WO2011118450A1 - 光学活性ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法 - Google Patents

光学活性ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法 Download PDF

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methylamino
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures

Definitions

  • Optically active N-methylamino acids and optically active N-methylamino acid amides are widely used as raw materials for peptide pharmaceuticals, and specific uses include raw materials for rheumatic drugs and anticancer agents (Special Table 2001).
  • No. 518515 International Publication No. 1999/17792
  • International Publication No. 1999/17792 Japanese Patent Publication No. 2001-514659
  • Japanese Patent Publication No. 2000-502092 International Publication No. 1997/22621
  • Japanese Patent Laid-Open No. 2001-190298 discloses that an optically active N-methylamino acid can be produced by reacting an ⁇ -keto acid compound with an inexpensive methylamine using an aminotransferase. ing.
  • ⁇ -keto acid compounds are usually difficult to obtain industrially, this method is not necessarily economically advantageous.
  • substrates to which the aminotransferase can be applied are limited.
  • Rhodococcus sp. A method of performing stereoselective hydrolysis using an amidase contained in AJ270 has also been reported (Tetrahedron: Asymmetry, 16, 2409 (2005)). By this method, an optically active N-methylamino acid can be obtained as a product of hydrolysis, and an optically active N-methylamino acid amide can be obtained as an unreacted product.
  • this method has high stereoselectivity for N-methylphenylglycinamides and N-methylcyclohexylglycinamides, it has stereoselectivity for lower aliphatic N-methylamino acid amides. Low.
  • microorganisms belonging to the genus Mycoplana or the genus Mycobacterium having a stereoselective hydrolysis activity toward an amide bond even in an organic solvent aqueous solution are known (Japanese Patent Laid-Open No. 2009-278914).
  • the reaction involving them is a reaction using a poorly water-soluble aromatic amino acid amide as a substrate, and the solvent is also in an organic solvent aqueous solution.
  • N-methylamino acid amide is a water-soluble substrate and is preferably reacted in an aqueous solution.
  • enzymes have different reaction activities depending on the properties of the solvent and the substrate, and thus the above-mentioned microorganisms were not considered to have activity on N-methylamino acid amide.
  • an object of the present invention is to provide an efficient method for producing optically active N-methylamino acid and / or optically active N-methylamino acid amide useful as a raw material for pharmaceuticals by using a biocatalyst.
  • the method for producing an optically active N-methylamino acid and / or optically active N-methylamino acid amide according to the present invention can be obtained by treating a microbial cell belonging to the genus Mycoplana or a processed product thereof with -Reacting with a methylamino acid amide to obtain an optically active N-methylamino acid of general formula (2) and an optically active N-methylamino acid amide of general formula (3) as an enantiomer.
  • acting a bacterial cell or a treated product thereof on the N-methylamino acid amide of the general formula (1) means that the bacterial cell or the treated product is subjected to, for example, an aqueous solution of N-methylamino acid amide Coexisting with and reacting by its catalytic action.
  • microorganism of the present invention having the activity of stereoselectively hydrolyzing the N-methylamino acid amide of the general formula (1) or its treated product has the activity of stereoselectively hydrolyzing the amide bond of the N-methylamino acid amide. It is what has.
  • Such microorganisms having biocatalytic activity are microorganisms belonging to the genus Mycoplana, and specifically, Mycoplana ramosa and Mycoplana dimorpha are preferable.
  • microorganisms having amino acid amide hydrolysis activity for example, cells derived from microorganisms belonging to the genus Xanthobacter, Protaminobacter, Mycobacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia, and Chromobacterium was used as a biocatalyst, it had almost no hydrolysis activity to N-methylamino acid amide.
  • microorganisms are usually cultured using a medium containing an assimilating carbon source, nitrogen source, inorganic salts essential to each microorganism, nutrients, and the like.
  • a medium containing an assimilating carbon source, nitrogen source, inorganic salts essential to each microorganism, nutrients, and the like In particular, when urea is added as a nitrogen source, the activity as a biocatalyst of microorganisms obtained by culturing is high, which is preferable.
  • the pH during culture is in the range of 4 to 10, and the temperature is 20 to 50 ° C.
