TWI641594B - 用於治療中風的環烯醚萜苷類化合物，其醫藥組合物及其用途 - Google Patents

用於治療中風的環烯醚萜苷類化合物，其醫藥組合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本發明提供式(I)或式(II)所示的環烯醚萜苷類化合物和其醫藥組合物： 式(I)和式(II)中各符號如說明書中所定義者，其可降低腦部中風受損區域及可保護神經幹細胞，適用於作為治療中風的藥物。

Description

用於治療中風的環烯醚萜苷類化合 物，其醫藥組合物及其用途
本發明是有關於一種化合物，特別是一種環烯醚萜苷類化合物及其醫藥組合物。
中風為台灣十大死因中排名第三位，WHO列中風為「全球第二大死因」，全球2005年有五百八十萬人因為中風死亡，2015年預計會有六百五十萬因中風死亡。台灣已漸漸步入老化的社會結構，而老化卻是引起中風疾病的重要危險因子，根據本土中風中心的健康醫療資料，大於80歲的老人，中風風險是30歲以下年輕人的384倍。
中風為腦部血液供應異常所導致的腦部功能快速發展喪失。醫學上又稱為腦血管意外(cerebrovascular accident；CVA)，起因於腦部的血液供應受到破壞，使得腦局部細胞無法獲得足夠的養分和氧氣，造成神經的機能受損。中風可分為出血性中風(hemorrhage stroke)及缺血性中風(ischemia stroke)。一般而言，缺血性中風約佔80%， 而出血性中風約佔20%，且兩者起因相當不同。出血性中風則為腦血管破裂所導致之腦出血，通常死亡率較高。而缺血性中風為腦部血液流通不良或阻塞造成的腦局部缺血，死亡率通常較低，但容易導致神經行為能力方面的損害。
在美國FDA於1996年核准tPA治療中風後，tPA是目前臨床上治療缺血性中風的唯一藥物，tPA的作用機制是將栓塞的組織血塊溶解以達到血液恢復通暢，其會令使用tPA的患者腦出血的機率增加10倍。此外，缺血性中風患者身體所造成的傷殘傷害，衍生的問題便是造成家庭的人力照護與經濟負擔，也造成國家的醫療經濟負擔。因此，目前仍需開發治療中風的藥物，期可減少缺血性中風所導致之神經細胞損害，進而提升缺血性中風之治療效果。
本發明之一態樣是在提供一種環烯醚萜苷類化合物，其結構如下式(I)或式(II)所示： 式(I)中R1係為-OH、-OCH2CH3、=O、如式(i)所示之結構、如式(ii)所示之結構、如式(iii)所示之結構或 如式(iv)所示之結構，R2為一價基團；式(II)中m1係為如式(v)所示之一結構： 式(ii)中R3係為氫、氨基鹽酸鹽或如式(vi)所示之一結構： 式(ii)中R3係為氫、氨基鹽酸鹽或如式(vi)所示之一結構：
依據前述之環烯醚萜苷類化合物，其中式(I)中R2為如式(vii)所示之一結構： 式(vii)中R4係為氫、如式(viii)所示之結構、如式(ix)所示之結構或如式(x)所示之結構： 式(x)；式(viii)中R5係為氫、氨基鹽酸鹽或如式(vi)所示之結構，式(x)中R6係為-H2Cl或如式(vi)所示之結構。
本發明之另一態樣是在提供一種用於治療中風之醫藥組合物，包含上述有效量之環烯醚萜苷類化合物以及藥學上可接受之包覆物(carrier)。
依據前述之用於治療中風之醫藥組合物，其中有效劑量為0.1-10mg/Kg。
依據前述之用於治療中風之醫藥組合物，其中有效劑量為1mg/Kg。
依據前述之用於治療中風之醫藥組合物，其中醫藥組合物為液態、粉末、錠劑、膠囊或注射劑。
本發明之再一態樣是在提供一種上述環烯醚萜苷類化合物之用途，其係用於製備治療中風之藥物。
依據前述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其係用於製備治療缺血性中風之藥物。
依據前述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其係用於製備降低腦部中風受損區域之藥物。
依據前述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其係用於製備保護神經幹細胞之藥物、用於製備促進神經幹細胞增生之藥物或用於製備促進神經幹細胞自我更新之藥物。
依據前述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其係用於製備促進神經幹細胞之HIF-1α-Bmi-1訊息途徑之藥物。
藉此，本發明之環烯醚萜苷類化合物經由實驗數據證實，其具有神經保護的功效，並能降低腦部受損區域，避免腦組織功能的損害。進一步地，本發明之化合物可藉由HIF-1α-Bmi-1訊息途徑刺激神經幹細胞生長和自我更新的能力，在中風(特別是缺血性中風)的動物腦部驅使神經幹細胞分裂並且移動到腦部受損區域，是以本發明之化合物適於作為治療中風的藥物，或與藥學上可接受之包覆物搭配作為治療中風的醫藥組合物。
上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。
