CN107298648A - 一类大黄酸硫代酰胺类化合物、其制备方法及用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一类具有如下结构通式的大黄酸硫代酰胺类化合物，同时本发明提供了其制备方法和用途，其制备方法简单，所述大黄酸硫代酰胺类化合物可以同时提高体内H2S水平，并抑制破骨细胞的形成。

Description

一类大黄酸硫代酰胺类化合物、其制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一类大黄酸硫代酰胺类化合物、其制备方法及用途。
背景技术
现阶段骨质疏松症已成为全球性的公共健康问题，据统计，全球有超过2亿的人口患有骨质疏松症，约50％的妇女和30％的50岁以上老年男性会发生因骨质疏松症导致的脆性骨折，严重影响中老年人的身体健康，降低生活质量和寿命，增加家庭及国家的财力与人力负担。
大黄酸(Rhein)，化学名为1,8-二羟基-3-羧基蒽醌，来源于大黄、何首乌等多种植物的根茎等部位，近年来，大黄酸及其衍生物因其具有抗菌抗肿瘤抗炎作用及对消化系统、肾脏、心血管系统、骨代谢系统等方面的药理作用而受到广泛关注(李晓红等，大黄酸及其衍生物药理作用研究新进展，现代药物与临床，2010，25(6)，417-452)。大黄酸具有多羟基蒽醌的核心结构，目前已知多种天然产物含有该核心结构，如大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素等系列化合物。具有这种特征结构的化合物往往具有多种生物活性，如二乙酰大黄酸—双醋瑞因已经在多个国家上市，用于骨关节炎的治疗，其耐受性好，安全性能高；芦荟大黄素通过阻断诱导型氮氧化物合酶(iNOS)和环加氧酶-2(COX-2)的mRNA表达而抑制炎症反应(ParkMY等，Biosci.Biotechnol.Biochem.,2009,73:828-832)；大黄酸酰胺类衍生物在不影响细胞生长的情况下有效抑制小鼠原代破骨细胞的活性、形成及其骨吸收功能，可以用于防治破骨细胞活性异常导致的如骨质疏松症等疾病(Xing Xu等，Eur.J.Med.Chem.2016,123:769-776)。
硫化氢(H2S)是继一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后被发现的第三种内源性气体信号分子，在机体中发挥着重要的生理功能，胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)是调节H2S体内释放的关键酶，研究发现，绝经后小鼠血清和骨髓中的CBS、CSE的水平大幅降低，通过提高体内的H2S量，骨形成及骨小梁面积均大幅提高(Rancesco Grassi等，J.Bone.Miner.Re.2015,31:949-963)。现阶段外源性H2S供体主要为硫化盐，包括硫氢化钠(NaHS)、硫化钠(Na2S)、硫化钙(CaS)和GYY4137等,它们可以在生理缓冲液中快速释放出HS-和H2S，但是，长期使用可能会造成组织细胞的毒性损伤，限制了它们的临床应用。临床上迫切需要新的更高效更特异的外源性H2S供体用于骨代谢性疾病的治疗。
发明内容
本申请保留了大黄酸多羟基蒽醌类的母体结构，在羧酸位引入磺酰胺活性基团，形成一类新型的，具有独特生理活性的大黄酸硫代酰胺类化合物。
一类具有如下结构通式的大黄酸硫代酰胺类化合物：
其中，
R1为氢或乙酰基；
R2和R3各自独立的选自氢、直链或支链C1～C6烷基、苯基、吡啶基、噻吩基；或者R2、R3和它们连接的氮原子一起形成被C5～C6饱和杂环基取代的C5～C6饱和杂环基，所述C5～C6饱和杂环基含有1～3个选自O、S、N的杂原子。
优选的，
R1为氢或乙酰基；
R2和R3各自独立的选自氢、甲基、乙基、苯基、2-吡啶基、3-噻吩基；或者R2、R3和它们连接的氮原子一起形成4-(吗啉-1-基)-1-哌啶基。
更优选的，所述大黄酸硫代酰胺类化合物具体选自如下的化合物：
本发明还提供了所述大黄酸硫代酰胺类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将大黄酸(化合物A)溶于醋酸酐溶液中，加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)，加入三乙胺，在室温下反应0.5～2h后，滴加HCl，得到化合物B；
(2)向化合物B中加入二氯甲烷和DMF，然后滴加二氯亚砜，反应1～3h后，然后加入氨水，得到化合物C；
(3)向化合物C中加入1，4-二氧六环和劳森试剂，反应6～10h后，得到化合物D；
(4)向化合物D中加入溶剂，然后加入LiOH，反应0.5～2h，得到化合物E；
其中，R2和R3的定义如前所述。
更具体的制备方法可以包括步骤：