  • the culture is aerobic for about 1 day to 1 week.
  • the microorganism thus cultured is used for the reaction as a microbial cell or a processed product of the microbial cell, for example, a culture solution, a separated microbial cell, a crushed cell, or a purified biocatalyst.
  • it can also be used as a biocatalyst by immobilizing
  • the pH during the reaction is preferably in the range of 6 to 10, more preferably in the range of pH 7 to 8.
  • an acid or a base may be added as appropriate.
  • the pH may be adjusted by adding an acid such as hydrochloric acid, sulfuric acid or nitric acid.
  • N-methylamino acid amide acid salt is used as a raw material, It is preferable to adjust the pH by adding a base such as sodium or potassium hydroxide.
  • a base such as sodium or potassium hydroxide.
  • the pH is lower than 6, the catalytic activity of the microbial cells or the processed microbial cells may decrease and the reaction may not proceed.
  • the pH is higher than 10 since a non-enzymatic hydrolysis reaction with a base occurs, the apparent reaction rate increases, but the optical purity may decrease.
  • the microbial cells and their processed products are removed from the reaction end solution by a normal solid-liquid separation means using, for example, a centrifugal separator or an ultrafiltration membrane.
  • the optically active N-methylamino acid as a reaction product can be recovered by an extraction operation into a solvent that dissolves the optically active N-methylamino acid.
  • An insoluble salt may be formed.
  • the organic solvent used at this time is not particularly limited as long as it dissolves optically active N-methylamino acid, and examples thereof include alcohols, and examples thereof include methanol, ethanol, isopropanol, and isobutanol.
  • the organic solvent from which the optically active N-methylamino acid has been extracted includes unreacted N-methylamino acid amide
  • a method using the difference in solubility between the optically active N-methylamino acid and N-methylamino acid amide Unreacted N-methylamino acid amide can be separated.
  • the solvent used here may be any solvent that has low solubility in optically active N-methylamino acid and high solubility in N-methylamino acid amide.
  • ketones such as acetone and methylethylketone, or toluene and xylene And hydrocarbons.
  • the optically active N-methylamino acid By adding the solvent to an organic solvent solution from which the optically active N-methylamino acid has been extracted, or a solution obtained by distilling the organic solvent from the organic solvent solution, a solid-liquid separation operation such as filtration or centrifugation is performed. By dissolving and removing the N-methylamino acid amide in the reaction, the optically active N-methylamino acid can be obtained as crystals.
  • Comparative Example 2 (1) Culture of other strains Similar to pMCA1 / JM109 FERM BP-10334 in Comparative Example 1, microorganisms Xanthobacter Flavus NCIB10071T, Xanthobacter autotrophicus DSM431 TK0502 -8823, Pseudomonas putida, Rhodococcus erythropolis, Serratia marcescens, and Chromobacterium iodium were inoculated into a medium having the composition shown in Table 4 and cultured at 30 ° C. for 48 hours under shaking. The obtained culture solution was centrifuged to obtain a concentrated cell fluid (Table 5). The results were as shown in Table 5.

