TW201835033A - 富勒烯衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

本發明提供一種富勒烯衍生物用於調節中樞神經系統之用途，其中該富勒烯衍生物包含5個親水性基團於半個富勒烯框架(fullerene cage)上，另一半富勒烯框架上未有任何的官能基。本發明揭露之富勒烯衍生物能夠修復中樞神經系統的損傷或是抗腦腫瘤，提供了一種新穎的腦腫瘤與神經損傷疾病之治療方式。

Description

富勒烯衍生物及其用途

本發明係關於一種富勒烯衍生物及其用途，特別係關於該些富勒烯衍生物及其用於調節中樞神經系統之用途。

精神分裂症、抑鬱、成癮症和其他精神疾病除了讓患者受苦外，失去生產力而造成的經濟損失每年更高達數十億美元。根據世界衛生組織(WHO)估計，若計算全球因病早逝和失去健康生活品質而損失的生命年數，神經和精神疾病佔了13%。

儘管我們迫切需要更新、更好的藥物，來治療像阿茲海默症或帕金森氏症等各種精神病和神經退化疾病，但對大型藥廠來說，開發這類藥物不僅複雜而且所費不貲，花了上百萬美元來開發新藥，最後卻可能血本無歸，風險實在太大，這也是為什麼許多大藥廠紛紛對神經失調和其他中樞神經系統(CNS)藥物研發打退堂鼓。

研發中樞神經藥物的困難度遠超過其他大部份藥物，除了與其他藥物相同，需投入大量時間與成本之外，研發中樞神經藥物還多了一個困難-最好能夠穿越血腦障壁(blood brain barrier；簡稱BBB)。血腦障壁指的是在血管和腦之間有一種選擇性地阻止某些物質由血進入腦的「屏障」。血腦障壁幾乎不讓所有的物質通過，除了氧氣、二氧化碳和血糖，大部分的藥和蛋白質由於分子結構過大，一般無法通過。與其他組織相較，譬如肌肉組織的毛細血管內皮細胞，腦毛細血管內皮細胞的胞飲作用很微弱。因此，對腦毛細血管內皮細胞來說，藉由胞飲作用轉運物質(大分子和電解質)的能力是很有限，這就更加強了腦毛細血管壁的屏障功能。血 腦障壁的功能是避免腦受到化學傳導物質的影響。由於身體很多功能都由腦經由荷爾蒙的分泌來控制，如果讓化學傳導物質在腦裡自由流動，可能會造成反饋現象。因此，欲使腦部正常的操作，血腦障壁的存在是必要的。另一方面，血腦障壁的存在也使腦不受到病菌的感染。

目前，中樞神經系統藥物的市場正在開發中，與開發相對成熟的心血管藥物相比，中樞神經系統的藥物在近年來成長了超過500%。中樞神經系統藥物開發不足的主要原因是因為絕大多數的藥物無法穿過人類的血腦障壁。以分子量來說，所有的大分子藥物無法通過血腦障壁，只有少部分(~2%)的小分子高脂溶性神經藥理學藥物能夠通過血腦障壁。在這些約佔2%能夠通過血腦障壁的小分子藥物來說，只有少數的腦部疾病對這些小分子藥物有反應。許多的神經失調(即腦腫瘤、阿茲海默症、與其他中樞神經系統失調)對這些小分子藥物的傳統治療仍然反應效果不佳。對於受神經疾病之苦的人們來說，雖然中樞神經系統藥物的開發面臨許多困難與挑戰，仍是殷切地期盼著有著更好的新藥或是新的療法能夠使用。

由上述種種問題，本發明提供一種富勒烯衍生物用於製備調節中樞神經系統之醫藥組成物的用途，其中該富勒烯衍生物包含5個親水性基團於半個富勒烯框架(fullerene cage)上，另一半富勒烯框架上未有任何的官能基。

在本發明之一實施例中，該未有官能基的半個富勒烯框架係為疏水性的，並且具有如式I之結構式： 其中R具有下列之一的結構： ，或；且R’為H或Cl。

在本發明之一實施例中，當R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有促進神經幹細胞增殖的效果；當R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有促進神經幹細胞之神經元分化的效果；當R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有保持神經前驅細胞之自我更新能力的效果；當R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有抑制腦神經膠質瘤細胞增殖的效果；當R為具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有抗腦腫瘤的效果；當R為具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有恢復受損之中樞神經系統的效果。