(1)将大黄酸(化合物A)溶于醋酸酐溶液中，在室温搅拌条件下缓慢加入DMAP(4-二甲氨基吡啶)，反应液中有固体出现，然后再缓慢滴加三乙胺，固体溶解，在室温下快速搅拌0.5～2h后，滴加HCl，溶液中又有固体出现，加水猝灭反应，对反应液进行抽滤、洗涤后得到化合物B；
(2)向化合物B中加入二氯甲烷和DMF，之后将反应体系置于50～70℃油浴中，缓慢滴加二氯亚砜，反应液中固体溶解，反应进行1～3h后，将反应液冷却至室温，然后加入氨水，反应液中有大量絮状物产生，对反应液进行抽滤、洗涤，干燥后得到化合物C；
(3)向化合物C中加入1，4-二氧六环和劳森试剂，在氮气保护条件下加热回流，反应物溶解后反应液颜色变深；6～10h后猝灭反应，旋干溶剂，二氯甲烷萃取，水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩后得到化合物D；
(4)向化合物D中加入溶剂，然后加入LiOH，在35～55℃条件下反应0.5～2h，反应结束后旋干溶剂，二氯甲烷萃取，水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩后得到化合物E；
其中，R2和R3的定义如前所述。
步骤(4)中的溶剂可以为甲醇等。
步骤(1)和(2)的反应条件也可以参照European Journal of MedicinalChemistry 2016,vol.123,769-776；步骤(3)的反应条件也可以参照SYNLETT,2011,vol.19,2807–2810。
本发明还提供了所述大黄酸硫代酰胺类化合物提高体内H2S水平的用途，所述大黄酸硫代酰胺类化合物可用于制备提高体内H2S水平的药物。
本发明还提供了所述大黄酸硫代酰胺类化合物抑制破骨细胞形成的用途，所述大黄酸硫代酰胺类化合物可用于制备抑制破骨细胞形成的药物。
本发明研究发现，所述大黄酸硫代酰胺类化合物可以同时提高体内H2S水平，并抑制破骨细胞的形成。
本发明还提供了所述大黄酸硫代酰胺类化合物在制备预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病的药物中的用途，所述破骨细胞活性异常导致的疾病包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s骨病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏等。
附图说明
图1为不同浓度的化合物D1干预骨髓破骨前体细胞破骨分化，分化结束后的TRAP染色图；
图2为化合物D1对对破骨分化及破骨行使功能时关键基因mRNA影响的柱状图；
图3为化合物D1、E7与假手术组(SHAM组)、去卵巢模型组(OVX组)比较，对小鼠血清H2S水平均影响的柱状图。
具体实施方式
制备实施例
制备实施例1 3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(化合物D1)
a.将大黄酸(10g,0.035mmol)溶于醋酸酐溶液中，在室温搅拌条件下缓慢加入DMAP(2.15g,0.018mmol)，反应液中有固体出现，然后再缓慢滴加三乙胺(9.7mL,0.07mmol)，固体溶解，在室温下快速搅拌1h后，滴加1M HCl，溶液中又有固体出现，加水猝灭反应。对反应液进行抽滤、洗涤后得粗品，粗品进行重结晶即可得黄色粉末固体化合物B，产率95％；
b.将步骤a所得化合物B(5g,13.58mmol)置于圆底烧瓶中，加入二氯甲烷和DMF，之后将反应体系置于55℃油浴中，缓慢滴加二氯亚砜(1.23mL,16.97mmol)，反应液中固体溶解，反应进行2h后，将反应液冷却至室温，然后加入氨水，反应液中有大量絮状物产生，对反应液进行抽滤、洗涤，干燥后得到黄色粉末固体化合物C1，产率95％；
c.将步骤b所得化合物C1(1.2g,3.27mmol)置于双口圆底烧瓶中，然后加入1，4-二氧六环和劳森试剂(2.65g,6.54mmol)，在氮气保护条件下加热回流，反应物溶解后反应液颜色变深；8h后猝灭反应，旋干溶剂，二氯甲烷萃取，水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗产，粗品经柱层析得到黄色粉末，称为化合物D1，产率30％。
1H-NMR(400MHz,DMSO-d 6)10.31(s,1H),9.97(s,1H),8.51(s,2H),8.12(s,1H),7.95(d,J＝7.9Hz,1H),7.64(s,1H),2.39(d,J＝3.4Hz,6H)；13C-NMR(100MHz,DMSO-d6)δ196.61,180.93,180.22,169.02,168.96,149.54,149.14,144.36,135.42,134.19,133.84,130.62,128.12,126.25,125.22,124.97,123.18,20.80,20.77.