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Abstract

　本発明は、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体又はその処理物を生体触媒として、Ｎ－メチルアミノ酸アミドに作用させて加水分解させることにより、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを製造する方法に関する。本発明によれば、医薬品の原料として有用な光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを立体選択的に効率良く得ることができる。

Description

光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法 関連出願の参照
　本願は、先行する日本国特許出願である特願２０１０－０６６１５７号（出願日：２０１０年３月２３日）に基づくものであって、その優先権の利益を主張するものであり、その開示内容全体は参照することによりここに組み込まれる。
　本発明は、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法に関する。
　光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドは、ペプチド医薬品の原料として幅広く利用されており、具体的な用途としてリウマチ治療薬や抗がん剤の原料が挙げられる(特表２００１－５１８５１５号公報（国際公開第１９９９／１７７９２号）、国際公開第１９９９／１７７９２号、特表２００１－５１４６５９号公報（国際公開第１９９８／４００９２号）、および特表２０００－５０２０９２号公報（国際公開第１９９７／２２６２１号）)。
　アミノ酸を原料とした医薬品は多数開発されているが、ペプチド医薬品は、消化器系の分解酵素により分解されやすく経口投与できない欠点がある。一方、非天然型のアミノ酸や化学修飾されたアミノ酸を構造に有するペプチド医薬品は、分解酵素への抵抗性を有し、経口投与が可能になる。このため、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドは、医薬品の原料として非常に有用であると言える。
　光学活性Ｎ－メチルアミノ酸は、光学活性アミノ酸に対し硫酸ジメチルやヨウ化メチルのようなメチル化剤を作用させることにより合成することができる（Can.J.Chem.,55(5),916 (1977)）。しかしながら、モノメチル化のみを進行させることは困難であり、ジメチル化まで反応はしばしば進行してしまう。このため、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を効率的に製造することは困難であった。
　光学活性Ｎ－メチルアミノ酸の別の製造方法として、工業的には光学活性アミノ酸のアミノ基をあらかじめＢｏｃ基、Ｃｂｚ基又はＦｍｏｃ基などで保護してから、メチル化を行う方法が開示されている（米国特許第５５８７５０６号明細書、米国特許第６２１８５７２号明細書）。しかしながら、アミノ基を保護する方法では、高価な保護化剤を用いなければならないうえに、メチル化後に脱保護が必要になるため、工程が煩雑となる。さらには、メチル化剤も過剰に用いなければならず、必ずしも経済的に有利なプロセスとはいえない。
　そこで、安価に光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を製造する方法として、微生物の有する酵素を利用する方法が挙げられる。天然型や非天然型のアミノ酸を製造できる酵素を有する微生物としては、例えば、バリンアミドの立体選択的な加水分解が可能なＸａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ　Ｆｌａｖｕｓより抽出された遺伝子を保有する遺伝子組み換え大腸菌ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３３４などが知られている（国際公開第２００６／００８８７２号（欧州出願公開ＥＰ１７７０１６６Ａ））。ただし、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸の合成に適用できる生物化学的な方法は２例しか報告されていない。
　例えば、特開２００１－１９０２９８号公報には、アミノ基転移酵素を用いて、α－ケト酸化合物に対して安価なメチルアミンを反応させることによって、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を製造できることが開示されている。しかしながら、通常、α－ケト酸化合物は工業的に入手が困難であることから、この方法は、経済的に有利とは必ずしも言えない。またここでは、フェニルアラニン骨格を有する光学活性Ｎ－メチルアミノ酸の実施例のみが記載されているに過ぎず、そのアミノ基転移酵素を適用できる基質は限られている。
　また、文献FEBS J.,272,1117 (2005)には、フェニルピルビン酸に対してメチルアミンを反応させて、Ｎ－メチルフェニルアラニンを製造することができるアミノ基転移酵素が報告されている。しかしながら、この酵素は、α－ケトイソ吉草酸やα－ケト－β－メチル吉草酸などでは活性を有さない。したがって、このアミノ基転移酵素は、基質特異性が非常に高く、基質が限定されるため、低級脂肪族の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸の製造に用いることはできない。
　さらに、Ｎ－メチルアミノ酸アミドへＲｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＪ２７０に含まれるアミダーゼを作用させて、立体選択的な加水分解を行う方法も報告されている（Tetrahedron: Asymmetry,16,2409 (2005)）。この方法により、加水分解による生成物として、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び未反応物として光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを取得することができる。しかしながら、この方法は、Ｎ－メチルフェニルグリシンアミド類やＮ－メチルシクロヘキシルグリシンアミド類に対しては高い立体選択性を有するものの、低級脂肪族のＮ－メチルアミノ酸アミドに対しては立体選択性が低い。例えば、Ｎ－メチルバリンアミドでは、得られるＮ－メチルバリンの光学純度は１３％ｅｅにとどまり、産業レベルで使用することは困難である。また、Ｎ－メチルフェニルグリシンアミド類についても、フェニル部位への置換基の置換部位が異なるだけで活性が大幅に低減してしまうことから、前記酵素は基質の電子的及び立体的な影響を受けやすいとされている。