為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1A圖至第1E圖為本發明之環烯醚萜苷類化合物之合成方法流程圖；第1F圖為本發明之環烯醚萜苷類化合物於乳酸脫氫酶釋放率分析之結果圖；第1G圖為不同濃度之本發明之環烯醚萜苷類化合物於乳酸脫氫酶釋放率分析之結果圖；第2A圖為缺血性中風大鼠腦部皮質的Bmi-1表現量分析圖； 第2B圖為缺血性中風大鼠腦部海馬迴的Bmi-1表現量分析圖；第2C圖為缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖；第3圖為缺血性中風大鼠腦組織Bmi-1和神經細胞標記共同表現的顯微照片圖；第4A圖為以不同氧氣量進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖；第4B圖為以不同氧氣量進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現的顯微照片圖；第4C圖為以不同時間進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞中表現Bmi-1的細胞統計圖；第4D圖為以不同時間進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖；第5A圖為缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1和HIF-1α共同表現的顯微照片圖；第5B圖為以2-ME處理後之缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1表現之顯微照片圖及其量化圖；第5C圖為以2-ME處理後之缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1表現之西方墨點法分析圖；第5D圖為HIF-1α基因剔除小鼠腦部的Bmi-1表現之西方墨點法分析圖； 第6A圖為HIF-1α和Bmi-1於不同條件下在初代大腦皮質細胞體內位置的顯微照片圖；第6B圖為暫時表現Bmi-1後再進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖；第6C圖為抑制HIF-1α表現後再進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖；第7A圖為抑制HIF-1α或HIF-2α表現後再進行缺氧處理的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖；第7B圖為Bmi-1之5’端基因組區域之示意圖；第7C圖為初代大腦皮質細胞之染色質免疫沉澱法結果圖；第8A圖為構築質體之5’端基因組區域之示意圖；第8B圖為螢光素酶測定法之結果圖；第9A圖為神經幹細胞之神經球培養之顯微照片圖；第9B圖為神經幹細胞經缺氧處理後神經球培養之顯微照片圖；第9C圖為神經幹細胞導入LV-Bmi-1-sh後Bmi-1的表現；第9D圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經球形成頻率之統計圖；第9E圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經幹細胞自我更新潛力之統計圖； 第9F圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經球大小之統計圖；第9G圖為以不同氧氣量進行神經球培養下表現BrdU的細胞比例之統計圖；第9H圖為以不同氧氣量進行神經球培養下表現ki-67的細胞比例之統計圖；第10A圖為化合物1影響神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖；第10B圖為抑制HIF-1α表現後再處理化合物1的神經幹細胞的HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖；第10C圖為化合物1不同的處理時間下神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖；第11A圖為對照組之神經幹細胞的增生指數測量結果圖第11B圖為0.1μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖；第11C圖為1μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖；第11D圖為10μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖；第11E圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經球培養之顯微照片圖； 第11F圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經球形成頻率之統計圖；第11G圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經幹細胞自我更新潛力之統計圖；第11H圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經球大小之統計圖；第12A圖為以免疫螢光染色法檢測神經幹細胞增生標記表現之顯微照片圖；第12B圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中表現BrdU的細胞比例之統計圖；第12C圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中表現ki-67的細胞比例之統計圖；第13A圖為以不同時間進行化合物1處理的中風大鼠腦內Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖；第13B圖為以不同劑量進行化合物1處理的中風大鼠腦內Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖；第13C圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦內Bmi-1表現量分析圖；第14A圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區中神經幹細胞Bmi-1表現的顯微照片圖；第14B圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區中神經幹細胞Bmi-1表現量分析圖； 