WO2010067613A1 - Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ－アミノ酸の製造方法 - Google Patents

Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ－アミノ酸の製造方法 Download PDF

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succinyl
amino acid
protein
succinylaminoacylase
seq
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PCT/JP2009/006770
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戸田　篤志
幸夫 岩井
西矢　芳昭
伸弥 熊谷
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東洋紡績株式会社
積水メディカル株式会社
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    • C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
    • C12P41/007—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures by reactions involving acyl derivatives of racemic amines

Definitions

  • the present invention relates to a novel L-succinylaminoacylase derived from thermophilic bacteria, and in particular, N-succinyl-L-tertiary leucine, N-succinyl-L-biphenylalanine, N-succinyl-L-cyclohexylglycine, N-succinyl Novel L-succinylaminoacylase capable of efficiently using sterically bulky unnatural amino acids such as succinyl-L-dichlorophenylalanine and N-succinyl-L-bromophenylalanine as substrates, and L-amino acids using this enzyme It relates to the manufacturing method.
  • L-amino acids are useful in many industrial fields such as pharmaceuticals, agricultural chemicals and foods.
  • industrially useful L-amino acids include L-lysine, L-threonine, L-isoleucine and L-proline used as additives for animal feed, health food ingredients and amino acid infusions, liver function promoters L-arginine and L-ornithine used as components of amino acid infusions and synthetic amino acid preparations, L-histidine used as a precursor of liver function promoters and histamine, L- used as a precursor of sweeteners Phenylalanine, L-tertiary leucine, L-biphenylalanine, L-cyclohexylglycine, L-dichlorophenylalanine, L-bromophenylalanine and the like used as intermediates for various pharmaceuticals are known. Therefore, it is required to efficiently obtain these useful L-amino acids in a state separated from D-amino acids.
  • L-aminoacylase As a method for producing L-amino acid, a racemate of N-acylamino acid is synthesized, and only the L-form in the racemate is hydrolyzed using an enzyme called L-aminoacylase to specifically produce only L-amino acid. Conventionally, the method of making it go is used.
  • L-aminoacylase used in this method for example, L-aminoacylase derived from Penicillium funiculosum (Patent Document 1) and L-aminoacylase derived from Streptomyces mobaraensis (Patent Document 2) are known.
  • N-acyl-L-tertiary leucine, N-acyl-L- A sterically bulky unnatural amino acid such as biphenylalanine, N-acyl-L-cyclohexylglycine, N-acyl-L-dichlorophenylalanine, N-acyl-L-bromophenylalanine could not be recognized as a substrate.
  • L-succinylaminoacylase obtained from Geobacillus stearothermophilus NCA1503, a kind of thermophile, as a substrate for N-succinyl-L-tertiary leucine. And the base sequence of the gene encoding this L-succinylaminoacylase was determined, and a patent application was filed (Patent Document 3).
  • L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3 can use N-succinyl-L-tertiary leucine as a substrate, it has substrate specificity that conventional L-aminoacylase does not have, but it has enzyme activity. Still had issues in terms.
  • this L-succinylaminoacylase is N-succinyl-L-cyclohexylglycine and N It has only been confirmed that succinyl-L-4-bromophenylalanine can be used as a substrate.
  • the present invention was devised in view of such problems of the prior art, and the object thereof is L-tertiary leucine, L-biphenylalanine, L-cyclohexylglycine, L-dichlorophenylalanine which are useful as intermediates for pharmaceuticals.
  • An object of the present invention is to provide a novel L-aminoacylase that can efficiently produce sterically bulky unnatural amino acids such as L-bromophenylalanine.
  • L-succinylaminoacylase derived from various organisms, and as a result, collected from IF012983 strain of Geobacillus stearothermophilus. It has been found that L-succinylaminoacylase can efficiently use N-succinyl-L-tertiary leucine as a substrate as compared with L-succinylaminoacylase of Patent Document 3.
  • L-succinylaminoacylase collected from this strain is not only N-succinyl-L-tertiaryleucine, but also N-succinyl-L-biphenylalanine, N-succinyl-L-cyclohexylglycine, N-succinyl- It has been found that other sterically bulky unnatural amino acids such as L-dichlorophenylalanine and N-succinyl-L-bromophenylalanine can also be efficiently used as substrates. Then, the present inventors determined the base sequence of the gene encoding this L-succinylaminoacylase, and completed the present invention.
  • a protein characterized by being represented by any one of (a) to (d): (A) a protein encoded by a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (B) a protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; (C) a protein encoded by a polynucleotide that hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and having L-succinylaminoacylase activity; (D) a protein comprising an amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the protein comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 and having L-succinylaminoacylase activity .
  • a step of preparing a recombinant vector by inserting the gene into a vector, transforming a host cell with the recombinant vector, preparing a transformant, and culturing the transformant A method for producing the protein is provided.
  • the method comprises the step of specifically hydrolyzing N-succinyl-L-amino acid in N-succinyl-DL-amino acid using the above protein. Is provided.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is different from conventionally known L-aminoacylases in that N-succinyl-L-tertiary leucine, N-succinyl-L-biphenylalanine, N-succinyl-L-cyclohexylglycine, N Since sterically bulky unnatural amino acids such as succinyl-L-dichlorophenylalanine and N-succinyl-L-bromophenylalanine can be efficiently used as a substrate, L-tertiary leucine and L- Biphenylalanine, L-cyclohexylglycine, L-dichlorophenylalanine, L-bromophenylalanine and the like can be produced efficiently.
  • the measurement result by HPLC of the yield of L-tertiary leucine in Example 2 is shown.
  • the elapsed time (hr) from the start of the reaction is shown on the horizontal axis, and the conversion rate (%) to L-tertiary leucine is shown on the vertical axis.
  • the measurement result by HPLC of the yield of L-tertiary leucine in Example 5 is shown.
  • the elapsed time (hr) from the start of the reaction is shown on the horizontal axis, and the conversion rate (%) to L-tertiary leucine is shown on the vertical axis.
  • the measurement result by HPLC of the yield of L-tertiary leucine in Example 6 is shown.
  • the elapsed time (hr) from the start of the reaction is shown on the horizontal axis, and the conversion rate (%) to L-tertiary leucine is shown on the vertical axis.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is (a) a protein encoded by a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1, or (b) a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 1 is the base sequence of L-succinylaminoacylase of Geobacillus stearothermophilus IFO12983, which is a kind of thermophile
  • SEQ ID NO: 2 is its amino acid sequence.
  • the proteins (a) and (b) above specifically hydrolyze only the N-succinyl-L-amino acid, which is the L-form of the D-form and L-form of the N-succinyl amino acid, to specifically treat the L-amino acid. It has the feature that can be generated. Although it is considered that N-acetylamino acid and N-succinylamino acid are generally present in the living body, the above proteins (a) and (b) are 100 times as much as N-succinylamino acid than N-acetylamino acid. It has higher activity.
  • proteins (a) and (b) described above are enzymes that catalyze the reaction of specifically hydrolyzing N-succinyl-L-amino acid to produce L-amino acid and succinic acid, that is, L- It can be said to be succinylaminoacylase.
  • the greatest feature of the L-succinylaminoacylase of the present invention is that N-succinyl-L-tertiary leucine, N-succinyl-L-biphenylalanine, N-succinyl-L-amino acid is used as the substrate N-succinyl-L-amino acid.
  • the steric bulky unnatural amino acid such as cyclohexylglycine, N-succinyl-L-dichlorophenylalanine, N-succinyl-L-bromophenylalanine and the like can be used efficiently.
  • N-succinyl-L-tertiary leucine N-succinyl-L-biphenylalanine
  • N-succinyl-L-cyclohexylglycine N-succinyl-L-cyclohexylglycine
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention can use these unnatural amino acids remarkably efficiently as compared with the L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention and the L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3 are enzymes derived from different strains of the same organism, and such enzymes of similar origin have greatly different enzyme activities. It is extremely surprising and not easily predictable by those skilled in the art.
  • the physicochemical properties of the L-succinylaminoacylase of the present invention are as shown in the following (i) to (v).
  • Temperature stability when heat treated for 30 minutes, it is stable at 70 ° C. and deactivated at 75 ° C.
  • Optimal temperature When reacting at pH 7-8, the effect is optimal at a temperature of 55-60 ° C; and
  • Optimal pH When reacting at 60 ° C for 30 minutes, the effect is optimal at pH 7. Is suitable.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention has activity by reacting a divalent or monovalent metal ion at a final concentration of 0.1 mM to 1M.
  • a divalent or monovalent metal ion examples include Mn 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ , K + and the like, and Co 2+ is particularly preferable. It has been found that the use of Co 2+ increases the activity by a factor of 2 or more than when Zn 2+ is used.