　さらには、有機溶媒水溶液中でもアミド結合へ立体選択的な加水分解活性を有するＭｙｃｏｐｌａｎａ属又はＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属の微生物が知られている（特開２００９－２７８９１４号公報）。しかしながら、これらが関与する反応は、難水溶性の芳香族アミノ酸アミドを基質とした反応であり、その溶媒も有機溶媒水溶液中である。一方、Ｎ－メチルアミノ酸アミドは水溶性の基質であり、水溶液中での反応が望ましい。一般に、酵素は溶媒、基質の性状の相違によって反応活性が異なるため、前述の微生物が、Ｎ－メチルアミノ酸アミドに対する活性を有しているとは考えられなかった。
　したがって、Ｎ－メチルアミノ酸アミドに対して高い活性を有する酵素を利用した光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法の例は報告されていない。このように、微生物の有する酵素を利用した生物化学的な方法を用いた場合においても、効率的な光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法は限られている。特に、低級アルキル基を有している光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法は、本発明者らの知る限り、未だ確立していない。
　本発明者らは今般、既存の微生物の中に、Ｎ－メチルアミノ酸アミドに対して、立体選択的な加水分解をなしうる活性を有する微生物があることを発見した。この微生物は、低級アルキル基を有するＮ－メチルアミノ酸アミドに対しても非常に高い立体選択性を有していた。この微生物の菌体若しくはその処理物を、生体触媒として作用させることにより、立体選択的に効率よく加水分解して光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを製造するに成功した。これによって、本発明者らは、生体触媒を利用する光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの効率的な新たな製造方法を確立することに成功した。本発明はこれら知見に基づくものである。
　よって本発明の目的は、生体触媒を利用することによる医薬品の原料として有用な光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの効率的な製造方法を提供することにある。
　即ち、本発明は、Ｎ－メチルアミノ酸アミドから光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを効率的に生産するための、以下の（i）～（iv）に示す製造方法に関する。
　（ｉ）　Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて、一般式（２）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と、対掌体としての一般式（３）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを得ることを含む、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
 　［上記一般式（１）、（２）および（３）中、ＲはＣ１～Ｃ４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示す］。
　（ii）　Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて得られた、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを含む加水分解液から、光学活性アミノ酸を結晶として析出させ、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを分離することをさらに含む、前記（ｉ）の方法。
　（iii）　前記Ｍｙｃｏｐｌａｎａに属する微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ又はＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａである、前記（ｉ）又は（ii）の方法。
　（iv）　一般式（１）、（２）および（３）中のＲがイソプロピル基である、前記（ｉ）～（iii）のいずれかの方法。
　本発明で用いる微生物の菌体またはその処理物は、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドのアミド結合を、高い反応率かつ立体特異性で加水分解する生体触媒活性を有する。すなわち、本発明は、既存の微生物において新たな活性を見出し、これに着目して成されたものである。本発明によって、原料のＮ－メチルアミノ酸アミドから、目的とする光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを、効率的に製造することが可能になる。したがって、本発明の方法を用いることによって、医薬品原料として重要な、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを、経済的に（低コストで）製造し供給することが可能となる。
発明の具体的説明
