CN103193669B - nNOS-Capon解偶联化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
nNOS-Capon解偶联化合物及其制备方法和应用，化合物符合下述结构通式：其中，R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基或冰片基，R2为异丙基、2-甲基丙基、异丁基、苯甲基或4-羟基苯甲基，R3为羧基、羧基的甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、冰片基酯、磷酸基或5-四氮唑基，a=0或1，b=0或1，c=1～6的整数，当a=0时b=0，a=1时b=0或1。本发明的化合物作用于nNOS蛋白的PDZ结构域，不影响nNOS的酶活性，因此，本发明的化合物可以克服作用于NMDA受体或直接抑制nNOS酶活性而导致的副作用。
Description
技术领域
本发明属于制药领域，提供一类能够抑制nNOS-Capon偶联的小分子化合物，及其该化合物在预防和治疗焦虑中的应用。
背景技术
焦虑症又称焦虑性神经症，是以广泛性焦虑症(慢性焦虑症)和发作性惊恐状态(急性焦虑症)为主要临床表现，常伴有头晕、胸闷、心悸、呼吸困难、口干、尿频、尿急、出汗、震颤和运动性不安等症。
随着社会的发展，人们的生活节奏普遍加快，来至于社会、生活和工作上的压力越来越大，因此焦虑症患者日渐怎多。据统计，我国城市人口的患病率已达2%～3%，发达国家近10%，且仍层增长趋势。急性焦虑症不但严重危害身心健康，而且伴随着焦虑必然会出现失眠、注意力无法集中、精力减退，思维混乱、理不出头绪、静不下心等症状，引起工作效率的明显下降。严重的，还可能出现身体不适，例如手脚出汗、胸闷、动不动就想小便等。
目前，临床上用于治疗焦虑症的药物主要有：（1）作用于苯二氮卓受体的药物，如地西泮、阿普唑仑等，这类药物起效快，但毒副作用也大，且易形成耐受和成瘾，停药后会出现戒断症状；（2）5-羟色胺部分激动剂，如丁螺环酮，虽然安全性较好但起效缓慢；（3）用于治疗抑郁症的药物，如丙咪嗪、阿米替林、西酞普兰、文拉法辛米氮平等，这些药物长时间给药后也具有抗焦虑的作用，但这些化合物都有着起效慢，不良反应多，如恶心、嗜睡、性功能障碍等缺点。焦虑症患者一般需要较长时间的维持治疗，但由于目前临床使用药物的毒副作用，使得一些病人不遵医嘱服药，存在很大的复发风险；另外，目前的治疗药物对许多病人无效；因此寻找副作用小、作用机制新的抗焦虑药是临床的需要。
目前，世界多个制药公司都在积极开展抗焦虑药物的研究，主要集中在γ-氨基丁酸（GABA）受体，外周苯二氮卓受体、5-羟色胺（5-HA）受体、胆囊收缩素受体（CCK-B）、促肾上腺皮质激素（CRF）受体、组胺H3受体、N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受体等靶点的研究。
近二十年来，人们逐渐认识到抑制NMDA受体的活性具有抗焦虑作用。例如，竞争性NMDA受体拮抗剂3-(2-羧基-4-哌啶基)-丙基-1-磷酸（CPP）、2-氨基-5-膦酰庚酸（AP5）、2-氨基-7-膦酰庚酸（AP7）和非竞争性NMDA受体阻断剂地佐环平（dizocilpine，MK-801）、苯环利定（phencyclidine，PCP）都具有抗焦虑样活性；作用于NMDA受体甘氨酸结合位点的拮抗剂7-氯-犬尿酸（7-CKA）、作用于NMDA受体NR2亚单位的多胺作用位点的拮抗剂艾芬地尔（ifenprodil）也都显示抗焦虑作用。尽管针对NMDA受体但拮抗剂的药物开发很诱人，但由于NMDA受体介导的生理作用多种多样，拮抗NMDA受体所体现出来的记忆损害、精神疾病、运动障碍等副作用使NMDA受体拮抗剂很难成为临床治疗药物（Br.J.Pharmacol，2009，158，494-506）。因此，研制不影响NMDA受体正常的生理功能、作用于NMDA受体信号通路中下游部分的药物是抗焦虑药物开发的新途径。
研究表明NMDA受体可以和骨架蛋白PSD-95和神经元一氧化氮合酶（nNOS）形成NMDA受体—PSD-95—nNOS三元复合物，经由NMDA受体内流的Ca2+激活nNOS产生NO。研究表明，NO是一个致焦虑分子，敲除nNOS基因、用nNOS的抑制剂7-硝基吲唑（7-NI）抑制其活性降低NO的产生均具有抗焦虑作用。因此，可以认为，NMDA受体拮抗剂的抗焦虑作用是通过降低钙离子内流，从而降低nNOS激活产生NO而起作用的（Brain Res.，2008，1240，39-46）。许多研究表明，NO是重要的信号分子，它不仅调节神经递质的释放、神经元的存活、调节神经元树突、轴突结构发育及参与突触可塑性的形成，还和学习和记忆等其它重要生理功能有关。所以，直接用nNOS合成酶抑制剂抑制NO的产生也是不合适的。因此，理想的药物是阻断和焦虑有关的NO靶标蛋白和nNOS的联系，抑制焦虑信号向下传递，但不抑制NO其它的功能。
NO是细胞内的一个信号分子，它通过作用于其它生物分子起作用。由于NO是一个高度活泼的自由基型气体分子，在生物体内存在很多的还原性物质，如谷胱甘肽，可以萃灭NO，因此，一般来说NO激活的是和它在空间上靠近的生物分子。nNOS是一个含有羧基端NO合成酶功能域和一个氮端PDZ结构域的蛋白分子，nNOS可以通过它的PDZ结构域和多种其它分子发生蛋白蛋白之间的相互作用，例如，它可以和肌肉型6-磷酸果糖激酶（PEK-M）（J.Biol.Chem.，1999，274，10545-10550）、Vac14（FEBS Lett.，2006，580，6948-6954）、RGSZ2(Antioxid.Redox Signal.，2011，15，873-887)、nNOS PDZ结构域羧基末端结合蛋白（Capon）（Neuron，1998，20，115-124）等蛋白发生相互作用。在这些蛋白之中，研究表明，Capon和精神疾病，如精神分裂症、狂郁症有关（Schizophrenia Res.，2006，82，283-285）。Capon是nNOS的一个重要接头蛋白，它的C-端可以和nNOS的PDZ结合，N-端含有一个磷酸酪氨酸（PTB）结合域。研究表明，Capon可以和Dexras1（Neuron，2000，28，183-193）、Synapsin(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，3199-3204)、Scribble（J.Neurosci.，2010，30，4796-4805）结合。Capon和Scribble的相互作用和突触的棘突的发生有关。Synapsin是突触前膜囊泡蛋白，它和NO一样具有调节神经递质释放的功能。Capon的另一个相互作用蛋白是Dexras1，该蛋白是小G蛋白Ras家族的一员。研究表明，nNOS、Capon、Dexras1可以组成nNOS-Capon-Dexras1三元复合物，Dexras1的活化需要nNOS产生的NO（Neuron，2000，28，183-193）。