本發明亦提供一種新穎的富勒烯衍生物，其具有如式I之結構式： 其中R具有下列之一的結構： ，或；R’係為H或Cl。

經由本發明之技術特徵，本發明提供之富勒烯衍生物解決了大多數傳統用於治療中樞神經系統之藥物，難以穿越血腦障壁之難題，並能夠促進神經幹細胞生長、增殖與抗腫瘤，更在動物實驗中證實能夠修復中樞神經系統的損傷或是抗腦腫瘤，本發明提供了一種新穎的腦腫瘤與神經損傷疾病之治療方式。

圖1係為本發明之水溶性C₆₀富勒烯衍生物的示例，分別為化合物1~11。

圖2係為本發明化合物1~9水溶液之動態光散射法(dynamic light scattering，DLS)圖譜。

圖3係為以本發明化合物1~11處理神經幹細胞及C6細胞後(圖3A)，神經幹細胞(圖3B)及C6細胞(圖3C)相對於控制組之細胞存活率(%)統計圖；*表示p<0.05。

圖4係為以本發明化合物1~6處理神經幹細胞後(圖4A)，神經幹細胞之nestin、β-tubulin及MAP2基因以控制組為基準之相對基因表現率統計圖(圖4B)；*表示p<0.05。

圖5係為以本發明化合物3~5、7~8處理神經幹細胞及以化合物3~4、7~8處理C6細胞後，該二細胞之HIF1α、Nrf-2、及AP1基因以控制組為基準之相對基因表現率統計圖；*表示p<0.05。

圖6係為以本發明化合物3~4處理神經幹細胞及以化合物7~8處理C6細胞後，該二細胞在基礎、ATP產生、及非粒線體呼吸時之氧氣消耗率(OCR)統計圖；*表示p<0.05。

圖7係為以本發明化合物3~5、7~8處理中樞神經缺損之斑馬魚胚胎後(圖6A)，各胚胎之收縮捲曲行為(圖6B)、甩尾頻率(圖6C)、及孵化率(圖6D)統計圖；*表示p<0.05。

圖8係為以本發明化合物3~4處理小腦受損之成年斑馬魚後(圖7A)，各斑馬魚之泳速回復率(%)統計圖(圖7B)。

圖9係為以本發明化合物3~4、7~8處理經注射C6細胞之斑馬魚胚胎後(圖8A)，各孵化幼體之螢光顯微照片(圖8B)及腫瘤生長率(%)統計圖(圖8C)；*表示p<0.05。

定義

除非有特別指明，本發明說明書所指「化合物」1~11，與「富勒烯衍生物」1~11係為同義，皆指圖1所示結構式1~11之化合物。

「約」、「約略」或「近似地」一般係指20%，較佳為10%，最佳為5%的範圍內。本文中的數值係為近似值，在未明確定義的情況下可隱含「約」「約略」或「近似地」之含義。

本發明中，我們合成11種不同的水溶性C₆₀富勒烯衍生物，並且評估其修復中樞神經系統或是殺死腦腫瘤的作用。利用神經幹細胞(neural stem cells，NSCs)與神經膠質瘤細胞(glioma cells)做體外試驗，以篩選候選化合物。利用斑馬魚模式生物評估體內效果。我們的實驗結果指出，官能化C₆₀可能有調節目標細胞之氧氣代謝的獨特性質，其神經保護作用或是凋亡作用能夠用於中樞神經系統疾病等治療。

本發明之水溶性富勒烯衍生物的分子結構如第1圖所示。化合物1至3分別具有苯乙酸、苯丙酸及苯丁酸的基團，係依據本團隊先前研發出的方法合成，參見Troshina等人¹。含硫富勒烯衍生物4與5以先前報導之方式合成，參見Khakina等人²。化合物4在其分子架構中含有商用藥物captopril的5個基團。化合物4~5的光譜特性如下所示。富勒烯衍生物6的合成方式與特性已揭露於本團隊之先前報導中，參見Yurkova等人³。富勒烯衍生物7~9具有胺基酸基團，其胺基酸基團分別為苯丙氨酸(phenyl alanine)、絲氨酸(serine)及β-丙氨酸(β-alanine)，係依據先前報導之合成方法合成，參見Kornev等人⁴。另外，化合物10~11亦如同化合物7~9之合成方式合成。新穎化合物9(受保護的叔丁基酯形式)之光譜特性亦如下所示。

化合物4之光譜特性：

¹ HNMR((CD₃)₂CO：CS₂(1：1),600MHz,δ,ppm.)：1.15-1.26(m,15H,CH ₃),1.76-2.34(m,20H,CH ₂),2.53-2.97(m,10H,CH ₂-S,CH-C(O)),3.1-3.23 (m,5H,CH ₂ -S),3.32-3.78(m,10H,CH ₂ -N),4.15-4.33(m,5H,CH-COOH),4.95(s,1H,C₆₀-H).