第14C圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核中神經幹細胞Bmi-1表現的顯微照片圖；第14D圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核中神經幹細胞Bmi-1表現量分析圖；第15A圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區內BrdU表現的顯微照片圖；第15B圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區內表現BrdU的細胞數統計圖；第15C圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核內BrdU表現的顯微照片圖；第15D圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核內表現BrdU的細胞數統計圖，第15E圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區內ki-67表現的顯微照片圖；第15F圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區內表現ki-67的細胞數統計圖；第15G圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核內ki-67表現的顯微照片圖；第15H圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核內表現ki-67的細胞數統計圖；第16圖為Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)和NL小鼠中風後腦部梗塞區域的照片圖； 第17A圖為施用化合物1對於中風大鼠腦內梗塞體積影響的照片圖；第17B圖為第17A圖的量化圖；第18A圖為中風大鼠經不同條件處理7天後的磁振造影圖；第18B圖為第18A圖的量化圖；第19A圖為中風大鼠身體擺動測試的結果圖；第19B圖為中風大鼠垂直運動數量測試的結果圖；第19C圖為中風大鼠垂直活動測試的結果圖；第19D圖為中風大鼠垂直活動時間測試的結果圖；以及第20圖為中風大鼠前肢抓握力測試的結果圖。
本說明書揭露內容提出一種新穎的環烯醚萜苷類化合物，其醫藥組合物及其新穎的用途。先以結構分析鑑定本發明之環烯醚萜苷類化合物，再以體外(in vitro)細胞試驗評估本發明之環烯醚萜苷類化合物保護神經細胞的功效，並以缺血性中風動物模式評估本發明之環烯醚萜苷類化合物治療中風的功效，並進一步驗證本發明之環烯醚萜苷類化合物治療中風的功效，係為藉由HIF-1α-Bmi-1訊息途徑刺激神經幹細胞生長和自我更新的能力，在缺血性中風的動物腦部驅使神經幹細胞分裂並且移動到腦部受損區域，可降低腦部受損區域，進而避免腦組織功能的損害。本說明書揭露內容提出的環烯醚萜苷類化合物為潛在的治療中風的物 質，可用以製備治療中風的藥物。
前述新穎的環烯醚萜苷類化合物其結構如式(I)或式(II)所示： 式(I)中R1係為-OH、-OCH2CH3、=O、如式(i)所示之結構、如式(ii)所示之結構、如式(iii)所示之結構或如式(iv)所示之結構，R2為一價基團；式(II)中m1係為如式(v)所示之一結構： 式(ii)中R3係為氫、氨基鹽酸鹽或如式(vi)所示之一結 構：
進一步的說，中式(I)中R2為如式(vii)所示之一結構： 式(vii)中R4係為氫、如式(viii)所示之結構、如式(ix)所示之結構或如式(x)所示之結構： 式(viii)中R5係為氫、氨基鹽酸鹽或如式(vi)所示之結構，式(x)中R6係為-H2Cl或如式(vi)所示之結構。
以下為本說明書中所用特定名詞的說明：本說明書中所述之「Bmi-1(B cell-specific MLV integration site-1)」是由Bmi-1基因所轉錄的蛋白 質。Bmi-1基因是多疏(polycomb group,PcG)基因家族中重要的調節基因，在調節幹細胞自我更新、細胞增殖和衰老中發揮重要作用。
本說明書中所述之「缺氧誘導因子1α(Hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)為缺氧誘導因子(Hypoxia-inducible factors HIFs)的成員之一，是一種在細胞環境中的轉錄因子，會因氧含量而產生不同反應，主要是在氧氣減少或缺氧的情況下活化。
茲以下列具體試驗例進一步示範說明本發明，用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些試驗例視為對本發明範圍的限制，但用於說明如何實施本發明的材料及方法。
<試驗例> 一、本發明之環烯醚萜苷類化合物的化學合成與結構鑑定
請參照下表一，為本發明之環烯醚萜苷類化合物之實施例化合物1至化合物17的結構式、分子量和化學式，其中Boc為t-Butyloxy carbonyl(叔丁氧羰基)的縮寫，即為前述之式(vi)結構。
請參照第1A圖，為本發明之化合物1之合成方法流程圖。