  • the present invention also includes (a) a gene consisting of the base sequence set forth in SEQ ID NO: 1 and (b) a gene encoding a protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2. These are genes corresponding to the above proteins (a) and (b).
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is not limited to the above (a) and (b), and (c) hybridizes under stringent conditions with a base sequence complementary to the base sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the gene of the present invention (c) encodes a protein that hybridizes with a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 under stringent conditions and has L-succinylaminoacylase activity.
  • a nucleotide sequence corresponding to the amino acid sequence in which one or several amino acids are substituted, deleted, inserted and / or added in the gene or (d) the protein consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2; -Also includes genes encoding proteins with succinylaminoacylase activity.
  • the gene encoding the protein (c) can be obtained by colony or plaque hybridization using a base sequence complementary to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or a part thereof as a probe.
  • stringent conditions used in the present specification refers to conditions under which a so-called specific hybrid is formed and a non-specific hybrid is not formed. For example, a certain base sequence and 60% or more, preferably 80 % Or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably 98% or more, more preferably 99% or more. Can be a condition to do.
  • Stringent conditions can be created by adjusting the salt concentration, temperature, etc. of the hybridization solution. For example, pretreatment overnight at 42 ° C. in a hybridization solution containing 25% formamide, 50% formamide under more severe conditions, 4 ⁇ SSC, 50 mM HEPES pH 7, 10 ⁇ Denhardt's solution, 20 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA. After hybridization, a labeled probe is added and hybridization is performed by incubating at 42 ° C. overnight.
  • the cleaning solution and temperature conditions in the subsequent cleaning are about “1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 37 ° C.”, and more severe conditions are about “0.5 ⁇ SSC, 0.1% SDS, 42 ° C.” As stricter conditions, it can be carried out at about “0.2% ⁇ SSC, 0.1% SDS, 65 ° C.”.
  • Combinations of SSC, SDS, and temperature conditions are exemplary, and those skilled in the art can use the above or other factors that determine the stringency of hybridization (for example, probe concentration, probe length, hybridization reaction time, etc.) as appropriate. By combining them, the same stringency as described above can be realized.
  • the gene obtained by hybridization is a gene encoding a protein having L-succinylaminoacylase activity is determined by, for example, introducing the obtained gene into Escherichia coli and preparing a transformant. Can be cultured to produce an enzyme protein, which can be confirmed by purifying the enzyme protein, adding it to N-succinyl-DL amino acid, and measuring the production of L-amino acid by chromatography or the like.
  • a gene consisting of a sequence and encoding a protein having L-succinylaminoacylase activity is described in SEQ ID NO: 1 using a commercially available kit such as KOD-Plus-Mutageness Kit (manufactured by Toyobo) or the PCR method. It can be obtained by modifying the base sequence. Whether or not the obtained gene is a gene encoding a protein having L-succinylaminoacylase activity can be confirmed by the same method as in the case of the gene obtained by hybridization.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is produced by inserting a gene into an appropriate vector to prepare a recombinant vector, and transforming an appropriate host cell with the recombinant vector to prepare a transformant. This can be done easily by culturing the transformant.
  • the vector is not particularly limited as long as it can be replicated and autonomously propagated in various prokaryotic and / or eukaryotic host cells, and includes plasmid vectors, phage vectors, virus vectors and the like.
  • Recombinant vectors can be prepared according to conventional methods.
  • the L-succinylaminoacylase gene of the present invention is added to these vectors with appropriate restriction enzymes and ligases, or, if necessary, linkers or adapter DNAs. It can carry out easily by using and connecting.
  • gene fragments amplified using a DNA polymerase that adds a single base to the amplification end, such as Taq polymerase can be connected to a vector by TA cloning.
  • a conventionally known cell can be used and is not particularly limited as long as a recombinant expression system is established.
  • microorganisms such as Escherichia coli, Bacillus subtilis, Actinomyces, Neisseria gonorrhoeae and yeast are used. Insect cells, animal cells, higher plants, etc., more preferably microorganisms, and particularly preferably Escherichia coli (for example, K12 strain, B strain, etc.).
  • the transformant may be prepared according to a conventional method.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is expressed from the incorporated gene and accumulates in the transformant. .
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention accumulated in the transformant can be used as it is, but it may be used after purification.
  • this purification method a conventionally known one can be used.
  • the transformed transformant after culturing or its culture is homogenized in an appropriate buffer, and the cells are extracted by sonication or surfactant treatment.
  • a liquid can be obtained, and separation techniques conventionally used for protein separation and purification can be appropriately combined therewith.
  • separation techniques include salting-out, solvent precipitation methods and other methods utilizing differences in solubility, dialysis, ultrafiltration, gel filtration, non-denaturing polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE), sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide.
  • Method using molecular weight difference such as gel electrophoresis (SDS-PAGE), method using charge such as ion exchange chromatography, hydroxyapatite chromatography, method using specific affinity such as affinity chromatography, reverse Examples include, but are not limited to, a method utilizing a difference in hydrophobicity such as phase high performance liquid chromatography and a method utilizing a difference in isoelectric point such as isoelectric focusing.
  • the L-amino acid according to the present invention specifically hydrolyzes N-succinyl-L-amino acid (L-form) in N-succinyl-DL-amino acid (racemic form) using the L-succinylaminoacylase of the present invention. Manufactured by process.
  • a reaction solution is prepared by dissolving the L-succinylaminoacylase of the present invention and the starting N-succinyl-DL-amino acid in a suitable solution. It can be performed by reacting with.
  • distilled water is sufficient, but if necessary, a buffer such as phosphate or Tris may be used.
  • a buffering agent the concentration is preferably 20 to 200 mM, and the pH is preferably 6.5 to 8.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is preferably used at a concentration of 5 to 500 mg / L (100 to 10000 U / L) in the reaction solution.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention has activity by adding a divalent or monovalent metal ion at a final concentration of 0.1 mM to 1 M (preferably 0.1 to 1 mM) as described above. Therefore, it is necessary to add a divalent or monovalent metal ion to the reaction solution.
  • the divalent or monovalent metal ion to be added include Mn 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Ca 2+ , Ni 2+ and K +, and Co 2+ is particularly preferable.
  • the N-succinyl-DL-amino acid to be reacted with the L-succinylaminoacylase of the present invention can be synthesized by various known methods, for example, Sakai A. et al. et al. , Biochemistry, 2006, 45 (14), 4455-62.
  • the type of DL amino acid as a raw material may be appropriately selected according to the type of L-amino acid to be produced. Twenty naturally occurring amino acids and derivatives thereof, tertiary leucine, cyclohexylglycine, bromophenylalanine, biphenylalanine, It can be an unnatural amino acid such as dichlorophenylalanine and its derivatives.
  • the concentration of N-succinyl-DL-amino acid in the reaction solution is not particularly limited, but is generally 1% by weight to 30% by weight.
  • the temperature at which the reaction solution is reacted is not particularly limited as long as the L-succinylaminoacylase of the present invention acts sufficiently, but generally 20 to 70 ° C. is preferable. 30 to 60 ° C. is more preferable, and 55 to 60 ° C. is more preferable.
  • the pH during the reaction is not particularly limited as long as the L-succinylaminoacylase of the present invention acts sufficiently, but generally pH 4 to 10 is preferable, and pH 6 to 9 is more preferable.
  • the reaction time is not particularly limited, but is generally about 1 to 7 days. The reaction time can be appropriately selected experimentally in consideration of the type of L-amino acid to be produced and the desired yield, yield, amount of enzyme or substrate used, quantity ratio, reaction temperature, reaction pH and the like.
  • the method for producing an L-amino acid of the present invention further comprises a step of racemizing N-succinyl-D-amino acid with N-succinyl racemase to produce N-succinyl-L-amino acid.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention specifically hydrolyzes only the L-succinyl-L-amino acid in the N-succinyl-DL-amino acid (racemate). Succinyl-D-amino acid is wasted.
  • N-succinyl-D-amino acid is racemized using N-succinyl racemase to produce N-succinyl-L-amino acid, all of the remaining N-succinyl-D-amino acid will eventually become L- Can be converted to an amino acid.
  • N-succinyl racemase is an enzyme that catalyzes both the reaction of converting the L-form of N-succinyl amino acid into the D-form and the reaction of converting the D-form into the L-form, and the ratios are almost equal (racematization).
  • the N-succinyl racemase used in the production method of the present invention is not particularly limited as long as the N-succinyl amino acid can be racemized, and the N-acyl amino acid racemase described in JP-A-2007-82534 and JP-A-2008 Conventionally known ones such as N-acylamino acid racemase described in Japanese Patent No. -61642 can be used.
  • the reaction of racemizing N-succinyl-D-amino acid using N-succinyl racemase is, for example, mixing in a reaction solution containing N-succinyl-D-amino acid, N-succinyl racemase and a buffer under the following conditions: To do.