研究表明，Dexras1具有抑制腺苷环化酶(AC)从而抑制Creb活性的作用（Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004，316，307-312）。药理学研究表明，在焦虑状态下，nNOS表达增加，Creb磷酸化水平下降；而在抗焦虑药的作用下，nNOS的表达下降，Creb磷酸化水平升高（J.Neurosci.，2010，30，2433-2441）。从这些研究来看，如果抑制nNOS和Capon的联系，则能抑制nNOS对Dexras1的活化作用，从而抑制Dexras1下调Creb活性的作用，从而表现抗焦虑作用。另有研究表明，在焦虑状态下，Erk磷酸化水平显著增加，抑制Erk信号通路具有抗焦虑作用（J.Psychia.Res.，2008，43，55-63）。有研究表明，Dexras1具有提高Erk活性的作用（J.Biol.Chem.，2002，277，10876-10882），因此，抑制Dexras1活性具有降低Erk活性的作用，从而表现抗焦虑作用。抑制nNOS和Capon的联系还能影响nNOS对Synapsin的调节作用，Synapsin对神经递质释放的调节作用，可能是Synapsin通过nNOS-Capon-Synapsin三元复合物由nNOS产生的NO介导的(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99，3199-3204)，断开nNOS和Capon的联系可以降低nNOS对Synapsin的调节作用，从而抑制神经递质，如谷氨酸，过量释放入突触间隙，从而起抗焦虑作用。
上述的药理学研究表明，抑制nNOS-Capon之间的相互作用，可以分别抑制由Dexras1、Synapsin介导的致焦虑作用，Capon在nNOS PDZ上的结合位点，是抗焦虑药物的新靶点。nNOS-Capon解偶联试剂的研制是开发抗焦虑药物的新途径。
发明内容
解决的技术问题：本发明提供了一类抑制nNOS-Capon偶联的小分子抑制剂，及其在焦虑的预防和治疗中的应用。
技术方案：nNOS-Capon解偶联化合物，符合下述结构通式：
其中，R1为氢、甲基、乙基、丙基、异丙基或冰片基，R2为异丙基、2-甲基丙基、异丁基、苯甲基或4-羟基苯甲基，R3为羧基、羧基的甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、冰片基酯、磷酸基或5-四氮唑基，a＝0或1，b＝0或1，c＝1～6的整数，当a＝0时b＝0，a＝1时b＝0或1。
优选的所述nNOS-Capon解偶联化合物，结构式为：
上述nNOS-Capon解偶联化合物的制备方法，步骤为：-15℃下将9mmol D-缬氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加18.45mmol N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加9.45mmol丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时；停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4次萃取，10%wt柠檬酸25mL×2次洗涤，饱和氯化钠洗涤，之后5%wt碳酸氢钠25mL×2次洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈黄色，用体积比乙酸乙酯：石油醚=1:2的流动相进行柱层析，最终得到产物。
所述nNOS-Capon解偶联化合物在制备预防或治疗焦虑症药物中的应用。
所述nNOS-Capon解偶联化合物在预防或治疗焦虑症中的应用。
如通式（1）所示的化合物，其光学异构体或消旋体。
本发明涉及的通式（1）化合物的合成可由合成示意路线1-3表示。
合成示意路线1：
合成示意路线2：
合成示意路线3：
有益效果：本发明的发明人针对nNOS PDZ结构域的结构特点，设计并合成了一系列化合物。其中的化合物N-2-甲氧羰基乙酰基-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）通过免疫共沉淀的方法证明了该化合物具有抑制nNOS和Capon相互结合的作用，通过小鼠腹腔给药的方式证明了该化合物ZLc-002在动物模型上具有抗焦虑作用。本发明的化合物作用于nNOS蛋白的PDZ结构域，不影响nNOS的酶活性，因此，本发明的化合物可以克服作用于NMDA受体或直接抑制nNOS酶活性而导致的副作用。
化合物ZLc-002的结构式如下：
附图说明
图1：化合物ZLc-002小鼠腹腔注射抗焦虑作用，结果表明，化合物ZLc-002在40-80mg/kg具有显著的抗焦虑作用；图1a、1b显示动物在40-80mg/kg连续给药14天后在高架迷宫实验中显示显著的抗焦虑活性；图1c显示40-80mg/kg连续给药14天后动物的自主活动不受影响；图1d显示动物在40mg/kg连续给药14天后在摄食实验中显示弱抗焦虑作用，在80mg/kg剂量下显示显著的抗焦虑作用；
图2：IP-WB测定化合物ZLc-002的nNOS-Capon解偶联作用，结果表明，化合物ZLc-002具有显著的抑制nNOS-Capon偶联的作用。实验结果表明，40-80mg/kg给药后nNOS-Capon的偶联明显减少。
具体实施方式
下面的实施例可使本专业技术人员可全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1N-(3-羧基丙酰基)-D-缬氨酸（ZLc-001）
称取2.34g(20mmol)丁二酸酐和2.02g(20mmol)D-缬氨酸于50mL茄形瓶中，加入20mL冰醋酸溶解，加热至55℃搅拌6小时。停止反应，将溶剂蒸干，加20mL水，乙酸乙酯50mL×4萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。残余物加入乙酸乙酯50mL，加热使全溶，趁热过滤，滤液自然冷却，析出固体，重复此操作两次，最后得到白色固体2.66g，产率61.2%。Rf=0.75(三氯甲烷:甲醇:冰醋酸=90:8:2，体积比)。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.86(d，3H，J=1.17Hz)，0.88(d，3H J=1.17Hz)，2.02(hept，1H，J=6.18Hz)，2.35～2.47(m，4H)，4.12～4.17(q，1H)，7.96～7.99(d，1H，J=8.67Hz)，12.25(s，2H)。
实施例2N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）