首先，將1g的梔子苷(geniposide)溶解於30mL二氯甲烷(dichloromethane)水溶液(二氯甲烷：水=1：1)中，並以100mg的ß-葡萄糖苷酵素(ß-glucosidase)處理。將反應混合物在37℃下劇烈攪拌24小時，以二氯甲烷萃取混合物三次後，將有機層以硫酸鈉(Na2SO4)乾燥並以減壓蒸餾去除二氯甲烷以得到487mg的梔子素(genipin)，產率為84%。再將到50mg(0.22mmol)梔子素溶於二氯甲烷中，再加入53mg(0.24mmol)的二碳酸二叔丁酯[(Boc)2O]、0.15mL(1.11mmol)的三乙胺(Et3N)。將反應物攪拌3小時後，加入1N的鹽酸(HCl)，將有機層分離，用鹽水洗滌後以硫酸鈉乾燥並濃縮。將粗產物 進行柱層析(10%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到51mg的化合物(i)，產率為71%。將1當量的化合物(i)溶於無水二氯甲烷中，再加入1.1當量的叔丁氧羰基-L-苯丙氨酸(Boc-L-phenylalanine)、1.1當量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl,EDCI)carbodiimide,EDCI)和0.1當量的4-二甲氨基吡啶(4-Dimethylaminopyridine,DMAP)，將反應混合物在室溫下攪拌直到原料被全部消耗，再將溶液以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮，殘留物進行柱層析純化，即可得到化合物(ii)，產率為99%。將1當量的化合物(ii)溶於25當量的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)和二氯甲烷中(二氯甲烷：三氟乙酸=10：1)。將反應物攪拌2小時，再將混合物濃縮以除去三氟乙酸。將殘留物進行柱層析(5%甲醇和二氯甲烷)純化，即可得到化合物1，產率為87%。
化合物1以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(300MHz,CDCl3)：δ 7.39(s,1H),7.31-7.20(overalp,5H),5.90(s,1H),4.85(d,J=9.6Hz,1H),4.78(d,J=9.3Hz,1H),4.25(t,J=4.8Hz,1H),3.72(3H,s),3.26(m,2H),3.11(dd,J=12.9,6.6Hz,1H),2.87(m,1H),2.38(t,J=6.0Hz,1H),2.01(m,1H)；ESI(m/z)374.14[M+H]+。
請參照第1B圖，為本發明之化合物2、化合物3和化合物12之合成方法流程圖。
將500mg(2.21mmol)的梔子素溶於無水二 氯甲烷中，再加入704mg(2.65mmol)的BOC-L-苯丙氨酸、636mg(3.32mmol)的EDCI和26.9mg(0.22mmol)的DMAP，將反應混合物在室溫下攪拌1小時，再將反應混合物以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層以硫酸鈉乾燥並濃縮。將殘留物進行柱層析(20%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到310.9mg的化合物2(產率為20%)、390.1mg的化合物3(產率為37%)和223.8mg的化合物12(產率為21.4%)。
化合物2以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.42(s,1H),7.31-7.14(overlap,10H),5.96(d,J=5.6Hz,1H),5.84(s,1H),4.75-4.57(overlap,4H),3.74(3H,s),3.21-3.05(overlap,6H),2.85(dd,J=17,8Hz,1H),2.72(m,1H),2.20(m,1H),1.41(s,18H).ESI(m/z)743.20[M+Na]+。
化合物3以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.50(s,1H),7.31-7.15(overlap,5H),5.90(s,1H),5.00(d,J=7.6Hz,1H),4.75-4.70(overlap,2H),4.55(d,J=6.4HZ,1H),3.72(3H,s),3.16-3.11(overlap,3H),2.90(m,1H),2.40(m,1H),2.03(m,1H),1.41(s,9H).ESI(m/z)496.05[M+Na]+。
化合物12以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.45(s,1H),7.33-7.18(overlap,5H),6.08(d,J=6.8Hz,1H),5.85(s,1H),4.59(dd,J=14.2,7.2Hz,1H),4.20(overlap,2H),3.75(3H,s),3.26(dd,J=14.6,7.2Hz,1H),3.17-3.05(overlap,2H),2.92-2.86(overlap,2H),2.23(m,1H),1.41(s,9H).ESI(m/z)496.05[M+Na]+。
請再參照第1C圖，為本發明之化合物4、化合物6、化合物9、化合物10、化合物11、化合物13和化合物17之合成方法流程圖。
將456mg(0.96mmol)的化合物3溶於無水二氯甲烷中，再加入268mg(1.16mmol)的叔丁氧羰基-L-天冬酰胺(Boc-L-asparagine)、277mg(1.44mmol)的EDCI和11.8mg(0.096mmol)的DMAP，將反應混合物在室溫下攪拌1小時，再將反應混合物以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層以硫酸鈉乾燥並濃縮。將粗產物進行柱層析(20%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到285.5mg的化合物(iv)，產率為43%，化合物(iv)的結構式如下：