制备实施例2(化合物E1)
将制备实施例1制得的化合物D1置于圆底烧瓶中，甲醇作为溶剂，然后加入LiOH，在40℃条件下反应1h，反应结束后旋干溶剂，二氯甲烷萃取，水洗涤，经无水硫酸钠干燥，浓缩后得到粗产品，粗品经柱层析得到铁红色粉末，得到化合物E1，产率90％。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),10.33(s,1H),9.98(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.95(t,J＝12.9Hz,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H).
制备实施例3(化合物D2)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为二甲胺水溶液。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)8.51(s,1H),8.12(d,J＝8.1Hz,1H),7.96(s,1H),7.93(t,J＝8.1Hz,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),3.00(s,6H),2.40(s,3H),2.38(s,3H)..
制备实施例4(化合物E2)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D2，得到化合物E2。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.95(t,J＝8.1Hz,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),3.00(s,6H).
制备实施例5(化合物D3)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为N-乙基甲基胺。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.96(s,1H),7.93(t,J＝8.1Hz,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),3.34(q,J＝4.2Hz,2H),3.00(s,6H),2.40(s,3H),2.38(s,3H),1.17(t,J＝4.2Hz,3H).
制备实施例6(化合物E3)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D3，得到化合物E3。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.95(t,J＝12.9Hz,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),3.35(q,J＝4.2Hz,2H),3.04(s,6H),2.42(s,3H),2.38(s,3H),1.17(t,J＝4.2Hz,3H).
制备实施例7(化合物D4)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为苯胺。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),7.96(s,1H),7.93(t,J＝8.1Hz,1H),7.72(m,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),6.81(t,J＝8.5Hz,1H),6.43(d,J＝7.8Hz,1H),4.00(s,1H),2.40(s,3H),2.38(s,3H).
制备实施例8(化合物E4)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D4，得到化合物E4。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.95(t,J＝8.1Hz,1H),7.73(m,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),6.81(t,J＝8.5Hz,1H),6.43(d,J＝7.8Hz,1H),4.00(s,1H).
制备实施例9(化合物D5)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为2-氨基吡啶。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(d,J＝7.3Hz,1H),7.96(s,1H),7.93(t,J＝8.1Hz,1H),7.72(m,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),6.62(m,1H),6.53(d,J＝7.8Hz,1H),4.00(s,1H),2.40(s,3H),2.38(s,3H).
制备实施例10(化合物E5)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D5，得到化合物E5。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.97(s,1H),7.95(t,J＝8.1Hz,1H),7.73(m,1H),7.64(d,J＝8.1Hz,1H),6.62(m,1H),6.53(d,J＝7.8Hz,1H),4.00(s,1H).
制备实施例11(化合物D6)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为3-氨基噻吩。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ8.51(s,1H),8.12(d,J＝8.4Hz,1H),8.07(d,J＝7.3Hz,1H),7.98(s,1H),7.96(s,1H),7.91(t,J＝8.1Hz,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),7.48(d,J＝8.4Hz,1H),4.00(s,1H),2.40(s,3H),2.38(s,3H).
制备实施例12(化合物E6)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D6，得到化合物E6。
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ12.15(s,1H),12.07(s,1H),8.53(s,1H),8.14(d,J＝8.1Hz,1H),7.98(s,1H),7.96(s,1H),7.91(t,J＝8.1Hz,1H),7.63(d,J＝8.1Hz,1H),7.48(d,J＝8.5Hz,1H),4.00(s,1H).