-15℃下将1.50g(9mmol)D-缬氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4次萃取，10%wt柠檬酸25mL×2次洗涤，饱和氯化钠洗涤，之后5%wt碳酸氢钠25mL×2次洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:2，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.03g，产率49.5%。Rf=0.5(乙酸乙酯:石油醚=1:2，碘显色)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm):0.96(t，6H，J=6.48Hz)，2.20(s，1H)，3.37(s，2H)，3.75(s，3H)，3.77(s，3H)，4.56(s，1H)，7.52(s，1H).
实施例3N-(3-羧基丙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-003）
冰水浴下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐1.01g(6mmol)溶于50mL二氯甲烷中，滴加三乙胺1mL(7.2mmol)，滴完后搅拌10min，然后缓慢滴加溶于30mL二氯甲烷的4-二甲氨基吡啶0.88g(7.2mmol)，最后加入丁二酸酐0.72g(7.2mmol)，冰水浴下继续搅拌10min，然后25℃搅拌20小时。蒸掉部分二氯甲烷，加入10%wt碳酸氢钠溶液50mL，水层用盐酸调pH至3，再用乙酸乙酯70mL×3萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。残余物用硅胶柱层析纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:1，体积比)，得到黄色液体1.01g，产率72.8%。Rf=0.55(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:1，体积比)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm):0.92(t，6H，J=7.05Hz)，2.12～2.19(m，1H)，2.56～2.60(t，2H，J=6.45Hz)，2.69～2.75(m，2H)，3.75(s，3H)，4.54～4.59(m，1H)，6.36(s，1H)。
实施例4N-(3-甲氧基羰基丙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-004）
-15℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入丁二酸单甲酯酰氯1.55mL(12.6mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，用乙酸乙酯60mL×4萃取，合并萃取液，依次用10%柠檬酸20mL×2，5%碳酸氢钠20mL×2，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。残余物用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，得到2.03g黄色固体，产率69.0%。Rf=0.65(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm):0.91(d，3H，J=6.84Hz)，0.94(d，3H，J=6.81Hz)，2.09～2.21(m，1H)，2.53～2.59(m，2H)，2.61～2.73(m，2H)，3.69(s，3H)，3.74(s，3H)，4.53～4.58(q，1H)，6.13～6.16(d，1H，J=8.22Hz)。
实施例5N-(2-羧基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-005）
0℃下将N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）1.92g(8.3mmol)溶于9mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)9.15mL，0℃继续搅拌15分钟后，30℃搅拌6小时。原料ZLc-2反应完全后，停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2–3，乙酸乙酯50mL×4萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。残余物用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=15:5:1，体积比)，得到1.13g黄色液体，产率62.7%。Rf=0.45（乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=15:5:1，体积比)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.94(d，3H，J=6.90Hz)，0.96(d，3H J=6.85Hz)，2.22(hept，1H，J=1.80Hz)，3.42(s，2H)，3.77(s，3H)，4.58～4.61(q，1H)，7.11(s，1H)。
实施例6N-(2-羧基乙酰基)-D-缬氨酸（ZLc-006）
0℃下将N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯(ZLc-002)1.16g(5mmol)溶于11mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)11mL，0℃继续搅拌15分钟后，30℃搅拌6小时。TLC检测反应完全后，停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2-3，乙酸乙酯50mL×4萃取，合并萃取液，依次用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱进行纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:3，体积比)，得到0.58g黄色固体，产率57.1%。Rf=0.35(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:3，体积比)。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.88(d，3H，J=3.20Hz)，0.89(d，3H，J=3.25Hz)，2.04(hept，1H，J=6.80Hz)，3.28～3.31(m，2H)，4.16～4.19(m，1H)，8.18(d，1H，J=8.6Hz)，12.50(s，2H)。
实施例72-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯
