CN103705499B

CN103705499B - 二羧酸及其酯类化合物的应用

Info

Publication number: CN103705499B
Application number: CN201310687692.7A
Authority: CN
Inventors: 厉廷有; 丁屹; 蔡鋆鑫; 常磊; 李飞; 朱东亚
Original assignee: Nanjing Medical University
Current assignee: Nanjing Medical University
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: CN103705499A

Abstract

二羧酸及其酯类化合物的应用，具体来说为化合物在制备用于神经保护药物中的应用，其中，R₁为氢或甲基，R₂为异丙基、异丁基，R₃为羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、冰片氧基羰基、5-四氮唑基，a=0或1，b=0或1，c=1～4的整数，当a=0时b=0，a=1时b=0或1。本发明中的化合物对谷氨酸诱导的神经元损伤有较强的保护作用。

Description

二羧酸及其酯类化合物的应用

技术领域

本发明属于制药领域，提供一类二羧酸及其酯类化合物在制备神经保护药物中的应用。

背景技术

神经保护剂是缺血性脑卒中治疗药物研制的一个热点。目前，针对脑梗死级联反应不同环节开发的众多保护试剂，除自由基清除剂依达拉奉外，都是动物有效，临床无效或效果很差，或因严重副作用而不能应用于临床。因此，新型神经保护剂的开发和筛选是目前研究的重点。

脑缺血发生时谷氨酸大量释放。大量释放的谷氨酸激活N-甲基天冬氨酸（NMDA）受体，从NMDA受体内流的钙离子激活锚定在NMDA受体附近的神经元一氧化氮合酶(nNOS)，从而生成大量NO，继而引发脑缺血瀑布，引起脑缺血损伤。nNOS过度激活之后大量生成的一氧化氮(NO)在缺血性脑卒中起重要作用。因此，抑制nNOS的过度激活或阻断nNOS和下游信号分子之间的信号传递在病理条件下具有神经保护作用。

神经元一氧化氮合酶相关蛋白（NOS1AP）是nNOS的接头蛋白。nNOS和NOS1AP连接之后，NOS1AP可以进一步和Dexras或syntrophin等蛋白形成三元复合物。nNOS产生的NO通过激活间接偶联的Dexras或syntrophin发挥药理学作用。在专利201310062554.X中，我们报道了一类具有新药理性学机制的新型抗焦虑化合物，该类化合物通过抑制nNOS和NOS1AP之间的偶联从而抑制NO信号向下传递而发挥抗焦虑作用。应用谷氨酸诱导的神经细胞损伤模型，我们发现这类化合物具有神经保护作用。最近，CourtneyMJ等报道，利用表达的nNOSPDZ结构域和NOS1AP竞争结合从而抑制天然nNOS和NOS1AP的结合，或利用Tat-YAGQWGESV(Tat连接的nNOSPDZ配体)和nNOSPDZ结合从而抑制NOS1AP和nNOS的偶联均具有神经保护作用（J.Neurosci.,2013,33,8185-8201）。他们的工作为我们化合物的神经保护作用提供了良好的理论基础。

谷氨酸在脑缺血引起的细胞损伤中起重要作用。神经细胞的损伤导致乳酸脱氢酶（LDH）释放到细胞外，通过测定药物抑制LDH的漏出率可评价药物对神经元细胞的保护作用。

基于谷氨酸刺激的神经元细胞乳酸脱氢酶（LDH）释放模型，我们对201310062554.X报道的部分化合物进行了神经保护活性分析，结果发现其中的一些化合物具有良好的神经细胞保护作用。

发明内容

解决的技术问题：提供一类二羧酸及其酯类化合物在制备神经保护药物中的应用。

技术方案：化合物其中R₁为氢或甲基，R₂为异丙基、异丁基，R₃为羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、冰片氧基羰基、5-四氮唑基，a=0或1，b=0或1，c=1～4的整数，当a=0时b=0，a=1时b=0或1在制备用于神经保护药物中的应用。

化合物其中R₁为氢或甲基，R₂为异丙基、异丁基，R₃为羧基、甲氧基羰基、乙氧基羰基、丙氧基羰基、异丙氧基羰基、冰片氧基羰基、5-四氮唑基，a=0或1，b=0或1，c=1～4的整数，当a=0时b=0，a=1时b=0或1在保护神经中的应用。