化合物(iv)以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.42(s,1H),7.29-7.18(overlap,5H),6.02-5.88(overlap,2H),5.11(d,J=7.6Hz,1H),4.92(d,J=12.4Hz,1H),4.62-4.59(overlap,2H),3.73(3H,s),3.22(dd,J=13.8,7.6Hz,1H),3.12-2.97(overlap,4H),2.88(dd,J=16.6,7.6Hz,1H),2.76-2.72(overlap,2H),1.45(s,9H),1.39(s,9H).ESI(m/z)710.10[M+Na]+。
將0.12mmol的化合物(iv)溶解在10mL的 HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物減壓濃縮，並將所得粗產物在10mL的乙醚中重結晶。所得晶體用乙醚洗滌即可得到化合物4，產率為51%。
化合物4以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.38-7.31(overlap,6H),6.30(s,1H),5.94(s,1H),4.96(d,J=9.6Hz,1H),4.84(m,1H),4.40(br s,2H),3.73(3H,s),3.32-2.98(overlap,6H),2.84(d,J=14Hz,1H),2.29(d,J=16.4Hz,1H).ESI(m/z)488.15[M+Na]+。
將177mg(0.37mmol)的化合物3溶解在4mL二氯甲烷中。然後將0.34mL(0.97mmol)的85% N,N-二乙基芐基磷酰胺(N,N-diethyl dibenzylphosphoramidite)溶於1.1mL二氯甲烷中，隨後加入2.16mL(0.97mmol)的1H-四唑(0.45M溶於乙腈)。將反應混合物在室溫下攪拌1小時，再將反應混合物冷卻至0℃，並加入1.7mL 30%的過氧化氫。將反應混合物在0℃攪拌15分鐘，再加入4.5mL飽和硫代硫酸鈉(Na2S2O3)，再將反應混合物中在0℃下攪拌2小時。以30mL的乙酸乙酯萃取反應混合物3次。將有機層以用飽和碳酸氫鈉(NaHCO3)和鹽水洗滌，再以硫酸鈉乾燥有機層並減壓濃縮，將殘留物進行柱層析(30%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到218mg的化合物(iii)，產率為80%。將149mg(0.20mmol)的化合物(iii)溶於2.5mL的二氯甲烷中的溶液，再以溶於1.6mL二氯甲烷的的一溴三甲基矽烷(trimethylsilyl bromide,TMSBr)(0.12mL,0.92mmol)和吡啶(pyridine)(0.19mL,2.31mmol)在0℃處理4至6小時。再加入4.5mL的水後，將水層分離並冷凍乾燥，即可得到純58.3mg的化合物6，產率為63%。
化合物6以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.50(s,1H),7.40-7.29(overlap,5H),5.97(s,1H),5.43(t,J=7.2Hz,1H),4.82(m,2H),4.38(m,1H),3.73(3H,s),3.28-3.03(overlap,4H),2.83(m,1H),2.17(m,1H).ESI(m/z)452.05[M-H]-。
將1當量的化合物3溶於無水二氯甲烷中，再加入1.1當量的叔丁氧羰基氨基酸、1.1當量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺和0.1當量的DMAP，將反應混合物在室溫下攪拌直到原料被消耗，再將溶液以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮，殘留物進行柱層析純化，即可得到純化合物。將該化合物溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物減壓濃縮，並將所得粗產物在10mL的乙醚中重結晶。所得晶體用乙醚洗滌即可得到化合物9，兩步總產率為52%。
化合物9以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.44(s,1H),7.36-7.31(overlap,5H),6.23(d,J=3.6Hz,1H),5.95(s,1H),4.91-4.80(overlap,2H),4.56(d,J=6.8Hz,1H),4.42(d,J=5.2Hz 1H),3.73(3H,s),3.41(br s,2H),3.31-3.27(overlap,3H),3.05(brs,1H),2.86(m,1H),2.49(m,1H), 2.29-2.11(overlap,4H).ESI(m/z)471.05[M+H]+。
將50mg(0.097mmol)的化合物3溶於0.60mL(7.76mmol)的三氟乙酸和25mL的二氯甲烷中。將反應混合物攪拌2小時，再加入12毫升的HCl(1.25M溶於乙醇中)。將反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將溶液濃縮，殘留物用二氯甲烷回溶，並鹽水洗滌3次。將有機層以硫酸鈉乾燥並濃縮。將粗產物進行柱層析(20%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到12.1mg的化合物11，產率為29%。
