JP6381605B2 - 脳卒中治療用のイリドイド配糖体類化合物、その医薬組成物及びその使用方法 - Google Patents
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Description
本発明は、化合物に関し、特にイリドイド配糖体類化合物及びその医薬組成物に関する。
脳卒中は、台湾の死因トップ１０における第３位であり、ＷＨＯにより「世界第２位の死因」として記入される。全世界で、２００５年に５８０万人が脳卒中で死亡したが、２０１５年に６５０万人が脳卒中で死亡すると予想される。台湾は、既に高齢化の社会構造となり、高齢化が脳卒中疾患を引き起こすリスク要因である。台湾本土の脳卒中センターによる健康医療データによると、８０歳以上の老人の脳卒中になるリスクが３０歳以下の若者の３８４倍である。
脳卒中とは、脳部への血液供給の異常により、脳部機能が快速に発展して喪失することである。医学上、脳血管障害（ｃｅｒｅｂｒｏｖａｓｃｕｌａｒ ａｃｃｉｄｅｎｔ；ＣＶＡ）とも言われており、脳部への血液供給が損害されることで、脳の一部の細胞が十分な栄養及び酸素を取得できず、神経機能が損害されることによるものである。脳卒中は、出血性脳卒中（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ ｓｔｒｏｋｅ）及び虚血性脳卒中（ｉｓｃｈｅｍｉａ ｓｔｒｏｋｅ）に分けられる。一般的には、虚血性脳卒中が約８０％を占め、出血性脳卒中が約２０％を占め、両者の起因がかなり異なっている。出血性脳卒中は、脳血管の破裂による脳出血であり、死亡率が一般的に高い。虚血性脳卒中は、脳部血液の流通不良や閉塞による脳の局所的な虚血であり、死亡率が一般的に低いが、神経行動能力への損傷を引き起こしやすい。
アメリカＦＤＡが１９９６年にｔＰＡによる脳卒中治療を許可してから、ｔＰＡは、現在の虚血性脳卒中を臨床的に治療するただ１つの薬物となり、その作用メカニズムとしては、塞栓になった組織凝血塊を溶解させて、血液の順調な流れを回復させるが、ｔＰＡを使用する患者の脳出血の発生確率を１０倍向上させる。また、虚血性脳卒中による患者の体への障害損傷により、家庭の人力的ケアと経済的負担を引き起こし、国家にも医療の経済的負担をもたらす問題が発生する。従って、現在、虚血性脳卒中による神経細胞への損傷を減少し、更に虚血性脳卒中に対する治療効果を向上させるために、依然として脳卒中治療薬を開発する必要がある。
本発明の一態様は、下記式(I)に示すイリドイド配糖体類化合物である。
これにより、本発明のイリドイド配糖体類化合物は、草本薬物で精製されたゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）をバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として、更に側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）に構造に対する化学的修飾を加えた誘導体であり、ゲニピン構造の化学的活性が水溶液の雰囲気で不安定となり、水溶液又は体の組織内のアミノ（−ＮＨ2）と反応しまた分子構造同士で架橋作用を発生しやすいという欠点を改善する。本発明のイリドイド配糖体類化合物は、漢方薬を主として薬物の効能及び体に対する親和性を修繕し改善することで、新薬物の人体に対する拒絶や副作用を低下させ、薬物の安定性を向上させることができる。
本発明の別の態様は、有効量の上記イリドイド配糖体類化合物と、医薬的に許容されるキャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）と、を含む脳卒中治療用の医薬組成物を提供することにある。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、有効量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、有効量は１ｍｇ／ｋｇである。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、医薬組成物は、液体、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤である。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、有効量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、有効量は１ｍｇ／ｋｇである。
前記の脳卒中治療用の医薬組成物によれば、医薬組成物は、液体、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤である。
本発明のさらに１つの態様は、脳卒中治療薬の調製に用いられる上記イリドイド配糖体類化合物の使用方法を提供することにある。
前記のイリドイド配糖体類化合物の使用方法によれば、虚血性脳卒中治療薬の調製に用いられる。
前記のイリドイド配糖体類化合物の使用方法によれば、虚血性脳卒中治療薬の調製に用いられる。
前記のイリドイド配糖体類化合物の使用方法によれば、神経幹細胞を保護する薬物、神経幹細胞の増殖を促進する薬物又は神経幹細胞の自己再生を促進する薬物の調製に用いられる。
前記のイリドイド配糖体類化合物の使用方法によれば、神経幹細胞のＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を促進する薬物の調製に用いられる。
前記のイリドイド配糖体類化合物の使用方法によれば、神経幹細胞のＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を促進する薬物の調製に用いられる。
これにより、本発明のイリドイド配糖体類化合物が神経保護の効果があり、脳組織機能の損傷を防止することができることは、試験データにより実証される。更に、本発明の化合物は、神経幹細胞の成長及び自己再生能力をＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって刺激することができ、脳卒中（特に虚血性脳卒中）となる動物の脳部で神経幹細胞が分裂し脳部損傷部位へ移動するように促し、本発明の化合物における脳卒中の治療に適する薬物、又は医薬的に許容されるキャリアと組み合わせて、脳卒中を治療する医薬組成物とする。
本発明の説明は、本開示内容を基本的に理解させるように、本開示内容の簡略化された概要を提供する。この発明の内容は、本開示内容の完全な記述ではなく、また本発明実施例の重要、肝心な要素を指定、又は本発明の範囲を限定するものではない。
下記の添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするためのものである。また、添付ファイル１〜１８は、本明細書とは別に、物件提出書にて提出される。
下記の添付図面の説明は、本発明の上記及び他の目的、特徴、メリット及び実施例をより分かりやすくするためのものである。また、添付ファイル１〜１８は、本明細書とは別に、物件提出書にて提出される。
本明細書の開示内容は、新規のイリドイド配糖体類化合物、その医薬組成物及びその新規の使用方法を提出する。本発明のイリドイド配糖体類化合物を構造分析によって鑑定してから、本発明のイリドイド配糖体類化合物の神経細胞に対する保護効果をインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）細胞試験によって評価し、本発明のイリドイド配糖体類化合物の脳卒中に対する治療効果を虚血性脳卒中になった動物モデルによって評価し、更に本発明のイリドイド配糖体類の化合物脳卒中に対する治療効果を検証しており、ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって神経幹細胞成長及び自己再生能力を刺激し、虚血性脳卒中となる動物脳部で神経幹細胞が分裂し脳部損傷部位へ移動するように促し、脳部損傷部位を低下させ、更に脳組織機能の損傷を防止することができる。本明細書の開示内容に提出されるイリドイド配糖体類化合物は、潜在的な脳卒中を治療する物質であり、脳卒中治療薬の調製に用いられる。
前記新規のイリドイド配糖体類化合物は、構造が式（Ｉ）又は式（ＩＩ）に示すようなものである。
式（Ｉ）中、Ｒ1は、−ＯＨ、−ＯＣＨ2ＣＨ3、＝Ｏ、式（ｉ）に示す構造、式（ｉｉ）に示す構造、式（ｉｉｉ）に示す構造、又は式（ｉｖ）に示す構造のうちいずれかであり、Ｒ2は、１価基である。
式（ＩＩ）中、ｍ1は、式（ｖ）に示す構造である。
式（ｉｉ）中、Ｒ3は、−ＮＨ2、−ＮＨ3 +Ｃｌ-、又は式（ｉｖ）に示す構造のうちいずれかである。
式（ＩＩ）中、ｍ1は、式（ｖ）に示す構造である。
更には、式（Ｉ）中、Ｒ2は、式（ｖｉｉ）に示す構造である。
式（ｖｉｉ）中、Ｒ4は、水素、式（ｖｉｉｉ）に示す構造、式（ｉｘ）に示す構造、又は式（ｘ）に示す構造のうちいずれかである。
式（ｖｉｉｉ）中、Ｒ5は、−ＮＨ2、−ＮＨ3 +Ｃｌ-、又は式（ｉｖ）に示す構造のうちいずれかである。式（ｘ）中、Ｒ6は、−Ｈ2Ｃｌ、又は式（ｖｉ）に示す構造のうちいずれかである。
以下は、本明細書に用いられる特定の用語の説明である。
本明細書に記載の「Ｂｍｉ−１（Ｂ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＬＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ−１）」は、Ｂｍｉ−１遺伝子により転写されるタンパク質である。Ｂｍｉ−１遺伝子は、ポリコーム（ｐｏｌｙｃｏｍｂｇｒｏｕｐ；ＰｃＧ）遺伝子群における重要な調節遺伝子であり、幹細胞の自己再生、細胞≡殖及び老化に対する調節で大切な役割を果たしている。
本明細書に記載の「Ｂｍｉ−１（Ｂ ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＭＬＶ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｓｉｔｅ−１）」は、Ｂｍｉ−１遺伝子により転写されるタンパク質である。Ｂｍｉ−１遺伝子は、ポリコーム（ｐｏｌｙｃｏｍｂｇｒｏｕｐ；ＰｃＧ）遺伝子群における重要な調節遺伝子であり、幹細胞の自己再生、細胞≡殖及び老化に対する調節で大切な役割を果たしている。
本明細書に記載の「低酸素誘導因子１α（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ １α；ＨＩＦ−１α）は、低酸素誘導因子（Ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒｓ ＨＩＦｓ）のメンバーの１つであり、細胞雰囲気における転写因子であり、酸素含有量によって異なる反応が発生し、主に酸素減少又は低酸素の状況で活性化する。
ここで、以下の具体的な試験例によって、本発明を更に示範的に説明する。これらの試験例は、当業者が本発明を過度に解釈せずに、完全的に利用し実践するためのものであるが、本発明の範囲を制限するためのものなく、本発明の材料及び方法を如何に実施するかを説明することに用いられる。
（試験例）
一、本発明のイリドイド配糖体類化合物の化学合成と構造鑑定
表１〜３を参照されたい。表１〜３は、本発明のイリドイド配糖体類化合物の実施例の化合物１〜化合物１７の構造式、分子量と化学式である。Ｂｏｃはｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ ｃａｒｂｏｎｙｌ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）の略語であり、即ち、前記の式（ｖｉ）の構造である。
一、本発明のイリドイド配糖体類化合物の化学合成と構造鑑定
表１〜３を参照されたい。表１〜３は、本発明のイリドイド配糖体類化合物の実施例の化合物１〜化合物１７の構造式、分子量と化学式である。Ｂｏｃはｔ−Ｂｕｔｙｌｏｘｙ ｃａｒｂｏｎｙｌ（ｔ−ブチルオキシカルボニル）の略語であり、即ち、前記の式（ｖｉ）の構造である。
図１Ａを参照されたい。図１Ａは、本発明の化合物１の合成方法を示すフロー図である。
まず、１ｇのゲニポシド（ｇｅｎｉｐｏｓｉｄｅ）を３０ｍＬのジクロロメタン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈａｎｅ）水溶液（ジクロロメタン：水＝１：１）に溶解させ、１００ｍｇの・−グルコシダーゼ（・−ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ）で処理した。反応混合物を３７℃で２４時間激しく撹拌し、ジクロロメタンで混合物を３回抽出した後で、有機層を硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ4）で乾燥させて、減圧蒸留でジクロロメタンを取り除き、４８７ｍｇのゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）が得られ、収率が８４％であった。
また５０ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のゲニピンをジクロロメタンに溶解させて、５３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ-ｔｅｒｔ-ブチル［（Ｂｏｃ）2Ｏ］、０．１５ｍＬ（１．１１ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）を加えた。反応物を３時間撹拌した後で、１Ｎの塩酸（ＨＣｌ）を加え、有機層を分離させ、塩水で洗浄した後で硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。粗生成物に対してカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製して、５１ｍｇの化合物（ｉ）が得られ、収率が７１％であった。
１当量の化合物（ｉ）を無水ジクロロメタンに溶解させて、１．１当量のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、１．１当量の１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ；ＥＤＣＩ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ；ＥＤＣＩ）及び０．１当量の４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；ＤＭＡＰ）を加え、反応混合物を室温で原料全体が消耗されるまで撹拌し、溶液をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー精製を行い、化合物（ｉｉ）が得られ、収率が９９％であった。
１当量の化合物（ｉｉ）を２５当量のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＦＡ）及びジクロロメタン（ジクロロメタン：トリフルオロ酢酸＝１０：１）に溶解させた。反応物を２時間撹拌してから、混合物を濃縮してトリフルオロ酢酸を取り除いた。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（５％メタノール及びジクロロメタン）を行って精製を行い、化合物１が得られ、収率が８７％であった。
また５０ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のゲニピンをジクロロメタンに溶解させて、５３ｍｇ（０．２４ｍｍｏｌ）の二炭酸ジ-ｔｅｒｔ-ブチル［（Ｂｏｃ）2Ｏ］、０．１５ｍＬ（１．１１ｍｍｏｌ）のトリエチルアミン（Ｅｔ3Ｎ）を加えた。反応物を３時間撹拌した後で、１Ｎの塩酸（ＨＣｌ）を加え、有機層を分離させ、塩水で洗浄した後で硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。粗生成物に対してカラムクロマトグラフィー（１０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製して、５１ｍｇの化合物（ｉ）が得られ、収率が７１％であった。
１当量の化合物（ｉ）を無水ジクロロメタンに溶解させて、１．１当量のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−フェニルアラニン（Ｂｏｃ−Ｌ−ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）、１．１当量の１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（１−Ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ；ＥＤＣＩ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ；ＥＤＣＩ）及び０．１当量の４−ジメチルアミノピリジン（４−Ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｙｒｉｄｉｎｅ；ＤＭＡＰ）を加え、反応混合物を室温で原料全体が消耗されるまで撹拌し、溶液をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー精製を行い、化合物（ｉｉ）が得られ、収率が９９％であった。
１当量の化合物（ｉｉ）を２５当量のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＦＡ）及びジクロロメタン（ジクロロメタン：トリフルオロ酢酸＝１０：１）に溶解させた。反応物を２時間撹拌してから、混合物を濃縮してトリフルオロ酢酸を取り除いた。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（５％メタノール及びジクロロメタン）を行って精製を行い、化合物１が得られ、収率が８７％であった。
化合物１の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３９（ｓ,１Ｈ）,７．３１−７．２０（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．９０（ｓ,１Ｈ）,４．８５（ｄ,Ｊ＝９．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．７８（ｄ,Ｊ＝９．３Ｈｚ,１Ｈ）,４．２５（ｔ,Ｊ＝４．８Ｈｚ,１Ｈ）,３．７２（３Ｈ,ｓ）,３．２６（ｍ,２Ｈ）,３．１１（ｄｄ,Ｊ＝１２．９,６．６Ｈｚ,１Ｈ）,２．８７（ｍ,１Ｈ）,２．３８（ｔ,Ｊ＝６．０Ｈｚ,１Ｈ）,２．０１（ｍ,１Ｈ）,ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３７４．１４ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
図１Ｂを参照されたい。図１Ｂは、本発明の化合物２、化合物３及び化合物１２の合成方法を示すフロー図である。
５００ｍｇ（２．２１ｍｍｏｌ）のゲニピンを無水ジクロロメタンに溶解させて、７０４ｍｇ（２．６５ｍｍｏｌ）のＢＯＣ−Ｌ−フェニルアラニン、６３６ｍｇ（３．３２ｍｍｏｌ）のＥＤＣＩ及び２６．９ｍｇ（０．２２ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、３１０．９ｍｇの化合物２（収率２０％）、３９０．１ｍｇの化合物３（収率３７％）及び２２３．８ｍｇの化合物１２（収率２１．４％）が得られた。
化合物２の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４２（ｓ,１Ｈ）,７．３１−７．１４（ｏｖｅｒｌａｐ,１０Ｈ）,５．９６（ｄ,Ｊ＝５．６Ｈｚ,１Ｈ）,５．８４（ｓ,１Ｈ）,４．７５−４．５７（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．２１−３．０５（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,２．８５（ｄｄ,Ｊ＝１７,８Ｈｚ,１Ｈ）,２．７２（ｍ,１Ｈ）,２．２０（ｍ,１Ｈ）,１．４１（ｓ,１８Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）７４３．２０ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
化合物３の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．５０（ｓ,１Ｈ）,７．３１−７．１５（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．９０（ｓ,１Ｈ）,５．００（ｄ,Ｊ＝７．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．７５−４．７０（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,４．５５（ｄ,Ｊ＝６．４ ＨＺ,１Ｈ）,３．７２（３Ｈ,ｓ）,３．１６−３．１１（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,２．９０（ｍ,１Ｈ）,２．４０（ｍ,１Ｈ）,２．０３（ｍ,１Ｈ）,１．４１（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４９６．０５ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
化合物１２の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４５（ｓ,１Ｈ）,７．３３−７．１８（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,６．０８（ｄ,Ｊ＝６．８Ｈｚ,１Ｈ）,５．８５（ｓ,１Ｈ）,４．５９（ｄｄ,Ｊ＝１４．２,７．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．２０（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,３．７５（３Ｈ,ｓ）,３．２６（ｄｄ,Ｊ＝１４．６,７．２Ｈｚ,１Ｈ）,３．１７−３．０５（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．９２−２．８６（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．２３（ｍ,１Ｈ）,１．４１（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４９６．０５ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