35℃下将钠5.52g(0.24mol)加入到150mL乙醇中，搅拌溶解后，滴加丙二酸二乙酯32.04g(0.2mol)，滴完后35℃继续搅拌20分钟，然后再滴加4-溴丁酸乙酯46.8g(0.24mol)，滴完后再加入碘化钾0.83g(5mmol)，加热至80℃回流24小时。停止反应，将溶剂蒸干。加水40mL，用乙酸乙酯80mL×4萃取，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干，得黄色液体。减压蒸馏，收集700帕大气压下144-146℃馏分，得到无色液体40.34g，产率73.53%。Rf=0.70(乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比，碘显色)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):1.24～1.28(m，9H)，1.66～1.70(m，2H)，1.91～1.95(q，2H)，2.33(t，2H，J=7.40Hz)，3.32～3.36(m，1H)，4.11～4.15(m，2H)，4.17～4.22(m，4H)。
实施例82-异丙基-2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯
35℃下将1.51g(63mmol)氢化钠加入到80mL四氢呋喃中，搅拌下滴加16.44g(60mmol)2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯，滴完后搅拌20分钟，然后再滴加2-溴异丙烷6.80mL(72mmol)，再加入碘化钾1.50g(9mmol)，然后加热到70℃回流60小时。停止反应，将溶剂蒸干。加水40mL，乙酸乙酯100mL×4萃取，合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯：石油醚=1：5，体积比)，得到微红色液体4.86g，产率25.6%。Rf=0.75(乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比，碘显色)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.93～0.97(m，6H)，1.22～1.27(m，9H)，1.53～1.59(m，2H)，1.87～1.90(m，2H)，2.26～2.29(m，4H)，2.31～2.34(m，2H)，4.08～4.20(m，6H)。
实施例92-异丙基己二酸（ZLc-007）
将1.90g(6mmol)2-异丙基2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯溶于20mL甲醇中，然后加入氢氧化钠(4mol/L)30mL，加热至85℃回流10小时，然后减压蒸去甲醇，加入浓盐酸30mL，加热到120℃回流12小时。乙酸乙酯60mL×4萃取，合并萃取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（用流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)，得0.57g微黄色固体，产率50.5%。Rf=0.75（用流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.86～0.94(m，6H)，1.38～1.48(m，4H)，1.69～1.80(m，1H)，1.94～1.99(m，1H)，2.14～2.20(m，2H)，12.01(s，2H)。
实施例102-异丙基己二酸二甲酯（ZLc-008）
-5℃下将3.40g(18.1mmol)2-异丙基己二酸(ZLc-007)溶于40mL甲醇中，然后滴加2.76mL(38.01mmol)二氯亚砜，滴完后-5℃下继续反应2小时，升温到25℃继续反应1小时，然后加热到70℃回流6小时。停止反应，将溶剂蒸干，加入乙酸乙酯80mL溶解，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干，用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比)，得微黄色液体2.42g，产率61.8%。Rf=0.70（流动相：乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.90(d，3H，J=6.70Hz)，0.93(d，3H，J=6.75Hz)，1.51～1.65(m，4H)，1.85(hept，1H，J=6.85Hz)，2.12～2.16(m，1H)，2.31(t，2H，J=7.05Hz)，3.66(s，3H)，3.67(s，3H)。
实施例115-异丙基己二酸单甲酯（ZLc-009）
35℃下将2-异丙基己二酸二甲酯(ZLc-008)1.42g(6.57mmol)溶于7mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)6.57mL，35℃继续搅拌8小时。停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2–3，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并萃取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯：石油醚=3：1，体积比），得淡黄色液体1.01g，产率76.0%。Rf=0.75（乙酸乙酯：石油醚=3：1，体积比）。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.84(d，3H，J=6.75Hz)，0.88(d，3H，J=6.80Hz)，1.37～1.44(m，2H)，1.45～1.51(m，2H)，1.76(hept，1H，J=6.90Hz)，2.09～2.13(m，1H)，2.17～2.23(m，2H)，3.60(s，3H)，11.98(s，1H)。
实施例122-异丙基-2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯
35℃下将1.51g(63mmol)氢化钠加入到80mL四氢呋喃中，搅拌下滴加16.44g(60mmol)2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯（CL-13），滴完后搅拌20分钟，然后再滴加2-溴异丁烷6.88mL(63mmol)，再加入碘化钾1.00g(6mmol)，然后加热到70℃回流60小时。停止反应，将溶剂蒸干。加水40mL，乙酸乙酯100mL×4萃取。合并萃取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯：石油醚=1：5，体积比)，得到微粉红色液体9.22g，产率46.5%。Rf=0.75(乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比，碘显色)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.88(d，6H，J=6.60Hz)，1.23～1.26(m，9H)，1.46～1.53(m，2H)，1.61～1.66(m，1H)，1.90(d，2H，J=6.35Hz)，1.92～1.95(m，2H)，2.30(t，2H，J=7.30Hz)，4.10～4.19(m，6H)。