  • the reaction temperature is not particularly limited as long as the N-succinyl racemase to be used acts sufficiently, but it is generally preferably 25 to 70 ° C, more preferably 37 to 70 ° C.
  • the pH during the reaction is not particularly limited as long as the N-succinyl racemase to be used is sufficiently effective, but generally pH 5 to 9 is preferable, and pH 6.5 to 8 is more preferable.
  • N-succinyl racemase is preferably used at a concentration of 5 to 500 mg / L (500 to 50000 U / L) in the reaction solution.
  • N-succinyl racemase is active by adding a divalent metal ion at a final concentration of 0.1 mM to 1 M (preferably 0.1 to 1 mM).
  • the divalent metal ion to be added include Mn 2+ , Co 2+ , Mg 2+ , Fe 2+ and Ni 2+, and Co 2+ is particularly preferable.
  • Co 2+ has a relative activity when it is reacted at a final concentration of 0.1 mM to 1 M, and has a relative activity that is more than double that when reacted at a final concentration of 0.1 mM to 1 M of Mn 2+ .
  • the buffer used for the reaction of N-succinyl racemase the same buffer used for the reaction of L-succinylaminoacylase can be used.
  • the N-acyl amino acid racemase described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-82534 has been found to be an N-succinyl racemase using N-succinyl amino acid as a more suitable substrate through subsequent studies. Therefore, the N-acyl amino acid racemase described in JP-A-2007-82534 can be used in combination with the L-succinylaminoacylase of the present invention.
  • the racemization reaction using N-succinyl racemase and the hydrolysis reaction using L-succinylaminoacylase can be performed separately, but are preferably performed simultaneously. When performed simultaneously, when viewed microscopically, first, only the L form of N-succinyl-DL-amino acid is deacylated (hydrolyzed) by the L-succinylaminoacylase of the present invention, and the target L-amino acid is obtained. Generate. Since the racemic state is eliminated when the L form of the substrate is consumed, N-succinyl racemase further promotes the reaction of converting the D form to the L form.
  • the N-succinyl-L-amino acid produced by N-succinyl racemase is sequentially decomposed into L-amino acids by the L-succinylaminoacylase of the present invention. This repetition can theoretically convert almost all N-succinyl-DL-amino acids to L-amino acids.
  • the reaction conditions when the racemization reaction and the hydrolysis reaction are performed simultaneously are not particularly limited as long as the N-succinyl racemase and the L-succinylaminoacylase of the present invention exhibit the activity, but the substrate concentration is 1 weight. It is preferable to carry out at 30% to 30% by weight, pH 6 to 8, and temperature 30 to 60 ° C.
  • the time required for the racemization reaction and hydrolysis reaction is not particularly limited as long as it is a time until the N-succinyl-DL-amino acid used as a raw material can be converted into a desired amount of L-amino acid, and depends on the amount charged. Generally, it is about 1 to 7 days.
  • N-succinyl-DL-amino acid (1) Synthesis of N-succinyl-DL-amino acid (1) Synthesis of N-succinyl-DL-tertiary leucine Equimolar mixture of D-tertiary leucine (manufactured by Tokyo Chemical Industry) and L-tertiary leucine (manufactured by Tokyo Chemical Industry) 10 g was dissolved in 50 ml of water and 15 g of 20% sodium hydroxide solution (manufactured by Nacalai Tesque), 8 g of succinic anhydride and 15 g of 20% sodium hydroxide solution (manufactured by Nacalai Tesque) were added, and the mixture was stirred at 20 to 40 ° C. Reacted.
  • reaction mixture was neutralized with hydrochloric acid, extracted with ethyl acetate, and concentrated. Crystallization was performed after drying with hexane to obtain 14 g of white powder of N-succinyl-DL-tertiary leucine.
  • reaction solution was neutralized with hydrochloric acid (Nacalai Tesque), extracted with ethyl acetate (Nacalai Tesque), and concentrated. Crystallization was performed by drying with hexane to obtain 15 g of white powder of N-succinyl-DL-valine.
  • N-succinyl racemase (1) Preparation of N-succinyl racemase described in JP-A-2008-61642 Chromosomal DNA of Geobacillus stearothermophilus NCA1503 was isolated by the following method. The strain was inoculated with 1 platinum ear in LB liquid medium (5 ml preparation / 30 ml test tube; 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl, pH 7.4) at 50 ° C. Cultured overnight with shaking. The bacterial cells were collected from 1 ml of the bacterial cells by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.).
  • Chromosomal DNA was extracted from the collected cells using the MagExtractor-genome-kit (manufactured by Toyobo) according to the procedure described in the instruction manual. About 20 ⁇ g of chromosomal DNA was obtained from 1 ml of cells. Next, the N-succinyl racemase gene (SEQ ID NO: 3) derived from Geobacillus stearothermophilus NCA1503 strain was amplified by PCR using the obtained chromosomal DNA as a template.
  • SEQ ID NO: 3 N-succinyl racemase gene derived from Geobacillus stearothermophilus NCA1503 strain was amplified by PCR using the obtained chromosomal DNA as a template.
  • PCR primers were 5 ′ primer (5′-AAG GAG GTA AAA TGG CGA TCA ACA TCG AGT AC-3 ′ (SEQ ID NO: 4)) and 3 ′ primer (5′-TCT AGA TTA TGC CGT CGC CGT ACG ATG AAA -3 ′ (SEQ ID NO: 5)) was used.
  • PCR primers and KOD Plus DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.)
  • PCR 94 ° C. for 15 seconds, 55 ° C. for 30 seconds, 68 ° C. for 90 seconds for 30 cycles) was performed using the chromosomal DNA as a template. .
  • a cloning kit Target Clone-Plus (manufactured by Toyobo) was used in accordance with the protocol, and the resulting gene was cloned into the vector pBluescript to obtain a recombinant expression plasmid pBSNAR1.
  • Escherichia coli JM109 strain competent cell (manufactured by Toyobo) was transformed to obtain a transformant.
  • This obtained transformant was named Escherichia coli JM109 (pBSNAR1).
  • TB medium 500 ml
  • This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pBSNAR1) previously cultured in an LB medium containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) at 30 ° C. for 16 hours, followed by aeration and agitation culture at 37 ° C. for 24 hours.
  • pBSNAR1 Escherichia coli JM109
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), crushed with a French press, further centrifuged, and the supernatant liquid obtained as a crude enzyme solution. Got as.
  • the obtained crude enzyme solution was subjected to denucleic acid removal with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, and after heat treatment at 50 ° C. for 1 hour, dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). Further, a purified enzyme preparation was obtained by separating and purifying by DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience) and octyl Sepharose (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • N-succinyl racemase described in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2007-82534 N-succinyl racemase (hereinafter referred to as NAAAR) gene (SEQ ID NO: 6) derived from Chloroflexus aurantiacus is upstream and downstream of this sequence.
  • NAAAR N-succinyl racemase
  • SEQ ID NO: 6 N-succinyl racemase derived from Chloroflexus aurantiacus is upstream and downstream of this sequence.
  • NdeI and BamHI sites were added to the cells, respectively, and artificially synthesized by the method described in the cell engineering separate volume “Plant PCR Experiment Protocol” (p84-89, published by Shujunsha).
  • the vector pBluescriptII KSN + was cloned to obtain a recombinant expression plasmid pCFNAR.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain competent cell manufactured by Toyobo
  • the obtained transformant was named Escherichia coli DH5 ⁇ (pCFNAR).
  • TB medium 500 ml
  • This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli DH5 ⁇ (pCFNAR) previously cultured in an LB medium containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) at 30 ° C. for 16 hours, and aerated and stirred at 37 ° C. for 24 hours. After completion of the culture, the cells are collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), crushed with a French press, further centrifuged, and the supernatant liquid obtained as a crude enzyme solution. Got as.
  • the obtained crude enzyme solution was subjected to nucleic acid removal with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, and dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7.5). Further, the purified enzyme preparation was obtained by separation and purification by column chromatography of DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience).
  • Example 1 Preparation of L-succinylaminoacylase of the present invention
  • Chromosomal DNA of Geobacillus stearothermophilus IFO12983 was isolated by the following method. The strain was inoculated with 1 platinum ear in LB liquid medium (5 ml preparation / 30 ml test tube; 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, 1.0% NaCl, pH 7.4) at 50 ° C. Cultured overnight with shaking. The bacterial cells were collected from 1 ml of the bacterial cells by centrifugation (12000 rpm, 10 minutes, 4 ° C.).