また図１Ｃを参照されたい。図１Ｃは、本発明の化合物４、化合物６、化合物９、化合物１０、化合物１１、化合物１３及び化合物１７の合成方法を示すフロー図である。
４５６ｍｇ（０．９６ｍｍｏｌ）の化合物３を無水ジクロロメタンに溶解させてから、２６８ｍｇ（１．１６ｍｍｏｌ）のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン（Ｂｏｃ−Ｌ−ａｓｐａｒａｇｉｎｅ）、２７７ｍｇ（１．４４ｍｍｏｌ）のＥＤＣＩ及び１１．８ｍｇ（０．０９６ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。粗生成物に対してカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、２８５．５ｍｇの化合物（ｉｖ）が得られ、収率が４３％であった。化合物（ｉｖ）の構造式は、以下の通りである。
化合物（ｉｖ）の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４２（ｓ,１Ｈ）,７．２９−７．１８（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,６．０２−５．８８（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,５．１１（ｄ,Ｊ＝７．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．９２（ｄ,Ｊ＝１２．４Ｈｚ,１Ｈ）,４．６２−４．５９（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,３．７３（３Ｈ,ｓ）,３．２２（ｄｄ,Ｊ＝１３．８,７．６Ｈｚ,１Ｈ）,３．１２−２．９７（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）,２．８８（ｄｄ,Ｊ＝１６．６,７．６Ｈｚ,１Ｈ）,２．７６−２．７２（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,１．４５（ｓ,９Ｈ）,１．３９（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）７１０．１０ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
０．１２ｍｍｏｌの化合物（ｉｖ）を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を減圧し濃縮し、得られた粗生成物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた結晶をエーテルで洗浄して化合物４が得られ、収率が５１％であった。
化合物４の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３８−７．３１（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,６．３０（ｓ,１Ｈ）,５．９４（ｓ,１Ｈ）,４．９６（ｄ,Ｊ＝９．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．８４（ｍ,１Ｈ）,４．４０（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,３．７３（３Ｈ,ｓ）,３．３２−２．９８（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,２．８４（ｄ,Ｊ＝１４Ｈｚ,１Ｈ）,２．２９（ｄ,Ｊ＝１６．４Ｈｚ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４８８．１５ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
１７７ｍｇ（０．３７ｍｍｏｌ）の化合物３を４ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。そして、０．３４ｍＬ（０．９７ｍｍｏｌ）の８５％Ｎ,Ｎ−ジエチルジベンジルホスホルアミダイト（Ｎ,Ｎ−ｄｉｅｔｈｙｌ ｄｉｂｅｎｚｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）を１．１ｍＬのジクロロメタンに溶解させて、２．１６ｍＬ（０．９７ｍｍｏｌ）の１Ｈ−テトラゾール（０．４５Ｍをアセトニトリルに溶解）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した後で、反応混合物を０℃に冷却させ、１．７ｍＬの３０％の過酸化水素を加えた。反応混合物を０℃で１５分間撹拌してから、４．５ｍＬの飽和チオ硫酸ナトリウム（Ｎａ2Ｓ2Ｏ3）を加え、また反応混合物を０℃で２時間撹拌した。３０ｍＬの酢酸エチルで反応混合物を３回抽出し反応させた。有機層を飽和炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ3）及び塩水で洗浄した後で、硫酸ナトリウムで有機層を乾燥させて、減圧し濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー（３０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、２１８ｍｇの化合物（ｉｉｉ）が得られ、収率が８０％であった。
１４９ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の化合物（ｉｉｉ）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解させた溶液を、１．６ｍＬのジクロロメタンに溶解したブロモトリメチルシラン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＴＭＳＢｒ）（０．１２ｍＬ、０．９２ｍｍｏｌ）及びピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）（０．１９ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ）で０℃で４〜６時間処理した。４．５ｍＬの水を加えてから、水層を分離し冷凍し乾燥させ、精製の５８．３ｍｇの化合物６が得られ、収率が６３％であった。
１４９ｍｇ（０．２０ｍｍｏｌ）の化合物（ｉｉｉ）を２．５ｍＬのジクロロメタンに溶解させた溶液を、１．６ｍＬのジクロロメタンに溶解したブロモトリメチルシラン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｙｌ ｂｒｏｍｉｄｅ；ＴＭＳＢｒ）（０．１２ｍＬ、０．９２ｍｍｏｌ）及びピリジン（ｐｙｒｉｄｉｎｅ）（０．１９ｍＬ、２．３１ｍｍｏｌ）で０℃で４〜６時間処理した。４．５ｍＬの水を加えてから、水層を分離し冷凍し乾燥させ、精製の５８．３ｍｇの化合物６が得られ、収率が６３％であった。
化合物６の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．５０（ｓ,１Ｈ）,７．４０−７．２９（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．９７（ｓ,１Ｈ）,５．４３（ｔ,Ｊ＝７．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．８２（ｍ,２Ｈ）,４．３８（ｍ,１Ｈ）,３．７３（３Ｈ,ｓ）,３．２８−３．０３（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）,２．８３（ｍ,１Ｈ）,２．１７（ｍ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４５２．０５ ［Ｍ−Ｈ］-であった。
１当量の化合物３を無水ジクロロメタンに溶解させて、１．１当量のｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸、１．１当量の１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び０．１当量のＤＭＡＰを加え、反応混合物を室温で原料が消耗するまで撹拌してから、溶液をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー精製を行い、精製化合物が得られた。前記化合物を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を減圧し濃縮し、得られた粗生成物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた結晶をエーテルで洗浄して化合物９が得られ、２つのステップの総計の収率が５２％であった。
化合物９の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４４（ｓ,１Ｈ）,７．３６−７．３１（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,６．２３（ｄ,Ｊ＝３．６Ｈｚ,１Ｈ）,５．９５（ｓ,１Ｈ）,４．９１−４．８０（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,４．５６（ｄ,Ｊ＝６．８Ｈｚ,１Ｈ）,４．４２（ｄ,Ｊ＝５．２Ｈｚ１Ｈ）,３．７３（３Ｈ,ｓ）,３．４１（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,３．３１−３．２７（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,３．０５（ｂｒｓ,１Ｈ）,２．８６（ｍ,１Ｈ）,２．４９（ｍ,１Ｈ）,２．２９−２．１１（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４７１．０５ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
５０ｍｇ（０．０９７ｍｍｏｌ）の化合物３を０．６０ｍＬ（７．７６ｍｍｏｌ）のトリフルオロ酢酸及び２５ｍＬのジクロロメタンに溶解させた。反応混合物を２時間撹拌した後で、１２ミリリットルのＨＣｌ（１．２５Ｍをエタノールに溶解）を加えた。反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、溶液を濃縮し、残留物をジクロロメタンで再溶解し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。粗生成物に対してカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、１２．１ｍｇの化合物１１が得られ、収率が２９％であった。
化合物１１の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．５２（ｓ,１Ｈ）,７．３０−７．１９（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．８２−５．７５（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,４．７４（ｂｒｓ,２Ｈ）,４．６３（ｑ,Ｊ＝７．６ ＨＺ,２Ｈ）,４．６５（ｄ,Ｊ＝５．６Ｈｚ,１Ｈ）,３．７１（３Ｈ,ｓ）,３．１２（ｍ,１Ｈ）,３．０５−２．９２（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,２．８１（ｍ,１Ｈ）,２．５８（ｍ,１Ｈ）,２．１５（ｍ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４０２．１５ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
１５０ｍｇ（０．３２ｍｍｏｌ）の化合物３及び４５ｍｇのｐ−トルエンスルホン酸（ｐ−ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）を１０ｍＬの４０％水性メチルアミン（ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｔｈｙｌ ａｍｉｎｅ）に溶解させ、室温で４８時間撹拌した。また反応混合物を１５ｍＬのジクロロメタンで３回抽出し、有機層を塩水で洗浄した後で、硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー精製を行い、２２．３ｍｇの化合物１３が得られ、収率が１９％であった。
化合物１３の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３１−７．２０（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,７．１２（ｓ,１Ｈ）,６．０１（ｓ,１Ｈ）,５．７６（ｂｒｓ,１Ｈ）,４．３７（ｍ,２Ｈ）,４．２１（ｄ,Ｊ＝５．２ ＨＺ,１Ｈ）,３．６７（ｓ,３Ｈ）,３．４１（ｓ,３Ｈ）,３．２５（ｍ,１Ｈ）,３．１７（ｍ,１Ｈ）,３．１３（ｍ,１Ｈ）,２．８１（ｍ,１Ｈ）,２．２８（ｍ,１Ｈ）,ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３９１．１０ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
３０１．２ｍｇ（０．９２ｍｍｏｌ）の化合物３をジクロロメタンに溶解させ、７８３．８ｍｇ（１．８４５ｍｍｏｌ）のＤｅｓｓ_Ｍａｒｔｉｎ超原子価ヨウ素剤及び１５５．３ｍｇ（１．８５ｍｍｏｌ）の重炭酸ナトリウムを加えた。反応混合物を原料全体が消耗されるまで撹拌した。水性飽和チオ硫酸ナトリウムで反応混合物を１０分間処理し、ジクロロメタンで３回抽出した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（１５％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、２４４．２ｍｇの化合物１７が得られ、収率が８２％であった。
化合物１７の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４９（ｓ,１Ｈ）,７．２９−７．１５（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．８８（ｓ,１Ｈ）,４．９７（ｄ,Ｊ＝１３．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．８９（ｄ,Ｊ＝１３．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．５９（ｄ,Ｊ＝７．２Ｈｚ,１Ｈ）,３．７９（３Ｈ,ｓ）,３．４４（ｍ,２Ｈ）,３．０９−３．０７（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．９２（ｍ,１Ｈ）,２．１９（ｍ,１Ｈ）,１．４１（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４９４．１５ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
０．１２ｍｍｏｌの化合物１７を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を真空で濃縮し、得られた粗生成物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄して化合物１０が得られ、収率が８４％であった。
化合物１０の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．５６（ｓ,１Ｈ）,７．３７−７．２５（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,５．９５（ｓ,１Ｈ）,５．０４（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．９６（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．３９（ｔ,Ｊ＝７．２Ｈｚ,１Ｈ）,３．７８（３Ｈ,ｓ）,３．５２（ｍ,１Ｈ）,３．４１（ｍ,１Ｈ）,３．２５−３．２３（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．８８（ｄｄ,Ｊ＝１６．６,８Ｈｚ,１Ｈ）,２．１９（ｄｄ,Ｊ＝１６．８,８．４Ｈｚ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３７１．９５ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
また図１Ｄを参照されたい。図１Ｄは、本発明の化合物５、化合物７、化合物８及び化合物１６の合成方法を示すフロー図である。
３２３．６ｍｇ（０．６８ｍｍｏｌ）の化合物３を無水ジクロロメタンに溶解させて、１９０ｍｇ（０．８２ｍｍｏｌ）のｔ−ブチルオキシカルボニル−Ｌ−アスパラギン、１９７ｍｇ（１．０３ｍｍｏｌ）のＥＤＣＩ及び８．４ｍｇ（０．０６８ｍｍｏｌ）のＤＭＡＰを加え、反応混合物を室温で１時間撹拌し、反応混合物をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮した。粗生成物に対してカラムクロマトグラフィー（２０％酢酸エチル及びヘキサン）を行って精製を行い、２０６．８ｍｇの化合物（ｖ）が得られ、収率が４０％であった。化合物（ｖ）の構造式は、以下の通りである。
化合物（ｖ）の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４５−７．１９（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,６．０４（ｓ,１Ｈ）,５．９３（ｓ,１Ｈ）,４．７７−４．５３（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,４．３５（ｍ,１Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．２８（ｔ,Ｊ＝６．８Ｈｚ,１Ｈ）,３．１０−２．７３（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,２．２１（ｍ,１Ｈ）,１．４４（ｓ,９Ｈ）,１．４０（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）７０１．４ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
０．１２ｍｍｏｌの化合物（ｖ）を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を真空で濃縮し、得られた粗生成物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄して化合物５が得られ、収率が８９％であった。
化合物５の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４０−７．３２（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,６．１９（ｓ,１Ｈ）,６．０３（ｓ,１Ｈ）,５．０４（ｍ,１Ｈ）,４．７８（ｍ,１Ｈ）,４．５４（ｍ,１Ｈ）,４．３７（ｍ,１Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．２８−３．７９（ｏｖｅｒｌａｐ ７Ｈ）,２．２８（ｍ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４８８．１０ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
１当量の化合物１２を無水ジクロロメタンに溶解させて、１．１当量のｔ−ブチルオキシカルボニルアミノ酸（Ｎ−Ｂｏｃ−ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ）、１．１当量の１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド及び０．１当量のＤＭＡＰを加え、反応混合物を室温で原料が消耗するまで撹拌してから、溶液をジクロロメタンで希釈し、塩水で３回洗浄した。有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ濃縮し、残留物に対してカラムクロマトグラフィー精製を行い、化合物７が得られ、収率が７７％であった。
化合物７の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．４２（ｓ,１Ｈ）,７．３１−７．１６（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,６．０５（ｄ,Ｊ＝６Ｈｚ,１Ｈ）,５．９２（ｓ,１Ｈ）,４．７０−４．６２（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,４．３４（ｄ,Ｊ＝７．６Ｈｚ,１Ｈ）,４．２５（ｄｄ,Ｊ＝４,８．６Ｈｚ,１Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．５２−３．３５（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,３．２６（ｄｄ,１４．４,８Ｈｚ,１Ｈ）,３．１７−３．０４（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．９２−２．８４（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,２．２７−２．１７（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,１．９９−１．８５（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,１．４１（ｓ,９Ｈ）,１．３９（ｓ,９Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）６９３．２０ ［Ｍ＋Ｎａ］+であった。
０．１２ｍｍｏｌの化合物７を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を真空で濃縮し、得られた残留物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄して化合物８が得られ、収率が７０％であった。