化合物11以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.52(s,1H),7.30-7.19(overlap,5H),5.82-5.75(overlap,2H),4.74(brs,2H),4.63(q,J=7.6HZ,2H),4.65(d,J=5.6Hz,1H),3.71(3H,s),3.12(m,1H),3.05-2.92(overlap,5H),2.81(m,1H),2.58(m,1H),2.15(m,1H).ESI(m/z)402.15[M+H]+。
將150mg(0.32mmol)的化合物3和45mg的對-甲苯磺酸(p-toluenesulfonic acid)溶於10mL的40%含水甲胺(aqueous methyl amine)，在室溫下攪拌48小時。再將反應混合物用15mL的二氯甲烷萃取3次，將有機層用鹽水洗滌，再以硫酸鈉乾燥並濃縮。殘留物進行柱層析純化，即可得到22.3mg的化合物13，產率為19%。
化合物13以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.31-7.20(overlap,5H),7.12(s,1H),6.01(s,1H),5.76(brs,1H),4.37(m,2H),4.21(d,J=5.2HZ,1H),3.67(s,3H),3.41(s,3H),3.25(m,1H),3.17(m,1H),3.13(m,1H),2.81(m,1H),2.28(m,1H),ESI(m/z)391.10[M+Na]+。
將301.2mg(0.92mmol)的化合物3溶於二氯甲烷中，並加入783.8mg(1.845mmol)的Dess-Martin高碘劑和155.3mg(1.85mmol)的碳酸氫鈉。將反應混合物攪拌直到所有的原料被消耗。用含水飽和硫代硫酸鈉硫代硫酸鈉處理反應混合物10分鐘，並用二氯甲烷萃取3次。將有機層以無水硫酸鈉乾燥並濃縮。殘留物進行柱層析(15%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到244.2mg的化合物17，產率為82%。
化合物17以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.49(s,1H),7.29-7.15(overlap,5H),5.88(s,1H),4.97(d,J=13.6Hz,1H),4.89(d,J=13.6Hz,1H),4.59(d,J=7.2Hz,1H),3.79(3H,s),3.44(m,2H),3.09-3.07(overlap,2H),2.92(m,1H),2.19(m,1H),1.41(s,9H).ESI(m/z)494.15[M+Na]+。
將0.12mmol的化合物17溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物在真空中濃縮，並將所得粗產物以10mL的乙醚重結晶。所得固體用乙醚洗滌即可得到化合物10，產率為84%。
化合物10以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.56(s,1H),7.37-7.25(overlap,5H),5.95(s,1H),5.04(d,J=13.2Hz,1H),4.96(d,J=13.2Hz,1H),4.39(t,J=7.2Hz,1H),3.78(3H,s),3.52(m,1H),3.41(m,1H),3.25-3.23(overlap,2H),2.88(dd,J=16.6,8Hz,1H),2.19(dd,J=16.8,8.4Hz,1H).ESI(m/z)371.95[M+H]+。
請再參照第1D圖，為本發明之化合物5、化合物7、化合物8和化合物16之合成方法流程圖。
將323.6mg(0.68mmol)的化合物3溶於無水二氯甲烷中，再加入190mg(0.82mmol)的叔丁氧羰基-L-天冬酰胺、197mg(1.03mmol)的EDCI和8.4mg(0.068mmol)的DMAP，將反應混合物在室溫下攪拌1小時，再將反應混合物以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層以硫酸鈉乾燥並濃縮。將粗產物進行柱層析(20%乙酸乙酯和己烷)純化，即可得到206.8mg的化合物(v)，產率為40%，化合物(v)的結構式如下：
化合物(v)以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.45-7.19(overlap,6H),6.04(s,1H),5.93(s,1H),4.77-4.53(overlap,3H),4.35(m,1H),3.74(3H,s),3.28(t,J=6.8Hz,1H),3.10-2.73(overlap,6H),2.21(m,1H),1.44(s,9H),1.40(s,9H).ESI(m/z)701.4[M+Na]+。
將0.12mmol的化合物(v)溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物在真空中濃縮，並將所得粗產物以10mL的乙醚重結晶。所得固體用乙醚洗滌即可得到化合物5，產率為89%。