¹³ C NMR((CD₃)₂CO：CS₂(1：1),150MHz,δ,ppm.)：16.54(CH₃),16.65(CH₃),24.37(CH₂),24.42(CH₂),27.08(CH₂),28.72(CH₂),41.14(CH-C(O)),41.33(CH-C(O)),46.44(S-CH₂),46.50(S-CH₂),46.55(S-CH₂),54.00(cage sp³ C),55.92(cage sp³ C),56.60(cage sp³ C),58.26(CH-COOH),58.30(CH-COOH),58.34(CH-COOH),59.06(cage sp³ C-H),140.06,141.95,142.23,142.48,142.58,142.61,142.72,143.27,143.65,143.76,144.07,145.68,146.12,146.16,146.22,146.27,146.31,146.35,147.45,147.51,147.53,147.65,147.73,147.81,147.87,147.99,148.17,148.20,172.72(N-C=O),173.25(N-C=O),173.30(COOH),173.34(COOH),173.45(COOH).

ESI MS：m/z=1800([M-H]^-),900([M-H]^2-).

化合物5之光譜特性：

¹ H NMR(D₂O,500MHz,δ,ppm)：2.00-2.19(_M,10H),2.87-2.91(_M,6H),2.93-3.00(_M,4H),3.08-3.12(_M,6H),3.20-3.23(_M,4H),3.45(c,1H).

¹³ C NMR(D₂O,125MHz,δ,ppm)：23.02(CH₂),24.50(CH₂),30.39(CH₂),30.64(CH₂),31.13(CH₂),48.27(CH₂),48.84(CH₂),52.50(cage sp³ C),54.44(cage sp³ C),55.03(cage sp³ C),59.38(cage sp³ C),141.67,141.72,141.78,141.88,142.41,142.53,142.58,142.79,143.16,143.58,143.71,144.99,145.20,145.27,145.42,145.99,146.36,146.52,146.71,146.92,147.02,147.16,148.96,149.70,152.00,152.15,152.66,152.88.

FTIR(KBr pellet,v,cm^-1)：454.00(W),498.00(W),528.00(M),542.00(M),558.00(W),606.00(M),668.00(W),738.00(W),808.00(VW),862.00(VW),944.00(W),1052.00(VS),1114.00(M),1190.00(VS),1350.00(W),1418.00(W),1634.00(M),1700.00(W).

化合物9(受保護的叔丁酯形式)之光譜特性：

¹ H NMR(CDCl₃,600MHz,δ,ppm.)：1.50(m,45H,C(CH ₃ )₃),2.67-2.75(m,10H,CH ₂ -N),3.50-3.62(m,10H,CH ₂ -C(O)).

¹³ C NMR(CDCl₃,150MHz,δ,ppm.)：28.20(C(CH₃)₃),28.23(C(CH₃)₃),28.25(C(CH₃)₃),36.07(CH₂-CH₂-N),36.18(CH₂-CH₂-N),36.93(CH₂-CH₂-N),42.54(CH₂-N),42.86(CH₂-N),44.61(CH₂-N),65.32(cage sp³ C),67.73(cage sp³ C),65.59(cage sp³ C),80.54(O-C),80.68(O-C),80.70(O-C),140.30,142.57,143.19,143.58,143.89,144.06,144.19,144.23,144.41,144.49,144.85,145.15,145.48,147.21,147.24,147.31,147.90,148.35,148.40,148.45,148.71,148.88,149.71,150.87,154.04,154.14,171.93(COOBu^t),172.19(COOBu^t),172.21(COOBu^t)。

ESI MS：m/z=1442([M-Cl]^-)。

化合物1~11包含5個親水性基團於半個富勒烯框架(fullerene cage)上，而另一半富勒烯框架未有任何的官能基且為高度疏水性的。另一方面，化合物1~11獨特的分子結構與其他已知水溶性富勒烯衍生物有很大的不同。另一方面，前述化合物1~11在富勒烯碳框架上的有機基團排列，使其呈現親水性並且在極性溶劑中具有強烈的自組裝傾向，尤其是在水中。因此，化合物1~11在水溶液中會比單獨溶解的分子有著更大的奈米粒子大小。