化合物在制备用于神经保护药物中的应用。

本发明中的化合物为已知化合物，其合成如下式所示，具体合成过程参照专利201310062554.X描述的方法进行。

本发明涉及的化合物的合成可由下述合成示意路线表示。

合成示意路线：

合成示意：化合物1-6、13-18合成路线

合成示意：化合物7-12合成路线

有益效果：

本发明中的化合物对谷氨酸诱导的神经元损伤有较强的保护作用。

附图说明

图1：N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）（1）的抗脑卒中作用。

具体实施方式

化合物具体合成过程参照专利201310062554.X描述的方法进行。

实施例1化合物对于谷氨酸诱导原代神经元细胞损伤的保护作用

实验原理：

本实验采用乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase,LDH）测定法。LDH存在于细胞内，正常情况下胞外含量较少，当细胞受损伤时，LDH会释放到胞外，因此检测LDH的漏出率即可判定细胞受损伤程度。LDH能催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸与2,4-二硝基苯肼反应生成丙酮酸二硝基苯腙，在碱性溶液中呈棕红色，通过比色可求出酶活力。

小鼠皮层原代神经元的提取：

取孕龄为15-16天的ICR孕小鼠，颈椎脱臼后，将子宫与胎盘分离，依次将取出的胎鼠置于0.1%的新洁尔灭溶液、75%酒精消毒。左手固定胎鼠，右手用眼科镊将颅盖骨分离，露出大脑半球，用眼科镊小心夹取两侧大脑皮层，置于放有10mLD-hanks的平皿中。全部取完后，剥去脑膜置于另外一个放有10mLD-hanks的平皿中，然后再吸取5mLD-hanks洗涤一次。用弯镊将皮层剪碎，取出置于37℃孵箱的0.125%的胰酶（2mL0.25%胰酶+2mLD-hanks）加到平皿中，再转移至小烧杯中，混匀后，在孵箱中消化10min。从孵箱取出后，加入5mLDMEM+10%wtFBS终止消化，吹打混匀后，转移至离心管中，1500rpm，离心5min。弃去上清，再加入4mLDMEM+10%wtFBS，吹打混匀后，再次离心，1500rpm，5min。将上清弃去，加入2mL神经元培养基（98mLNeurobasalMedium，2mLB27，50μmol/lL-glutamine400μL，青霉素50μL，链霉素50μL），吹打使细胞分散，过400目筛。稀释10倍后，进行细胞计数，然后进行接种，24孔板每孔接种300μL，标记好后置于孵箱中培养。一天后换培养基，吸走120μL，再加450μL。第四天再次换液，吸走200μL，再加300μL。第七天，谷氨酸造模。

谷氨酸损伤模型：

先将24孔板每孔定容至300μL，然后每孔给药0.3μL，每一个药物浓度设3个平行孔，半小时后，每孔再给Glu3μL和Gly3μL，期间观察细胞状态，半小时后全量换液，置于孵箱8h后收集培养基（胞外）。再用PBS洗涤两次后，加入300μL双蒸水，然后于-80℃反复冻融3次后收集（胞内）。-20℃保存。

LDH漏出率的测定：

表1漏出率测定的操作步骤

加完NaOH溶液后再次混匀，将样品分别加入到96孔板，每孔200μL，然后在酶标仪上测定440nm时的各孔吸光度。

漏出率=胞外测定值/（胞外测定值+胞内测定值）×100%

结果评价依据：

根据下述公式计算化合物对谷氨酸诱导的神经元细胞损伤的抑制率：

抑制率=(谷氨酸组漏出率-化合物组漏出率)/(谷氨酸组漏出率-对照组漏出率)×100%

化合物的抑制率为三个平行孔测定值的平均值。

结果：

表2化合物1-6LDH漏出抑制率

ZL006是一种新型神经保护剂，是PSD95-nNOS偶联的抑制剂。ZL006通过抑制nNOS与PSD95的偶联从而降低nNOS避免在病理条件下被过度激活从而起神经保护作用（Nat.Med.,2010,16,1439-1443）。我们以ZL006作为阳性对照药物。由表2可知，化合物1和2在测试的浓度范围内（10^-7～10^-5nM）有良好的体外神经保护作用。化合物1在测试的范围内神经保护作用比较稳定，化合物2在低浓度下（10^-7nM）保护作用约是ZL006的2倍，但随浓度提供保护作用变弱。其他化合物3-6要么具有神经毒性，要么药理性质不稳定。