化合物5以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.40-7.32(overlap,6H),6.19(s,1H),6.03(s,1H),5.04(m,1H),4.78(m,1H),4.54(m,1H),4.37(m,1H),3.74(3H,s),3.28-3.79(overlap 7H),2.28(m,1H).ESI(m/z)488.10[M+H]+。
將1當量的化合物12溶於無水二氯甲烷中，再加入1.1當量的叔丁氧羰基氨基酸(N-Boc-amino acid)、1.1當量的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺和0.1當量的DMAP，將反應混合物在室溫下攪拌直到原料被消耗，再將溶液以二氯甲烷稀釋，並用鹽水洗滌3次。將有機層經硫酸鈉乾燥並濃縮，殘留物進行柱層析純化，即可得到化合物7，產率為77%。
化合物7以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.42(s,1H),7.31-7.16(overlap,5H),6.05(d,J=6Hz,1H),5.92(s,1H),4.70-4.62(overlap,2H),4.34(d,J=7.6Hz,1H),4.25(dd,J=4,8.6Hz,1H),3.74(3H,s),3.52-3.35(overlap,2H),3.26(dd,14.4,8Hz,1H),3.17-3.04(overlap,2H),2.92-2.84(overlap,2H),2.27-2.17(overlap,2H),1.99-1.85(overlap,3H),1.41(s,9H),1.39(s,9H).ESI(m/z)693.20[M+Na]+。
將0.12mmol的化合物7溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物在真空中濃縮，並將所得殘留物以10mL的乙醚重結晶。所得固體用乙醚洗滌即可得到化合物8，產率為70%。
化合物8以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜 分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.37-7.30(overlap,6H),6.31(s,1H),6.01(s,1H),5.92(s,1H),4.90-4.83(overlap,2H),4.48(br s,2H),3.75(3H,s),3.42(br s,2H),3.31-3.20(overlap,3H),2.83(d,J=14Hz,1H),2.48(br s,1H),2.30(d,J=15.6Hz,1H),2.21-2.11(overlap,4H).ESI(m/z)471.05[M+H]+。
將0.12mmol的化合物12溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物真空濃縮，並將所得殘留物以10mL的乙醚重結晶。所得固體用乙醚洗滌即可得到化合物16，產率為63%。
化合物16以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.37-7.28(overlap,6H),6.31(d,J=5.2Hz,1H),5.79(s,1H),4.46(t,J=6.8Hz,1H),4.17(d,J=14Hz,1H),4.13(d,J=13.6Hz,1H),3.75(3H,s),3.21-3.13(overlap,3H),3.06(t,J=5.6Hz,1H),2.81(dd,16.8,7.6Hz,1H),2.25(t,J=16.8Hz,1H).ESI(m/z)373.95[M+H]+。
請再參照第1E圖，為本發明之化合物14和化合物15之合成方法流程圖。
將83.1mg(0.12mmol)的化合物2溶解在10mL的HCl(2M溶於乙醚中)，反應混合物在室溫下攪拌過夜，再將反應混合物減壓濃縮，並將所得殘留物以10mL的乙醚重結晶。所得固體用乙醚洗滌即可得到64.2mg的化合物14，產率為94%。
化合物14以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.38-7.26(overlap, 11H),6.26(d,J=4.8Hz,1H),5.92(s,1H),4.94(d,J=13.2Hz,1H),4.76(d,J=13.2Hz,1H),4.46(t,J=6.8Hz,1H),4.38(t,J=6.4Hz,1H),3.74(3H,s),3.28-3.12(overlap,5H),2.95(t,J=5.0Hz,1H),2.80(dd,J=17,8Hz,1H),2.27(d,J=17.6Hz,1H).ESI(m/z)521.10[M+H]+。
將1當量的化合物2溶於25當量的三氟乙酸(trifluoroacetic acid,TFA)和二氯甲烷中(二氯甲烷：三氟乙酸=10：1)。將反應物攪拌2小時，再將混合物濃縮以除去三氟乙酸。將殘留物進行柱層析(5%甲醇和二氯甲烷)純化，即可得到化合物15，產率為92%。
化合物15以核磁共振光譜儀進行核磁共振光譜分析數據為：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 7.27-7.14(overlap,11H),5.90(d,J=6.0Hz,1H),5.77(s,1H),4.60(d,J=13.2Hz,1H),4.52(d,J=13.2Hz,1H),4.34(brs,1H),4.22(brs,1H),3.74(3H,s),3.29-3.20(overlap,4H),3.05(dd,J=14,7.2Hz,1H),2.79(dd,J=14,7.2Hz,1H),2.51(m,1H),2.08(m,1H).ESI(m/z)521.20[M+H]+。