圖2顯示利用動態光散射法(dynamic light scattering，DLS)檢測之化合物1~9水溶液(濃度為2.75×10^-3M)之粒徑分布圖譜。以化合物3為例，其圖譜中可以發現最小的粒子有接近1nm的平均流體力學半徑(<R_h>)，表示化合物3能夠單獨溶於溶劑中。中間大小的粒子有約為6nm平均流體力學半徑，是因為小富勒烯群集(clusters)成為如同微胞(micelles)的樣子。最大的群集有接近50nm的平均流體力學半徑，大多數有雙層富勒 烯囊泡的結構。相似的囊泡結構在其他親水性富勒烯衍生物亦多有發現，富勒烯組成的囊泡可以自組裝形成接近1~100μm的更大的超分子結構(supramolecular architectures)。相似的特性亦出現於化合物2與5。

圖2顯示化合物1~9的聚集特性，亦顯示了本發明所有的水溶性富勒烯衍生物皆呈現由大量單獨分子組成的奈米粒子。這些超分子結構是以相對微弱的凡得瓦力鍵結，故應為不穩定的結構，並且在動態平衡下會與一些單獨溶解的分子同時存在。因此，奈米粒子與單獨分子皆運用於細胞與動物體內不同的生物作用。

動物體內毒性測試

一些時間以前，研究人員對於富勒烯是否具有毒性有些爭議。最近的研究顯示未經修飾的C₆₀對於動物不具有顯著的毒性。這表示富勒烯衍生物的毒性會取決於其上的有機基團之化學結構與化合物在水性介質中的溶解度。由表一，我們發現雖然化合物1~6及8在小鼠中有急性毒性(經由腹腔注射)，但這些具有可溶性羧基基團的富勒烯衍生物的毒性非常低，其LD₅₀值超過300mg/kg。磺酸基(化合物5)與磷酸基(化合物6)有更強些的毒性，LD₅₀值為150-200mg/kg。具有最小毒性的化合物4與8有極佳的LD₅₀值，分別為730與930mg/kg。因此，本發明之富勒烯衍生物有著中度至低度的毒性，並且使用於不同動物研究中是相當安全的。

體外(in vitro)實驗

我們以神經幹細胞(NSCs)與神經膠質瘤細胞(brain glioma cells；C6細胞)進行體外實驗，測試水溶性C₆₀富勒烯衍生物對該些細胞的存活率與生長之影響。

下述各實驗之神經幹細胞係為鼠類神經幹細胞(murine NSCs)，分離自成年小鼠的腦部，且該細胞以啟動子F1B-綠色螢光蛋白(F1B-GFP)進行轉染。神經幹細胞培養於DMEM/F12培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium及Ham’s F-12，Gibco，美國)，其中含有10%胎牛血清(FBS，Gibco，美國)，400μg/ml G418(Invitrogen)，及100U/ml盤尼西林-鏈黴素(Caisson Labs，美國)，並且保存在37℃、5%二氧化碳的培養箱中。該培養基每隔2天更換一次。

下述各實驗之腦膠質瘤細胞係為大鼠C6膠質瘤細胞株(ATCC，羅克維爾，馬里蘭州，美國)，生長於DMEM培養基(Invitrogen，伯靈頓，安大略省，加拿大)中而形成一單層培養，該培養基含有經熱去活化的10%胎牛血清(Invitrogen，伯靈頓，安大略省)，glutamax-1麩醯胺酸補充液(Invitrogen，伯靈頓，安大略省)，及盤尼西林-鏈黴素(Invitrogen，伯靈頓，安大略省)。細胞株係保存在37℃、5%二氧化碳的環境。該培養基每隔2天更換一次。

我們評估水溶性C₆₀富勒烯衍生物1~11對於神經幹細胞與神經膠質瘤細胞在存活率與生長方面所造成的影響(圖3A)，細胞存活率的評估係使用MTT分析計算而得。MTT分析係於細胞與化合物接觸24小時後以磷酸鹽緩衝溶液(PBS)清洗，並加入100μl 0.5mg/ml的四唑染料(tetrazolium dye；Sigma-Aldrich)於37℃培養1小時，培養結束時將四唑染料去除。以DMSO溶解所形成的紫色結晶，並以微量盤分析儀(SpectraMax® M5,USA) 於570nm波長下讀取吸光值。每一測試均經過重複三次獨立實驗。每一獨立實驗中，每組有4個樣本。