化合物８の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３７−７．３０（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,６．３１（ｓ,１Ｈ）,６．０１（ｓ,１Ｈ）,５．９２（ｓ,１Ｈ）,４．９０−４．８３（ｏｖｅｒｌａｐ,２Ｈ）,４．４８（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,３．７５（３Ｈ,ｓ）,３．４２（ｂｒ ｓ,２Ｈ）,３．３１−３．２０（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,２．８３（ｄ,Ｊ＝１４Ｈｚ,１Ｈ）,２．４８（ｂｒ ｓ,１Ｈ）,２．３０（ｄ,Ｊ＝１５．６Ｈｚ,１Ｈ）,２．２１−２．１１（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）４７１．０５ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
０．１２ｍｍｏｌの化合物１２を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を真空で濃縮し、得られた残留物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄して、化合物１６が得られ、収率が６３％であった。
化合物１６の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３７−７．２８（ｏｖｅｒｌａｐ,６Ｈ）,６．３１（ｄ,Ｊ＝５．２Ｈｚ,１Ｈ）,５．７９（ｓ,１Ｈ）,４．４６（ｔ,Ｊ＝６．８Ｈｚ,１Ｈ）,４．１７（ｄ,Ｊ＝１４Ｈｚ,１Ｈ）,４．１３（ｄ,Ｊ＝１３．６Ｈｚ,１Ｈ）,３．７５（３Ｈ,ｓ）,３．２１−３．１３（ｏｖｅｒｌａｐ,３Ｈ）,３．０６（ｔ,Ｊ＝５．６Ｈｚ,１Ｈ）,２．８１（ｄｄ,１６．８,７．６Ｈｚ,１Ｈ）,２．２５（ｔ,Ｊ＝１６．８Ｈｚ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）３７３．９５ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
また図１Ｅを参照されたい。図１Ｅは、本発明の化合物１４及び化合物１５の合成方法を示すフロー図である。
８３．１ｍｇ（０．１２ｍｍｏｌ）の化合物２を１０ｍＬのＨＣｌ（２Ｍをエーテルに溶解）に溶解させ、反応混合物を室温で徹夜撹拌してから、反応混合物を減圧し濃縮し、得られた残留物を１０ｍＬのエーテルで再結晶させた。得られた固体をエーテルで洗浄して６４．２ｍｇの化合物１４が得られ、収率が９４％であった。
化合物１４の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．３８−７．２６（ｏｖｅｒｌａｐ,１１Ｈ）,６．２６（ｄ,Ｊ＝４．８Ｈｚ,１Ｈ）,５．９２（ｓ,１Ｈ）,４．９４（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．７６（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．４６（ｔ,Ｊ＝６．８Ｈｚ,１Ｈ）,４．３８（ｔ,Ｊ＝６．４Ｈｚ,１Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．２８−３．１２（ｏｖｅｒｌａｐ,５Ｈ）,２．９５（ｔ,Ｊ＝５．０Ｈｚ,１Ｈ）,２．８０（ｄｄ,Ｊ＝１７,８Ｈｚ,１Ｈ）,２．２７（ｄ,Ｊ＝１７．６Ｈｚ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）５２１．１０ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
１当量の化合物２を２５当量のトリフルオロ酢酸（ｔｒｉｆｌｕｏｒｏａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ；ＴＦＡ）及びジクロロメタン（ジクロロメタン：トリフルオロ酢酸＝１０：１）に溶解させた。反応物を２時間撹拌した後で、混合物を濃縮してトリフルオロ酢酸を取り除いた。残留物に対してカラムクロマトグラフィー（５％メタノール及びジクロロメタン）を行って精製を行い、化合物１５が得られ、収率が９２％であった。
化合物１５の核磁気共鳴分光計による核磁気共鳴分光分析のデータは、1Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＣＤＣｌ3）：δ ７．２７−７．１４（ｏｖｅｒｌａｐ,１１Ｈ）,５．９０（ｄ,Ｊ＝６．０Ｈｚ,１Ｈ）,５．７７（ｓ,１Ｈ）,４．６０（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．５２（ｄ,Ｊ＝１３．２Ｈｚ,１Ｈ）,４．３４（ｂｒｓ,１Ｈ）,４．２２（ｂｒｓ,１Ｈ）,３．７４（３Ｈ,ｓ）,３．２９−３．２０（ｏｖｅｒｌａｐ,４Ｈ）,３．０５（ｄｄ,Ｊ＝１４,７．２Ｈｚ,１Ｈ）,２．７９（ｄｄ,Ｊ＝１４,７．２Ｈｚ,１Ｈ）,２．５１（ｍ,１Ｈ）,２．０８（ｍ,１Ｈ）．ＥＳＩ（ｍ／ｚ）５２１．２０ ［Ｍ＋Ｈ］+であった。
二、本発明のイリドイド配糖体類化合物が神経保護の効果を有する
＜試験例２−１：乳酸脱水素酵素の放出率分析＞
Ｈ2Ｏ2が細胞に酸化傷害を与え、また細胞膜の損害を引き起こし、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）を培地に放出する。従って、培地におけるＬＤＨ放出率が低いほど、細胞の受ける損傷の比率が低く、サンプルが細胞に対する保護効力を有することを表示する。
＜試験例２−１：乳酸脱水素酵素の放出率分析＞
Ｈ2Ｏ2が細胞に酸化傷害を与え、また細胞膜の損害を引き起こし、乳酸脱水素酵素（ｌａｃｔａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＬＤＨ）を培地に放出する。従って、培地におけるＬＤＨ放出率が低いほど、細胞の受ける損傷の比率が低く、サンプルが細胞に対する保護効力を有することを表示する。
１７日妊娠したＣ５７ＢＬ／６マウスの大脳皮質から調製された初代の大脳皮質細胞（ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｒｔｉｃａｌ ｃｅｌｌｓ；ＰＣＣ）を、試験の細胞とした。初代の大脳皮質細胞の調製方法については、Ｗｅｔｚｅｌ Ｍ等により提出された工程（Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｆｆｅｒ ２００８；１５：１４３−１５１）を参照されたい。初代の大脳皮質細胞を血清を含まない条件で培養し、Ｂ−２７サプリメント（２％、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グルタミン（０．５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、グルタミン酸（２５ｍＭ、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）及びストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加される神経元細胞培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地とした。インビトロで４日培養した後、培地の半分をグルタミン酸を含まない新鮮な培地に置換し、３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータに培養した。インビトロで７日培養した後、初代の大脳皮質細胞は、試験に用いられることができる。
試験上、先に初代の大脳皮質細胞を２４ウェルマイクロタイタープレートに接種し、２０分間静置した後で、培養液にそれぞれサンプル又は誘導剤Ｈ2Ｏ2（１０-4 ｍｏｌ／Ｌ）を与えた。誘導剤Ｈ2Ｏ2のみを加えたものを対照群とし、誘導剤Ｈ2Ｏ2及びサンプルを同時に加えたものを試験群とした。サンプルは濃度がそれぞれ１００μＭの化合物１〜化合物１７であった。また３７℃、５％ＣＯ2のインキュベータで２４時間培養した。培養後に培養液を吸出し、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄した後で、ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｊａｐａｎ）で培養液におけるＬＤＨ活性を分析して、細胞の損傷様子を示す、初代の大脳皮質細胞に対する毒性の百分率（ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を算出することができる。分析結果であるＬＤＨ活性が低い場合、その毒性の百分率が小さく、細胞の損傷様子が厳しくなく、前記サンプルが細胞に対する保護効力を有することを表示する。乳酸脱水素酵素の活性は比色法により測定され、特定の基質と酵素とが反応した後で、反応液の吸光度と乳酸脱水素酵素の活性とは正の線形関係になる。乳酸脱水素酵素の活性（Ｕ／１０-3Ｌ）は、３分間における波長３４０ｎｍが減少する光学密度の勾配で算出された。１つの乳酸脱水素酵素の活性単位は、１分間毎に１×１０-3 ｍｏｌＮＡＤＨを触媒反応させる消耗量と定義された。
図１Ｆを参照されたい。図１Ｆは、本発明のイリドイド配糖体類化合物の乳酸脱水素酵素の放出率分析を示す結果図であり、分析する化合物は化合物１〜化合物１７である。
結果によると、化合物１〜化合物１７の何れも、Ｈ2Ｏ2の加えられた初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を５０％以下に低下させることができ、なお、化合物７及び化合物１３以外、他の化合物の何れもＨ2Ｏ2の加えられた初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を４５％以下に低下させることができる。これは、本発明の化合物の何れもＨ2Ｏ2による酸化傷害から初代の大脳皮質細胞を保護する効果があることを示す。
結果によると、化合物１〜化合物１７の何れも、Ｈ2Ｏ2の加えられた初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を５０％以下に低下させることができ、なお、化合物７及び化合物１３以外、他の化合物の何れもＨ2Ｏ2の加えられた初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を４５％以下に低下させることができる。これは、本発明の化合物の何れもＨ2Ｏ2による酸化傷害から初代の大脳皮質細胞を保護する効果があることを示す。
また図１Ｇを参照されたい。図１Ｇは、異なる濃度の本発明のイリドイド配糖体類化合物の乳酸脱水素酵素の放出率分析を示す結果図であり、分析する化合物は化合物１、化合物３、化合物５、化合物１５及び化合物１６である。本試験において、図１Ｆにおける乳酸脱水素酵素放出率の低い化合物１、化合物３、化合物５、化合物１５及び化合物１６を選択し、その初代の大脳皮質細胞を保護可能な最適濃度を更に分析し、試験の濃度がそれぞれ０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭであった。
図１Ｇの結果から分かるように、化合物１、化合物３、化合物５、化合物１５及び化合物１６の何れも、濃度が１００μＭである場合、初代の大脳皮質細胞の乳酸脱水素酵素の放出率に対する低下効果が最適であり、且つ何れも濃度の低下につれて、その乳酸脱水素酵素の放出率の低下効果も低くなって、これで本発明の化合物のＨ2Ｏ2による酸化傷害から初代の大脳皮質細胞を保護する効果が投与量依存性を有することが判明される。また、化合物１は、濃度が０．１μＭでも、Ｈ2Ｏ2の添加された初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を３０％に低下させることができるため、後の虚血性脳卒中になった動物モデルに対しては、化合物１によって、本発明の化合物の脳卒中に対する治療効果を評価した。
図１Ｇの結果から分かるように、化合物１、化合物３、化合物５、化合物１５及び化合物１６の何れも、濃度が１００μＭである場合、初代の大脳皮質細胞の乳酸脱水素酵素の放出率に対する低下効果が最適であり、且つ何れも濃度の低下につれて、その乳酸脱水素酵素の放出率の低下効果も低くなって、これで本発明の化合物のＨ2Ｏ2による酸化傷害から初代の大脳皮質細胞を保護する効果が投与量依存性を有することが判明される。また、化合物１は、濃度が０．１μＭでも、Ｈ2Ｏ2の添加された初代の大脳皮質細胞のその乳酸脱水素酵素の放出率を３０％に低下させることができるため、後の虚血性脳卒中になった動物モデルに対しては、化合物１によって、本発明の化合物の脳卒中に対する治療効果を評価した。
三、虚血性脳卒中が発生した後の神経幹細胞の自己再生及び分子間の作用調節メカニズム
虚血性脳卒中が発生すると、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＮＳＣｓ）が自己再生と分子間の作用調節メカニズムを如何にするかはまだ判明されていない。現在の研究によると、Ｂｍｉ−１は幹細胞の自己再生及び成長を促す肝心な要因であるため、この部分の試験例では、先に神経幹細胞が如何にＢｍｉ−１の活性化によって自己再生しまた成長するかを先に検討する。
虚血性脳卒中が発生すると、神経幹細胞（ｎｅｕｒａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ；ＮＳＣｓ）が自己再生と分子間の作用調節メカニズムを如何にするかはまだ判明されていない。現在の研究によると、Ｂｍｉ−１は幹細胞の自己再生及び成長を促す肝心な要因であるため、この部分の試験例では、先に神経幹細胞が如何にＢｍｉ−１の活性化によって自己再生しまた成長するかを先に検討する。
＜試験３−１．脳虚血によるラット脳内Ｂｍｉ−１の向上の発現＞
脳虚血によりＢｍｉ−１の発現が向上するかを確定するために、本試験例では、免疫蛍光染色及びウエスタンブロット法によって虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１の発現量を分析した。
脳虚血によりＢｍｉ−１の発現が向上するかを確定するために、本試験例では、免疫蛍光染色及びウエスタンブロット法によって虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１の発現量を分析した。
脳卒中ラットモデルとしては、脳虚血／再灌流モデル（ｉｓｃｈｅｍｉａ_ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ）を利用してラットの一過性局所脳虚血の症状を模擬し、試験動物として体重が２５０〜３００グラムであるオスＳＤ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットを使用した。ラットに対して先に抱水クロラール（０．４ｇ／ｋｇ）を腹腔内に注射して麻酔をかけ、ラットの脳虚血／再灌流モデルに対してラットの両方の総頸動脈（ｃｏｍｍｏｎ ｃａｒｏｔｉｄ ａｒｔｅｒｉｅｓ；ＣＣＡ）及び右中大脳動脈（ｍｉｄｄｌｅ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｒｔｅｒｙ；ＭＣＡ）を閉塞することで局所性脳虚血を誘発し、９０分間閉塞してから解除して再灌流を行った。ラットの中核体温をサーミスタ温度プローブ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｍｏｄｅｌ ２１０９０Ａ ｐｒｏｂｅ；Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ Ｃｏｍｐａｎｙ；Ａｎｄｏｖｅｒ；ＭＡ）で測定し、麻酔中に加温パッドでラットの体温を３７℃に維持して、麻酔から回復してからも、ラットの体温を加熱ランプで３７℃に維持した。
試験上、脳虚血後４時間、１２時間、２４時間及び３日間の脳卒中ラットの脳部組織切片に対して、免疫蛍光染色法によってＢｍｉ−１をキャリブレーションし、別に、脳虚血／再灌流モデルを処理していないラットを対照群とした。
図２Ａ、図２Ｂ、添付ファイル１及び添付ファイル２を参照されたい。
図２Ａは、虚血性脳卒中ラットの脳部皮質（ｃｏｒｔｅｘ）のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図２Ｂは、虚血性脳卒中ラットの脳海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
添付ファイル１は、図２Ａのカラー図面である。
添付ファイル２は、図２Ｂのカラー図面である。
図２Ａの左図は、脳卒中ラットの脳部皮質部位を撮影する顕微鏡写真図であり、四角枠は観察し撮影する部位である。図２Ａの右図は、ラットの脳部皮質部位におけるＢｍｉ−１を発現した細胞の統計結果である。
図２Ｂの左図は、脳卒中ラットの脳海馬部位を撮影する顕微鏡写真図であり、四角枠は観察し撮影する部位である。図２Ｂの右図は、ラットの脳部皮質部位におけるＢｍｉ−１を発現した細胞の統計結果である。
図２Ａ及び図２Ｂの結果から分かるように、脳卒中ラットと対照群のラットとを比べて、脳卒中ラットの脳部からより多くのＢｍｉ−１（Ｂｍｉ−１+）を発現する細胞が検出され、且つ主にラットの脳部梗塞境界に近い同側の皮質部位と脳海馬梗塞境界と海馬の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅｇｙｒｕｓ；ＤＧ）に発現される。また、脳卒中ラットと対照群のラットとを比べると、Ｂｍｉ−１の免疫反応向上が時間依存性を有し、脳虚血後の２４時間にＢｍｉ−１の最高発現量を達すことが判明される。
図２Ａ、図２Ｂ、添付ファイル１及び添付ファイル２を参照されたい。
図２Ａは、虚血性脳卒中ラットの脳部皮質（ｃｏｒｔｅｘ）のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図２Ｂは、虚血性脳卒中ラットの脳海馬（ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ）のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
添付ファイル１は、図２Ａのカラー図面である。
添付ファイル２は、図２Ｂのカラー図面である。
図２Ａの左図は、脳卒中ラットの脳部皮質部位を撮影する顕微鏡写真図であり、四角枠は観察し撮影する部位である。図２Ａの右図は、ラットの脳部皮質部位におけるＢｍｉ−１を発現した細胞の統計結果である。
図２Ｂの左図は、脳卒中ラットの脳海馬部位を撮影する顕微鏡写真図であり、四角枠は観察し撮影する部位である。図２Ｂの右図は、ラットの脳部皮質部位におけるＢｍｉ−１を発現した細胞の統計結果である。
図２Ａ及び図２Ｂの結果から分かるように、脳卒中ラットと対照群のラットとを比べて、脳卒中ラットの脳部からより多くのＢｍｉ−１（Ｂｍｉ−１+）を発現する細胞が検出され、且つ主にラットの脳部梗塞境界に近い同側の皮質部位と脳海馬梗塞境界と海馬の歯状回（ｄｅｎｔａｔｅｇｙｒｕｓ；ＤＧ）に発現される。また、脳卒中ラットと対照群のラットとを比べると、Ｂｍｉ−１の免疫反応向上が時間依存性を有し、脳虚血後の２４時間にＢｍｉ−１の最高発現量を達すことが判明される。
本試験は、更にウエスタンブロット法で虚血性脳卒中ラットの脳組織におけるＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を検出した。試験上、先に脳虚血後の４時間、１６時間、１日間、２日間、４日間、７日間及び１０日間の脳卒中ラットの脳部組織の全部タンパク質を抽出した後で、ウエスタンブロット法でタンパク質の発現量を検出し、脳卒中ラットの脳組織（皮質区と線条体）における閉塞がない相同性ドメインを正常な対照とした。
また図２Ｃを参照されたい。図２Ｃは、虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。
図２Ｃの結果から分かるように、脳卒中ラットの脳組織におけるＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が時間に依存するように向上し、この結果が図２Ａ及び図２Ｂの結果と一致であるので、脳虚血がラットの脳におけるＢｍｉ−１の発現を向上させることが判明される。
また図２Ｃを参照されたい。図２Ｃは、虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。
図２Ｃの結果から分かるように、脳卒中ラットの脳組織におけるＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が時間に依存するように向上し、この結果が図２Ａ及び図２Ｂの結果と一致であるので、脳虚血がラットの脳におけるＢｍｉ−１の発現を向上させることが判明される。
＜試験３−２．脳虚血後のＢｍｉ−１と神経膠細胞との共同発現＞
更に脳虚血後にＢｍｉ−１を発現するものがどんな脳細胞であるかを確定するために、試験上、虚血性脳卒中ラットの脳組織を免疫蛍光二重染色法で神経細胞マーカー及びＢｍｉ−１をキャリブレーションし、また共焦点顕微鏡で撮影し観察して、神経細胞マーカー及びＢｍｉ−１の共同発現の状況を確認し、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’,６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）で細胞核をキャリブレーションした。特定な細胞形態マーカーは、星状膠細胞マーカーＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、神経元特異性細胞骨格タンパク質ＭＡＰ−２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、神経核マーカーＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）及び神経幹細胞マーカーＮｅｓｔｉｎ（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）を含む。
更に脳虚血後にＢｍｉ−１を発現するものがどんな脳細胞であるかを確定するために、試験上、虚血性脳卒中ラットの脳組織を免疫蛍光二重染色法で神経細胞マーカー及びＢｍｉ−１をキャリブレーションし、また共焦点顕微鏡で撮影し観察して、神経細胞マーカー及びＢｍｉ−１の共同発現の状況を確認し、４’,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’,６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；ＤＡＰＩ）で細胞核をキャリブレーションした。特定な細胞形態マーカーは、星状膠細胞マーカーＧＦＡＰ（ｇｌｉａｌ ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ ａｃｉｄｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）、神経元特異性細胞骨格タンパク質ＭＡＰ−２（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ２）、神経核マーカーＮｅｕＮ（ｎｅｕｒｏｎａｌ ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｔｉｇｅｎ）及び神経幹細胞マーカーＮｅｓｔｉｎ（ｎｅｕｒｏｅｃｔｏｄｅｒｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｍａｒｋｅｒ）を含む。