实施例132-异丁基己二酸（ZLc-010）
将1.98g(6mmol)2-异丙基-2-(3-乙氧羰基丙基)丙二酸二乙酯溶于20mL甲醇中，然后加入氢氧化钠(4mol/L)30mL，加热至85℃回流10小时，然后将溶剂甲醇减压蒸干，再加入浓盐酸30mL，加热到120℃回流12小时。乙酸乙酯60mL×4萃取，提取液用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)，得到1.13g微黄色固体，产率93.12%。Rf=0.45(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.85(d，3H，J=6.10Hz)，0.86(d，3H，J=6.55Hz)，1.17(hex，1H，J=4.85Hz)，1.37～1.54(m，6H)，2.16～2.30(m，2H)，2.25～2.29(m，1H)，11.99(s，2H)。
实施例142-异丁基己二酸二乙酯（ZLc-011）
-5℃下将2.80g(13.84mmol)2-异丁基己二酸（ZLc-010）溶于40mL甲醇中，然后滴加2.11mL(29.06mmol)二氯亚砜，滴完后-5℃下继续反应2小时，升温到25℃继续反应1小时，然后加热到70℃回流6小时。停止反应，将溶剂蒸干，加入乙酸乙酯80mL溶解，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比)，得微黄色液体2.60g，产率81.6%。Rf=0.75(乙酸乙酯:石油醚=1:5，体积比，碘显色)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.87(d，3H，J=6.50Hz)，0.89(d，3H，J=6.50Hz)，1.24(hept，1H，J=5.35Hz)，1.44～1.53(m，2H)，1.54～1.62(m，4H)，2.30(t，2H，J=7.3)，2.42～2.48(m，1H)，3.67(s，6H)。
实施例155-异丁基己二酸单甲酯（ZLc-012）
35℃下将2-异丁基己二酸二乙酯（ZLc-011）4.43g(19.24mmol)溶于20mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)21.16mL，35℃继续搅拌8小时。停止反应，旋蒸除去甲醇。剩余的液体用浓盐酸调pH值至2–3，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。硅胶柱色谱纯化（流动相：乙酸乙酯：石油醚=3：1，体积比），得黄色液体3.72g，产率89.4%。1H-NMR(500MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.83(d，3H，J=6.25Hz)，0.85(d，3H，J=6.40Hz)，1.21(hept，1H，J=5.15Hz)，1.40～1.52(m，6H)，2.19(t，2H，J=5.40)，2.38～2.41(m，1H)，3.60(s，3H)。
实施例16L-缬氨酸甲酯
-5℃下将5.01g(42.7mmol)L-缬氨酸加入到30mL甲醇中，然后滴加3.72mL(51.3mmol)氯化亚砜，滴完后，0℃反应3小时，然后70℃回流24小时。停止反应，将溶剂减压蒸干，加5mL水溶解，调pH至10-11，用乙酸乙酯50mL×8萃取，合并提取液，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干，得微黄色液体3.21g，产率57.3%。Rf=0.70（正丁醇：氨水=15:6，体积比）。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.90(d，3H，J=6.85Hz)，0.97(d，3H，J=6.85Hz)，1.56(s，2H)，2.02(hept，1H，J=5.10Hz)，3.30(d，1H，J=5.00Hz)，3.72(s，3H)。
实施例17N-(2-乙氧甲酰基乙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-013）
-15℃下将1.31g(10mmol)L-缬氨酸甲酯加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加1.15mL（10.5mL）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.15mL丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用10%柠檬酸25mL×2洗涤，饱和氯化钠洗涤，之后5%碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干，浓缩液呈黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:2，体积比）进行硅胶柱层析，得到黄色液体0.87g，产率37.7%。Rf=0.5(乙酸乙酯:石油醚=1:2，体积比，碘显色)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.94(d，3H，J=6.90Hz)，0.97(d，3H，J=6.90Hz)，2.21(hept，1H，J=4.95Hz)，3.38(s，2H)，3.75(s，3H)，3.77(s，3H)，4.55～4.57(q，1H)，7.53(d，1H，J=6.85Hz)。
实施例18N-(2-羧基乙酰基)-L-缬氨酸（ZLc-014）
35℃下将N-(2-乙氧甲酰基乙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-013）1.16g(5mmol)溶于11mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)11mL，35℃继续搅拌6小时。停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2–3，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:1，体积比)进行柱层析，得到0.66g黄色液体，产率65.0%。Rf=0.35(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=10:10:1，体积比，碘显色)。1H-NMR(300MHz，DMSO-d6)δ(ppm):0.87(d，3H，J=1.86Hz)，0.89(d，3H，J=1.83Hz)，2.06(hept，1H，J=6.81Hz)，3.16～3.32(m，2H)，4.15～4.20(q，1H)，8.19(d，1H，J=8.58Hz)，12.50(s，2H)。