　本発明による光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法は、前記したように、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて、一般式（２）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と、対掌体としての一般式（３）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを得ることを含む。ここで、菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに「作用」させるとは、菌体若しくはその処理物を、例えば、水溶液中にて、Ｎ－メチルアミノ酸アミドと共存させ、その触媒的作用により反応させることを意味する。
　またここで「及び／又は」とは、例えば、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとある場合、「光学活性Ｎ－メチルアミノ酸」、「光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミド」、または「光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミド」を包含する意味で用いられる。
　本発明の原料基質となるＮ－メチルアミノ酸アミドは、一般式（１）に示される側鎖ＲにＣ１～Ｃ４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有するＮ－メチルアミノ酸アミドである。ここで、Ｒは好ましくはＣ３～Ｃ４の分岐鎖のアルキル基である。Ｒ基の具体例としては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチルが挙げられる。
　したがって、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドの具体例としては、Ｎ－メチルアラニンアミド、Ｎ－メチルアミノ酪酸アミド、Ｎ－メチルノルバリンアミド、Ｎ－メチルバリンアミド、Ｎ－メチルノルロイシンアミド、Ｎ－メチルロイシンアミド、Ｎ－メチルイソロイシンアミド及びＮ－メチル－ｔｅｒｔ－ロイシンアミドが挙げられる。好ましくは、Ｎ－メチルバリンアミド、Ｎ－メチルロイシンアミド、Ｎ－メチルイソロイシンアミド及びＮ－メチル－ｔｅｒｔ－ロイシンアミドである。この内、特にＮ－メチルバリンアミドは、好適な基質である。
　本発明において、反応に使用するＮ－メチルアミノ酸アミドは、塩酸、硫酸又は硝酸等の鉱酸塩、或いは酢酸等の有機酸塩の形態であってもよい。
　本発明の、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドを立体選択的に加水分解する活性を有する微生物またはその処理物は、Ｎ－メチルアミノ酸アミドのアミド結合を立体選択的に加水分解する活性を有するものである。このような生体触媒活性を有する微生物としては、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物であり、具体的にはＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａとＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａが好ましいものとして挙げられる。
　従来において、アミノ酸アミド加水分解活性を有するとされる微生物、例えば、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ属、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ属、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ属、Ｓｅｒｒａｔｉａ属、およびＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する微生物に由来する菌体またはその処理物を、生体触媒として用いた場合には、Ｎ－メチルアミノ酸アミドへの加水分解活性はほとんど有していなかった。
　このような状況において、本発明者らは、既存の微生物、すなわち、販売されていたり、寄託者より分与されていたりして、当業者に入手可能な微生物の中で、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物が、Ｎ－メチルアミノ酸アミドについて高い生体触媒活性を有していることを今回、予想外にも見出したのである。本発明において利用できる微生物としては、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物に属するものであれば、特に制限はなく、所望の触媒活性に着目して、該属から適宜選択して使用することができる。
　本発明において、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の好ましい具体例としては、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ　ＡＴＣＣ４９６７８、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａ　ＡＴＣＣ４２７９、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａ　ＮＣＩＢ９４３９Ｔが挙げられる。これらの菌体またはその処理物を生体触媒として用いた場合には、基質となるＮ－メチルアミノ酸アミドについて、より高い生体触媒活性が得られる。
　なお、これら具体的に示した微生物は、各種研究機関等で広く用いられており、必要であれば、ＡＴＣＣ（米国）およびＮＣＩＭＢ（又はＮＣＩＢ）（英国）より、Accession 番号にしたがって、直接、購入または分譲を受けることが可能である。また必要であれば、所定のAccession番号及び／又は微生物名称等に基づいて、現に所有している者から関係者の許可を得て容易に入手することも可能であろう。また、本明細書において、具体的に示した他の微生物も同様に、必要であれば容易に入手可能であろう。
　また、上記の微生物から人工的変異手段によって誘導される変異株や細胞融合株、または遺伝子組換え法等の遺伝学的手法により誘導される組換え株等の何れの株であっても上記能力（活性）を有するものであれば、本発明に使用できる。