  • Chromosomal DNA was extracted from the collected cells using the MagExtractor-genome-kit (manufactured by Toyobo) according to the procedure described in the instruction manual. About 20 ⁇ g of chromosomal DNA was obtained from 1 ml of cells. Next, the L-succinylaminoacylase gene (SEQ ID NO: 1) derived from Geobacillus stearothermophilus IFO12983 was amplified by PCR using the obtained chromosomal DNA as a template.
  • SEQ ID NO: 1 L-succinylaminoacylase gene derived from Geobacillus stearothermophilus IFO12983
  • PCR primers were 5 ′ primer (5′-AAG GAG GTA AAA TGA AAG AAA TTA TTC AGC AGA TGA AAG C-3 ′ (SEQ ID NO: 7)) and 3 ′ primer (5′-TCT AGA TCA ATG ATT TGC AGC GAT AGA GAC ACG-3 ′ (SEQ ID NO: 8)) was used.
  • PCR primers and KOD Plus DNA polymerase (Toyobo Co., Ltd.)
  • PCR was performed using the above chromosomal DNA as a template (94 ° C for 15 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 68 ° C for 90 seconds for 30 cycles). It was.
  • the resulting vector was cloned into the vector pBluescript to obtain a recombinant expression plasmid pLSA2.
  • Escherichia coli JM109 strain competent cell manufactured by Toyobo
  • the obtained transformant was named Escherichia coli JM109 (pLSA2).
  • TB medium 500 ml was dispensed into two 2 L Sakaguchi flasks, autoclaved at 121 ° C.
  • This medium was inoculated with 5 ml of a culture solution of Escherichia coli JM109 (pLSA2) previously cultured in an LB medium containing ampicillin (100 ⁇ g / ml) at 30 ° C. for 16 hours, and cultured with aeration at 37 ° C. for 24 hours.
  • pLSA2 Escherichia coli JM109
  • the cells are collected by centrifugation, suspended in 50 mM phosphate buffer (pH 7.5), crushed with a French press, further centrifuged, and the supernatant liquid obtained as a crude enzyme solution. Got as.
  • the resulting crude enzyme solution was subjected to nucleic acid removal with polyethyleneimine and ammonium sulfate fractionation, and after heat treatment at 50 ° C. for 1 hour, dialyzed against 50 mM phosphate buffer (pH 7.5).
  • the purified enzyme preparation was obtained by separating and purifying by DEAE Sepharose CL-6B (manufactured by GE Healthcare Bioscience) and octyl Sepharose (manufactured by GE Healthcare Bioscience). The obtained specimen was confirmed to be single by SDS-PAGE.
  • Example 2 Synthesis of L-tertiary leucine from N-succinyl-DL-tertiary leucine using L-succinylaminoacylase of the present invention N-succinyl-DL-tertiary leucine synthesized in (1) above was prepared. It was dissolved in distilled water, pH was adjusted with 0.1N sodium hydroxide (manufactured by Nacalai Tesque), and 5 wt% N-succinyl-DL-tertiary leucine solution (pH 7-8) was prepared.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is equivalent to 50% which is the maximum theoretical yield of N-succinyl-DL-tertiary leucine from L-tertiary leucine in a short period of time. It was possible to synthesize with a yield (hereinafter sometimes referred to as “conversion rate”).
  • N-succinyl-DL-valine, N-succinyl-DL-phenylalanine, N-succinyl-DL-tryptophan, N-succinyl-DL-asparagine, N-succinyl- using the L-succinylaminoacylase of the present invention Synthesis of each corresponding L-amino acid from DL-serine, N-succinyl-DL-tyrosine, N-succinyl-DL-cyclohexylglycine N-succinyl-DL-tertiary leucine in place of (2) and (3 N-succinyl-DL-valine, N-succinyl-DL-phenylalanine, N-succinyl-DL-tryptophan, N-succinyl-DL-asparagine, N-succinyl-DL-serine, N-succinyl-DL- Tyrosine, N-s
  • N-succinyl-DL-amino acid concentration of each N-succinyl-DL-amino acid was 10% by weight.
  • a sample was collected and subjected to HPLC measurement under the same conditions as in Example 2.
  • the conversion rate to each L-amino acid corresponding to DL-asparagine, N-succinyl-DL-serine, N-succinyl-DL-tyrosine, N-succinyl-DL-cyclohexylglycine was calculated.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention includes N-succinyl-DL-valine, N-succinyl-DL-phenylalanine, N-succinyl-DL-tryptophan, N-succinyl-DL-asparagine, N
  • the corresponding L-amino acids could be synthesized efficiently from succinyl-DL-serine, N-succinyl-DL-tyrosine and N-succinyl-DL-cyclohexylglycine in a short period of time.
  • the unnatural amino acid L-cyclohexylglycine could be synthesized in a short period of time with a yield approximately equal to the theoretical maximum yield of 50%.
  • Example 4 Synthesis of L-tertiary leucine from N-succinyl-DL-tertiary leucine using L-succinylaminoacylase and N-succinyl racemase of the present invention
  • concentration of the N-succinyl-DL-tertiary leucine solution was adjusted to 1% by weight, and 0.1 ml of 9.6 mg / ml N-succinyl racemase prepared in (1) above was added to the reaction solution. Except for this, the reaction was carried out for 90 hours under the same conditions as in Example 2. After completion of the reaction, a sample was collected and subjected to HPLC measurement under the same conditions as in Example 2 to calculate the yield of L-tertiary leucine. The yield was 90% or more, which was the theoretical maximum yield. A value close to 100% was obtained.
  • Example 5 Synthesis of L-tertiary leucine from N-succinyl-DL-tertiary leucine using L-succinylaminoacylase and N-succinyl racemase of the present invention (ii) The reaction was performed for 120 hours in the same manner as in Example 4 except that the N-succinyl racemase prepared in the above (2) was used, and 24 hours, 48 hours, and 120 hours after the start of the reaction. A sample was later collected and subjected to HPLC measurement under the same conditions as in Example 2 to confirm the synthesis of L-tertiary leucine from N-succinyl-DL-tertiary leucine.
  • Example 6 Comparative test of enzyme activity of L-succinylaminoacylase of the present invention and L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3
  • N-succinyl-DL-tertiary leucine synthesized in (1) above is dissolved in distilled water, pH is adjusted with 0.1 N sodium hydroxide (manufactured by Nacalai Tesque), and 5 wt% N-succinyl- A DL-tertiary leucine solution (pH 7-8) was prepared.
  • 0.5 mM (final concentration) CoCl 2 and 0.1 ml of the N-succinyl racemase prepared in (2) above were added.
  • FIG. 3 The results of HPLC measurement are shown in FIG.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is changed from N-succinyl-DL-tertiary leucine to L-tertiary leucine.
  • the conversion rate was remarkably high and the reactivity was significantly improved. From this result, it is clear that the L-succinylaminoacylase of the present invention can efficiently use N-succinyl-L-tertiary leucine as a substrate.
  • Example 7 Comparative test of enzyme activity of L-succinylaminoacylase of the present invention and L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3 (ii) N-succinyl-DL-4-bromophenylalanine, N-succinyl-DL-biphenylalanine, N-succinyl-DL-3,4-dichlorophenylalanine, N-succinyl-DL-cyclohexylglycine synthesized in (3) above, N-succinyl-DL-tertiary leucine was used to prepare 10% by weight amino acid solutions (pH 7.5).
  • Example 2 0.1 mg HEPES-NaOH (pH 7.5) buffer solution 0.25 ml, 0.1 M cobalt acetate solution 0.025 ml, each amino acid solution 0.5 ml, distilled water 4.2 ml prepared in a solution of 5 mg / ml 0.025 ml of the L-succinylaminoacylase described in Example 1 of Patent Document 3 or the solution of L-succinylaminoacylase of the present invention obtained in Example 1 above prepared to 5 mg / ml was added. The obtained reaction solution was reacted at 50 ° C. for 4 hours while stirring. After completion of the reaction, a sample was collected and subjected to HPLC measurement under the same conditions as in Example 2.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention includes N-succinyl-DL-4-bromophenylalanine, N-succinyl-DL-biphenylalanine, N-succinyl-DL-3,4-dichlorophenylalanine, Each corresponding L-amino acid can be synthesized at a high conversion rate from either N-succinyl-DL-cyclohexylglycine or N-succinyl-DL-tertiary leucine.
  • L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3 includes N-succinyl-DL-4-bromophenylalanine and N-succinyl-DL-3,4-dichlorophenylalanine corresponding to each L-amino acid. Can be synthesized at a high conversion rate, but N-succinyl-DL-biphenylalanine, N-succinyl-DL-cyclohexylglycine, and N-succinyl-DL-tertiary leucine have a considerably low conversion rate. From these results, it is clear that the L-succinylaminoacylase of the present invention can also efficiently use unnatural amino acids that cannot be efficiently used as a substrate by the L-succinylaminoacylase described in Patent Document 3.