神經幹細胞以100nM之化合物4、5~6、1~3處理24小時後，存活率顯著提升(分別平均約130%、120%、及120%)，而以化合物8及9處理後存活率顯著降低。以化合物7處理的神經幹細胞於存活率則沒有顯著差異(圖3B)。這些結果顯示化合物1~6之富勒烯衍生物會增進腦神經前驅細胞(brain neural progenitors)之存活率與增殖。另外，在化合物10、11之結果中，化合物10與11皆可增加神經幹細胞之存活率達控制組的約2倍，顯見化合物10與11亦會增進腦神經前驅細胞(brain neural progenitors)之存活率與增殖。

C6細胞以含磷與硫之化合物4~6處理，其存活率有顯著地增加(分別約130%、110%、與115%)。相反地，化合物7、8、及9明顯降低C6細胞之存活率。同時，化合物1、2、及3對神經膠質瘤細胞的存活率沒有顯著影響(圖3C)。這些結果顯示具有胺基酸基團的富勒烯衍生物7~9有抑制腦神經膠質瘤細胞增殖的效果。另外，在化合物10、11之結果中，化合物11亦有抑制腦神經膠質瘤細胞增殖的效果。

有趣的是，具有苯乙酸、苯丙酸及苯丁酸基團之化合物1~3有促進神經幹細胞增殖的效果，但對C6細胞沒有作用。相反地，具有苯丙氨酸基團之化合物7會抑制C6細胞，卻對神經幹細胞的存活率沒有影響。

接著以濃度100nM的化合物1~6處理細胞，並利用反轉錄聚合酶連鎖反應分析基因表現量，以評估細胞之狀態。水溶性富勒烯衍生物於神經幹細胞分化的作用如圖4所示。與對照組相較，神經幹細胞以化合物4及3處理7天後，nestin基因(神經幹細胞標的)之表現程度顯著提升(約為3.5及5倍)，但以化合物2及1處理的組別則顯著降低。與對照組比較，以化合物1~6處理的神經幹細胞在第7天表現較多的β微管蛋白(β-tubulin；早期神經標記)與MAP2(成熟神經標記)。在本發明所有的C₆₀富勒烯衍生物中， 化合物4誘導β微管蛋白與MAP2之表現量最大。以上結果顯示富勒烯衍生物1~6可以促進神經幹細胞之神經元分化。此外，化合物3~6能夠保持一部分神經前驅細胞的自我更新能力。

化合物3~5、7、8對粒腺體的影響

因為粒腺體為細胞死亡、增殖與分化的關鍵調節者，並且在神經退化疾病與腦腫瘤的形成上扮演重要的角色。因此，我們測試這些水溶性富勒烯衍生物是否有粒腺體相關的細胞保護之抗氧化作用或是抗腫瘤的效果。我們以濃度100nM的化合物3~5、7、8處理細胞，並利用定量反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction)檢測粒腺體相關標記HIF1α、Nrf-2、及AP1相對於控制組之該些基因的相對基因表現率。結果顯示於圖5。神經幹細胞以濃度100nM的化合物3~5、7~8處理2天，比控制組表現更多的粒腺體相關基因(HIF1α、Nrf-2、及AP1)。在所有的C₆₀富勒烯衍生物中，以化合物4處理的神經幹細胞，其粒腺體相關基因表現程度最高。另一方面，C6細胞經化合物7與8之含胺基酸富勒烯衍生物處理後，其粒腺體相關基因表現程度降低。同時，C6細胞之粒腺體相關基因表現程度在經化合物3處理後些微增加，顯示化合物3不會誘發腫瘤生長。這些基因表現結果顯示官能化富勒烯能夠在不同種類的細胞中調節粒腺體活性並且具有保護細胞(抗氧化)或是抗腫瘤效果。