　これら微生物の培養は通常、資化し得る炭素源、窒素源、各微生物に必須の無機塩、栄養等を含有させた培地を用いて行われる。特に、尿素を窒素源として加えた場合、培養により得られる微生物の生体触媒としての活性が高く、好適である。培養時のｐＨは４～１０の範囲であり、温度は２０～５０℃である。培養は1日～１週間程度好気的に行われる。このようにして培養した微生物は、菌体または該菌体の処理物、例えば培養液、分離菌体、菌体破砕物、さらには精製した生体触媒として反応に使用される。また、常法に従って菌体またはその処理物を固定化して生体触媒して使用することもできる。
　原料である一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに対する微生物の菌体または菌体処理物の使用量は、乾燥菌体の重量に対する重量比に換算して、０．０００１～３倍量の範囲になるように添加することが好ましく、０．００１～１倍量の範囲になるようにすることがより好ましい。重量比が０．０００１倍量を下回る場合には反応速度が遅いため、処理に長時間を要することがある。３倍量を超える場合には反応時間は短くなるものの、生体触媒としての利用効率の面から好適とは言えなくなることがあり、しかも反応後の菌体または菌体処理物の分離に労力を要することとなり工業的に不利となる。
　Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて反応させる際の反応温度は、１０～６０℃の範囲が好ましい。反応温度は、３０～５０℃の範囲がより好適である。反応温度が１０℃を下回る場合は反応速度が遅いため処理時間が長くなることがある。一方、反応温度が６０℃を超える場合は、菌体または菌体処理物の生体触媒活性が失活により低下し、アミノ酸アミドの非酵素的分解も随伴するようになるので光学純度が低下してしまうことがある。また、工程間で反応液の昇温、冷却に多くのエネルギーを必要とするようになる。
　反応を行う際のｐＨは６～１０の範囲であることが好ましく、より好ましくはｐＨ７～８の範囲が望ましい。反応液のｐＨを好適な範囲内とするため、適宜、酸又は塩基を加えてもよい。例えば、Ｎ－メチルアミノ酸アミドを原料に用いる場合は、塩酸、硫酸若しくは硝酸等の酸を加えてｐＨを調整すると良く、また、Ｎ－メチルアミノ酸アミドの酸塩を原料に用いる場合は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の塩基を加えてｐＨを調整すると良い。ｐＨ６を下回る場合は、菌体または菌体処理物の触媒活性が低下し反応が進行しなくなることがある。一方、ｐＨ１０を上回る場合は、塩基による非酵素的な加水分解反応が起こるようになるため、見掛け上の反応率は高くなるものの光学純度が低下してしまうことがある。
　次いで、反応終了液から、例えば、遠心分離機または限外濾過膜等を用いた通常の固液分離手段により微生物菌体やその処理物を除く。その後、反応生成物となる光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を溶解する溶媒への抽出操作により回収することができる。上記ｐＨの調整にて酸又は塩基を加えた場合には、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を効率よく抽出するため添加した酸又は塩基の中和処理を行い、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を溶解する溶媒に対し不溶性の塩を形成させるとよい。このとき用いる有機溶媒は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を溶解するものであれば特に制限はないが、例えば、アルコール類が挙げられ、その例としてメタノール、エタノール、イソプロパノール又はイソブタノールなどが挙げられる。
　また、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸が抽出された有機溶媒には未反応のＮ－メチルアミノ酸アミドも含まれるため、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸とＮ－メチルアミノ酸アミドとの溶解度差を利用した方法により、未反応のＮ－メチルアミノ酸アミドを分離することができる。このとき用いる溶媒は、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸に対し溶解性が低く、Ｎ－メチルアミノ酸アミドに対しては溶解性が高いものであればよく、例えばアセトンやメチルエチルケトンなどのケトン類或いはトルエンやキシレンなどの炭化水素類が挙げられる。光学活性Ｎ－メチルアミノ酸が抽出された有機溶媒溶液、又は前記有機溶媒溶液から有機溶媒を留去したものへ前記溶媒を加えて、ろ過や遠心分離などの固液分離操作を行うことにより、未反応のＮ－メチルアミノ酸アミドを溶解除去し、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸を結晶として取得することができる。
　続けて、前記固液分離操作により得られた有機溶媒溶液から有機溶媒を留去すれば、未反応のＮ－メチルアミノ酸アミドを高い光学純度で取得することができる。また、前記固液分離操作により得られた有機溶媒溶液へ塩酸、硫酸などの鉱酸、或いは酢酸等の有機酸を加えれば、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの酸塩として取得することができる。光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの酸塩が有機溶媒から析出した場合には、これをろ過や遠心分離などの固液分離操作を行うことにより回収する。さらには、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドをさらに塩酸などを用いて加水分解し、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸へ誘導することもできる。
　本発明の方法によって、例えば、医薬品の原料として有用なＮ－メチル－Ｌ－バリン及びＮ－メチル－Ｄ－バリンアミドをＮ－メチルバリンアミドから製造することができる。