实施例19N-(2-羧基乙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-015）
35℃下将N-(2-乙氧甲酰基乙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-013）2.32g(10mmol)溶于11mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)11mL，35℃继续搅拌6小时。停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2-3，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)进行硅胶柱层析，得1.22g黄色液体，产率56.2%。Rf=0.10(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.94(d，3H，J=6.95Hz)，0.97(d，3H，J=6.85Hz)，2.21(hept，1H，J=5.30Hz)，3.44(s，2H)，3.76(s，3H)，4.57～4.59(q，1H)，7.48(d，1H，J=8.20Hz)，9.09(s，1H)。
实施例20N-(2-甲氧羰基丙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-016）
-15℃下将4.04g(30.8mmol)L-缬氨酸甲酯溶于40mL二氯甲烷中，搅拌10分钟后，滴加3.73mL(33.88mmol)N-甲基吗啉，然后滴加4.17mL(30.8mmol)丁二酸单甲酯酰氯，-15℃下继续搅拌30分钟，然后升温至30℃继续反应15小时。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4萃取。合并提取液，10%柠檬酸20mL×2洗涤，5%碳酸氢钠20mL×2洗涤，饱和氯化钠洗涤。无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行硅胶柱层析，得到黄色液体5.89g，产率78.0%。Rf=0.75(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)。1H-NMR(300MHz，CDCl3)δ(ppm):0.91(d，3H，J=6.93Hz)，0.94(d，6H，J=6.93Hz)，2.15(hept，1H，J=4.95Hz)，2.48～2.61(m，2H)，2.63～2.73(m，2H)，3.69(s，3H)，3.74(s，3H)，4.53～4.58(q，1H)，6.17(d，1H，J=7.92Hz)。
实施例21N-(3-羧基丙酰基)-L-缬氨酸（ZLc-017）
称取2.34g(20mmol)丁二酸酐和2.02g(20mmol)L-缬氨酸于50mL茄形瓶中，然后加入20mL冰醋酸并加热至55℃搅拌6小时。停止反应，将溶剂蒸干，加20mL水，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。再加入乙酸乙酯50mL，加热至回流，趁热过滤，滤液自然冷却，析出固体。重复此操作两次，最后得到微黄色固体2.53g，产率58.9%。Rf=0.75(三氯甲烷:甲醇:冰醋酸=90:8:2，体积比)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.90～0.94(m，6H)，2.01(hex，1H，J=6.80Hz)，2.36～2.49(m，4H)，4.13～4.16(q，1H)，7.95(d，1H，J=8.60Hz)，12.24(s，2H)。
实施例22N-(3-羧基丙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-018）
35℃下将N-(2-甲氧羰基丙酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLc-16）2.45g(10mmol)溶于11mL甲醇中，然后用恒压滴液漏斗滴加NaOH(1mol/L)11mL，35℃继续搅拌8小时。停止反应，旋蒸除去甲醇，剩余的液体用浓盐酸调pH值至2～3，乙酸乙酯50mL×4萃取。合并提取液，用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥。过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)进行硅胶柱层析，得1.67g黄色液体，产率72.2%。Rf=0.10(乙酸乙酯:石油醚:冰醋酸=20:20:1，体积比)。1H-NMR(500MHz，CDCl3)δ(ppm):0.91(d，3H，J=6.90Hz)，0.93(d，3H，J=6.85Hz)，2.16(hept，1H，J=1.45Hz)，2.54～2.61(m，2H)，2.66～2.78(m，1H)，3.74(s，3H)，4.55～4.58(q，1H)，6.42(s，1H)，8.89(s，1H)。
实施例23N-(5-甲氧羰基戊酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-019）
-15℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入己二酸单甲酯酰氯1.74mL(12.6mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，Rf=0.65。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4，10%wt柠檬酸20mL×2，5%wt碳酸氢钠20mL×2饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到2.36g浅紫色固体，产率71.9%。
实施例24N-(4-甲氧羰基丁酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-020）