図３及び添付ファイル３を参照されたい。図３は、虚血性脳卒中ラットの脳組織Ｂｍｉ−１及び神経細胞マーカーの共同発現を示す顕微鏡写真図である。
添付ファイル３は、図３のカラー図面であり、スケールが５０μｍを表す。
結果から分かるように、脳卒中ラット脳部で大量にＢｍｉ−１+を発現した細胞の虚血皮質部位又は歯状回から、Ｂｍｉ−１+細胞がそれぞれ神経幹細胞マーカー（Ｎｅｓｔｉｎ+）、成熟神経マーカー（ＭＡＰ−２+とＮｅｕＮ+）及び神経膠細胞マーカー（ＧＦＡＰ+）と共同発現することが見られた。
添付ファイル３は、図３のカラー図面であり、スケールが５０μｍを表す。
結果から分かるように、脳卒中ラット脳部で大量にＢｍｉ−１+を発現した細胞の虚血皮質部位又は歯状回から、Ｂｍｉ−１+細胞がそれぞれ神経幹細胞マーカー（Ｎｅｓｔｉｎ+）、成熟神経マーカー（ＭＡＰ−２+とＮｅｕＮ+）及び神経膠細胞マーカー（ＧＦＡＰ+）と共同発現することが見られた。
＜試験３−３．低酸素によるＢｍｉ−１の初代の大脳皮質細胞における発現の向上＞
低酸素の雰囲気がＢｍｉ−１の初代の大脳皮質細胞における発現に影響を与えるかを評価するために、本試験例は、それぞれ異なる酸素量（２１％、１％、３％と５％）で初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理を行い、又は異なる時間で（１時間、４時間、８時間、１６時間及び２４時間）初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理を行い、酸素量２１％の群を対照群とし、また免疫蛍光染色及びウエスタンブロット法で、異なる条件で処理された初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を分析した。
低酸素の雰囲気がＢｍｉ−１の初代の大脳皮質細胞における発現に影響を与えるかを評価するために、本試験例は、それぞれ異なる酸素量（２１％、１％、３％と５％）で初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理を行い、又は異なる時間で（１時間、４時間、８時間、１６時間及び２４時間）初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理を行い、酸素量２１％の群を対照群とし、また免疫蛍光染色及びウエスタンブロット法で、異なる条件で処理された初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を分析した。
図４Ａ〜図４Ｄ及び添付ファイル４を参照されたい。
図４Ａは、異なる酸素量で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図４Ｂは、異なる酸素量で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図４Ｃは、異なる時間で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞におけるＢｍｉ−１を発現する細胞の統計図である。図４Ｄは、異なる時間で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
添付ファイル４は、図４Ｂのカラー図面である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、ｎ＝８であり、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図４Ａ及び図４Ｂにおける初代の大脳皮質細胞が無酸素処理を行う時間が８時間であり、図４Ｃ及び図４Ｄにおける初代の大脳皮質細胞が無酸素処理を行う酸素量が１％であった。免疫蛍光染色又はウエスタンブロット法の結果の何れも、無酸素処理がされていない初代の大脳皮質細胞と比べて、低酸素雰囲気により初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現を向上させ、且つこの向上の状況が時間依存性（低酸素時間が１６時間である時にＢｍｉ−１の発現量が一番高い）及び投与量依存性（酸素量が３％である時にＢｍｉ−１の発現量が一番高い）を有することを示す。
図４Ａは、異なる酸素量で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図４Ｂは、異なる酸素量で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図４Ｃは、異なる時間で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞におけるＢｍｉ−１を発現する細胞の統計図である。図４Ｄは、異なる時間で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
添付ファイル４は、図４Ｂのカラー図面である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、ｎ＝８であり、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図４Ａ及び図４Ｂにおける初代の大脳皮質細胞が無酸素処理を行う時間が８時間であり、図４Ｃ及び図４Ｄにおける初代の大脳皮質細胞が無酸素処理を行う酸素量が１％であった。免疫蛍光染色又はウエスタンブロット法の結果の何れも、無酸素処理がされていない初代の大脳皮質細胞と比べて、低酸素雰囲気により初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現を向上させ、且つこの向上の状況が時間依存性（低酸素時間が１６時間である時にＢｍｉ−１の発現量が一番高い）及び投与量依存性（酸素量が３％である時にＢｍｉ−１の発現量が一番高い）を有することを示す。
＜試験３−４．虚血ラットのＨＩＦ−１α活性抑制によるＢｍｉ−１の発現の負調節＞
虚血後にＨＩＦ−１αを誘発することでＢｍｉ−１を正調節するかを証明するために、本試験例は、それぞれＨＩＦ−１α阻害剤（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ；２−ＭＥ２）で脳卒中ラットを処理し、又はＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウス（ＨＩＦ−１α ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ）を利用してから、免疫蛍光染色法及びウエスタンブロット法でラット（又はマウス）の虚血脳におけるＢｍｉ−１の発現量を分析した。
虚血後にＨＩＦ−１αを誘発することでＢｍｉ−１を正調節するかを証明するために、本試験例は、それぞれＨＩＦ−１α阻害剤（２−Ｍｅｔｈｏｘｙｅｓｔｒａｄｉｏｌ；２−ＭＥ２）で脳卒中ラットを処理し、又はＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウス（ＨＩＦ−１α ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ）を利用してから、免疫蛍光染色法及びウエスタンブロット法でラット（又はマウス）の虚血脳におけるＢｍｉ−１の発現量を分析した。
試験上、先に２−ＭＥ２をジメチルスルホキシド（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；ＤＭＳＯ）に溶解させて、１０ｍｍｏｌ／Ｌの貯蔵液を得た。２−ＭＥ２で脳卒中ラットを処理する方法については、Ｒｉｃｋｅｒ ＪＬ等により提出された工程（Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２００４；１０：８６６５−８６７３）を参照されたい。
試驗のラットは、脳虚血／再灌流を処理する前の何日間から脳虚血／再灌流を処理したまで、毎日、異なる投与量の２−ＭＥ２（５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇ）を含むリポソーム（ｄｉ−ｏｌｅｏｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ；ＵＳＡ）を５〜１０日連続して腹腔内に注射した。
試驗のラットは、脳虚血／再灌流を処理する前の何日間から脳虚血／再灌流を処理したまで、毎日、異なる投与量の２−ＭＥ２（５０ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ又は１５０ｍｇ／ｋｇ）を含むリポソーム（ｄｉ−ｏｌｅｏｙｌ−ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ；ＵＳＡ）を５〜１０日連続して腹腔内に注射した。
ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスは、ＨＩＦ−１αのｌｏｘＰ両側対立遺伝子を有し、Ｊｏｈｎｓｏｎ ＲＳ．チームにより贈られたものである（Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ；２０００；６０：４０１０−４０１５）。ＨＩＦ−１αの発現を中断させるために、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスに対して、胚胎期の第１５日から出生後の第１日まで、毎日、ドキシサイクリン誘導剤（２ｍｇ／ｍｌを５％ｗ／ｖの蔗糖溶液に溶解）を与えた。ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスに対しても、同様に、脳虚血／再灌流モデルでマウスの一過性局所脳虚血の症状を模擬した。
図５Ａ〜図５Ｄ、添付ファイル５及び添付ファイル６を参照されたい。
図５Ａは、虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの共同発現を示す顕微鏡写真図である。
図５Ｂは、２−ＭＥ２で処理された虚血性脳卒中ラットの腦部のＢｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図及びその定量化図である。
図５Ｃは、２−ＭＥ２で処理された虚血性脳卒中ラットの腦部のＢｍｉ−１の発現を示すウエスタンブロット法分析図である。
図５Ｄは、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスの腦部のＢｍｉ−１の発現を示すウエスタンブロット法分析図であり、ＮＬ（ｎｏｒｍａｌ ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）は、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスの同腹子であるがＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトがされていないマウスを表す。
添付ファイル５は、図５Ａのカラー図面である。
添付ファイル６は、図５Ｂのカラー図面である。
図５Ａの結果から分かるように、虚血性脳卒中ラットの脳部におけるＢｍｉ−１の発現が向上する皮質部位に、Ｂｍｉ−１+細胞の共同発現ＨＩＦ−１αが見られた。
図５Ｂ及び図５Ｃの結果から分かるように、脳虚血後にラットの脳におけるＢｍｉ−１の発現が向上する現象が２−ＭＥ２の注射により抑制され、且つその抑制作用が投与量依存性を有した。
図５Ｄの結果から分かるように、正常なマウスが脳虚血処理（脳虚血／再灌流モデルで）される群及び脳虚血処理がされていない群と比べて、その脳部のＢｍｉ−１の発現量が向上した。しかしながら、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスが脳虚血処理されてから、その脳部のＢｍｉ−１の発現量の向上が見られていない。上記の結果から、虚血性脳卒中ラットの（又はマウス）のＨＩＦ−１α活性を抑制すれば、Ｂｍｉ−１の発現を負調節するようになることが判明された。
図５Ａは、虚血性脳卒中ラットの脳部のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの共同発現を示す顕微鏡写真図である。
図５Ｂは、２−ＭＥ２で処理された虚血性脳卒中ラットの腦部のＢｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図及びその定量化図である。
図５Ｃは、２−ＭＥ２で処理された虚血性脳卒中ラットの腦部のＢｍｉ−１の発現を示すウエスタンブロット法分析図である。
図５Ｄは、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスの腦部のＢｍｉ−１の発現を示すウエスタンブロット法分析図であり、ＮＬ（ｎｏｒｍａｌ ｌｉｔｔｅｒｍａｔｅ）は、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスの同腹子であるがＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトがされていないマウスを表す。
添付ファイル５は、図５Ａのカラー図面である。
添付ファイル６は、図５Ｂのカラー図面である。
図５Ａの結果から分かるように、虚血性脳卒中ラットの脳部におけるＢｍｉ−１の発現が向上する皮質部位に、Ｂｍｉ−１+細胞の共同発現ＨＩＦ−１αが見られた。
図５Ｂ及び図５Ｃの結果から分かるように、脳虚血後にラットの脳におけるＢｍｉ−１の発現が向上する現象が２−ＭＥ２の注射により抑制され、且つその抑制作用が投与量依存性を有した。
図５Ｄの結果から分かるように、正常なマウスが脳虚血処理（脳虚血／再灌流モデルで）される群及び脳虚血処理がされていない群と比べて、その脳部のＢｍｉ−１の発現量が向上した。しかしながら、ＨＩＦ−１α遺伝子ノックアウトマウスが脳虚血処理されてから、その脳部のＢｍｉ−１の発現量の向上が見られていない。上記の結果から、虚血性脳卒中ラットの（又はマウス）のＨＩＦ−１α活性を抑制すれば、Ｂｍｉ−１の発現を負調節するようになることが判明された。
＜試験３−５．低酸素による初代の大脳皮質細胞ＨＩＦ−１αの核転座核輸入＞
本試験例は、更に免疫蛍光染色法でＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が低酸素雰囲気で初代の大脳皮質細胞インビボにおける位置を確定した。試験上、初代の大脳皮質細胞が３つの群に分けられ、それぞれ酸素量２１％の雰囲気に培養されるものを対照群とし、酸素量１％の雰囲気で８時間培養されるものを低酸素群とし、先に培地に１μＭの２−ＭＥ２を加え１６時間を処理してから酸素量１％の雰囲気で８時間培養されるものを低酸素＋２−ＭＥ２群とした。
本試験例は、更に免疫蛍光染色法でＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が低酸素雰囲気で初代の大脳皮質細胞インビボにおける位置を確定した。試験上、初代の大脳皮質細胞が３つの群に分けられ、それぞれ酸素量２１％の雰囲気に培養されるものを対照群とし、酸素量１％の雰囲気で８時間培養されるものを低酸素群とし、先に培地に１μＭの２−ＭＥ２を加え１６時間を処理してから酸素量１％の雰囲気で８時間培養されるものを低酸素＋２−ＭＥ２群とした。
図６Ａと添付ファイル７を参照されたい。
添付ファイル７は、図６Ａのカラー図面であり、ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が異なる条件で初代の大脳皮質細胞体における位置を示す顕微鏡写真図である。
図６Ａの結果から分かるように、正常な雰囲気で（対照群）、ＨＩＦ−１αが同時に細胞質（神経突起を含む）と細胞核に分布され、低酸素の雰囲気で、ＨＩＦ−１αが細胞核又は細胞核周囲の部位に転座され、且つ低酸素の雰囲気でＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が共同に発現した。先に２−ＭＥ２を処理する群は、ＨＩＦ−１αが低酸素雰囲気で核転座核輸入する状況を抑制した。
添付ファイル７は、図６Ａのカラー図面であり、ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が異なる条件で初代の大脳皮質細胞体における位置を示す顕微鏡写真図である。
図６Ａの結果から分かるように、正常な雰囲気で（対照群）、ＨＩＦ−１αが同時に細胞質（神経突起を含む）と細胞核に分布され、低酸素の雰囲気で、ＨＩＦ−１αが細胞核又は細胞核周囲の部位に転座され、且つ低酸素の雰囲気でＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１が共同に発現した。先に２−ＭＥ２を処理する群は、ＨＩＦ−１αが低酸素雰囲気で核転座核輸入する状況を抑制した。
本試験は、更にウエスタンブロット法でＨＩＦ−１α活性化とＢｍｉ−１の発現の間の関係を分析した。
図６Ｂを参照されたい。図６Ｂは、Ｂｍｉ−１を一時に発現した後で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
試験上、ＬＶ−Ｂｍｉ−１を初代の大脳皮質細胞にトランスフェクションし、初代の大脳皮質細胞で一時に大量にＢｍｉ−１を発現し、先に１μＭの２−ＭＥ２で１６時間を処理してからＬＶ−Ｂｍｉ−１を初代の大脳皮質細胞にトランスフェクションし、試験上、ＬＶ−ＧＦＰを初代の大脳皮質細胞にもトランスフェクションしたものを試験対照群とした。
図６Ｂの結果から分かるように、ＬＶ−Ｂｍｉ−１をトランスフェクションした後で、初代の大脳皮質細胞が大量にＢｍｉ−１を発現するが、この大量にＢｍｉ−１を発現する結果が先に２−ＭＥ２を処理する影響を受けない。
図６Ｂを参照されたい。図６Ｂは、Ｂｍｉ−１を一時に発現した後で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
試験上、ＬＶ−Ｂｍｉ−１を初代の大脳皮質細胞にトランスフェクションし、初代の大脳皮質細胞で一時に大量にＢｍｉ−１を発現し、先に１μＭの２−ＭＥ２で１６時間を処理してからＬＶ−Ｂｍｉ−１を初代の大脳皮質細胞にトランスフェクションし、試験上、ＬＶ−ＧＦＰを初代の大脳皮質細胞にもトランスフェクションしたものを試験対照群とした。
図６Ｂの結果から分かるように、ＬＶ−Ｂｍｉ−１をトランスフェクションした後で、初代の大脳皮質細胞が大量にＢｍｉ−１を発現するが、この大量にＢｍｉ−１を発現する結果が先に２−ＭＥ２を処理する影響を受けない。
また図６Ｃを参照されたい。図６Ｃは、ＨＩＦ−１αの発現を抑制した後で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。試験上、レンチウイルスにより標的ＨＩＦ−１αのｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈ；ｓｃ−３５５６２−Ｖ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養して、初代の大脳皮質細胞におけるＨＩＦ−１αの発現を低下させ、試験上、別に１μＭの２−ＭＥ２で１６時間を処理して初代の大脳皮質細胞におけるＨＩＦ−１αの発現を低下させ、試験上も、レンチウイルスにより対照群のｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈ；ｓｃ−１０８０８０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養して試験対照群とした。
図６Ｃの結果から分かるように、ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートしても又は先に２−ＭＥ２を処理しても、何れも初代の大脳皮質細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を低下させるとともに、初代の大脳皮質細胞におけるＢｍｉ−１の発現量も低下させた。
図６Ｃの結果から分かるように、ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートしても又は先に２−ＭＥ２を処理しても、何れも初代の大脳皮質細胞におけるＨＩＦ−１αの発現量を低下させるとともに、初代の大脳皮質細胞におけるＢｍｉ−１の発現量も低下させた。
上記の結果から分かるように、ＨＩＦ−１αの活性化は、ＨＩＦ−１αの核転座核輸入とＢｍｉ−１の発現を影響し、且つ２−ＭＥ２は、単独でＢｍｉ−１の発現を抑制できず、ＨＩＦ−１αによりガイドされるＢｍｉ−１の発現のみを抑制できる。
＜試験３−６．ＨＩＦ−１αがＢｍｉ−１遺伝子のプロモーターにリクルートされて低酸素を反応させた＞
ＨＩＦ−１αを正調節することのみにより低酸素雰囲気でＢｍｉ発現量を向上させることを証明するために、試験上、それぞれＨＩＦ−１αの発現又はＨＩＦ−２α（低酸素誘導因子の別のメンバー）発現を低下させてから、初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理をして、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αとＢｍｉ−１との間の関係を観察した。ＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−２α発現の低下は、レンチウイルスによりＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈ又は標的ＨＩＦ−２αのｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ＨＩＦ−２α−ｓｈ；ｓｃ−３５３１６−Ｖ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養した。試験上も、レンチウイルスにより対照群のＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養して試験対照群とした。
ＨＩＦ−１αを正調節することのみにより低酸素雰囲気でＢｍｉ発現量を向上させることを証明するために、試験上、それぞれＨＩＦ−１αの発現又はＨＩＦ−２α（低酸素誘導因子の別のメンバー）発現を低下させてから、初代の大脳皮質細胞に対して無酸素処理をして、ＨＩＦ−１αとＨＩＦ−２αとＢｍｉ−１との間の関係を観察した。ＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−２α発現の低下は、レンチウイルスによりＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈ又は標的ＨＩＦ−２αのｓｈＲＮＡ（ＬＶ−ＨＩＦ−２α−ｓｈ；ｓｃ−３５３１６−Ｖ；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養した。試験上も、レンチウイルスにより対照群のＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを培地にインポートし初代の大脳皮質細胞を培養して試験対照群とした。