為直接評估官能化富勒烯衍生物3、4、7、8對神經幹細胞與C6細胞內粒腺體功能的影響，利用生物能量分析(bioenergetic assay)來評估細胞能量氧氣消耗率(oxygen consumption rate，簡稱OCR)。我們使用XF-96細胞外分析儀(Seahorse Bioscience)於37℃分析細胞能量氧氣消耗率。將神經幹細胞或C6細胞以20000個/孔的密度植入8孔培養盤內，並於培養器中培養24小時。接著，分別加入100nM的化合物3、4或0.5mM的化合物7、8，培養24小時。加入培養液更換為未緩衝的DMEM(DMEM添加25mM 葡萄糖、1mM丙酮酸鈉、31mM NaCl、2mM GlutaMax^TM培養液，pH值為7.4)，將該水膠(hydrogel)於37℃且未添加5% CO₂的環境下培養1小時。所有欲進行分析的試劑，在進行分析當天將pH值調整至7.4。由Seahorse XF-96軟體自動計算細胞的氧氣消耗率。數據為培養盤內3~6個孔的檢測結果平均值。

氧氣消耗率為正常細胞功能的一個重要指標，且其亦為用於研究粒腺體功能的一個參數。在癌細胞中，氧氣消耗率被視為由健康的氧化磷酸化轉變為有氧糖解作用(aerobic glycolysis)的一個標記。生物能量評估結果如圖6所示。以100nM化合物3或4處理的神經幹細胞，其基礎氧氣消耗率與三磷酸腺苷(ATP)產生量有顯著增加。以化合物3與4處理的神經幹細胞之非粒腺體呼吸氧氣消耗改變則不明顯。以含胺基酸富勒烯衍生物7~8(濃度0.5mM)處理C6細胞24小時，發現C6細胞的基礎氧氣消耗率、ATP產量(由測得的氧氣消耗率換算而得)、及非粒腺體呼吸氧氣消耗下降。綜合來看，這些結果顯示富勒烯衍生物3~4在增加粒腺體功能以誘導神經幹細胞之增殖與分化效果最佳。同時，化合物7~8能夠摧毀粒腺體功能以及非粒腺體呼吸作用，而有抗腫瘤的效果。

利用中樞神經系統缺損之模式動物，測試化合物3~5、7、8的效果

斑馬魚(Danio rerio)是一個在神經科學中重要的脊椎動物模式。如圖7A之實驗流程所示，將斑馬魚胚胎直接浸入2%乙醇(EtOH)中4小時後，置換為含有100nM富勒烯衍生物3~5、7、8之正常培養基。浸入2%乙醇4小時會造成斑馬魚中樞神經系統的缺損。在斑馬魚胚胎的18體節期(somite stage)進行檢驗，其早期的運動行為有自發性的收縮蜷曲(coiling contraction)。如圖7B所示，未暴露於乙醇的野生型的胚胎(WT，空白控制組)顯示約85%的完全擺尾全反應(side-to-side contraction)與約15%的輕微反應(非常輕微的蜷曲或是單一側收縮蜷曲)；不正常的胚胎 (EtOH，被乙醇所損傷)在未經任何處理下約有76%的無反應(無收縮)與約24%的輕微反應。不正常的胚胎在以化合物7處理後約有28.6%的完全收縮、約43%的輕微反應、以及28.4%的無反應。以化合物8處理的胚胎，約有10%的輕微反應與約90%的無反應。值得一提的是，以化合物3與含硫富勒烯衍生物4~5處理的胚胎分別顯示約有70%、55%、及65%的完全收縮。

在受精後24小時測量斑馬魚的甩尾頻率，如圖7C所示。野生型斑馬魚胚胎的甩尾頻率約為0.075Hz，未處理的神經受損組別則顯著較低，約0.03Hz。以化合物7處理的組別，甩尾頻率些微增加至約0.05Hz。令人吃驚的是，以化合物8處理的組別，其甩尾頻率降低至0.01Hz。胚胎以化合物3、4、及5處理的組別，其甩尾頻率顯著提升至分別約0.065、0.10、及0.15Hz。

孵化率是由乙醇誘導的中樞神經系統損傷後，評估功能恢復最重要的參數。如圖7D所示，野生型胚胎有95%的孵化率。經乙醇誘導中樞神經系統損傷後，未處理的組別有17%的孵化率。以化合物7處理的組別有25%的孵化率。另一方面，以化合物8處理的組別未有任何的胚胎自卵中孵化。以captopril為基礎的富勒烯衍生物4處理的胚胎有約為65%的最高孵化率，而以化合物3及5處理的胚胎則有約55%的孵化率。中樞神經系統受損模型顯示富勒烯衍生物3~5在胚胎時期能夠顯著改善受損的神經系統功能。