  • the L-succinylaminoacylase of the present invention is efficient for sterically bulky unnatural amino acids such as L-tertiary leucine, L-biphenylalanine, L-cyclohexylglycine, L-dichlorophenylalanine, L-bromophenylalanine and natural amino acids. Since it can be produced well, it can be widely used to produce L-amino acids useful as intermediates and raw materials for pharmaceuticals, agricultural chemicals, foods and the like.
  • SEQ ID Nos: 4, 5, 7, and 8 are primer sequences used in the examples.
  • SEQ ID NO: 6 is the sequence of DNA encoding NAAAR designed to be efficiently expressed in E. coli strain K-12.

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Abstract

　本発明によれば、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質からなるＬ－サクシニルアシラーゼが提供される。この酵素は、医薬品の中間体として有用なＬ－ターシャリーロイシンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を効率的に製造することができる。

Description

Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたＬ－アミノ酸の製造方法
　本発明は、好熱菌由来の新規なＬ－サクシニルアミノアシラーゼに関し、特に、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンやＮ－サクシニル－Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として効率的に利用できる新規なＬ－サクシニルアミノアシラーゼ、およびこの酵素を用いたＬ－アミノ酸の製造方法に関する。
　医薬品、農薬および食品などの多くの産業分野でＬ－アミノ酸は有用である。例えば産業上有用なＬ－アミノ酸としては、動物飼料用の添加物、健康食品の成分およびアミノ酸輸液等として使用されるＬ－リジン、Ｌ－スレオニン、Ｌ－イソロイシンおよびＬ－プロリン、肝機能促進薬、アミノ酸輸液および総合アミノ酸製剤等の成分として使用されるＬ－アルギニンおよびＬ－オルニチン、肝機能促進薬およびヒスタミンの前駆体として使用されるＬ－ヒスチジン、甘味料の前駆体として使用されるＬ－フェニルアラニン、様々な医薬品の中間体として使用されるＬ－ターシャリーロイシン、Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどが知られている。従って、これらの有用なＬ－アミノ酸をＤ－アミノ酸から分離された状態で効率的に得ることが求められている。
　Ｌ－アミノ酸の製造方法としては、Ｎ－アシルアミノ酸のラセミ体を合成し、Ｌ－アミノアシラーゼという酵素を用いてラセミ体中のＬ体のみを加水分解し、Ｌ－アミノ酸のみを特異的に生成させる方法が従来から使用されている。この方法で使用するＬ－アミノアシラーゼとしては、例えば、ペニシリウム・フニコロサム由来のＬ－アミノアシラーゼ（特許文献１）やストレプトミセス・モバラエンシス由来のＬ－アミノアシラーゼ（特許文献２）が知られている。
　しかし、特許文献１，２に記載のＬ－アミノアシラーゼは、加水分解能に優れるものの、基質特異性は未だ満足のいくものではなく、Ｎ－アシル－Ｌ－ターシャリーロイシン、Ｎ－アシル－Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｎ－アシル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－アシル－Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－アシル－Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として認識することができなかった。従って、特許文献１，２に記載のＬ－アミノアシラーゼを用いた方法では、Ｎ－アシル－ＤＬ－ターシャリーロイシンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を光学分割することができず、医薬品の中間体として有用なＬ－ターシャリーロイシンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を製造することができなかった。
　本発明者らは、最近、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＣＡ１５０３株から採取されたＬ－サクシニルアミノアシラーゼが、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンを基質として認識することができることを見出し、このＬ－サクシニルアミノアシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定し、特許出願を行った（特許文献３）。特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンを基質とすることができるという、従来のＬ－アミノアシラーゼが有しない基質特異性を有するものの、酵素活性の点でなお課題を有していた。また、特許文献３では、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシン以外の立体的にかさ高い非天然アミノ酸に対する基質特異性については、このＬ－サクシニルアミノアシラーゼがＮ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン及びＮ－サクシニル－Ｌ－４－ブロモフェニルアラニンを基質とすることができることが確認されているにすぎない。
特開平５－３２８９７２号公報 特開２００６－６７８７０号公報 ＷＯ２００９／１３６５００号公報
　本発明は、かかる従来技術の問題点に鑑み創案されたものであり、その目的は、医薬品の中間体として有用なＬ－ターシャリーロイシンやＬ－ビフェニルアラニン、Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を効率良く製造することができる新規なＬ－アミノアシラーゼを提供することにある。
　本発明者らは、上記目的を達成するために、様々な生物由来のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性について検討した結果、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＩＦ０１２９８３株から採取されたＬ－サクシニルアミノアシラーゼが、特許文献３のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと比較してＮ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンを基質として効率良く利用できることを見出した。また、この株から採取されたＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリロイシンのみならず、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの他の立体的にかさ高い非天然アミノ酸も基質として効率良く利用できることを見出した。そして、本発明者らは、このＬ－サクシニルアミノアシラーゼをコードする遺伝子の塩基配列を決定し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明によれば、（ａ）～（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
　また、本発明によれば、（ａ）～（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子が提供される：
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
　さらに、本発明によれば、上記遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする上記タンパク質の製造方法が提供される。
　さらに、本発明によれば、上記タンパク質を用いてＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸中のＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ－アミノ酸の製造方法が提供される。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、従来公知のＬ－アミノアシラーゼとは異なり、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンやＮ－サクシニル－Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を基質として効率良く利用できるので、医薬品の中間体として有用なＬ－ターシャリーロイシンやＬ－ビフェニルアラニン、Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどを効率良く製造することができる。
実施例２におけるＬ－ターシャリーロイシンの収率のＨＰＬＣによる測定結果を示す。反応開始からの経過時間（ｈｒ）を横軸に、Ｌ－ターシャリーロイシンへの変換率（％）を縦軸に示す。 実施例５におけるＬ－ターシャリーロイシンの収率のＨＰＬＣによる測定結果を示す。反応開始からの経過時間（ｈｒ）を横軸に、Ｌ－ターシャリーロイシンへの変換率（％）を縦軸に示す。 実施例６におけるＬ－ターシャリーロイシンの収率のＨＰＬＣによる測定結果を示す。反応開始からの経過時間（ｈｒ）を横軸に、Ｌ－ターシャリーロイシンへの変換率（％）を縦軸に示す。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質、または（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号１は、好熱菌の一種であるゲオバチルス・ステアロサーモフィラス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＩＦＯ１２９８３株のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの塩基配列であり、配列番号２は、そのアミノ酸配列である。
　上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ－サクシニルアミノ酸のＤ体とＬ体のうちＬ体であるＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸のみを特異的に加水分解してＬ－アミノ酸を特異的に生成させることができるという特徴を有する。生体内に、Ｎ－アセチルアミノ酸とＮ－サクシニルアミノ酸は一般的に存在すると考えられるが、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ－アセチルアミノ酸よりもＮ－サクシニルアミノ酸に対して１００倍以上高い活性を有する。これらのことから、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質は、Ｎ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解してＬ－アミノ酸とコハク酸を生成する反応を触媒する酵素、つまりＬ－サクシニルアミノアシラーゼであると言える。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの最大の特徴は、基質のＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸として、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンやＮ－サクシニル－Ｌ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸を効率良く利用することができることにある。特に、これらの立体的にかさ高い非天然アミノ酸のうち、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシン、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ビフェニルアラニン、及びＮ－サクシニル－Ｌ－シクロヘキシルグリシンについては、後述の実施例７で示すように、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと比較して、これらの非天然アミノ酸を顕著に効率良く利用することができる。本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、同じ生物の異なる株由来の酵素であり、このような由来の近い酵素同士が大きく異なる酵素活性を有することは極めて驚くべきことであり、当業者が容易に予測できないことである。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの理化学的性質は、以下の（ｉ）～（ｖ）に示す通りである。
（ｉ）分子量：４３ｋＤａ（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）；
（ｉｉ）基質特異性：Ｎ－サクシニルターシャリーロイシン、Ｎ－サクシニルビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニルシクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニルジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニルブロモフェニルアラニンに作用する；
（ｉｉｉ）温度安定性：３０分間熱処理した場合、７０℃では安定であり７５℃以上では失活する；
（ｉｖ）至適温度：ｐＨ７～８で反応させる場合、温度５５～６０℃において作用が至適である；および
（ｖ）至適ｐＨ：６０℃で３０分間反応させる場合、ｐＨ７において作用が至適である。
　また、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ～１Ｍの終濃度で反応させることで活性を有する。ここで使用する２価または１価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋，Ｋ＋などが挙げられ、なかでもＣｏ２＋が特に好ましい。Ｃｏ２＋を使用すると、Ｚｎ２＋を使用したときより活性が２倍以上増加することが判明している。