図７Ａを参照されたい。図７Ａは、ＨＩＦ−１α又はＨＩＦ−２α発現を抑制した後で無酸素処理をした初代の大脳皮質細胞のＢｍｉ−１の発現量を示す分析図であり、ウエスタンブロット法でＢｍｉ−１の発現量を分析した。
結果から分かるように、初代の大脳皮質細胞のＨＩＦ−１αの発現を抑制してから、Ｂｍｉ−１の発現が検出されていないが、初代の大脳皮質細胞のＨＩＦ−２αを抑制してもＢｍｉ−１の発現を影響しなく、これで低酸素雰囲気で向上したＢｍｉ−１の発現がＨＩＦ−１αにより調節されるが、ＨＩＦ−２αに調節されないことが判明される。
結果から分かるように、初代の大脳皮質細胞のＨＩＦ−１αの発現を抑制してから、Ｂｍｉ−１の発現が検出されていないが、初代の大脳皮質細胞のＨＩＦ−２αを抑制してもＢｍｉ−１の発現を影響しなく、これで低酸素雰囲気で向上したＢｍｉ−１の発現がＨＩＦ−１αにより調節されるが、ＨＩＦ−２αに調節されないことが判明される。
ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１のプロモーターとの間の相互作用の直接証拠を取得するために、本試験例は、更にクロマチン免疫沈降法（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）で確定した。試験上、先に初代の大脳皮質細胞を酸素量３％の雰囲気に４時間培養してから、１％のホルムアルデヒド（ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）を３７℃で２０分間固定して、後の可逆的架橋に寄与した。また商業化試薬キット（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でクロマチン免疫沈降法を行い、ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１プロモーター（ＮＣＢＩ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ：ＮＣ＿００００１０．１０）の結合を検出した。
ＤＮＡ−タンパク質複合物は、抗ＨＩＦ−１α一次抗体が接種されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓで免疫沈降を行い、また１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）と０．１Ｍの重炭酸ナトリウムで溶出した。ＤＮＡ−タンパク質の架橋により複合物を６５℃で５時間培養して逆転させ、且つプロテアーゼＫでタンパク質を取り除きすることができる。分離されたＤＮＡをフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）／クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）で抽出してから、ＰＣＲで大きくした。使用されたプライマーがＢｍｉ−１プロモーターのプライマーであり、フォワードプライマーの配列が５’−ＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＣ Ｃ−３’であり、リバースプライマーの配列が５’−ＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧ ＧＧＣ−３’であった。
ＤＮＡ−タンパク質複合物は、抗ＨＩＦ−１α一次抗体が接種されたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ ａｇａｒｏｓｅ ｂｅａｄｓで免疫沈降を行い、また１％のドデシル硫酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ；ＳＤＳ）と０．１Ｍの重炭酸ナトリウムで溶出した。ＤＮＡ−タンパク質の架橋により複合物を６５℃で５時間培養して逆転させ、且つプロテアーゼＫでタンパク質を取り除きすることができる。分離されたＤＮＡをフェノール（ｐｈｅｎｏｌ）／クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）で抽出してから、ＰＣＲで大きくした。使用されたプライマーがＢｍｉ−１プロモーターのプライマーであり、フォワードプライマーの配列が５’−ＣＣＧＣＧＧＧＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＣ Ｃ−３’であり、リバースプライマーの配列が５’−ＧＧＧＧＣＣＧＧＣＡＧＧＣＧＣＧＧ ＧＧＣ−３’であった。
図７Ｂ及び図７Ｃを参照されたい。
図７Ｂは、Ｂｍｉ−１の５’端のゲノム部位を示す模式図である。
図７Ｃは、初代の大脳皮質細胞のクロマチン免疫沈降法の結果図である。
図７Ｂにおいて、Ｂｍｉ−１の５’端のゲノム部位がＢｍｉ−１プロモーター部位、第１のエクソン部位及びＨＲＥ（ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）結合部位を含み、ＨＲＥ結合部位がヌクレオチド−２７２〜−２６８（推定する転写開始部位に対して＋１）であることが判明される。
図７Ｃの結果から分かるように、初代の大脳皮質細胞が４時間の無酸素処理された後で、ＨＩＦ−１αがＢｍｉ−１プロモーターにリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）されそして直接結合されるが、この現象がＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈの初代の大脳皮質細胞にインポートする場合で見られなかった。
上記の結果から分かるように、低酸素の状况で、ＨＩＦ−１αがＢｍｉ−１遺伝子のプロモーターにリクルートされ結合されて、Ｂｍｉ−１の発現を正調節した。
図７Ｂは、Ｂｍｉ−１の５’端のゲノム部位を示す模式図である。
図７Ｃは、初代の大脳皮質細胞のクロマチン免疫沈降法の結果図である。
図７Ｂにおいて、Ｂｍｉ−１の５’端のゲノム部位がＢｍｉ−１プロモーター部位、第１のエクソン部位及びＨＲＥ（ｈｏｒｍｏｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）結合部位を含み、ＨＲＥ結合部位がヌクレオチド−２７２〜−２６８（推定する転写開始部位に対して＋１）であることが判明される。
図７Ｃの結果から分かるように、初代の大脳皮質細胞が４時間の無酸素処理された後で、ＨＩＦ−１αがＢｍｉ−１プロモーターにリクルート（ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ）されそして直接結合されるが、この現象がＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈの初代の大脳皮質細胞にインポートする場合で見られなかった。
上記の結果から分かるように、低酸素の状况で、ＨＩＦ−１αがＢｍｉ−１遺伝子のプロモーターにリクルートされ結合されて、Ｂｍｉ−１の発現を正調節した。
＜試験３−７．低酸素条件でＢｍｉの正調節はＨＩＦ−１αに誘導された転写活性により調節された＞
更に低酸素雰囲気で細胞Ｂｍｉ−１の発現の向上が、ＨＩＦ−１α活性化後にＢｍｉ−１プロモーターのＨＲＥ結合部位に結合される結果によるかを確定するために、本試験は、異なるプラスチドを構築し、ルシフェラーゼアッセイ法（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）により低酸素雰囲気でそのルシフェラーゼ活性を検出した。構築されたプラスチドは、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチド、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドとｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドを含んだ。
更に低酸素雰囲気で細胞Ｂｍｉ−１の発現の向上が、ＨＩＦ−１α活性化後にＢｍｉ−１プロモーターのＨＲＥ結合部位に結合される結果によるかを確定するために、本試験は、異なるプラスチドを構築し、ルシフェラーゼアッセイ法（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ）により低酸素雰囲気でそのルシフェラーゼ活性を検出した。構築されたプラスチドは、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチド、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドとｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドを含んだ。
図８Ａを参照されたい。図８Ａは、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチド、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドとｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドの５’端のゲノム部位を示す模式図である。
試験上、先に５’端のゲノム部位を含む人類Ｂｍｉ−１遺伝子のプロモーター（約９００ ｂｐ）をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に構築してｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドが得られ、その中ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターがＨＲＥ結合部位を有し、且つｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターがルシフェラーゼ発現ベクターであった。ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドは、ＨＲＥ結合部位を有しないプラスチドであり、他の部分がｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドと同じであった。ｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドは、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドにおけるＨＲＥ結合部位の配列を５’−ＧＣＧＴＧ−３’から５’−ＡＡＡＡＧ−３’に置換した。すべての構築されたプラスチドをそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、試験上、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターも３Ｔ３細胞にトランスフェクションして対照群とした。また、トランスフェクション效率を校正するために、３Ｔ３細胞は、同時にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をコーディングするｐＲＬ−ＳＶ４０ベクターを共トランスフェクションしてから、３Ｔ３細胞を低酸素雰囲気で（酸素量３％）培養した。
ルシフェラーゼ活性を測定する時に、先に細胞を開裂させてから、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し冷光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルシフェラーゼ活性を測定した。
試験上、先に５’端のゲノム部位を含む人類Ｂｍｉ−１遺伝子のプロモーター（約９００ ｂｐ）をｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）に構築してｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドが得られ、その中ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターがＨＲＥ結合部位を有し、且つｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターがルシフェラーゼ発現ベクターであった。ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドは、ＨＲＥ結合部位を有しないプラスチドであり、他の部分がｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドと同じであった。ｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドは、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドにおけるＨＲＥ結合部位の配列を５’−ＧＣＧＴＧ−３’から５’−ＡＡＡＡＧ−３’に置換した。すべての構築されたプラスチドをそれぞれＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３Ｔ３細胞にトランスフェクションし、試験上、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターも３Ｔ３細胞にトランスフェクションして対照群とした。また、トランスフェクション效率を校正するために、３Ｔ３細胞は、同時にＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ遺伝子をコーディングするｐＲＬ−ＳＶ４０ベクターを共トランスフェクションしてから、３Ｔ３細胞を低酸素雰囲気で（酸素量３％）培養した。
ルシフェラーゼ活性を測定する時に、先に細胞を開裂させてから、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用し冷光マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）でルシフェラーゼ活性を測定した。
図８Ｂを参照されたい。図８Ｂは、ルシフェラーゼアッセイ法の結果図であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示す。
結果から分かるように、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドのルシフェラーゼ活性がその他の群よりも著しく高く、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドがｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドとｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドと比べて、Ｂｍｉ−１遺伝子のプロモーターの完全な５’端のゲノム部位を有した。
上記の結果から分かるように、低酸素雰囲気でのＨＩＦ−１αの活性化は、Ｂｍｉ−１の発現量を向上させることを促すように、Ｂｍｉ−１プロモーターのＨＲＥ結合部位に結合される必要がある。
結果から分かるように、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドのルシフェラーゼ活性がその他の群よりも著しく高く、ｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−１プラスチドがｐＢｍｉ−１−ｌｕｃ−２プラスチドとｐＢｍｉ−１ｍｕｔＨＲＥプラスチドと比べて、Ｂｍｉ−１遺伝子のプロモーターの完全な５’端のゲノム部位を有した。
上記の結果から分かるように、低酸素雰囲気でのＨＩＦ−１αの活性化は、Ｂｍｉ−１の発現量を向上させることを促すように、Ｂｍｉ−１プロモーターのＨＲＥ結合部位に結合される必要がある。
＜試験３−８．低酸素はＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって神経幹細胞インビトロの増殖と自己再生を刺激した＞
ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１カスケード反応が神経幹細胞の≡殖を調節するかを確定するために、本試験例において、神経幹細胞の非接着培養により、神経幹細胞がニューロスフェアを形成するかを確認して、ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１経路による神経幹細胞の自己再生の効果を確定した。
ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１カスケード反応が神経幹細胞の≡殖を調節するかを確定するために、本試験例において、神経幹細胞の非接着培養により、神経幹細胞がニューロスフェアを形成するかを確認して、ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１経路による神経幹細胞の自己再生の効果を確定した。
神経幹細胞を調製するために、成体マウス（４週齢）の側脳室の脳室下帯（ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ；ＳＶＺ）を取り、髄膜を取り除いてから神経幹細胞の分離をＶｉｅｇａｓ Ｐにより提出された工程（Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ ２００６；１１９,４４６７−４４７４）を参照して、且つすべての工程を無菌状態下で操作した。ニューロスフェア培養は、神経幹細胞をＢ−２７サプリメント（２％；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、Ｌ−グルタミン（０．５ｍＭ；ＰＡＮ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及びストレプトマイシン（０．１ｍｇ／ｍｌ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）が添加される神経元細胞培地（ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ ｍｅｄｉｕｍ；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）に培養した。神経幹細胞を確保し大きくして培養するために、神経元細胞培地に別に２μｇ／ｍＬのヘパリン（Ｓｉｇｍａ）、２０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ−２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と２０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を加え、ニューロスフェア培養物を３７℃、５％ ＣＯ2のインキュベータに培養した。無性／低密度培養のために、培養後の高密度の初代のニューロスフェアを分離させ希釈して９６ウェルマイクロタイタープレートに接種し、各ウェルに０．２ｍＬのニューロスフェア培養物があり、細胞の密度が１００細胞／ｍＬであった。７日培養した後で、新規に形成されるニューロスフェアの数量を算出し、免疫蛍光染色でニューロスフェアにおけるＢｍｉ−１、ＳＯＸ２、Ｎｅｓｔｉｎ、Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ＢｒｄＵとＫｉ−６７の発現を確認した。
図９Ａと添付ファイル８を参照されたい。
図９Ａは、神経幹細胞のニューロスフェア培養の顕微鏡写真図である。
添付ファイル８は、図９Ａのカラー図面であり、スケールが５０μｍを表す。
結果から分かるように、ニューロスフェアにおいてＢｍｉ−１と幹細胞マーカー（Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ＮｅｓｔｉｎとＳＯＸ２）が共同発現し、Ｎｅｓｔｉｎを発現した細胞も増殖マーカー（ＢｒｄＵとｋｉ−６７）と共同に発現した。
図９Ａは、神経幹細胞のニューロスフェア培養の顕微鏡写真図である。
添付ファイル８は、図９Ａのカラー図面であり、スケールが５０μｍを表す。
結果から分かるように、ニューロスフェアにおいてＢｍｉ−１と幹細胞マーカー（Ｍｕｓａｓｈｉ−１、ＮｅｓｔｉｎとＳＯＸ２）が共同発現し、Ｎｅｓｔｉｎを発現した細胞も増殖マーカー（ＢｒｄＵとｋｉ−６７）と共同に発現した。
本試験は、別に神経幹細胞をそれぞれ異なる酸素量（２１％、５％、３％と１％）の雰囲気で培養し、正常な雰囲気と低酸素の雰囲気でニューロスフェアの形成数量を影響するかを観察した。
図９Ｂと添付ファイル９を参照されたい。
添付ファイル９は、図９Ｂのカラー図面であり、神経幹細胞が無酸素処理されたニューロスフェア培養の顕微鏡写真図である。
結果から分かるように、酸素量３％の雰囲気で、神経幹細胞のニューロスフェアを形成する数量が一番多かった。
図９Ｂと添付ファイル９を参照されたい。
添付ファイル９は、図９Ｂのカラー図面であり、神経幹細胞が無酸素処理されたニューロスフェア培養の顕微鏡写真図である。
結果から分かるように、酸素量３％の雰囲気で、神経幹細胞のニューロスフェアを形成する数量が一番多かった。
本試験は、更にレンチウイルスによりそれぞれＬＶ−Ｂｍｉ−ｓｈ又はＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈを神経幹細胞にインポートし、異なる酸素量（２１％、５％、３％と１％）でニューロスフェアを培養し、異なる条件でニューロスフェアの形成頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力、ニューロスフェアのサイズ及び神経幹細胞においてＢｒｄＵ（ＢｒｄＵ+）とｋｉ−６７（ｋｉ−６７+）を発現する細胞の比例を観察し、神経幹細胞の自己再生潜在力が神経幹細胞のＮｅｓｔｉｎの発現量で評価された。