-15℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入戊二酸单甲酯酰氯2.24g(12.6mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，Rf=0.65。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4，10%wt柠檬酸20mL×2，5%wt碳酸氢钠20mL×2饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到1.85g黄色液，产率69.0%。
实施例25N-(5-甲氧羰基戊酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLm-021）
-15℃下将L-缬氨酸甲酯1.31g(10mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺1.81mL(13mmol)，搅拌10分钟后再加入己二酸单甲酯酰氯1.66mL(11mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，Rf=0.65。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4，10%柠檬酸20mL×2，5%碳酸氢钠20mL×2饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到1.99g黄色液体，产率72.9%。
实施例26N-(4-甲氧羰基丁酰基)-L-缬氨酸甲酯（ZLm-022）
-15℃下将L-缬氨酸甲酯1.31g(10mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺1.81mL(13mmol)，搅拌10分钟后再加入戊二酸单甲酯酰氯1.54mL(11mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，碘缸显色，Rf=0.65。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4，10%wt柠檬酸20mL×2，5%wt碳酸氢钠20mL×2饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到1.72g淡黄色液体，产率66.3%。
实施例27N-(3-乙氧羰基丙基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-023）
65℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于50mL甲醇中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入4-溴丁酸乙酯2.06mL(14.4mmol)，KI少量，65℃水浴继续搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(氯仿:甲醇:醋酸=90:8:2，体积比)，碘缸显色，Rf=0.71。停止反应，将溶剂蒸干，加入乙醚30mL，冰水冷却，析出结晶，抽滤。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到0.64g红褐色液体，产率21.7%。
实施例28N-(2-甲氧羰基乙基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-024）
65℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于50mL甲醇中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入4-溴丁酸乙酯1.60mL(14.4mmol)，KI少量，65℃水浴继续搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(氯仿:甲醇:醋酸=90:8:2，体积比)，碘缸显色，Rf=0.65。停止反应，将溶剂蒸干，加入乙醚30mL，冰水冷却，析出结晶，抽滤。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)进行柱层析，最终得到1.64g红褐色液体，产率90.6%。
实施例29N-(3-甲氧羰基丙基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-025）
65℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐2.01g(12mmol)溶于50mL甲醇中，然后加入三乙胺3.42mL(24.6mmol)，搅拌10分钟后再加入4-溴丁酸乙酯1.82mL(14.4mmol)，KI少量，65℃水浴继续搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，Rf=0.65，碘缸显色。停止反应，将溶剂蒸干，加入乙醚30mL，冰水冷却，析出结晶，抽滤。先用流动相(乙酸乙酯:石油醚=2:3，体积比)，再用流动相(石油醚:甲醇=10:1，体积比)进行柱层析，最终得到0.75g红褐色液体，产率30.0%。
实施例30N-(氰基甲酰基)-D-缬氨酸甲酯
-5℃下将D-缬氨酸甲酯盐酸盐5g(56mmol)溶于60mL二氯甲烷中，然后加入氰基乙酸2.7g(59mmol)，再加入DIEA12mL(124mmol)，-5℃充分搅拌，立即加入PyBoc18.6g(67mmol)，搅拌30分钟。再转入水浴锅内25℃继续搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)。停止反应，将溶剂蒸干，加乙酸乙酯120mL溶解，用60mL饱和氯化钠溶液与60mL10%wt柠檬酸配制的混合液分四次洗涤，再用60mL饱和氯化钠溶液与60mL5%wt碳酸氢钠配制的混合液分四次洗涤，饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)进行柱层析，得到6.58g，产率48.7%
实施例31N-(四氮唑-2-基甲酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLm-026）
取4.0g N-(氰基甲酰基)-D-缬氨酸甲酯(0.02mol)置于100mL三口烧瓶中，依次加入叠氮化钠1.69g，三乙胺盐酸盐3.56g，溶于30mL硝基苯中，放入微波反应合成仪中，温度100℃，功率75W，搅拌反应6小时，TLC检测反应进程，展开剂（氯仿:甲醇:醋酸=90:8:2，体积比)，Rf=0.65。停止反应，反应液放冷至室温，水30mL×4萃取，合并萃取液，乙醚30mL×2洗涤，2mol/L的盐酸溶液酸化，调PH至2～3，加入氯化钠搅拌至溶液饱和，乙酸乙酯30mL×4，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸至10mL，冰水冷却下加入30mL石油醚，析出晶体，抽滤，洗涤多次，置入真空干燥器中干燥2小时，得白色粉末状固体2.1g，产率43.5%.
