。使用UH-50型超声波匀浆器(SMT公司制造)将上述菌体破碎后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞的提取液。测定所述无细胞提取液的N-酰基氨基酸消旋酶活性，确认表达了活性2U的N-酰基氨基酸消旋酶。通过实施使用DNA聚合酶PrimeSTAR(宝酒造公司制造)的PCR，可以得到在嗜热栖热菌HB8菌株来源的N-酰基氨基酸消旋酶基因(SEQ ID NO：3)中添加有NdeI识别位点和EcoRI识别位点的基因。将通过上述PCR得到的DNA片段插入质粒pUCN18的lac启动子下游的NdeI识别位点与EcoRI识别位点之间，构建重组载体pNIT。使用重组载体pNIT，转化大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara-bio公司制造)，得到大肠杆菌HB101(pNIT)。将得到的转化体接种至5mL含200μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)中，并于37℃振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，并混悬于5mL的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。使用UH-50型超声波匀浆器(SMT公司制造)将上述菌体破碎后，通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞的提取液。测定所述无细胞提取液的N-酰基氨基酸消旋酶活性，确认表达了活性1U的N-酰基氨基酸消旋酶。
(参考例4)N-酰基氨基酸消旋酶的活性测定
按照下述方法测定N-酰基氨基酸消旋酶的消旋酶活性。将作为底物的N-乙酰基-D-甲硫氨酸溶液100μL(终浓度20mM)、氯化钴水溶液5μL(终浓度1mM)、Tris-HCL(0.5M/pH7.5)50μL(终浓度50mM)、灭菌蒸馏水245μL混合，并在该反应液中加入L-酰化氨基酸水解酶溶液(20mg/mL、将通过消旋酶生成的N-乙酰基-L-甲硫氨酸进行脱酰基化而生成L-甲硫氨酸)50μL和酶液50μL，于30℃进行反应，并在适当的时间添加1N HCl使反应停止。通过高效液相色谱测定生成的L-甲硫氨酸的含量，计算出酶活性。酶活性定义如下：将在1分钟内由N-乙酰基-D-甲硫氨酸生成1微摩尔N-乙酰基-L-甲硫氨酸的情况，定义为1单位(U)。
(实施例1)L-4-溴代苯丙氨酸的制造
将DL-4-溴代苯丙氨酸2.2g和琥珀酸酐0.99g以及乙酸20mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-4-溴代苯丙氨酸2.1g。制备N-琥珀酰-DL-4-溴代苯丙氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例1和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为8重量％)，于45℃进行反应，反应液中有4-溴代苯丙氨酸析出。搅拌18小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)和光学纯度(％e.e)，其结果如下，转化率为98.0摩尔％，L-4-溴代苯丙氨酸的光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-4-溴代苯丙氨酸的积累浓度为5.5重量％。此外，使用高效液相色谱对L-4-溴代苯丙氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为0.5重量％以下。
转化率(摩尔％)＝产物量/(残存底物量+产物量)×100
光学纯度(％e.e)＝(A-B)/(A+B)×100(A为作为对象的镜像异构体的量，B为对映镜像异构体的量)
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：COSMOSIL 5C 18-AR-II
(4.6mmφ×250mm、NAKARAI公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝8/2
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CROWNPAC CR(+)(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm。
N-琥珀酰-DL-4-溴代苯丙氨酸1H-NMR(400MHz、CD3OD)δppm：2.44-2.56(4H，m)，2.94(1H，dd，J＝8.6Hz，J＝13.9Hz)，3.14(1H，dd，J＝5.4Hz，J＝13.9Hz)，4.62-4.66(1H，m)，7.14-7.19(2H，m)，7.39-7.43(2H，m)。
(实施例2)L-3-氟代苯丙氨酸的制造