　実施例および比較例によって本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらの例にのみ限定されるものではない。
測定法：
　基質のＮ－メチルアミノ酸アミド、反応生成物である光学活性Ｎ－メチルアミノ酸の量または光学純度は、以下のＨＰＬＣ条件で測定した。
（１）反応率の測定
カラム：Ｌｉｃｈｒｏｓｏｒｂ　ＲＰ－１８（４．６φ×２５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃，　検出：ＲＩ
溶離液：過塩素酸５０ｍＭ水溶液，　流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ
（２）光学純度の測定
カラム：Ｓｕｍｉｃｈｉｒａｌ　ＯＡ－５０００（４．６φ×５０ｍｍ）
カラム温度：３０℃，　検出：２６０ｎｍ吸収
溶離液：１ｍＭ硫酸銅水溶液，　流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
参考例１：
Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ　ＡＴＣＣ４９６７８の培養
　Ｎ－メチルアミノ酸アミドを基質とした場合に、効率良く立体選択的に加水分解することが判明したＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ　ＡＴＣＣ４９６７８を、表１に示す組成を有する培地に接種し、３０℃で６９時間振盪培養した。得られた培養液を５℃にて遠心加速度１２００×ｇにて１５分間の遠心分離を行った。上清液を除去し、濃縮菌体液２．６５ｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
実施例１：
Ｎ－メチルバリンアミドの加水分解
　２００ｍＬフラスコでラセミ体のＮ－メチルバリンアミド塩酸塩１．０ｇを、水５０ｇに溶解し、さらに２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．０に調整した後に水を加え、基質溶液１００ｇを調製した。各々の基質溶液に、参考例１で取得したＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ　ＡＴＣＣ４９６７８の濃縮菌体液を０．５ｇ添加し、マグネチックスターラで撹拌下３５℃にて１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、Ｎ－メチルバリンアミドの４７．３％が加水分解した。また、加水分解により生成したＮ－メチルバリンはＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した。
参考例２：
その他菌株の培養
　参考例１のＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ　ＡＴＣＣ４９６７８と同様に、スクリーニングによって選抜したＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａ　ＡＴＣＣ４２７９、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａ　ＮＣＩＢ９４３９Ｔの各菌株を、表１に示した組成の培地に接種し、振盪下３０℃で７０時間培養した。得られた培養液を遠心分離し濃縮菌体液を取得した。
　結果は表２に示される通りであった。なお表中、濃縮菌体取得量とは、濃縮菌体液の量（ｇ）を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
実施例２：
Ｎ－メチルバリンアミドの加水分解
　２００ｍＬフラスコでラセミ体のＮ－メチルバリンアミド塩酸塩１．０ｇを、水５０ｇに溶解し、さらに２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．０に調整した後に水を加え、基質溶液１００ｇを調製した。各々の基質溶液に、参考例２で取得した各濃縮菌体液を０．５ｇ添加し、マグネチックスターラで撹拌下３５℃にて１時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、いずれもＮ－メチルバリンアミドの加水分解が進行した。また、いずれも加水分解により生成したＮ－メチルバリンはＬ体であり、９９％ｅｅ以上の光学純度を示した。
　結果は表３に示される通りであった。なお表中、生成率とは、反応に用いた基質Ｎ－メチルバリンアミド塩酸塩に含まれるＬ－Ｎ－メチルバリンアミドについて、加水分解によりＬ－Ｎ－メチルバリンへ転化した割合を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
比較例１：
（１）ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３３４の培養
　表４に示す組成を有する組成を有する培地を滅菌し、アンピシリン５０ｍｇを添加した後にアミノ酸アミド、特にフェニルグリシンアミドの様な難水溶性アミノ酸アミドに対し加水分解活性を有する遺伝子組み換え大腸菌ｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３３４を接種し、３０℃で１６時間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離し濃縮菌体液１．６３ｇを得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）Ｎ－メチルバリンアミドの加水分解
　２００ｍＬフラスコでラセミ体のＮ－メチルバリンアミド塩酸塩１．０ｇを、水５０ｇに溶解し、さらに２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．０に調整した後に水を加え、基質溶液１００ｇを調製した。基質溶液に、前記（１）で取得したｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３３４の濃縮菌体液を０．５ｇ添加し、マグネチックスターラで撹拌下３５℃にて２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、Ｎ－メチルバリンアミドの加水分解は進行しなかった。