また、本試験においても、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）の側脳の脳室下帯で神経幹細胞を調製し、そしてＢｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウスの同腹子であるが遺伝子ノックアウトがされていないマウス（ＮＬ）の側脳の脳室下帯で神経幹細胞を調製して、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）はヘテロ接合体を持つＢｍｉ−１+/-マウスの交配により得られ、Ｂｍｉ−１+/-マウスはＶａｎ Ｌｏｈｕｉｚｅｎチームの贈れ（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ ２０１２；１２２：１９２０−１９３２）からであった。前記神経幹細胞に対してニューロスフェア培養をしてから、レンチウイルスによりそれぞれＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈを神経幹細胞にインポートし、異なる酸素量（２１％と３％）でニューロスフェア培養を行い、異なる条件でニューロスフェアの形成頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力、ニューロスフェアのサイズ及び神経幹細胞におけるＢｒｄＵ+細胞比例とｋｉ−６７+細胞比例を観察した。
図９Ｃ〜図９Ｈを参照されたい。
図９Ｃは、神経幹細胞にＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈが導入されたＢｍｉ−１の発現を示す図である。
図９Ｄは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のニューロスフェアの形成頻度を示す統計図である。
図９Ｅは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合の神経幹細胞の自己再生潜在力を示す統計図である。
図９Ｆは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のニューロスフェアのサイズを示す統計図である。
図９Ｇは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のＢｒｄＵ+細胞比例を示す統計図である。
図９Ｈは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のｋｉ−６７+細胞比例を示す統計図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図９Ｃは、神経幹細胞にＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈが導入されたＢｍｉ−１の発現を示す図である。
図９Ｄは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のニューロスフェアの形成頻度を示す統計図である。
図９Ｅは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合の神経幹細胞の自己再生潜在力を示す統計図である。
図９Ｆは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のニューロスフェアのサイズを示す統計図である。
図９Ｇは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のＢｒｄＵ+細胞比例を示す統計図である。
図９Ｈは、異なる酸素量でニューロスフェア培養を行う場合のｋｉ−６７+細胞比例を示す統計図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図９Ｃの結果から分かるように、ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈをインポートすることで確実に神経幹細胞におけるＢｍｉ−１の発現を低下させることができ、且つとＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈをインポートするが正常酸素（酸素量２１％）で培養する群と比べて、低酸素雰囲気（酸素量３％）により神経幹細胞におけるＢｍｉ−１を大量に発現させた。
図９Ｄ〜図９Ｆの結果から分かるように、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトがされていないマウスから調製された神経幹細胞が低酸素の雰囲気でニューロスフェアの形成頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力とニューロスフェアのサイズを向上させることができる（特に酸素量が３％である条件で）。しかし、Ｂｍｉ−１の発現を低下させる群（ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈをインポートした、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウスから調製された神経幹細胞）とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で、低酸素によりガイドされる神経幹細胞の増殖能力の何れも抑制された。
別に図９Ｇと図９Ｈの結果から分かるように、特に酸素量が３％である条件で、低酸素の雰囲気でより多くのＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞が見られるが、この現象がＢｍｉ−１の発現を低下させる群と下ＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で見られない。
図９Ｄ〜図９Ｆの結果から分かるように、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトがされていないマウスから調製された神経幹細胞が低酸素の雰囲気でニューロスフェアの形成頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力とニューロスフェアのサイズを向上させることができる（特に酸素量が３％である条件で）。しかし、Ｂｍｉ−１の発現を低下させる群（ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈをインポートした、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウスから調製された神経幹細胞）とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で、低酸素によりガイドされる神経幹細胞の増殖能力の何れも抑制された。
別に図９Ｇと図９Ｈの結果から分かるように、特に酸素量が３％である条件で、低酸素の雰囲気でより多くのＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞が見られるが、この現象がＢｍｉ−１の発現を低下させる群と下ＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で見られない。
上記の結果から分かるように、低酸素雰囲気で、ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を調節することにより、神経幹細胞の増殖と神経幹細胞の自己再生潜在力を促すことができる。
四、本発明のイリドイド配糖体類化合物により脳卒中を治療する効果
前記により本発明のイリドイド配糖体類化合物が神経幹細胞を保護する能力があることが分かり、この部分の試験例で本発明のイリドイド配糖体類化合物がインビトロとインビボで神経幹細胞増殖と自己再生を促す能力、及び本発明のイリドイド配糖体類化合物が脳組織損傷の個体への治療に用いられる効果を検討した。以下の試験例は、乳酸脱水素酵素の放出率分析結果が最適な化合物を試験の目標とした。注意すべきなのは、精製の化合物１による効果が化合物１を主要な有効成分とする混合物に発見された。
前記により本発明のイリドイド配糖体類化合物が神経幹細胞を保護する能力があることが分かり、この部分の試験例で本発明のイリドイド配糖体類化合物がインビトロとインビボで神経幹細胞増殖と自己再生を促す能力、及び本発明のイリドイド配糖体類化合物が脳組織損傷の個体への治療に用いられる効果を検討した。以下の試験例は、乳酸脱水素酵素の放出率分析結果が最適な化合物を試験の目標とした。注意すべきなのは、精製の化合物１による効果が化合物１を主要な有効成分とする混合物に発見された。
＜試験４−１．化合物１はＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１経路によりインビトロの神経幹細胞の増殖と自己再生を促した＞
［ｉ．化合物１によるインビトロの神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響］
化合物１が神経幹細胞の自己再生を調節するかを検討するために、本試験例で化合物１による神経幹細胞の正常酸素雰囲気（酸素量２１％）でのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響を検査した。
［ｉ．化合物１によるインビトロの神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響］
化合物１が神経幹細胞の自己再生を調節するかを検討するために、本試験例で化合物１による神経幹細胞の正常酸素雰囲気（酸素量２１％）でのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響を検査した。
試験上、先にニューロスフェア培地にそれぞれ異なる濃度の化合物１（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ及び１００μＭ）を加えてから、ウエスタンブロット法で神経幹細胞のＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を観察した。試験上、化合物１が添加されない群を試験対照群とした。
図１０Ａを参照されたい。図１０Ａは、化合物１の神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量に対する影響示す分析図である。
結果から分かるように、培地に化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えた群の、神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を向上させた。
図１０Ａを参照されたい。図１０Ａは、化合物１の神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量に対する影響示す分析図である。
結果から分かるように、培地に化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えた群の、神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を向上させた。
本試験は、更に先に神経幹細胞のＨＩＦ−１αの発現を抑制してから、培地に１μＭの化合物１を加え、ウエスタンブロット法で神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を観察した。神経幹細胞ＨＩＦ−１αの発現を抑制する方法は、１μＭの２−ＭＥ２で神経幹細胞を１６時間処理し、又はレンチウイルスによりＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈＲＮＡとＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈＲＮＡを神経幹細胞にインポートした。
図１０Ｂを参照されたい。図１０Ｂは、ＨＩＦ−１αの発現を抑制した後で化合物１で処理された神経幹細胞のＨＩＦ−１α及びＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図１０Ｂ及び図１０Ａとの結果が同じであり、化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えて神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を向上させるが、神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量が化合物１の添加により向上する現象は、ＨＩＦ−１αの発現を抑制する群（２−ＭＥ２を加えそしてＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）の何れも抑制された。
図１０Ｂを参照されたい。図１０Ｂは、ＨＩＦ−１αの発現を抑制した後で化合物１で処理された神経幹細胞のＨＩＦ−１α及びＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図１０Ｂ及び図１０Ａとの結果が同じであり、化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えて神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を向上させるが、神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量が化合物１の添加により向上する現象は、ＨＩＦ−１αの発現を抑制する群（２−ＭＥ２を加えそしてＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）の何れも抑制された。
本試験例は、別に１μＭの化合物１を神経幹細胞の培地に加え、異なる時間で（０．５時間、１時間、４時間、８時間、１６時間及び２４時間）で引き続き神経幹細胞を培養し、ウエスタンブロット法により神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を観察した。
図１０Ｃを参照されたい。図１０Ｃは、化合物１の異なる処理時間での神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、ＨＩＦ−１αの発現の部分において、化合物１で０．５時間を処理する神経幹細胞のそのＨＩＦ−１αの発現量が一番高く、且つ神経幹細胞のＨＩＦ−１αの発現量が化合物１の処理時間が長くなることにつれて減少した。Ｂｍｉ−１の発現の部分において、神経幹細胞のＢｍｉ−１の発現量が化合物１の処理時間が長くなることにつれて向上し、且つ第１６時間で一番高いＢｍｉ−１の発現量に達した。
上記の結果から分かるように、化合物１がＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１を向上させることは時間依存性があった。
図１０Ｃを参照されたい。図１０Ｃは、化合物１の異なる処理時間での神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、ＨＩＦ−１αの発現の部分において、化合物１で０．５時間を処理する神経幹細胞のそのＨＩＦ−１αの発現量が一番高く、且つ神経幹細胞のＨＩＦ−１αの発現量が化合物１の処理時間が長くなることにつれて減少した。Ｂｍｉ−１の発現の部分において、神経幹細胞のＢｍｉ−１の発現量が化合物１の処理時間が長くなることにつれて向上し、且つ第１６時間で一番高いＢｍｉ−１の発現量に達した。
上記の結果から分かるように、化合物１がＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１を向上させることは時間依存性があった。
［ｉｉ．化合物１によるインビトロの神経幹細胞の増殖への影響］
化合物１が神経幹細胞の増殖を調節するかを検討するために、本試験例は、まずＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路による神経幹細胞の自己再生への影響を検査した。神経幹細胞の増殖潜在力を検出するために、試験上、ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で神経幹細胞をキャリブレーションし、引き続き神経幹細胞を５日間培養してから、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ）でＣＦＳＥの神経幹細胞における分布状况を検出し、更にＭＯＤＦＩＴソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ；ＭＥ）で神経幹細胞の増殖指数（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ；ＰＩ）を算出し、算出の方法について前の研究に提出された工程（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７；２：２０５７−２０６７；ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ２０１１；２９：２０６２_２０７６）を参照して、算出される増殖指数が高いほど、細胞増殖能力がよくなることを示す。試験上、同時に神経幹細胞の培地にそれぞれ異なる濃度の化合物１（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）を加え１６時間を処理し、化合物１を加えることが神経幹細胞の増殖を影響するかを観察し、試験が化合物１の添加されない群を含み試験対照群とした。
化合物１が神経幹細胞の増殖を調節するかを検討するために、本試験例は、まずＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路による神経幹細胞の自己再生への影響を検査した。神経幹細胞の増殖潜在力を検出するために、試験上、ＣＦＳＥ（ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｅｓｔｅｒ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で神経幹細胞をキャリブレーションし、引き続き神経幹細胞を５日間培養してから、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；ＢＤ）でＣＦＳＥの神経幹細胞における分布状况を検出し、更にＭＯＤＦＩＴソフトウェア（Ｖｅｒｉｔｙ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｈｏｕｓｅ；ＭＥ）で神経幹細胞の増殖指数（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ；ＰＩ）を算出し、算出の方法について前の研究に提出された工程（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２００７；２：２０５７−２０６７；ＳＴＥＭ ＣＥＬＬＳ ２０１１；２９：２０６２_２０７６）を参照して、算出される増殖指数が高いほど、細胞増殖能力がよくなることを示す。試験上、同時に神経幹細胞の培地にそれぞれ異なる濃度の化合物１（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）を加え１６時間を処理し、化合物１を加えることが神経幹細胞の増殖を影響するかを観察し、試験が化合物１の添加されない群を含み試験対照群とした。
図１１Ａ〜図１１Ｄを参照されたい。
図１１Ａは、対照群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｂは、０．１μＭの化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｃは、１μＭの化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｄは、１０μＭ化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
結果から分かるように、神経幹細胞培地に化合物１を加えて神経幹細胞の増殖を促すことができ、特に１μＭの化合物１を加えて、神経幹細胞の増殖指数を４．３７から６．７７に向上させることができる。
図１１Ａは、対照群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｂは、０．１μＭの化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｃは、１μＭの化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
図１１Ｄは、１０μＭ化合物１で処理される群の神経幹細胞の増殖指数測定の結果図である。
結果から分かるように、神経幹細胞培地に化合物１を加えて神経幹細胞の増殖を促すことができ、特に１μＭの化合物１を加えて、神経幹細胞の増殖指数を４．３７から６．７７に向上させることができる。
また図１１Ｅを参照されたい。図１１Ｅは、異なる濃度（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のニューロスフェア培養を示す顕微鏡写真図であり、その中スケールが５０μｍを表す。
図１１Ｅと図１１Ａ〜図１１Ｄの結果が同じであり、神経幹細胞培地に化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加える群でニューロスフェアの形成を促すことができる。
図１１Ｅと図１１Ａ〜図１１Ｄの結果が同じであり、神経幹細胞培地に化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加える群でニューロスフェアの形成を促すことができる。
試験上、別に神経幹細胞培養液にそれぞれ異なる濃度の化合物１（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）を加え１６時間を処理し、１μＭの化合物１を処理する群に加え、別に群がレンチウイルスによりそれぞれＬＶ−Ｂｍｉ−ｓｈ又はＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈを神経幹細胞にインポートしてから、ニューロスフェア培養を行い、異なる条件でニューロスフェアの形成頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力とニューロスフェアのサイズを観察し、使用される細胞が正常マウス、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）とＮＬマウスから調製される神経幹細胞を含んだ。
図１１Ｆ〜図１１Ｈを参照されたい。
図１１Ｆは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のニューロスフェアの形成頻度を示す統計図である。
図１１Ｇは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合の神経幹細胞の自己再生潜在力を示す統計図である。