我們也評估了官能化富勒烯3、4在修復成年斑馬魚之中樞神經系統的效果，係藉由比較未有腦損傷的成年斑馬魚(空白控制組)、以針筒(27G，Thermo Scientific，美國)穿刺而對其小腦造成損傷的成年斑馬魚(控制組)、以及在小腦損傷後立即注射10μl的100nM富勒烯衍生物3或4的成年斑馬魚之泳速的回復率(rescue rate)，因為有創傷性小腦損傷的成年斑馬魚會有不能移動或是游泳時不平衡的情況。圖8A說明對小腦受損的成年斑馬魚注射富勒烯衍生物並以攝影機記錄其泳速，各組別受試斑馬魚11隻，且本實驗重複二次。進行泳速測量之斑馬魚皆經過訓練，會在一260mm×90mm×50mm的水缸中游動，泳速之分析係使用軟體ImageJ(National Institutes of Health，美國)；以未注射或注射富勒烯衍生物至小腦損傷處的斑馬魚之泳速相對於空白控制組斑馬魚之泳速的百分比計算得泳速的回復率(%)。如圖8B所示，對小腦受損的斑馬魚注射以captopril為基礎的富勒烯衍生物4，在受損及注射後第2、4、及6天，斑馬魚移動的回復率分別有34%、57%、及72%。另外，富勒烯衍生物4也有良好的腦部受損回復效果。相較之下，控制組在4天後未有任何功能上的恢復。

為評估C₆₀富勒烯衍生物於體內(in vivo)作用於腦部腫瘤的效果，我們用一腫瘤異體移植模型評估C6細胞的凋亡作用。如圖9A所示，對受精後24小時的斑馬魚胚胎的中後腦區注射C6細胞(2×10²細胞/胚胎)，並在腫瘤移植後(受精後48小時)將100nM的富勒烯衍生物3、4或0.5mM的富勒烯衍生物7、8注射至腫瘤移植處。

細胞標記方面，於體外將C6細胞以紅色螢光染劑(PKH26紅螢光細胞連接套組，Sigma公司)標記。細胞以1×10⁷cells/ml之密度與2×10^-6M PKH26混合以標記，PKH26的長脂肪尾部能夠穩定地與細胞膜結合。標記過程以完全培養基終止，並將已標記之細胞清洗備用。

本實施例使用Tg(fli1a：EGFP)斑馬魚，其胚胎購自斑馬魚國際資源中心(ZIRC，Oregon，USA)，並以標準條件養殖及交配。fli1a啟動子驅動的綠螢光蛋白質(EGFP)主要表現在血管內皮細胞及心內膜細胞中，可即時監測血管增生。在28℃、含有E3胚胎培養液(5mM NaCl、0.17mM KCl、0.33mM CaCl₂、以及0.33mM MgSO₄)的培養皿中培養斑馬魚。胚胎與仔魚的行為以Leica(Z16 APO)立體顯微鏡觀察，並使用Olympus相機(C-7070 CCD)拍攝影像。以image J軟體計算腫瘤體積，並以腫瘤細胞注射後3天的腫瘤體積除以腫瘤細胞注射後1天的腫瘤體積，換算為腫瘤生長率。

結果如圖9B及9C，顯示化合物7~8顯著降低了腫瘤大小。相反地，與控制組相較，化合物4甚至促進了腫瘤的擴張程度。同時，在體外實驗中有些許作用的化合物3，在斑馬魚試驗中為對腫瘤大小未有顯著的效 果。

由前所述，我們呈現了幾個不同化學種類的水溶性富勒烯衍生物的例子。首先，我們研究在富勒烯框架(cage)與可溶性基團間不同種類的鏈結：C-C鍵(化合物1~3)、C-S鍵(化合物4~5)、C-P鍵(化合物6)、以及C-N鍵(化合物7~9)。第二，我們做出不同性質的可溶性基團：絕大多數的化合物(1~4與7~9)具有鉀鹽形式的羧基(-COO^-K⁺)，化合物5具有鈉鹽形式的磺酸基(-SO₃ ^-K⁺)，化合物6具有鉀鹽形式的磷酸基(-PO(O^-K⁺)₂)。第三，碳球與末端可溶性基團中間的間隔子結構也是可替換的，例如，我們提高化合物1~3的C-C鍵系統脂肪鏈中CH₂單元的量，或我們在C-N化合物中運用不同的氨基酸基團：苯丙氨酸(化合物7)、絲氨酸(化合物8)和β-丙氨酸(化合物9)。實驗結果顯示鏈結種類與可溶性基團的性質皆會影響水溶性富勒烯衍生物之毒性。例如，化合物5與6分別具有磺酸與磷酸基團，較其他具有羧基的富勒烯衍生物呈現較低的半致死劑量(median lethal dose)LD₅₀。