将DL-3-氟代苯丙氨酸2.0g和琥珀酸酐0.99g以及乙酸20mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-3-氟代苯丙氨酸1.9g。制备N-琥珀酰-DL-3-氟代苯丙氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例1和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为8重量％)，在45℃条件下反应，反应液中有3-氟代苯丙氨酸析出。搅拌20小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)和光学纯度(％e.e)，其结果如下，转化率为97.5摩尔％，L-3-氟代苯丙氨酸的光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-3-氟代苯丙氨酸的积累浓度为5.1重量％。此外，使用高效液相色谱对L-3-氟代苯丙氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为0.5重量％以下。
转化率(摩尔％)＝产物量/(残存底物量+产物量)×100
光学纯度(％e.e)＝(A-B)/(A+B)×100(A为作为对象的镜像异构体的量，B为对映镜像异构体的量)
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：COSMOSIL 5C 18-AR-II
(4.6mmφ×250mm、NAKARAI公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝8/2
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CROWNPAC CR(+)(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm。
(实施例3)L-2-萘基丙氨酸的制造
将DL-2-萘基丙氨酸2.0g和琥珀酸酐1.02g以及乙酸25mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-2-萘基丙氨酸2.3g。制备N-琥珀酰-DL-2-萘基丙氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例1和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为9重量％)，于45℃进行反应，反应液中有2-萘基丙氨酸析出。搅拌20小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)和光学纯度(％e.e)，其结果如下，转化率为99.8摩尔％，L-2-萘基丙氨酸的光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-2-萘基丙氨酸的积累浓度为6.2重量％。此外，使用高效液相色谱对L-2-萘基丙氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为0.2重量％以下。
转化率(％)＝产物量/(残存底物量+产物量)×100
光学纯度(％e.e)＝(A-B)/(A+B)×100(A为作为对象的镜像异构体的量，B为对映镜像异构体的量)
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：COSMOSIL 5C 18-AR-II
(4.6mmφ×250mm、NAKARAI公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝8/2
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CHIROBIOTIC T(4.6mmφ×250mm、Astec公司制造)
洗提液：水/乙醇＝3/7
流速：0.5mL/分钟
色谱柱温度：40℃
测定波长：210nm。
N-琥珀酰-DL-2-萘基丙氨酸1H-NMR(400MHz、CD3OD)δppm：2.38-2.50(4H，m)，3.14(2H，dd，J＝8.5Hz，J＝13.9Hz)，4.74-4.87(1H，m)，7.36-7.45(3H，m)，7.05-7.15(4H，m)。
(实施例4)L-2-茚满基甘氨酸的制造
将DL-2-茚满基甘氨酸2.5g和琥珀酸酐1.44g以及乙酸30mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-2-茚满基甘氨酸3.2g。制备N-琥珀酰-DL-2-茚满基甘氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例11和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为8重量％)，于45℃进行反应，反应液中有2-茚满基甘氨酸析出。搅拌20小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)和光学纯度(％e.e)，其结果如下，转化率为100摩尔％，L-2-茚满基甘氨酸的光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-2-茚满基甘氨酸的积累浓度为5.3重量％。此外，使用高效液相色谱对L-2-茚满基甘氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为0.5重量％以下。
转化率(％)＝产物量/(残存底物量+产物量)×100
光学纯度(％e.e)＝(A-B)/(A+B)×100(A为作为对象的镜像异构体的量，B为对映镜像异构体的量)
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：COSMOSIL 5C 18-AR-II