　本発明は、（ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子、および（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子も包含する。これらは、上記（ａ）および（ｂ）のタンパク質に対応する遺伝子である。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、上記（ａ）および（ｂ）のものに限定されず、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質も含む。また、本発明の遺伝子は、（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子、または（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子も含む。これは、タンパク質をコードする遺伝子の塩基配列の一部に変異が生じたり、またその結果としてタンパク質のアミノ酸配列の一部に変異が生じても、機能的には同等のタンパク質であることが多いからである。また、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を、由来生物以外の宿主生物（大腸菌など）に組込んで本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼを発現させる場合、発現効率向上のため、宿主生物のコドンユーセージに合わせて塩基配列を変更することもあるからである。
　上記（ｃ）のタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列またはその一部をプローブとしてコロニー又はプラークハイブリダイゼーションを行うことにより得ることができる。なお、本明細書において用いる用語「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいい、例えば、ある塩基配列と６０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡのみが特異的にハイブリダイズする条件であることができる。
　ストリンジェントな条件はハイブリダイゼーション溶液の塩濃度、温度等を調節することにより作り出すことができる。一例を示せば、２５％ホルムアミド、より厳しい条件では５０％ホルムアミド、４×ＳＳＣ、５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７、１０×デンハルト溶液、２０μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含むハイブリダイゼーション溶液中、４２℃で一晩プレハイブリダイゼーションを行なった後、標識したプローブを添加し、４２℃で一晩保温することによりハイブリダイゼーションを行なう。その後の洗浄における洗浄液および温度条件は「１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、３７℃」程度で、より厳しい条件としては「０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、４２℃」程度で、さらに厳しい条件としては「０．２％×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃」程度で実施することができる。ＳＳＣ、ＳＤＳおよび温度条件の組み合わせは例示であり、当業者であれば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する上記もしくは他の要素（例えばプローブ濃度、プローブの長さ、ハイブリダイゼーション反応時間等）を適宜組み合わせることにより、上記と同様のストリンジェンシーを実現することが可能である。
　ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子がＬ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、例えば、得られた遺伝子を大腸菌に導入して形質転換体を作成し、この形質転換体を培養して酵素タンパク質を生成させ、この酵素タンパク質を精製してＮ－サクシニル－ＤＬアミノ酸に添加してＬ－アミノ酸の生成をクロマトグラフィーなどで測定することによって確認することができる。
　また、上記（ｄ）のタンパク質の遺伝子である、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子は、例えばＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（東洋紡製）などの市販のキットやＰＣＲ法を利用して配列番号１に記載の塩基配列を改変することによって得ることができる。得られた遺伝子がＬ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子であるかどうかは、ハイブリダイゼーションによって得られた遺伝子の場合と同様の方法で確認することができる。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの製造は、その遺伝子を適当なベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで適当な宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養することによって容易に行うことができる。
　ベクターとしては、原核および／または真核細胞の各種宿主細胞内で複製保持または自律増殖できるものであれば特に限定されず、プラスミドベクターおよびファージベクター、ウィルスベクター等が包含される。組換えベクターの調製は、常法に従って行えばよく、例えば、これらのベクターに、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの遺伝子を適当な制限酵素およびリガーゼ、あるいは必要に応じてさらにリンカーもしくはアダプターＤＮＡを用いて連結することにより容易に行うことができる。また、Ｔａｑポリメラーゼのように増幅末端に一塩基を付加するようなＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅作製した遺伝子断片であれば、ＴＡクローニングによるベクターへの接続も可能である。
　また、宿主細胞としては、従来公知のものが使用可能であり、組換え発現系が確立しているものであれば特に制限されないが、好ましくは大腸菌、枯草菌、放線菌、麹菌、酵母といった微生物ならびに昆虫細胞、動物細胞、高等植物などが挙げられ、より好ましくは微生物が挙げられ、特に好ましくは大腸菌（例えば、Ｋ１２株、Ｂ株など）が挙げられる。形質転換体の調製は、常法に従って行えばよい。
　得られた形質転換体を、その宿主細胞に応じた適当な培養条件で一定期間培養すれば、組込まれた遺伝子から本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼが発現されて、形質転換体中に蓄積する。
　形質転換体中に蓄積した本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、未精製のまま用いることができるが、精製したものを使用しても良い。この精製方法としては、従来公知のものが使用可能であり、例えば、培養後の形質転換体あるいはその培養物を適当な緩衝液中でホモジナイズし、超音波処理や界面活性剤処理などにより細胞抽出液を得、そこから蛋白質の分離精製に常套的に利用される分離技術を適宜組み合わせることにより行うことができる。このような分離技術としては、塩析、溶媒沈澱法等の溶解度の差を利用する方法、透析、限外濾過、ゲル濾過、非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）などの分子量の差を利用する方法、イオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなどの荷電を利用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが挙げられるが、これらに限定されない。
　次に、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼを用いてＬ－アミノ酸を製造する方法について説明する。本発明によるＬ－アミノ酸は、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼを用いてＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸（ラセミ体）中のＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸（Ｌ体）を特異的に加水分解する工程によって製造される。
　この工程は、具体的には、適当な溶液中に、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと原料のＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸を溶解させて反応液を調製し、この反応液を適当な条件で反応させることによって行うことができる。
　使用する溶液は、蒸留水で十分であるが、必要により、リン酸塩やトリスなどの緩衝剤を使用してもよい。緩衝剤を使用する場合、その濃度は２０～２００ｍＭであることが好ましく、ｐＨは６．５～８であることが好ましい。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、反応液中５～５００ｍｇ／Ｌ（１００～１００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。また、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、上述の通り、２価または１価の金属イオンを０．１ｍＭ～１Ｍ（好ましくは０．１～１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つため、反応液中に２価または１価の金属イオンを添加することが必要である。添加する２価または１価の金属イオンの例としては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋、Ｍｇ２＋，Ｃａ２＋，Ｎｉ２＋およびＫ＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと反応させるＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸は、種々の公知の方法によって合成することができ、例えばＳａｋａｉ　Ａ．ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００６，４５（１４），４４５５－６２に記載の方法によって合成することができる。原料のＤＬアミノ酸の種類は、製造したいＬ－アミノ酸の種類に応じて適宜選択すればよく、天然に存在する２０種のアミノ酸およびその誘導体、並びにターシャリーロイシン、シクロヘキシルグリシン、ブロモフェニルアラニン、ビフェニルアラニン、ジクロロフェニルアラニンなどの非天然アミノ酸およびその誘導体であることができる。
　反応液中のＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸の濃度は、特に限定されないが、一般的に１重量％～３０重量％である。
　本発明のＬ－アミノ酸の製造方法では、反応液を反応させる温度は、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２０～７０℃が好ましく、３０～６０℃がより好ましく、５５～６０℃がさらに好ましい。また、反応時のｐＨは、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ４～１０が好ましく、ｐＨ６～９がより好ましい。反応時間は、特に限定されないが、一般的に１日～７日程度である。反応時間は、製造したいＬ－アミノ酸の種類と所望の収量、収率、使用する酵素や基質の量、量比、反応温度や反応ｐＨなどを考慮し、実験的に適宜選択することができる。
　好ましくは、本発明のＬ－アミノ酸の製造方法は、Ｎ－サクシニルラセマーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸をラセミ化してＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を生成させる工程をさらに含む。本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸（ラセミ体）中のＬ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸のみを特異的に加水分解するため、このままではラセミ体の残り半分のＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸は無駄になってしまう。そこで、Ｎ－サクシニルラセマーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸をラセミ化してＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を生成させてやれば、残ったＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸も結果的にすべてＬ－アミノ酸に変換することができる。
　Ｎ－サクシニルラセマーゼは、Ｎ－サクシニルアミノ酸のＬ体をＤ体に変換する反応とＤ体をＬ体に変換する反応の両方を触媒してその比率をほぼ等しく（ラセミ化）する酵素である。本発明の製造方法で使用するＮ－サクシニルラセマーゼは、Ｎ－サクシニルアミノ酸をラセミ化することができれば特に限定されず、特開２００７－８２５３４号公報に記載されたＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼや特開２００８－６１６４２号公報に記載されたＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼなどの従来公知のものを使用することができる。
　Ｎ－サクシニルラセマーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸をラセミ化する反応は、例えば以下の条件でＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸、Ｎ－サクシニルラセマーゼおよび緩衝剤を含む反応溶液中で混合することにより行なう。反応温度は、使用するＮ－サクシニルラセマーゼが十分作用する温度であれば特に限定されないが、一般的には２５～７０℃が好ましく、３７～７０℃がより好ましい。反応時のｐＨは、使用するＮ－サクシニルラセマーゼが十分作用するｐＨであれば特に限定されないが、一般的にはｐＨ５～９が好ましく、ｐＨ６．５～８がより好ましい。Ｎ－サクシニルラセマーゼは、反応液中５～５００ｍｇ／Ｌ（５００～５００００Ｕ／Ｌ）の濃度で使用されることが好ましい。Ｎ－サクシニルラセマーゼは、２価の金属イオンを０．１ｍＭ～１Ｍ（好ましくは０．１～１ｍＭ）の終濃度で添加することにより活性を持つ。添加する２価の金属イオンとしては、Ｍｎ２＋，Ｃｏ２＋，Ｍｇ２＋，Ｆｅ２＋およびＮｉ２＋が挙げられ、特にＣｏ２＋が好適である。Ｃｏ２＋は終濃度０．１ｍＭ～１Ｍで反応させた時、相対活性でＭｎ２＋の終濃度０．１ｍＭ～１Ｍで反応させた時の２倍以上の活性を有する。Ｎ－サクシニルラセマーゼの反応に用いる緩衝剤は、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼの反応に用いる緩衝剤と同様のものが使用できる。なお、特開２００７－８２５３４号に記載のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼは、その後の研究により、Ｎ－サクシニルアミノ酸をより好適な基質とするＮ－サクシニルラセマーゼであることが判明している。従って、特開２００７－８２５３４号に記載のＮ－アシルアミノ酸ラセマーゼは、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと組合せて使用することができる。