該些富勒烯衍生物之所有其他的生物作用主要取決於富勒烯框架(fullerene cage)與可溶性基團間的鍵結種類。因此，相較於具有C-C鍵結的化合物1~3、具有C-S鍵結的化合物4~5與具有C-P鍵結的化合物6，具有C-N鍵結的化合物7~9並未有促進腦神經前驅細胞之存活率與增殖的效果。三個含胺基酸富勒烯衍生物7~9於體內及體外試驗中皆有著相同的抑制腦膠質瘤細胞生長的效果，而其他化合物未有抗腫瘤活性。有趣的是，只有具有C-S鍵結的化合物4~5在神經幹細胞內顯著誘導基礎耗氧率與ATP產生。此外，含硫的化合物4在斑馬魚胚胎及成年之動物模型的體內實驗中顯示最強的中樞神經系統的保護作用。

由上述實施例可知，本發明提出一種富勒烯衍生物，能夠促進神經幹細胞生長、增殖與抗腫瘤，並且在動物實驗中證實能夠修復中樞神經系統的損傷或是抗腦腫瘤，提供了一種新穎的腦腫瘤與神經損傷疾病之治療方式。值得注意的是，本發明提出之富勒烯衍生物能夠穿越血腦障 壁到達腦內，而達到治療效果，不必如同現有許多中樞神經系統之藥物，必須直接傳送至腦內才能有治療效果。

【參考文獻】

1. O. A. Troshina, P. A. Troshin, A. S. Peregudov, V. I. Kozlovskiy, J. Balzarini, R. N. Lyubovskaya, Chlorofullerene C₆₀Cl₆: a precursor for straightforward preparation of highly water-soluble polycarboxylic fullerene derivatives active against HIV. Org. Biomol. Chem., 2007, 5 , 2783-2791

2. E. A. Khakina, A. A. Yurkova, A. A. Peregudov, S. I. Troyanov, V. Trush, A. I. Vovk, A. V. Mumyatov, V. M. Martynenko, J. Balzarini, P. A. Troshin, Highly selective reactions of C₆₀Cl₆ with thiols for synthesis of functionalized [60]fullerene derivatives. Chem. Commun., 2012, 48, 7158-7160

3. A. A. Yurkova, E. A. Khakina, S. I. Troyanov, A. Chernyak, L. Shmygleva, A. A. Peregudov, V. M. Martynenko, Y. A. Dobrovolskiy, P. A. Troshin, Arbuzov chemistry with chlorofullerene C₆₀Cl₆: a powerful method for selective synthesis of highly functionalized [60]fullerene derivatives. Chem. Commun., 2012, 48, 8916-8918

4. A. B. Kornev, E. A. Khakina, S. I. Troyanov, A. A. Kushch, D. G. Deryabin, A. S. Peregudov, A. Vasilchenko, V. M. Martynenko, P. A. Troshin, Facile preparation of amine and amino acid adducts of [60]fullerene using chlorofullerene C₆₀Cl₆ as a precursor. Chem. Commun., 2012, 48, 5461-5463

Claims (10)

1. 一種富勒烯衍生物用於製備調節中樞神經系統之醫藥組成物的用途，其中該富勒烯衍生物包含5個親水性基團於半個富勒烯框架(fullerene cage)上，另一半富勒烯框架上未有任何的官能基。
2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該未有官能基的半個富勒烯框架係為疏水性。
3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該富勒烯衍生物具有如式I之結構式： 且R具有下列之一的結構： 且R’為H或Cl。
4. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有促進神經幹細胞增殖的效果。
5. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有促進神經幹細胞之神經元分化的效果。
6. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有保持神經前驅細胞之自我更新能力的效果。
7. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有抑制腦神經膠質瘤細胞增殖的效果。
8. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有抗腦腫瘤的效果。
9. 如申請專利範圍第3項所述之用途，其中R具有下列之一的結構時： 該富勒烯衍生物有恢復受損之中樞神經系統的效果。
10. 一種富勒烯衍生物，其具有如式I之結構式： 其中R具有下列之一的結構： R’係為H或Cl。