(4.6mmφ×250mm、NAKARAI公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝8/2
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CROWNPAC CR(+)(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：高氯酸水溶液(pH1.5)/甲醇＝85/15
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：35℃
测定波长：210nm。
N-琥珀酰-DL-2-茚满基甘氨酸1H-NMR(400MHz、CD3OD)δppm：2.47-2.61(4H，m)，2.79-3.31(5H，m)，4.51(1H，d，J＝6.8Hz)，7.05-7.15(4H，m)。
(实施例5)L-6-庚烯基甘氨酸的制造
将DL-6-庚烯基甘氨酸2.0g和琥珀酸酐1.29g以及乙酸20mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-6-庚烯基甘氨酸1.4g。制备N-琥珀酰-DL-6-庚烯基甘氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例1和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为9重量％)，于45℃进行反应，反应液中的6-庚烯基甘氨酸析出。搅拌24小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)，其结果如下，转化率为99.6摩尔％。进一步地，使用焦碳酸二叔丁酯将产物衍生为N-叔丁氧羰基6-庚烯基甘氨酸，并使用高效液相色谱进行光学纯度(％e.e)进行分析，结果显示其光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-6-庚烯基甘氨酸的积累浓度为5.7重量％。此外，使用高效液相色谱对L-6-庚烯基甘氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果为0.5重量％以下。
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：YMC-A303(4.6mmφ×250mm、YMC公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝1/1
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：35℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CHIRALPAK AD-RH(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：0.02％磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝65/35
流速：0.7mL/分钟
色谱柱温度：35℃
测定波长：205nm。
N-琥珀酰-DL-6-庚烯基甘氨酸1H-NMR(400MHz、DMSO-d6)δppm：1.25-1.38(6H，m)，1.51-1.69(2H，m)，2.01(2H，q，J＝6.6Hz)，2.32-2.44(4H，m)，4.16(1H，dt，J＝5.2Hz，J＝8.6Hz)，4.93(1H，d，J＝10.2Hz)，4.99(1H，d，J＝17.1Hz)，5.79(1H，m)，8.08(1H，d，J＝7.1Hz)。
(比较例)L-苯丙氨酸的制造
将DL-苯丙氨酸5.0g和琥珀酸酐3.0g以及乙酸30mL混合，于55℃反应4h，浓缩后在乙酸乙酯中进行结晶析出，得到N-琥珀酰-DL-苯丙氨酸4.5g。制备N-琥珀酰-DL-苯丙氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例1和参考例3相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNHK)和大肠杆菌HB101(pNIG)的培养液混合(底物的终浓度为6重量％)，于45℃进行反应。搅拌21小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)和光学纯度(％e.e)，其结果如下，结果显示转化率为86.0摩尔％，L-苯丙氨酸的光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-苯丙氨酸的积累浓度为3.2重量％。此外，使用高效液相色谱对L-苯丙氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为4重量％以下。
转化率(摩尔％)＝产物量/(残存底物量+产物量)×100
光学纯度(％e.e)＝(A-B)/(A+B)×100(A为作为对象的镜像异构体的量，B为对映镜像异构体的量)
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：COSMOSIL 5C 18-AR-II
(4.6mmφ×250mm、NAKARAI公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝8/2