　前述のＮ－サクシニルラセマーゼによるラセミ化反応とＬ－サクシニルアミノアシラーゼによる加水分解反応は、別々に行なうことも可能であるが、同時に行なわれることが好ましい。同時に行われる場合、微視的に見ると、まずＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸のうちＬ体のみが本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼにより脱アシル化（加水分解）され、目的のＬ－アミノ酸が生成する。基質のＬ体が消費されるとラセミ状態が解消されるため、Ｎ－サクシニルラセマーゼはＤ体をＬ体に変換する反応をより促進する。Ｎ－サクシニルラセマーゼにより生成したＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸は、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼにより順次Ｌ－アミノ酸へと分解される。この繰返しにより、理論的にはほぼすべてのＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸をＬ－アミノ酸に変換することができる。ラセミ化反応および加水分解反応を同時に行う場合の反応条件は、Ｎ－サクシニルラセマーゼおよび本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼが活性を発揮する条件の範囲内であれば特に限定しないが、基質濃度１重量％～３０重量％、ｐＨ６～８、温度３０～６０℃で行うことが好ましい。ラセミ化反応および加水分解反応に要する時間は、原料として用いるＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸が、所望する量のＬ－アミノ酸へと変換し得るまでの時間であれば特に制限されず、仕込み量によっても異なるが、一般的に１日～７日程度である。
　以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されない。
Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸の合成
（１）Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンの合成
　Ｄ－ターシャリーロイシン（東京化成工業製）とＬ－ターシャリーロイシン（東京化成工業製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇに溶解し、無水コハク酸８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１５ｇを加え、２０℃～４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸で中和後、酢酸エチルで抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンの白色粉末を１４ｇ得た。
（２）Ｎ－サクシニル－ＤＬ－バリンの合成
　Ｄ－バリン（ナカライテスク製）とＬ－バリン（ナカライテスク製）の等モル混合物１０ｇを水５０ｍｌと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇに溶解し、無水コハク酸（ナカライテスク製）８．８ｇと２０％水酸化ナトリウム溶液（ナカライテスク製）１７ｇを加え、２０℃～４０℃で撹拌しながら反応させた。反応液を塩酸（ナカライテスク製）で中和後、酢酸エチル（ナカライテスク製）で抽出し、濃縮した。ヘキサンで乾燥させて晶析し、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－バリンの白色粉末を１５ｇ得た。
（３）Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－トリプトファン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アスパラギン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－セリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－チロシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３，４－ジクロロフェニルアラニンの合成
　これらのＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸は、（２）のＮ－サクシニル－ＤＬ－バリンの合成方法に準じた方法で合成した。
Ｎ－サクシニルラセマーゼの調製
（１）特開２００８－６１６４２号公報に記載のＮ－サクシニルラセマーゼの調製
　ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ｇｅｎｏｍｅ－キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
　次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＮＣＡ１５０３株由来のＮ－サクシニルラセマーゼ遺伝子（配列番号３）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’－ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＧＧ　ＣＧＡ　ＴＣＡ　ＡＣＡ　ＴＣＧ　ＡＧＴ　ＡＣ－３’（配列番号：４））および３’プライマー（５’－ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＴＡ　ＴＧＣ　ＣＧＴ　ＣＧＣ　ＣＧＴ　ＡＣＧ　ＡＴＧ　ＡＡＡ－３’（配列番号：５））を用いた。これらのＰＣＲプライマーおよびＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
　次に、クローニングキットＴａｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ－Ｐｌｕｓ（東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られた遺伝子をベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＢＳＮＡＲ１を取得した。このｐＢＳＮＡＲ１を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。この得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）と命名した。
　ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＢＳＮＡＲ１）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
（２）特開２００７－８２５３４号公報に記載のＮ－サクシニルラセマーゼの調製
　クロロフレクサス・オーランティアカス由来のＮ－サクシニルラセマーゼ（以下、ＮＡＡＡＲ）遺伝子（配列番号６）を、この配列の上流と下流にそれぞれＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩサイトを付加し、細胞工学別冊「植物のＰＣＲ実験プロトコール」（ｐ８４－８９，秀潤社刊）に記載の方法で人工的に合成した。ベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＫＳＮ＋にクローニングし、組換え発現プラスミドｐＣＦＮＡＲを取得した。このｐＣＦＮＡＲを用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＤＨ５α株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）と命名した。
　ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地にアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＤＨ５α（ｐＣＦＮＡＲ）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。更にＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）のカラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。
実施例１　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの調製
　ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した。該菌株をＬＢ液体培地（５ｍｌ仕込み／３０ｍｌ容試験管；１．０％ポリペプトン、０．５％酵母エキス、１．０％ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に１白金耳植菌し、５０℃にて一晩振とう培養した。この菌体１ｍｌ分から遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分間、４℃）により菌体を回収した。回収した菌体よりＭａｇＥｘｔｒａｃｔｏｒ－ｇｅｎｏｍｅ－キット（東洋紡製）を用いて、取扱説明書に記載された手順により染色体ＤＮＡを抽出した。１ｍｌの菌体より約２０μｇの染色体ＤＮＡを取得した。
　次に、得られた染色体ＤＮＡを鋳型として、ゲオバチルス・ステアロサーモフィラスＩＦＯ１２９８３株由来のＬ－サクシニルアミノアシラーゼ遺伝子（配列番号１）を、ＰＣＲで増幅した。ＰＣＲプライマーは、５’プライマー（５’－ＡＡＧ　ＧＡＧ　ＧＴＡ　ＡＡＡ　ＴＧＡ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＴＴＡ　ＴＴＣ　ＡＧＣ　ＡＧＡ　ＴＧＡ　ＡＡＧ　Ｃ－３’（配列番号：７））および３’プライマー（５’－ＴＣＴ　ＡＧＡ　ＴＣＡ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＴＧＣ　ＡＧＣ　ＧＡＴ　ＡＧＡ　ＧＡＣ　ＡＣＧ－３’（配列番号：８））を用いた。これらのＰＣＲプライマー、およびＫＯＤ　Ｐｌｕｓ　ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡製）を用いて、上記の染色体ＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（９４℃・１５秒、５５℃・３０秒、６８℃・９０秒を３０サイクル）を行った。
　次に、クローニングキット（Ｔａｒｇｅｔ　Ｃｌｏｎｅ（登録商標）－Ｐｌｕｓ－、東洋紡製）を用いて、そのプロトコールに従って操作を行い、得られたベクターをベクターｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔにクローニングし、組換え発現プラスミドｐＬＳＡ２を取得した。このｐＬＳＡ２を用いて、エシェリヒア・コリー（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）ＪＭ１０９株コンピテントセル（東洋紡製）を形質転換し、形質転換体を取得した。得られた形質転換体は、エシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）と命名した。
　ＴＢ培地（５００ｍｌ）を２Ｌ容坂口フラスコ２個に分注し、１２１℃、２０分間オートクレーブを行い、放冷後別途無菌濾過したアンピシリンとイソプロピル－β－Ｄ－チオガラクトシドをそれぞれ終濃度が１００μｇ／ｍｌと０．１ｍＭになるように添加した。この培地に、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含むＬＢ培地で予め３０℃、１６時間培養したエシェリヒア・コリーＪＭ１０９（ｐＬＳＡ２）の培養液を５ｍｌ接種し、３７℃で２４時間通気攪拌培養を行った。培養終了後、菌体を遠心分離により集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に懸濁した後、フレンチプレスにて破砕し、更に遠心分離を行い、上清液を粗酵素液として得た。得られた粗酵素液に対してポリエチレンイミンによる除核酸および硫安分画を行い、５０℃、１時間の熱処理後、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）で透析を行った。さらにＤＥＡＥセファロースＣＬ－６Ｂ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）、およびオクチルセファロース（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス製）の各カラムクロマトグラフィーにより分離・精製することにより、精製酵素標品を得た。得られた標品は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより、単一であることが確認された。
実施例２　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成
　上記の（１）で合成したＮ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７～８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と５．８ｍｇ／ｍｌの実施例１で調製したＬ－サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．５ｍｌ添加し、反応液（ｐＨ　７～８）を調製した。この反応液を撹拌しながら５７℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、以下の条件でＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成を確認した。
　カラム：Ｉｎｅｒｔｓｉｌ　ＯＤＳ－２（粒径５μｍ、内４．６ｍｍ×長さ２５０ｍｍ）ＧＬサイエンス（株）製
　溶離液：ｐＨ２．３リン酸水溶液／ＨＰＬＣ用アセトニトリル＝８０：２０
　流速：０．８ｍｌ／ｍｉｎ　カラム温度：４０℃　検出器：２１０ｎｍ
　ＨＰＬＣ測定の結果を図１に示す。図１からわかるように、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからＬ－ターシャリーロイシンを短期間で、理論上の最高収率である５０％にほぼ等しい収率（以下、「変換率」ということがある）で合成することができた。