比較例２：
（１）その他菌株の培養
　比較例１のｐＭＣＡ１／ＪＭ１０９　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０３３４と同様に、アミノ酸アミド加水分解活性を有する微生物Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ　Ｆｌａｖｕｓ　ＮＣＩＢ１００７１Ｔ、Ｘａｎｔｈｏｂａｃｔｅｒ　ａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ　ＤＳＭ４３１　ＴＫ０５０２、Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ａｌｂｏｆｌａｖｕｓ　ＮＣＩＢ８１６７、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ　ＢＴ－８４　ＦＥＲＭ　Ｐ－８８２３、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｃｅ、およびＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｏｄｉｕｍを、表４に示した組成を有する培地に接種し、振盪下３０℃で４８時間培養した。得られた培養液を遠心分離し濃縮菌体液を取得した（表５）。
　結果は表５に示される通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２）Ｎ－メチルバリンアミドの加水分解
　２００ｍＬフラスコでラセミ体のＮ－メチルバリンアミド塩酸塩１．０ｇを、水５０ｇに溶解し、さらに２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨを８．０に調整した後に水を加え、基質溶液１００ｇを調製した。各々の基質溶液に、前記（１）で取得した各濃縮菌体液を０．５ｇ添加し、マグネチックスターラで撹拌下３５℃にて２４時間反応させた。反応液をＨＰＬＣで測定したところ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓを除くいずれの菌株もＮ－メチルバリンアミドの加水分解は進行しなかった。一方、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓはＮ－メチルバリンアミドの５７．５％が加水分解したが、生成したＮ－メチルバリンの光学純度はＤ体過剰で２３％ｅｅに過ぎなかった。
実施例３：
　実施例１のＮ－メチルバリンアミドの加水分解後の溶液へザルトリウス限外ろ過器ＶＩＶＡＦＬＯＷ２００を用いて限外ろ過を行い、菌体を除去した。得られた限外ろ過液へ２０％水酸化ナトリウムを１．１２ｇ加え、ロータリーエバポレータにて濃縮した。さらに５０℃で濃縮物の真空乾燥を行った。濃縮乾燥物へメタノール６０ｍＬを加え、２５℃にてマグネチックスターラで３０分間撹拌した。撹拌後、スラリーの吸引ろ過により固体をろ別し、つづけて、ろ液をロータリーエバポレータにて濃縮した。得られた濃縮物へアセトン１０ｍＬを加え、２５℃にてマグネチックスターラで３０分間撹拌した。撹拌後、吸引ろ過によりアセトン溶液と固体に分離した。前記固体を回収し、５０℃で真空乾燥を行った。乾燥後、白色粉末として０．４５ｇのＮ－メチル－Ｌ－バリンを取得した。ラセミ体中のＮ－メチル－Ｌ－バリンアミド基準で回収率は９０％であった。また、取得したＮ－メチル－Ｌ－バリンの光学純度は９９％ｅｅであった。
実施例４：
　実施例３のアセトン溶液をロータリーエバポレータにて濃縮した。さらに、濃縮物は５０℃で真空乾燥を行った。乾燥後、白色粉末として０．４５ｇのＮ－メチル－Ｄ－バリンアミドを取得した。
　ラセミ体中のＮ－メチル－Ｄ－バリンアミド基準で回収率は９０％であった。また、取得したＮ－メチル－Ｄ－バリンアミドの光学純度は９９％ｅｅであった。
　医薬品原料として有用な、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドを、経済的に製造し供給することを可能とする。

Claims (4)

  1. 　Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて、一般式（２）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と、対掌体としての一般式（３）の光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを得ることを含む、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸及び／又は光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドの製造方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     　［上記一般式（１）、（２）および（３）中、ＲはＣ１～Ｃ４の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を示す］。
  2. 　Ｍｙｃｏｐｌａｎａ属に属する微生物の菌体若しくはその処理物を、一般式（１）のＮ－メチルアミノ酸アミドに作用させて得られた、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを含む加水分解液から、光学活性アミノ酸を結晶として析出させ、光学活性Ｎ－メチルアミノ酸と光学活性Ｎ－メチルアミノ酸アミドとを分離することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記Ｍｙｃｏｐｌａｎａに属する微生物が、Ｍｙｃｏｐｌａｎａ　ｒａｍｏｓａ又はＭｙｃｏｐｌａｎａ　ｄｉｍｏｒｐｈａである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　一般式（１）、（２）および（３）中のＲがイソプロピル基である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
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