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：30℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CROWNPAC CR(+)(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：高氯酸水溶液(pH2.5)
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：35℃
测定波长：254nm。
(实施例6)制备由含有L-琥珀酰酶和N-酰基氨基酸消旋酶基因的载体转化的转化 体
通过实施使用DNA聚合酶PrimeSTAR(宝酒造公司制造)的PCR，可以得到在嗜热地芽孢杆菌NBRC102445菌株来源的L-琥珀酰酶基因(SEQ IDNO：1)615位的C修饰为G的基因中添加有SacI识别位点和BamHI识别位点的基因。将通过上述PCR得到的DNA片段插入参考例3中制备的质粒pNIG的SacI识别位点与BamHI识别位点之间，构建重组载体pNIGHK。使用重组载体pNIGHK，转化大肠杆菌HB101感受态细胞(Takara-bio公司制造)，得到大肠杆菌HB101(pNIGHK)。将得到的转化体接种至5mL含200μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基(胰蛋白胨1.6％、酵母提取物1.0％、NaCl 0.5％、pH7.0)中，并于37℃振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，并混悬于5mL的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)中。使用UH-50型超声波匀浆器(SMT公司制造)将上述菌体破碎，然后通过离心分离除去菌体残渣，得到无细胞的提取液。测定所述无细胞提取液的琥珀酰酶活性和N-酰基氨基酸消旋酶活性，确认表达了活性4U的琥珀酰酶，表达了活性1U的N-酰基氨基酸消旋酶。
(实施例7)使用由含有L-琥珀酰酶和N-酰基氨基酸消旋酶基因的载体转化的转化 体来制备L-6-庚烯基甘氨酸
与实施例5相同，制备N-琥珀酰-DL-6-庚烯基甘氨酸的底物溶液(pH8)，并添加氯化钴水溶液使其终浓度为1mM，然后与按照和参考例6相同的方法培养的大肠杆菌HB101(pNIGHK)培养液混合(底物的终浓度为9重量％)，于45℃进行反应，在反应液中析出6-庚烯基甘氨酸。搅拌24小时后，使用高效液相色谱对反应液中的底物和产物进行分析，求出转化率(摩尔％)，其结果如下，转化率为99.6摩尔％。进一步地，使用焦碳酸二叔丁酯将产物衍生为N-叔丁氧羰基6-庚烯基甘氨酸，再使用高效液相色谱进行光学纯度(％e.e)分析，结果显示其光学纯度为100％e.e.。通过转化率计算出L-6-庚烯基甘氨酸的积累浓度为5.7重量％。此外，使用高效液相色谱对L-6-庚烯基甘氨酸的溶解浓度进行定量分析测定，结果显示为0.5重量％以下。
<高效液相色谱分析条件>
[转化率的分析]
色谱柱：YMC-A303(4.6mmφ×250mm、YMC公司制造)
洗提液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝1/1
流速：1.0mL/分钟
色谱柱温度：35℃
测定波长：210nm
[光学纯度分析]
色谱柱：CHIRALPAK AD＝RH(4.6mmφ×150mm、Daicel公司制造)
洗提液：0.02％磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈＝65/35
流速：0.7mL/分钟
色谱柱温度：35℃

Claims (5)

1.L-氨基酸的制造方法，该制造方法通过使L-琥珀酰酶作用于N-琥珀酰氨基酸的对映体混合物来制造L-氨基酸；其中，L-氨基酸的溶解浓度为1重量％以下，
在共存有N-酰基氨基酸消旋酶的条件下，一边使生成的L-氨基酸析出，一边进行反应，其中，
所述N-琥珀酰氨基酸如通式(I)所示：
[化学式1]
通式(I)中，R代表4-溴苄基、3-氟苄基、萘基甲基、茚满基或6-庚烯基，
所述L-氨基酸如通式(II)所示，
[化学式2]
通式(II)中，R表示与上述相同的取代基。
2.根据权利要求1中所述的制造方法，其中，N-酰基氨基酸消旋酶来源于属于地芽孢杆菌属(GeobaciLLus)或栖热菌属(Thermus)的微生物，L-琥珀酰酶来源于属于地芽孢杆菌属(GeobaciLLus)的微生物。
3.根据权利要求2所述的制造方法，其中，N-酰基氨基酸消旋酶来源于嗜热地芽孢杆菌(GeobaciLLus kaustophiLus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophiLus)，L-琥珀酰酶来源于嗜热地芽孢杆菌(GeobaciLLus kaustophiLus)。
4.根据权利要求3所述的制造方法，其中，N-酰基氨基酸消旋酶来源于嗜热地芽孢杆菌(GeobaciLLus kaustophiLus)NBRC102445、嗜热栖热菌(Thermus thermophiLus)HB8，L-琥珀酰酶来源于嗜热地芽孢杆菌 (GeobaciLLus kaustophiLus)NBRC102445。
5.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，N-酰基氨基酸消旋酶和L-琥珀酰酶是用包含编码N-酰基氨基酸消旋酶和L-琥珀酰酶的DNA的载体进行转化而得到的转化体。
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