実施例３　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼを用いたＮ－サクシニル－ＤＬ－バリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－トリプトファン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アスパラギン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－セリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－チロシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシンからの対応する各Ｌ－アミノ酸の合成
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンの代わりに上記の（２）および（３）で合成したＮ－サクシニル－ＤＬ－バリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－トリプトファン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アスパラギン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－セリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－チロシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシンを使用して、実施例２と同様の条件で反応を９６時間行った。ただし、各Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸の濃度は１０重量％にした。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－バリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－トリプトファン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アスパラギン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－セリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－チロシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシンに対応する各Ｌ－アミノ酸への変換率を算出した。
　結果を、表１に示す。表１からわかるように、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－バリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－フェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－トリプトファン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アスパラギン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－セリン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－チロシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシンから対応する各Ｌ－アミノ酸を短期間で、効率良く合成できた。特に、非天然アミノ酸のＬ－シクロへキシルグリシンについては、短期間で、理論上の最高収率である５０％にほぼ等しい収率で合成することができた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
実施例４　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ－サクシニルラセマーゼを用いたＮ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成（ｉ）
　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシン溶液の濃度を１重量％にし、上記の（１）で調製した９．６ｍｇ／ｍｌのＮ－サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを反応液に添加しておいたことを除いては、実施例２と同様の条件で反応を９０時間行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｌ－ターシャリーロイシンの収率を算出したところ、収率は９０％以上であり、理論上の最高収率である１００％に近い値が得られた。
実施例５　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼおよびＮ－サクシニルラセマーゼを用いたＮ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成（ｉｉ）
　Ｎ－サクシニルラセマーゼとして上記の（２）で調製したものを使用したことを除いては、実施例４と同様にして反応を１２０時間行い、反応開始の２４時間後、４８時間後、および１２０時間後にサンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成を確認した。
　ＨＰＬＣ測定の結果を図２に示す。図２からわかるように、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼとＮ－サクシニルラセマーゼを併用することにより、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンのほぼすべて（収率９０％以上）をＬ－ターシャリーロイシンに変換できた。
実施例６　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性の比較試験（ｉ）
　上記の（１）で合成したＮ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンを蒸留水に溶解させ、０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ナカライテスク製）で、ｐＨ調整を行い、５重量％　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシン溶液（ｐＨ７～８）を調製した。この溶液１０ｍｌに、０．５ｍＭ（終濃度）ＣｏＣｌ２と、１０ｍｇ／ｍｌに調製した上記の（２）のＮ－サクシニルラセマーゼ０．１ｍｌを添加した。得られた溶液に、２．５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼ、または２．５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．１ｍｌ添加した。得られた反応液を撹拌しながら５０℃で１４４時間保持した。反応開始の２４時間後、４８時間後、７２時間後、および１４４時間後にサンプルを採取し、ＨＰＬＣ測定を行い、サクシニル体とフリー体のピークを確認することで、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからのＬ－ターシャリーロイシンの合成を確認した。
　ＨＰＬＣ測定の結果を図３に示す。図３からわかるように、特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと比較して、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンからＬ－ターシャリーロイシンへの変換率が顕著に高く、反応性が有意に向上していた。この結果から、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－Ｌ－ターシャリーロイシンを基質として効率的に利用することができることが明らかである。
実施例７　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼと特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの酵素活性の比較試験（ｉｉ）
　上記の（３）で合成したＮ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３，４－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンを使用し、それぞれ１０重量％のアミノ酸溶液（ｐＨ７．５）を調製した。０．１Ｍ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ（ｐＨ７．５）緩衝液０．２５ｍｌ、０．１Ｍ酢酸コバルト溶液０．０２５ｍｌ、各アミノ酸溶液０．５ｍｌ、蒸留水４．２ｍｌを混合物した溶液に、５ｍｇ／ｍｌに調製した特許文献３の実施例１に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼ、または５ｍｇ／ｍｌに調製した上記実施例１で得られた本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼの溶液を０．０２５ｍｌ添加した。得られた反応液を、５０℃で撹拌しながら４時間反応を行った。反応終了後、サンプルを採取して実施例２と同様の条件でＨＰＬＣ測定を行い、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３，４－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンに対応する各Ｌ－アミノ酸への変換率を算出した。
　結果を、表２に示す。表２からわかるように、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－３，４－ジクロロフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンのいずれからも対応する各Ｌ－アミノ酸を高変換率で合成できる。これに対して、特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－４－ブロモフェニルアラニン及びＮ－サクシニル－ＤＬ－３，４－ジクロロフェニルアラニンについては、対応する各Ｌ－アミノ酸を高変換率で合成できるものの、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシンについては、変換率がかなり低い。この結果から、本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、特許文献３に記載のＬ－サクシニルアミノアシラーゼが基質として効率良く利用できない非天然アミノ酸も効率良く利用できることが明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　本発明のＬ－サクシニルアミノアシラーゼは、Ｌ－ターシャリーロイシンやＬ－ビフェニルアラニン、Ｌ－シクロヘキシルグリシン、Ｌ－ジクロロフェニルアラニン、Ｌ－ブロモフェニルアラニンなどの立体的にかさ高い非天然アミノ酸および天然アミノ酸を効率良く製造できるので、医薬品、農薬、食品などの中間体や原料として有用なＬ－アミノ酸を製造するために広く利用できる。
　配列番号４，５，７，８は、実施例で使用したプライマーの配列である。
　配列番号６は、大腸菌株Ｋ－１２中で効率的に発現されるように設計されたＮＡＡＡＲをコードするＤＮＡの配列である。

Claims (8)

  1. 　下記（ａ）～（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とするタンパク質：
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子によってコードされるタンパク質；
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
    （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされ、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質；
    （ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質。
  2. 　下記（ａ）～（ｄ）のいずれか１つで表されることを特徴とする遺伝子：
    （ａ）配列番号１に記載の塩基配列からなる遺伝子；
    （ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする遺伝子；
    （ｃ）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子；
    （ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質において１または数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列に対応する塩基配列からなり、かつ、Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする遺伝子。
  3. 　請求項２に記載の遺伝子をベクターに挿入して組換えベクターを調製し、この組換えベクターで宿主細胞を形質転換して形質転換体を調製し、この形質転換体を培養する工程を含むことを特徴とする請求項１に記載のタンパク質の製造方法。
  4. 　請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸中のＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解する工程を含むことを特徴とするＬ－アミノ酸の製造方法。
  5. 　Ｎ－サクシニルラセマーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸をラセミ化してＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を生成させる工程をさらに含むことを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 　請求項１に記載のタンパク質を用いてＮ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸中のＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を特異的に加水分解する工程、およびＮ－サクシニルラセマーゼを用いてＮ－サクシニル－Ｄ－アミノ酸をラセミ化してＮ－サクシニル－Ｌ－アミノ酸を生成させる工程が同時に行なわれることを特徴とする請求項５に記載の方法。
  7. 　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸が、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ジクロロフェニルアラニン、またはＮ－サクシニル－ＤＬ－ブロモフェニルアラニンであることを特徴とする請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. 　Ｎ－サクシニル－ＤＬ－アミノ酸が、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ターシャリーロイシン、Ｎ－サクシニル－ＤＬ－ビフェニルアラニン、またはＮ－サクシニル－ＤＬ－シクロヘキシルグリシンであることを特徴とする請求項７に記載の方法。
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