図１１Ｈは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のニューロスフェアのサイズを示す統計図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えて神経幹細胞がニューロスフェアを形成する頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力とニューロスフェアのサイズを向上させることができ、化合物１の神経幹細胞の増殖を向上させることが投与量依存性を有することを示す。しかし、Ｂｍｉ−１の発現を低下させる群（ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈをインポートした、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウスから調製された神経幹細胞）とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポート）では、化合物１にガイドされる神経幹細胞の増殖能力の何れも抑制された。
図１１Ｆは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のニューロスフェアの形成頻度を示す統計図である。
図１１Ｇは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合の神経幹細胞の自己再生潜在力を示す統計図である。
図１１Ｈは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のニューロスフェアのサイズを示す統計図である。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１を加え、特に１μＭの化合物１を加えて神経幹細胞がニューロスフェアを形成する頻度、神経幹細胞の自己再生潜在力とニューロスフェアのサイズを向上させることができ、化合物１の神経幹細胞の増殖を向上させることが投与量依存性を有することを示す。しかし、Ｂｍｉ−１の発現を低下させる群（ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈをインポートした、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウスから調製された神経幹細胞）とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポート）では、化合物１にガイドされる神経幹細胞の増殖能力の何れも抑制された。
本試験は、別に免疫蛍光染色法により化合物１の添加が神経幹細胞の増殖マーカーの発現を影響するかを検出した。試験上、神経幹細胞培養液にそれぞれ異なる濃度の化合物１（０．１μＭ、１μＭ及び１０μＭ）を加え１６時間を処理し、１μＭの化合物１を処理する群に加え、別に群がレンチウイルスによりそれぞれＬＶ−Ｂｍｉ−ｓｈ又はＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈを神経幹細胞にインポートして、神経幹細胞Ｂｍｉの発現又はＨＩＦ−１αの発現を低下させてから、免疫蛍光染色法により神経幹細胞のＮｅｓｔｉｎ、ＢｒｄＵとＫｉ−６７発現を確定し、異なる条件で神経幹細胞がＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞を発現する比例を観察し、使用される細胞が正常マウス、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）とＮＬマウスから調整される神経幹細胞を含んだ。
図１２Ａ〜図１２Ｃと添付ファイル１０を参照されたい。
図１２Ａは、免疫蛍光染色法により神経幹細胞の増殖マーカーの発現を検出する顕微鏡写真図である。
図１２Ｂは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のＢｒｄＵを発現する細胞比例を示す統計図である。
図１２Ｃは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のｋｉ−６７を発現する細胞比例を示す統計図であり、スケールが５０μｍを表す。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
添付ファイル１０は、図１２Ａのカラー図面である。
図１２Ａは、免疫蛍光染色法により神経幹細胞の増殖マーカーの発現を検出する顕微鏡写真図である。
図１２Ｂは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のＢｒｄＵを発現する細胞比例を示す統計図である。
図１２Ｃは、異なる濃度の化合物１を神経幹細胞培地に加える場合のｋｉ−６７を発現する細胞比例を示す統計図であり、スケールが５０μｍを表す。
データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
添付ファイル１０は、図１２Ａのカラー図面である。
図１２Ａの結果から分かるように、神経幹細胞においてＮｅｓｔｉｎが増殖マーカー（ＢｒｄＵとｋｉ−６７）と共同に発現した。
図１２Ｂ及び図１２Ｃの結果から分かるように、化合物１を加えて神経幹細胞におけるＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞の比例を向上させることができ、特に１μＭの化合物１を処理する群で、化合物１の神経幹細胞におけるＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞を向上させる比例が投与量依存性を有することを示するが、この現象がＢｍｉ−１の発現を低下させる群とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で見られなかった。Ｂｍｉ−１の発現とＨＩＦ−１αの発現を低下させては化合物１の神経幹細胞増殖を促す作用を抑制することを示す。
図１２Ｂ及び図１２Ｃの結果から分かるように、化合物１を加えて神経幹細胞におけるＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞の比例を向上させることができ、特に１μＭの化合物１を処理する群で、化合物１の神経幹細胞におけるＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞を向上させる比例が投与量依存性を有することを示するが、この現象がＢｍｉ−１の発現を低下させる群とＨＩＦ−１αの発現を低下させる群（ＬＶ−ＨＩＦ−１α−ｓｈをインポートする）で見られなかった。Ｂｍｉ−１の発現とＨＩＦ−１αの発現を低下させては化合物１の神経幹細胞増殖を促す作用を抑制することを示す。
上記の結果から分かるように、化合物１がＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を調節することにより、インビトロの神経幹細胞増殖と自己再生潜在力を促すことができる。
＜試験４−２．化合物１を全身注射してインビボの神経幹細胞増殖を向上させた＞
［ｉ．化合物１による脳卒中ラットの脳内の神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響］
化合物１のインビボ神経幹細胞の自己再生への影響を検討するために、本試験例は、まず化合物１の投薬が脳卒中ラットの脳内のＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１に対する正調節を影響するかを検査した。
［ｉ．化合物１による脳卒中ラットの脳内の神経幹細胞ＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現への影響］
化合物１のインビボ神経幹細胞の自己再生への影響を検討するために、本試験例は、まず化合物１の投薬が脳卒中ラットの脳内のＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１に対する正調節を影響するかを検査した。
試験上、脳虚血／再灌流モデルを行うラットの右中大脳動脈を閉塞させて４時間の後で、異なる投与量の化合物１（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）をラットの腹腔内に注射し、引き続き３日間を注射した。本試験において、別に偽手術群（ｓｈａｍ）のラットは上記のような同じ手術工程がされるが、偽手術群の両方の総頸動脈と右中大脳動脈が閉塞されなく、そしてｖｅｈｉｃｌｅのみをラットに注射する群を対照群として、それぞれ化合物１を４時間、１６時間、２４時間、３６時間と７２時間処理してから、脳卒中ラットを犠牲にしその大脳組織を取り、ウエスタンブロット法により脳卒中ラットの脳内のＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を検出した。
図１３Ａ及び図１３Ｂを参照されたい。
図１３Ａは、異なる時間で化合物１の処理を行う脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。図１３Ａにおける化合物１の投与量が１ｍｇ／ｋｇであった。
図１３Ｂは、異なる投与量で化合物１の処理を行う脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。図１３Ｂにおける化合物１を処理する時間が３６時間であった。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図１３Ａ及び図１３Ｂの結果から分かるように、ＨＩＦ−１αの発現の部分において、化合物１をラットに注射して４時間後の群と１ｍｇ／ｋｇの化合物１をラットに注射する群に一番高いＨＩＦ−１αの発現量が見られた。Ｂｍｉ−１の発現の部分において、化合物１をラットに注射して３６時間後の群と１ｍｇ／ｋｇの化合物１をラットに注射する群に一番高いＢｍｉ−１の発現量が見られた。従って、対照群とｓｈａｍと比べて、化合物１の投薬が確実に脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現を著しく向上させ、且つこの向上の現象が投与量依存性と時間依存性を有した。
図１３Ａは、異なる時間で化合物１の処理を行う脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。図１３Ａにおける化合物１の投与量が１ｍｇ／ｋｇであった。
図１３Ｂは、異なる投与量で化合物１の処理を行う脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現量を示す分析図である。図１３Ｂにおける化合物１を処理する時間が３６時間であった。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
図１３Ａ及び図１３Ｂの結果から分かるように、ＨＩＦ−１αの発現の部分において、化合物１をラットに注射して４時間後の群と１ｍｇ／ｋｇの化合物１をラットに注射する群に一番高いＨＩＦ−１αの発現量が見られた。Ｂｍｉ−１の発現の部分において、化合物１をラットに注射して３６時間後の群と１ｍｇ／ｋｇの化合物１をラットに注射する群に一番高いＢｍｉ−１の発現量が見られた。従って、対照群とｓｈａｍと比べて、化合物１の投薬が確実に脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現を著しく向上させ、且つこの向上の現象が投与量依存性と時間依存性を有した。
本試験例は、別にそれぞれ１００ｍｇ／ｋｇの２−ＭＥ２で処理し又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈとＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを脳卒中ラットの脳に３次元測位注射して、脳卒中ラットＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させてから、１ｍｇ／ｋｇの化合物１を脳卒中ラットに注射して、ウエスタンブロット法により化合物１の投薬が低いＨＩＦ−１αの発現の脳卒中ラットと低いＢｍｉ−１の発現の脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１の発現への影響を観察した。
図１３Ｃを参照されたい。図１３Ｃは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が抑制される脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳内Ｂｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１を投薬し、特に１ｍｇ／ｋｇの化合物１を投薬して確実に脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１の発現を著しく向上させるが、この向上の効果が脳卒中ラットのＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現を低下させることにより抑制された。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１を投薬し、特に１ｍｇ／ｋｇの化合物１を投薬して確実に脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１の発現を著しく向上させるが、この向上の効果が脳卒中ラットのＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現を低下させることにより抑制された。
本試験において、異なる投与量の化合物１（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）で処理される脳卒中ラットに対して、免疫蛍光染色で脳卒中ラットの脳における神経幹細胞（Ｎｅｓｔｉｎでキャリブレーションする）Ｂｍｉ−１の発現を検出した。
試験上、別の群において、それぞれ脳卒中ラットのＨＩＦ−１αの発現を低下させ又は脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、１ｍｇ／ｋｇの化合物１を脳卒中ラットに注射し、ウエスタンブロット法により化合物１の投薬が低いＨＩＦ−１αの発現脳卒中ラットと低いＢｍｉ−１の発現脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１の発現への影響を観察した。脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させる群において、１００ｍｇ／ｋｇの２−ＭＥ２をラットの腹腔内に注射した。脳卒中ラットＢｍｉ−１の発現を低下させる群において、ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈとＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを脳卒中ラットの脳に３次元測位注射し、又はＢｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）に対して脳虚血／再灌流モデルを処理し、同様にＮＬマウスに対して脳虚血／再灌流モデルを処理して対照群とした。
試験上、別の群において、それぞれ脳卒中ラットのＨＩＦ−１αの発現を低下させ又は脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、１ｍｇ／ｋｇの化合物１を脳卒中ラットに注射し、ウエスタンブロット法により化合物１の投薬が低いＨＩＦ−１αの発現脳卒中ラットと低いＢｍｉ−１の発現脳卒中ラットの脳内のＢｍｉ−１の発現への影響を観察した。脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させる群において、１００ｍｇ／ｋｇの２−ＭＥ２をラットの腹腔内に注射した。脳卒中ラットＢｍｉ−１の発現を低下させる群において、ＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈとＬＶ−ｃｏｎｔｒｏｌ−ｓｈを脳卒中ラットの脳に３次元測位注射し、又はＢｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）に対して脳虚血／再灌流モデルを処理し、同様にＮＬマウスに対して脳虚血／再灌流モデルを処理して対照群とした。
図１４Ａ〜図１４Ｄ、添付ファイル１１及び添付ファイル１２を参照されたい。
図１４Ａは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図１４Ｂは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図１４Ｃは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラット歯状回における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図１４Ｄは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示し、スケールが５０μｍを表す。
添付ファイル１１は、図１４Ａのカラー図面である。
添付ファイル１２は、図１４Ｃのカラー図面である。
結果から分かるように、脳卒中ラットの脳室下帯又は歯状回を問わず、化合物１を注射して神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現（Ｂｍｉ−１+Ｎｅｓｔｉｎ+細胞）を向上させることができ、特に１ｍｇ／ｋｇ化合物１を注射する群において、化合物１の神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を向上させる効果が投与量依存性を有することを示す。しかし、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットで、化合物１の神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を向上させる効果が抑制された。
図１４Ａは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図１４Ｂは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
図１４Ｃは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラット歯状回における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を示す顕微鏡写真図である。
図１４Ｄは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回における神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現量を示す分析図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示し、スケールが５０μｍを表す。
添付ファイル１１は、図１４Ａのカラー図面である。
添付ファイル１２は、図１４Ｃのカラー図面である。
結果から分かるように、脳卒中ラットの脳室下帯又は歯状回を問わず、化合物１を注射して神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現（Ｂｍｉ−１+Ｎｅｓｔｉｎ+細胞）を向上させることができ、特に１ｍｇ／ｋｇ化合物１を注射する群において、化合物１の神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を向上させる効果が投与量依存性を有することを示す。しかし、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットで、化合物１の神経幹細胞Ｂｍｉ−１の発現を向上させる効果が抑制された。
［ｉｉ．化合物１による脳卒中ラットの神経幹細胞増殖への影響］
本試験例は、別に異なる投与量の化合物１（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）で処理される脳卒中ラット、及びＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現が下げられてから１ｍｇ／ｋｇ化合物１を処理する脳卒中ラットを犠牲にした後でその脳組織に対して免疫蛍光染色を行って、脳卒中ラットの脳における増殖マーカーであるＢｒｄＵとｋｉ−６７の発現を検出した。
本試験例は、別に異なる投与量の化合物１（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）で処理される脳卒中ラット、及びＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現が下げられてから１ｍｇ／ｋｇ化合物１を処理する脳卒中ラットを犠牲にした後でその脳組織に対して免疫蛍光染色を行って、脳卒中ラットの脳における増殖マーカーであるＢｒｄＵとｋｉ−６７の発現を検出した。
図１５Ａ〜図１５Ｈ、添付ファイル１３〜添付ファイル１６を参照されたい。
図１５Ａは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯におけるＢｒｄＵの発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｂは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯におけるＢｒｄＵを発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｃは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの歯状回におけるＢｒｄＵの発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｄは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回におけるＢｒｄＵを発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｅは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯におけるｋｉ−６７発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｆは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯におけるｋｉ−６７を発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｇは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの歯状回におけるｋｉ−６７発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｈは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回におけるｋｉ−６７を発現する細胞数を示す統計図である。