制备实施例13(化合物D7)
参照制备实施例1中的方法，将步骤b的氨水替换为4-(4-哌啶基)吗啉。
1H NMR(300MHz,CDCl3)7.87(t,J＝7.3Hz,1H),7.73(dd,J＝14.5,6.8Hz,2H),7.35(d,J＝8.4Hz,1H),7.19(s,1H),3.97(d,J＝13.5Hz,1H),3.77(t,J＝4.5Hz,4H),3.35(m,J＝30.1,18.8,7.2Hz,2H),2.61(p,J＝11.3Hz,5H),2.44(s,3H),2.42(s,3H),2.39(d,J＝3.4Hz,6H),2.13(d,J＝13.2Hz,1H),1.89(d,J＝11.6Hz,1H),1.86–1.75(m,1H),1.58(d,J＝9.5Hz,1H),1.35(s,1H)
制备实施例14(化合物E7)
参照制备实施例2的方法，将化合物D1替换为D7，得到化合物E7。
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ12.13(s,1H),12.02(s,1H),7.84(t,J＝7.3Hz,1H),7.71(dd,J＝14.5,6.8Hz,2H),7.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.17(s,1H),3.95(d,J＝13.5Hz,1H),3.75(t,J＝4.5Hz,4H),3.33(m,J＝30.1,18.8,7.2Hz,2H),2.59(p,J＝11.3Hz,5H),2.10(d,J＝13.2Hz,1H),1.88(d,J＝11.6Hz,1H),1.84–1.73(m,1H),1.57(d,J＝9.5Hz,1H),1.33(s,1H)；13C NMR(125MHz,CDCl3)δ195.69,192.28,181.08,162.80,162.66,150.85,137.43,134.18,133.50,124.94,120.18,115.73,115.34,67.16,60.80,50.93,49.90,47.90,29.2
测试实施例
1、主要实验材料与仪器
材料：胎牛血清、ɑ-MEM培养基、青霉素/链霉素购自Gibco，DMSO，MTT，TRAP染色试剂盒购自sigma，H2S检测试剂盒购自南京建成，细胞因子如M-CSF和mRANKL购自peprotech，细胞裂解液购自promega，PBS购自WISENT公司，RNAiso Reagent、反转录和PCR试剂盒购自TaKaRa公司，4周龄C57BL/6小鼠购自斯莱克。
细胞株：骨髓破骨前体细胞，取自C57BL/6小鼠股骨与胫骨髓腔细胞正常传代，培养时采用完全培养基，即α-MEM+10％胎牛血清+1％青霉素/链霉素。
仪器:Thermo scientific公司CO2培养箱；Olympus倒置显微镜；Tecan公司酶标仪。
2、实验方法：
1)受试细胞株的制备：
C57BL/6小鼠断颈处死，75％酒精浸泡消毒，无菌条件下剥离四肢长骨(股骨、胫骨)，去除附着的软组织，纵向切开长骨，轻刮骨髓腔，用完全培养基反复冲洗骨髓腔内表面，使骨髓破骨前体细胞彻底脱落，细胞悬液用200目细胞筛过滤，细胞定量后接种于24孔培养板内(1mL/孔)，于5％CO2和饱和湿度条件下培养过夜，次日换含1×10-8mol·L-1新鲜的完全培养基。
2)MTT法检测大黄酸硫代酰胺类化合物对骨髓破骨前体细胞存活率的影响：
骨髓破骨细胞前体细胞以每孔5000个的浓度接种到96孔板，每孔100μL，培养过夜。设置实验组和阴性对照组；其中，实验组：将大黄酸硫代酰胺类化合物以培养基(含30ng/mLM-CSF和50ng/mLRANKL)配制成浓度10μmol/L，每孔加入100μL；阴性对照组：每孔加入等量培养基(含30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL)。培养48h后，每孔加入MTT(5g·L－1)20μL，反应2h后，小心甩去培养液，每孔加入100μLDMSO，震荡10分钟充分溶解，酶标仪在492nm波长检测吸光度值，计算细胞存活率，存活率(PR％)＝吸光度值(实验组)/吸光度值(阴性对照组)×100％。
3)大黄酸硫代酰胺类化合物破骨细胞Trap活性测试：