实施例32N-(5-甲氧羰基戊酰基)-D-亮氨酸甲酯（ZLm-027）
-15℃下将D-亮氨酸甲酯盐酸盐1.82g(10mmol)溶于40mL二氯甲烷中，然后加入三乙胺2.94mL(21mmol)，搅拌10分钟后再加入己二酸单甲酯酰氯1.66mL(11mmol)，-15℃继续搅拌20分钟，然后25℃搅拌12小时。TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，Rf=0.72。停止反应，将溶剂蒸干，加水20mL，乙酸乙酯60mL×4，10%wt柠檬酸20mL×2，5%wt碳酸氢钠20mL×2，乙酸乙酯60mL×4。用流动相(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)进行柱层析，最终得到2.12g淡黄色液体，产率86.5%。
实施例33N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-亮氨酸甲酯（ZLm-028）
-15℃下将1.64g(9mmol)D-亮氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，碘显色，Rf=0.7。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，之后用5%wt碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈淡黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.57g，产率71.0%。
实施例34N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-苯丙氨酸甲酯（ZLm-029）
-15℃下将1.94g(9mmol)D-苯丙氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，碘显色，Rf=0.7。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，之后用5%wt碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈淡黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.87g，产率74.5%
实施例35N-(2-甲氧羰基乙酰基)-L-苯丙氨酸甲酯（ZLm-030）
-15℃下将1.94g(9mmol)L-苯丙氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，碘显色，Rf=0.7。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，之后用5%wt碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈淡黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到无色液体2.26g，产率90%
实施例36N-(2-甲氧羰基乙酰基)-L-酪氨酸甲酯（ZLm-031）
-15℃下将1.76g(9mmol)L-酪氨酸甲酯加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，碘显色，Rf=0.32。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈淡黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.19g，产率44.7%。
实施例37N-(2-甲氧羰基乙酰基)-L-亮氨酸甲酯（ZLm-032）
-15℃下将1.64g(9mmol)L-亮氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)进行柱层析，碘显色，Rf=0.70。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，之后用5%wt碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.69g，产率76.6%。
实施例38N-(2-甲氧羰基乙酰基)-L-异亮氨酸甲酯（ZLm-033）
-15℃下将1.64g(9mmol)L-异亮氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时，TLC检测反应进程，展开剂(乙酸乙酯:石油醚=1:1，体积比)，碘显色，Rf=0.7。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4萃取，10%wt柠檬酸25mL×2洗涤，之后用5%wt碳酸氢钠25mL×2洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈淡黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:1，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.18g，产率53.4%。
实施例39ZLc-002新奇摄食抑制实验（NSF）
新奇摄食抑制是一种用于检测冲突心理的动物行为学检测方法，摄食的动力和害怕进入新环境明亮的中央区域的矛盾形成冲突。在新奇摄食抑制中的摄食潜伏期被用来评价焦虑样行为。实验过程是在五分钟的时间内，观察小鼠的摄食潜伏期，检测的环境是塑料盒（50×50×20cm），盒子底部铺一层约2cm厚的木屑垫料。在实验前24小时，小鼠禁食，在测试过程中，一个食丸放在塑料小皿中，小皿下面垫一张白纸，然后放在测试盒的中间。每一只小鼠面朝测试盒的一角，从角落放进测试盒，立即开始计时。摄食开始的时间（摄食定义为小鼠坐在垫料上，用前爪捧起食物，开始吃食）计时。在检测完新笼中的摄食潜伏期之后，小鼠被转移到原来的养殖笼，检测小鼠在老笼中的摄食潜伏期和15分钟内的摄食量，这两个检测指标作为小鼠在新笼中的摄食潜伏期的可能的干扰因素，进行排除。新笼潜伏期越长，代表焦虑。实验结果见附图1。
实施例40ZLc-002旷场实验
旷场检测中的旷场区域被划分为，新奇环境的中央区域和与此对应的周围有墙壁保护的外周区域。如果小鼠在检测中觉得害怕和焦虑就会在外周呆更多的时间。此项试验在进行NSF检测24小时之后进行，此段时间内小鼠不能接受任何应激。在检测通过Hamilton KinderOF2325-0222旷场测试仪进行。旷场区域是由一个56.13×56.13厘米的底面，四面35.18厘米高的壁构成。底部用标记笔分成256个相同大小的区域，其中中央64格被定义为中央区域，其余的格子被定义为外周区域，测试开始时，小鼠从外周的一个固定的角落被放入，而后记录5分钟的活动情况。旷场实验表现的是动物总体活动性和探究行为，所以我们主要记录小鼠5分钟内在旷场中的穿行格数和站立次数。实验结果见附图1。
实施例41ZLc-002高架十字迷宫检测（EPM）
在NSF检测后24小时，通过高架十字迷宫检测小鼠自发的焦虑样行为。高架置于地面38.5厘米的高架上。在检测时，每只小鼠置于四条臂的中央区域，面向任意一条开放臂，之后检测小鼠在五分钟的自由活动时间内在各条臂的时间和进入各条臂的总次数。进入任意一条臂定义为小鼠的全部四肢进入该臂。在小鼠进入四条臂的总次数无差异的前提下，若在闭合臂内停留的时间越长，而代表焦虑。实验结果见附图1。
实施例42ZLc-002免疫共沉淀实验
取小鼠右侧海马置于100mM HEPES（含200mM NaCl，10%glycerol，2mM NaO4P2O7，2mM DTT，1mM EDTA，1mM benzamidine，0.1mM Na3VO4，1μM pepstatine，10μg/mLaprotinine，10μg/mL leupeptin and10μM phenylmethylsulfonyl fluoride）中，冰浴上迅速匀浆。匀浆完毕后将样品置于冰浴上裂解15min，4℃离心机12000×g离心15min，小心吸取上清即为蛋白提取液。将上述提取的蛋白上清加到beads和抗体中，4℃振摇过夜。第二天用PBS洗蛋白-抗体-Beads复合物，重复洗三次，每次洗时4℃摇动5min，最后一次要尽量弃净上清，并将蛋白-抗体-Beads复合物重悬至50μL PBS中。进而进行Western blot分析，结果见附图2。
Claims (3)
1.一类N-酰基化的氨基酸烷基酯，其结构符合通式(I)：
其中，R1为甲基、乙基、丙基、异丙基；R2为异丙基、异丁基；R3为羧基的甲酯、乙酯、丙酯、异丙酯、冰片基酯、5-四氮唑基。
2.如权利要求1所述的化合物在制备解除nNOS与Capon蛋白之间偶联的药物中的应用。
3.权利要求1中所述的化合物在制备焦虑症药物中的应用。
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