添付ファイル１３は、図１５Ａのカラー図面である。
添付ファイル１４は、図１５Ｃのカラー図面である。
添付ファイル１５は、図１５Ｅのカラー図面である。
添付ファイル１６は、図１５Ｇのカラー図面である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示し、スケールが５０μｍを表す。
図１５Ａは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯におけるＢｒｄＵの発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｂは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯におけるＢｒｄＵを発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｃは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの歯状回におけるＢｒｄＵの発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｄは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回におけるＢｒｄＵを発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｅは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの脳室下帯におけるｋｉ−６７発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｆは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した脳室下帯におけるｋｉ−６７を発現する細胞数を示す統計図である。
図１５Ｇは、異なる投与量の化合物１で処理した脳卒中ラットの歯状回におけるｋｉ−６７発現を示す顕微鏡写真図である。
図１５Ｈは、Ｂｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現が下げられる脳卒中ラットに化合物１を投薬した歯状回におけるｋｉ−６７を発現する細胞数を示す統計図である。
添付ファイル１３は、図１５Ａのカラー図面である。
添付ファイル１４は、図１５Ｃのカラー図面である。
添付ファイル１５は、図１５Ｅのカラー図面である。
添付ファイル１６は、図１５Ｇのカラー図面である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示し、スケールが５０μｍを表す。
図１５Ａ〜図１５Ｈの結果から分かるように、脳卒中ラット脳部の脳室下帯又は歯状回を問わず、化合物１の投薬が脳卒中ラットの脳内のＢｒｄＵ+細胞とｋｉ−６７+細胞の数量を向上させることができ、特に１ｍｇ／ｋｇの化合物１を投薬して、化合物１が脳卒中ラットの脳における細胞増殖を促すことができることを示す。しかし、この化合物１が脳卒中ラットの脳における細胞増殖を促す効果は、脳卒中ラットのＢｍｉ−１及びＨＩＦ−１αの発現を低下させることにより抑制された。
上記の結果から分かるように、化合物１は、ＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を誘発し、更にインビボの神経幹細胞増殖と自己再生潜在力を促した。
＜試験４−３．化合物１を全身性投与して脳虚血後の梗塞体積を小さくすることができる＞
前記試験例により化合物１がインビトロとインビボの神経幹細胞増殖と自己再生を促すことができることが分かり、本試験例で化合物１を脳組織損傷の個体の治療に用いられる効果を検討した。
前記試験例により化合物１がインビトロとインビボの神経幹細胞増殖と自己再生を促すことができることが分かり、本試験例で化合物１を脳組織損傷の個体の治療に用いられる効果を検討した。
本試験は、まずＢｍｉ−１の発現が脳卒中マウスの梗塞部位サイズへの影響を観察し、試験上、それぞれＢｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）とＮＬマウスに対して脳虚血／再灌流モデルを処理し、２日間後マウスを犠牲にしその脳部組織を取りマウスの脳部梗塞部位のサイズを観察した。
図１６と添付ファイル１７を参照されたい。図１６は、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）とＮＬマウスの脳卒中後の脳部梗塞部位の写真図であり、下図における矢印が指すところが梗塞部位である。
添付ファイル１７は、図１６のカラー図面である。
結果から分かるように、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）が脳卒中となってから、その梗塞部位が著しく脳卒中ＮＬマウスの梗塞部位よりも大きかった。
図１６と添付ファイル１７を参照されたい。図１６は、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）とＮＬマウスの脳卒中後の脳部梗塞部位の写真図であり、下図における矢印が指すところが梗塞部位である。
添付ファイル１７は、図１６のカラー図面である。
結果から分かるように、Ｂｍｉ−１遺伝子ノックアウトマウス（Ｂｍｉ−１-/-）が脳卒中となってから、その梗塞部位が著しく脳卒中ＮＬマウスの梗塞部位よりも大きかった。
本試験例は、別に異なる投与量の化合物１（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇ）を脳卒中ラットに腹腔内に注射し、そしてｖｅｈｉｃｌｅのみを脳卒中ラットに注射することを対照群とし、３日間後脳卒中ラットを犠牲にしその脳部組織を取り、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ ｃｈｌｏｒｉｄｅ；ＴＴＣ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｃｓ Ｉｎｃ）で染色し、塩化トリフェニルテトラゾリウムで染色されてから、非梗塞部位が赤レンガ色を呈し、梗塞部位が黄白色を呈し、脳卒中ラットの脳内の梗塞部位サイズを観察して、化合物１の投薬が脳卒中ラットの虚血による損傷を確定した。
図１７Ａ、図１７Ｂと添付ファイル１８を参照されたい。
図１７Ａは、化合物１の投薬による脳卒中ラットの脳内の梗塞体積への影響の写真図である。図１７Ｂは、図１７Ａの定量化図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
添付ファイル１８は、図１７Ａのカラー図面である。
結果から分かるように、化合物１が投薬される脳卒中ラット、特に１ｍｇ／ｋｇ化合物１を投薬する群のその脳部梗塞の体積が著しく対照群よりも小さかった。
図１７Ａは、化合物１の投薬による脳卒中ラットの脳内の梗塞体積への影響の写真図である。図１７Ｂは、図１７Ａの定量化図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
添付ファイル１８は、図１７Ａのカラー図面である。
結果から分かるように、化合物１が投薬される脳卒中ラット、特に１ｍｇ／ｋｇ化合物１を投薬する群のその脳部梗塞の体積が著しく対照群よりも小さかった。
本試験は、更に脳卒中ラットを５群に分け、４群の試験群と１群の対照群を含み、試験群でそれぞれ１ｍｇ／ｋｇの化合物１、３０ｍｇ／ｋｇのゲニピン（３０ｍｇ／ｋｇ）、１ｍｇ／ｋｇの化合物１＋１００ｍｇ／ｋｇの２−ＭＥ２及び１ｍｇ／ｋｇの化合物１とＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを脳卒中ラットに注射し、対照群でｖｅｈｉｃｌｅのみを脳卒中ラットに注射した。７日後に先に脳卒中ラットに対して麻酔をかけてから、磁気共鳴画像（ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｉｍａｇｉｎｇ；ＭＲＩ）により異なる群の脳卒中ラットの脳における梗塞体積を観察した。
図１８Ａ及び図１８Ｂを参照されたい。
図１８Ａは、脳卒中ラットが前記条件で処理されて７日後の磁気共鳴画像図である。
図１８Ｂは、図１８Ａの定量化図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１の投薬が大幅に脳卒中ラットの脳内の梗塞体積と最大梗塞部位の面積を低下させることができる。ゲニピンの投薬も脳卒中ラットの脳内の梗塞体積と最大梗塞部位の面積を低下させることができるが、化合物１が脳卒中ラットの脳内の梗塞部位サイズを低下させる効果がゲニピンよりも優れた。ＨＩＦ−１αの発現（２−ＭＥ２を処理する）を低下させることとＢｍｉ−１の発現（を処理しＬＶ−Ｂｍｉ−ｓｈ）を低下させることは、化合物１が脳卒中ラットの脳内の梗塞部位サイズを低下させる効果を抑制した。
図１８Ａは、脳卒中ラットが前記条件で処理されて７日後の磁気共鳴画像図である。
図１８Ｂは、図１８Ａの定量化図である。
ｎ＝８であり、データ結果をｍｅａｎ±ＳＤ値で表示し、＊が対照群と比べてｐ＜０．０５であることを示し、＊＊が対照群と比べてｐ＜０．０１であることを示す。
結果から分かるように、化合物１の投薬が大幅に脳卒中ラットの脳内の梗塞体積と最大梗塞部位の面積を低下させることができる。ゲニピンの投薬も脳卒中ラットの脳内の梗塞体積と最大梗塞部位の面積を低下させることができるが、化合物１が脳卒中ラットの脳内の梗塞部位サイズを低下させる効果がゲニピンよりも優れた。ＨＩＦ−１αの発現（２−ＭＥ２を処理する）を低下させることとＢｍｉ−１の発現（を処理しＬＶ−Ｂｍｉ−ｓｈ）を低下させることは、化合物１が脳卒中ラットの脳内の梗塞部位サイズを低下させる効果を抑制した。
＜試験４−４．化合物１の注射により脳虚血後の運動の改善を促すことができる＞
本試験例は、更に３種の神経学的障害モデルにより脳卒中となる前後のラットの神経行動を検出して、化合物１を脳卒中ラットに注射して脳卒中ラットの神経機能の回復に寄与するかを評価した。
本試験例は、更に３種の神経学的障害モデルにより脳卒中となる前後のラットの神経行動を検出して、化合物１を脳卒中ラットに注射して脳卒中ラットの神経機能の回復に寄与するかを評価した。
試験の脳卒中ラットを４群に分け、３群の試験群と１群の対照群を含み、試験群でそれぞれ１ｍｇ／ｋｇの化合物１、１ｍｇ／ｋｇの化合物１＋１００ｍｇ／ｋｇの２−ＭＥ２及び１ｍｇ／ｋｇの化合物１とＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを脳卒中ラットに注射し、対照群でｖｅｈｉｃｌｅのみを脳卒中ラットに注射した。神経行動に対する検出の時間点は、脳虚血／再灌流する前の５日間、細胞移植後の第１日、第７日、第１４日と第２８日であった。３種の神経学的障害モデルは、それぞれ脳卒中ラットの体の左右非対称性、活動能力と前肢把持力を評価した。
［ｉ．ボディスイングテスト］
脳卒中ラットの体の左右非対称性は、ボディスイングテストにより評価され、試験上、先に脳卒中ラットを宙に浮させるようにしっぽの上の１０センチメートルの飼育箱底板に置き、脳卒中ラットの横方向の移動回数を記録し、特に虚血側の相対側のヘッドスイング頻度を引き続き２０回カウンティングして、ベースラインスコアにより標準化した。
脳卒中ラットの体の左右非対称性は、ボディスイングテストにより評価され、試験上、先に脳卒中ラットを宙に浮させるようにしっぽの上の１０センチメートルの飼育箱底板に置き、脳卒中ラットの横方向の移動回数を記録し、特に虚血側の相対側のヘッドスイング頻度を引き続き２０回カウンティングして、ベースラインスコアにより標準化した。
図１９Ａを参照されたい。図１９Ａは、脳卒中ラットのボディスイングテストの結果図である。
結果から分かるように、化合物１の投薬される群が対照群よりも著しく神経機能が回復するが、この神経機能の回復状況が２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、試験群ラットの神経機能回復結果を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させることにより化合物１の治療効果を抑制した。
結果から分かるように、化合物１の投薬される群が対照群よりも著しく神経機能が回復するが、この神経機能の回復状況が２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、試験群ラットの神経機能回復結果を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させることにより化合物１の治療効果を抑制した。
［ｉｉ．活動能力テスト］
ラットの活動能力は、ＶｅｒｓａＭａｘ動物の活動モニタリングシステム（Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりラットを２時間検出した。ＶｅｒｓａＭａｘ動物の活動モニタリングシステムは、１６台の水平赤外線センサーと８台の垂直赤外線センサーを含み、垂直センサがそれぞれチャンバー底板上の１０ｃｍに位置し、ラットの活動能力運動がチャンバーにおけるラットの運動が光束をバリアする回数により定量化した。測定する３つの垂直運動パラメーターは、垂直活動、垂直活動時間及び垂直運動数量であった。
ラットの活動能力は、ＶｅｒｓａＭａｘ動物の活動モニタリングシステム（Ａｃｃｕｓｃａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によりラットを２時間検出した。ＶｅｒｓａＭａｘ動物の活動モニタリングシステムは、１６台の水平赤外線センサーと８台の垂直赤外線センサーを含み、垂直センサがそれぞれチャンバー底板上の１０ｃｍに位置し、ラットの活動能力運動がチャンバーにおけるラットの運動が光束をバリアする回数により定量化した。測定する３つの垂直運動パラメーターは、垂直活動、垂直活動時間及び垂直運動数量であった。
図１９Ｂ〜図１９Ｄを参照されたい。
図１９Ｂは、脳卒中ラットの垂直運動数量テストの結果図である。
図１９Ｃは、脳卒中ラットの垂直活動テストの結果図である。
図１９Ｄは、脳卒中ラットの垂直活動時間テストを示す結果図である。
図１９Ｂ〜図１９Ｄの結果から分かるように、化合物１が投薬される群が対照群と比べて活動能力が著しく改善されるが、この活動能力の改善状況は、２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、これにより試験群のラットの活動能力の改善結果を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させて化合物１の治療効果を抑制することを示す。
図１９Ｂは、脳卒中ラットの垂直運動数量テストの結果図である。
図１９Ｃは、脳卒中ラットの垂直活動テストの結果図である。
図１９Ｄは、脳卒中ラットの垂直活動時間テストを示す結果図である。
図１９Ｂ〜図１９Ｄの結果から分かるように、化合物１が投薬される群が対照群と比べて活動能力が著しく改善されるが、この活動能力の改善状況は、２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、これにより試験群のラットの活動能力の改善結果を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させて化合物１の治療効果を抑制することを示す。
［ｉｉｉ．前肢把持力テスト］
ラットの前肢把持力テストは、握力計（ＴＳＥ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出された。試験上、別々にラットの各前肢の把持力を測定し、ラットが２０回引く把持力の平均値を算出し、同側：相対側の把持力比率を算出した。また、本試験例は、細胞治療前と細胞治療後のラット把持力の比率も算出して、細胞治療後のラット把持力の変化を評価した。
ラットの前肢把持力テストは、握力計（ＴＳＥ−Ｓｙｓｔｅｍｓ）により検出された。試験上、別々にラットの各前肢の把持力を測定し、ラットが２０回引く把持力の平均値を算出し、同側：相対側の把持力比率を算出した。また、本試験例は、細胞治療前と細胞治療後のラット把持力の比率も算出して、細胞治療後のラット把持力の変化を評価した。
図２０を参照されたい。図２０は、ラット前肢把持力テストを示す結果図である。
図２０の結果から分かるように、化合物１の投薬される群が対照群のラットを比べて、化合物１が投薬されてからラットの前肢把持力が大幅に改善されるが、この改善状況は、２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、これにより試験群のラットの前肢把持力を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させて化合物１の治療効果を抑制することを示す。
図２０の結果から分かるように、化合物１の投薬される群が対照群のラットを比べて、化合物１が投薬されてからラットの前肢把持力が大幅に改善されるが、この改善状況は、２−ＭＥ２を注射して脳卒中ラットＨＩＦ−１αの発現を低下させ又はＬＶ−Ｂｍｉ−１−ｓｈを注射して脳卒中ラットのＢｍｉ−１の発現を低下させてから、これにより試験群のラットの前肢把持力を対照群と相匹敵するようにして、脳卒中ラットのＨＩＦ−１αとＢｍｉ−１の発現を低下させて化合物１の治療効果を抑制することを示す。
上記３つの神経学的障害モデルの試験は、類似している結果を呈し、化合物１の投薬が脳卒中ラットの神経行動を改善し、且つこの神経行動改善がＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって達成することを示す。
上記の試験結果によれば、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示すイリドイド配糖体類化合物は、草本薬物で精製されたゲニピン（ｇｅｎｉｐｉｎ）をバックボーン（ｂａｃｋｂｏｎｅ）として、更に側鎖（ｓｉｄｅ ｃｈａｉｎ）に構造に対する化学的修飾を加えた誘導体であり、ゲニピン構造の化学的活性が水溶液の雰囲気で不安定となり、水溶液又は体の組織内のアミノ（−ＮＨ2）と反応しまた分子構造同士で架橋作用を発生しやすいという欠点を改善した。従って、本発明のイリドイド配糖体類化合物は、ゲニピンをバックボーンとし、化学合成技術によりゲニピンの側鎖分子に特定な小分子の構造を接続して、本発明のイリドイド配糖体類化合物の薬物安定度の改善、薬物効能と体に対する親和性を向上させ、新薬物の人体への拒絶や副作用を低下させ、且つその神経細胞死亡を保護する効果が一層ゲニピンよりも優れた。
また、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示すイリドイド配糖体類化合物が、脳部損傷部位を低下させ、脳組織機能の損傷を防止し、且つＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって神経幹細胞成長及び自己再生能力を刺激し、脳卒中（特に虚血性脳卒中）の動物脳部で神経幹細胞が分裂し脳部損傷部位へ移動するように促し、従って、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示すイリドイド配糖体類化合物は、脳卒中治療薬又は薬学組成物とされることができる。
また、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示すイリドイド配糖体類化合物が、脳部損傷部位を低下させ、脳組織機能の損傷を防止し、且つＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路によって神経幹細胞成長及び自己再生能力を刺激し、脳卒中（特に虚血性脳卒中）の動物脳部で神経幹細胞が分裂し脳部損傷部位へ移動するように促し、従って、式（Ｉ）及び式（ＩＩ）に示すイリドイド配糖体類化合物は、脳卒中治療薬又は薬学組成物とされることができる。
上記薬剤又は薬学組成物は、人に受けられる薬学プロセスにより調製され、製剤における他の成分と互換性があり且つ生物体と互換性がある医薬的に許容されるキャリアを含んだ。ここで言われた「医薬的に許容されるキャリア」（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｃａｒｒｉｅｒ）とは、医薬的に許容される材料、組成物又はビークル（ｖｅｈｉｃｌｅ）を指し、例えば液体又は固体充填剤（ｌｉｑｕｉｄ ｏｒ ｓｏｌｉｄ ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）、溶剤（ｓｏｌｖｅｎｔ）又は被覆材料（ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ）であり、目標成分を体の器官又は部分から体の別の器官又は部分へ携帯し又は運送することに用いられてもよい。
本発明の実施形態を前記の通りに開示したが、これは本発明を限定するものではなく、当業者なら、本発明の精神と範囲から逸脱しない限り、多様の変更や修正を加えることができる。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲に記載した内容を基準とする。
Claims (11)
- 下記式(I)に示すイリドイド配糖体類化合物。
- 有効量の請求項１に記載のイリドイド配糖体類化合物と、
医薬的に許容されるキャリアと、を含む脳卒中治療用の医薬組成物。 - 前記有効量は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇである請求項２に記載の脳卒中治療用の医薬組成物。
- 前記有効量は１ｍｇ／ｋｇである請求項２に記載の脳卒中治療用の医薬組成物。
- 前記医薬組成物は、液体、粉末、錠剤、カプセル又は注射剤である請求項２に記載の脳卒中治療用の医薬組成物。
- 脳卒中治療薬の調製に用いられる請求項１に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
- 前記脳卒中は、虚血性脳卒中である請求項６に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
- 前記脳卒中治療薬は、神経幹細胞を保護する薬物である請求項７に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
- 前記脳卒中治療薬は、神経幹細胞の増殖を促進する薬物である請求項７に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
- 前記脳卒中治療薬は、神経幹細胞の自己再生を促進する薬物である請求項７に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
- 前記脳卒中治療薬は、神経幹細胞のＨＩＦ−１α−Ｂｍｉ−１信号径路を促進する薬物である請求項８〜１０の何れか一項に記載のイリドイド配糖体類化合物の使用方法。
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