骨髓破骨细胞前体细胞以每孔5000个的浓度接种到96孔板，每孔100μL，培养过夜。将大黄酸硫代酰胺类化合物(化合物D1-D7，E1-E7)分别以培养基(含30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL)配制成浓度10μmol/L，每孔加入100μL，阴性对照组每孔加入等量培养基(含30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL)，空白对照组每孔加入等量培养基(含30ng/mL M-CSF)。骨髓破骨前体细胞培养5天后弃培养液，PBS轻洗3次，然后按照TRAP酶活性检测试剂盒说明书进行操作，在530nm处测定吸光度值，最后换算出酶活力。以96孔培养板的1孔细胞在37℃与底物作用，1min产生1nmol的游离酚表示1个酶活力单位。抑制率(PR％)＝【酶活力(阴性对照组)－酶活力(实验组)】/【酶活力(阴性对照组)－酶活力(空白对照组)】×100％
4)3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)对骨髓破骨前体细胞形成影响的测试(TRAP染色法)：
将骨髓破骨细胞前体细胞以每孔5000个的浓度接种到96孔板，每孔100μL，加入3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)使其终浓度分别为1、5、10μmol·L-1，置于5％CO2，37℃孵育箱中预孵育4天，每隔2天换液(吸掉旧培养基，补充100μL含相同浓度药物新培养基)。4天后破骨细胞出泡，PBS洗2次，10％多聚甲醛固定5分钟，然后用PBS洗1次，晾干。在含有0.8mol·L-1pH5.0醋酸钠缓冲液，0.1g L-1萘酚AS-BI磷酸盐，0.6gL-1坚牢石榴红GBC盐，0.2mol·L-1酒石酸溶液中反应15分钟，经乙醇梯度脱水，以≥3个细胞核为破骨细胞样细胞计数。
5)大黄酸硫代酰胺类化合物对破骨细胞分化过程相关基因影响的分析(实时荧光定量PCR(D1-PCR))：
将骨髓破骨细胞前体细胞以每孔8×104个的浓度接种到6孔板，每孔2mL，实验组加入3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)使其终浓度分别为10μmol·L-1，阴性对照组每孔加入等量培养基(含30ng/mL M-CSF和50ng/mL RANKL)，空白组每孔加入等量培养基(含30ng/mL M-CSF，不含RANKL)，置于5％CO2，37℃孵育箱中预孵育4天，每隔2天换液。于药物培养3天后提取总RNA，Real-time RT-PCR法检测TRAP和CTSK的表达水平。引物由TaKaRa公司合成。总RNA的提取采用Trizol一步法进行，紫外分光光度计检测纯度并调整浓度至50ng·μL-1，反转录体系、PCR扩增体系及反应条件均参照试剂盒说明书设定，经内参校正，求得目的基因的相对表达量。
6)大黄酸硫代酰胺类化合物体内释放H2S水平测试：
成年清洁级雌性健康未交配的SD大鼠30只，6个月龄，体重为(250±20)g，购自斯莱克，实验分为假手术组(SHAM组)、去卵巢模型组(OVX组)和D1给药组、E7给药组各10只。大鼠适应性喂养1周后，于术前禁食过夜，自由饮水。假手术组大鼠进行假手术，不切除双侧卵巢。去卵巢模型组大鼠用3.6％水合氯醛(按10ml/kg体重)通过腹腔注射麻醉，仰面固定在木板上，常规消毒，腹正中切口找到子宫，沿每侧子宫找到输卵管和卵巢分离周围组织，结扎后完整摘切除双侧卵巢；大鼠自然清醒，术后用青霉素(4万单位/只/天)腹腔注射3天。给药组大鼠在卵巢切除后口服注射用生理盐水溶解的化合物D1和E7(20μmol/kg)。假手术组和去卵巢模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。连续给药4周后，通过眼眶睬血1ml，取血清后用硫化氢检测试剂盒(南京建成)立即检测H2S水平。
3、结果：
(1)本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物对骨髓破骨前体细胞的毒性作用研究。
选择10μM的本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物与骨髓破骨前体细胞进行共孵育，并通过MTT对存活细胞进行检测，结果如表1所示。试验结果表明：本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物D1、D4、D5、D6、D7、E1、E4、E5、E6、E7对骨髓破骨前体细胞无明显毒性。
表1.大黄酸硫代酰胺类化合物对骨髓破骨前体细胞的存活的影响