表3化合物7-12LDH漏出抑制率

由表3可知，此系列化合物除9具有弱的神经保护作用外其他化合物多具有神经毒性。

表4化合物13-18LDH漏出抑制率

由表4可知，此系列化合物13和15在测试的浓度范围内具有较强的神经保护作用，化合物16保护作用较弱，化合物14，18随浓度增加有神经毒性，化合物17在低浓度有神经毒性。

我们以在测试浓度范围内神经保护作用较强且稳定的化合物1进行了大鼠体内的神经保护研究。

实施例2N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）（1）在动物模型上的神经保护作用

N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（ZLc-002）的制备：

-15℃下将1.50g(9mmol)D-缬氨酸甲酯盐酸盐加入到35mL二氯甲烷中溶解，滴加2.03mL（18.45mmol）N-甲基吗啉，滴完后搅拌5分钟，再滴加1.02mL(9.45mmol)丙二酸单甲酯酰氯，搅拌30分钟，然后30℃继续搅拌22小时。停止反应，将溶剂蒸干，加水8mL，乙酸乙酯50mL×4次萃取，10%wt柠檬酸25mL×2次洗涤，饱和氯化钠洗涤，之后5%wt碳酸氢钠25mL×2次洗涤，再用饱和氯化钠洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液蒸干，浓缩液呈黄色。用流动相（乙酸乙酯：石油醚=1:2，体积比）进行柱层析，最终得到黄色液体1.03g，产率49.5%。Rf=0.5(乙酸乙酯:石油醚=1:2，碘显色)。¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ(ppm):0.96(t，6H，J=6.48Hz)，2.20(s，1H)，3.37(s，2H)，3.75(s，3H)，3.77(s，3H)，4.56(s，1H)，7.52(s，1H).

脑缺血模型的制备：

采用颈内动脉线栓法制备大脑中动脉阻塞（Middlecerebralartery,MCAO）脑缺血再灌注模型。动物用10％水合三氯乙醛（4.0mL/kg）麻醉后，仰卧位固定于手术台上，消毒皮肤，颈部正中切开，分离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，轻轻剥离迷走神经，结扎并剪断颈外动脉，循颈内动脉向前，结扎翼腭动脉。夹闭颈总动脉近心端，从颈外动脉的结扎线的远端作一切口，插入外径为0.285mm的尼龙线，顶端经过抛光和润滑处理，经过颈总动脉分叉进入颈内动脉，然后徐徐插入至有轻微阻力为止（自分叉处约20mm），阻断大脑中动脉的所有血供，脑缺血2.0小时后，轻轻拔出尼龙线，恢复血供并即刻通过尾静脉注射药物，缝合颈部皮肤，消毒。整个手术过程中使用大鼠加热板维持大鼠直肠温度37.0±0.5℃。

神经保护作用的评价：

动物在恢复血供24小时后用10％wt的水合氯醛麻醉，断头取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，用生理盐水冲洗大脑表面血迹，吸去表面残留水迹，于-80℃放置7min，取出后立即于视线交叉平面垂直向下作冠状切面，并向后每隔2mm切一片，将脑片置于用PBS（0.2mol/L，pH7.4～7.8）新鲜配制的TTC（20g/L）染液中于37℃温育90min，正常脑组织染成深红色，缺血脑组织则呈苍白色，用生理盐水冲洗后，迅速将脑片从前向后按顺序排列，吸干表面残留水迹，拍照。比对模型组和给药组的梗死面积，评价药物的神经保护作用。

实验结果见附图1，结果显示N-(2-甲氧羰基乙酰基)-D-缬氨酸甲酯（1）5mg/Kg静脉给药后，小鼠的脑梗死区比模型组的梗死面积明显减少。

Claims

1.R构型化合物在制备治疗脑卒中引起的神经元损伤药物中的应用。