(2)本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物对破骨细胞分化的TRAP活性的抑制作用研究
通过上述毒性试验结果，我们选取10μM上述对骨髓破骨前体细胞无明显毒性的大黄酸硫代酰胺类化合物进行试验，并通过M-CSF和mRANKL对骨骨髓破骨前体细胞进行破骨分化的诱导，检测大黄酸硫代酰胺类化合物对分化过程中TRAP活性的影响。如表2所示，结果表明：本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物D1、D7、E1、E7对骨髓破骨细胞分化过程中的TRAP活性有着非常好的抑制作用，其中化合物D1对TRAP活性的抑制率达到96.7％。
表2.大黄酸硫代酰胺类化合物对骨髓破骨前体细胞分化TRAP活性的抑制
作用
选取对TRAP活性抑制作用最优的大黄酸硫代酰胺类化合物D1进一步生物活性研究。
(3)本发明的3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)对破骨细胞形成的影响
选取不同浓度的化合物D1干预骨髓破骨前体细胞破骨分化，分化结束后通过TRAP对破骨细胞进行染色，并以≧3个细胞核为破骨细胞样细胞计数，如图1和表3所示，试验结果表明：本发明的大黄酸硫代酰胺类化合物D1能有效浓度依赖性地抑制破骨细胞的形成。
表3.D1对破骨细胞形成数量的影响
(4)本发明的3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)对破骨细胞特异性mRNA表达的影响结果。
选取对TRAP活性抑制作用最优的大黄酸硫代酰胺类化合物D1，干预骨髓破骨前体细胞破骨分化，研究大黄酸硫代酰胺类化合物D1对破骨分化及破骨行使功能时关键基因mRNA的影响。如图2所示，试验结果表明：本发明的化合物D1在10μM浓度下能有效抑制破骨细胞分化及骨吸收关键基因如TRAP，Cathepsin K的表达。
(5)本发明的3-甲基磺酰胺-9,10-二氧代-9,10-二氢化蒽-1,8-二乙酸酯(D1)对去卵巢小鼠血清H2S浓度的影响结果。
如图3所示，与假手术组(SHAM组)比较，去卵巢模型组(OVX组)小鼠血清H2S水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢模型组比较，D1、E7组血清H2S水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.0001)。

Claims (8)

1.一类具有如下结构通式的大黄酸硫代酰胺类化合物：
其中，
R1为氢或乙酰基；
R2和R3各自独立的选自氢、直链或支链C1～C6烷基、苯基、吡啶基、噻吩基；或者R2、R3和它们连接的氮原子一起形成被C5～C6饱和杂环基取代的C5～C6饱和杂环基，所述C5～C6饱和杂环基含有1～3个选自O、S、N的杂原子。
2.如权利要求1所述的大黄酸硫代酰胺类化合物，其特征在于：
R1为氢或乙酰基；
R2和R3各自独立的选自氢、甲基、乙基、苯基、2-吡啶基、3-噻吩基；或者R2、R3和它们连接的氮原子一起形成4-(吗啉-1-基)-1-哌啶基。
3.如权利要求1所述大黄酸硫代酰胺类化合物，其具体选自如下的化合物：
4.权利要求1～3中任一项所述大黄酸硫代酰胺类化合物的制备方法，其包括如下步骤：
(1)将大黄酸溶于醋酸酐溶液中，加入DMAP，加入三乙胺，在室温下反应0.5～2h后，滴加HCl，得到化合物B；
(2)向化合物B中加入二氯甲烷和DMF，然后滴加二氯亚砜，反应1～3h后，然后加入氨水，得到化合物C；
(3)向化合物C中加入1，4-二氧六环和劳森试剂，反应6～10h后，得到化合物D；
(4)向化合物D中加入溶剂，然后加入LiOH，反应0.5～2h，得到化合物E；
其中，R2和R3的定义与相对应的权利要求中相同。
5.权利要求1～3中任一项所述大黄酸硫代酰胺类化合物提高体内H2S水平的用途。
6.权利要求1～3中任一项所述大黄酸硫代酰胺类化合物抑制破骨细胞形成的用途。
7.权利要求1～3中任一项所述大黄酸硫代酰胺类化合物在制备预防和/或治疗破骨细胞活性异常导致的疾病的药物中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，所述破骨细胞活性异常导致的疾病包括骨质疏松症、类风湿性关节炎、牙周炎、牙齿脱落、Paget’s骨病、佝偻病、骨巨细胞瘤、骨髓瘤骨病以及癌症骨转移造成的骨破坏。
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