二、本發明之環烯醚萜苷類化合物具有神經保護功效 試驗例2-1：乳酸脫氫酶釋放率分析
H2O2對細胞造成氧化傷害，也導致細胞膜的破壞，因而釋放出乳酸脫氫脢(lactate dehydrogenase,LDH)到培養基之中，故培養基之中LDH釋放率越低，則細胞受到損傷的比率越低，表示樣品越有保護細胞之效力。
試驗之細胞為初代大腦皮質細胞(primary cortical cells,PCC)，初代大腦皮質細胞從懷孕17天 C57BL/6小鼠的大腦皮層製備而得，初代大腦皮質細胞之製備方法參照Wetzel M等人提出的步驟(Cell Death Differ 2008；15：143-151)。初代大腦皮質細胞培養於不含血清的條件下，培養基為添加B-27補充物(2%；Invitrogen)、麩醯胺酸(0.5mM；Sigma Aldrich)、穀氨酸(25mM；Sigma Aldrich)、青黴素(100U/ml)和鏈黴素(100mg/ml；Invitrogen)的神經元細胞培養基(neurobasal medium,Invitrogen)。體外培養4天後，將一半的培養基置換為不含穀氨酸的新鮮培養基，並培養於37℃、5% CO2培養箱中。體外培養7天後，初代大腦皮質細胞即可用於試驗。
試驗上先將初代大腦皮質細胞接種於24孔微量盤中，靜置20分鐘後，於培養液中分別給予樣品或誘導劑H2O2(10-4mol/L)，其中以僅添加誘導劑H2O2做為對照組，同時添加誘導劑H2O2與樣品為實驗組，而樣品分別為濃度為100μM的化合物1至化合物17，再於37℃、5% CO2培養箱中培養24小時。培養後將培養液吸出，用磷酸緩衝液(PBS)洗兩次後，使用LDH Cytotoxicity Detection Kit(TaKaRa Bio Laboratories,Japan)分析培養液中之LDH活性，可以計算對初代大腦皮質細胞造成的毒性百分率(percentage cytotoxicity)，即表示細胞受到損傷的情形。當分析結果LDH活性較低時，其毒性百分率較小，則細胞受到損傷的情形較不嚴重，表示該樣品越有保護細胞之效力。乳酸脫氫酶活性是藉由比色法來測定，在特定的基質 與酵素反應後，反應液的吸光度與乳酸脫氫酶活性成線性正相關。乳酸脫氫酶活性(U/10-3L)以3分鐘內波長340nm所減少的光密度的斜率來計算。1個乳酸脫氫酶活性單位被定義為每分鐘催化1×10-3mol NADH的消耗量。
請參照第1F圖，為本發明之環烯醚萜苷類化合物於乳酸脫氫酶釋放率分析之結果圖，分析的化合物為化合物1至化合物17。結果顯示，化合物1至化合物17皆能使添加H2O2的初代大腦皮層細胞其乳酸脫氫酶釋放率降低至50%以下，另除了化合物7和化合物13外，其他的化合物皆能使添加H2O2的初代大腦皮層細胞其乳酸脫氫酶釋放率降低至45%以下，顯示本發明之化合物皆具有保護初代大腦皮層細胞免受於H2O2氧化傷害的功效。
請再參照第1G圖，為不同濃度之本發明之環烯醚萜苷類化合物於乳酸脫氫酶釋放率分析之結果圖，分析的化合物為化合物1、化合物3、化合物5、化合物15和化合物16。於本試驗中，挑選第1A圖中乳酸脫氫酶釋放率較低的化合物1、化合物3、化合物5、化合物15和化合物16進一步分析其可保護初代大腦皮層細胞的最佳濃度，試驗的濃度分別為0.1μM、1μM、10μM和100μM。由第1B圖的結果顯示，不論是化合物1、化合物3、化合物5、化合物15和化合物16於濃度為100μM時，對於初代大腦皮層細胞之乳酸脫氫酶釋放率降低效果最佳，且皆隨著濃度降低，其降低乳酸脫氫酶釋放率的效果也減低，可見本發明之化合物保護初代大腦皮層細胞免於受到H2O2氧化傷害的功效具有劑量依賴 性此外。化合物1即使於濃度為0.1μM時，其亦能使添加H2O2的初代大腦皮層細胞其乳酸脫氫酶釋放率降低至30%，故後續缺血性中風動物模式將以化合物1評估本發明之化合物可用於治療中風之效果。
三、缺血性中風發生後神經幹細胞自我更新及分子間的作用調節機制
一旦發生缺血性中風後，神經幹細胞(neural stem cells,NSCs)如何的自我更新與分子間的作用調節機制仍尚未釐清。目前研究顯示，Bmi-1為促進幹細胞的自我更新和生長的一個關鍵因子，因而此部分之試驗例將先探討神經幹細胞如何透過活化Bmi-1自我更新和生長。
試驗3-1. 腦缺血增加大鼠腦內Bmi-1的表現
為了確定腦缺血是否會增加Bmi-1的表現，本試驗例藉由免疫螢光染色和西方墨點法分析在缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1的表現量。
中風大鼠模型採取腦缺血/再灌注模型(ischemia-reperfusion model)來模擬大鼠中暫時性局部腦缺血的症狀，所使用之試驗動物為體重250-300克雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠。大鼠先腹腔注射水合氯醛(0.4g/kg)進行麻醉，大鼠的腦缺血/再灌注模型係以阻塞大鼠的雙側頸總動脈(common carotid arteries；CCA)及右側大腦中動脈(middle cerebral artery；MCA)誘發局部性腦缺血，阻塞90分鐘後解除以進行再灌注。大鼠的 核心溫度以熱敏電阻溫度探測器(Hewlett-Packard Model 21090A probe,Hewlett-Packard Company,Andover,MA)監測，並於麻醉的過程中以加熱墊使大鼠的體溫維持在37℃，從麻醉中恢復後，大鼠體溫亦以熱燈保持在37℃。
實驗上將腦缺血後4小時、12小時、24小時和3天的中風大鼠的腦部組織切片以免疫螢光染色法標定Bmi-1，另有未處理腦缺血/再灌注模型的大鼠作為對照組。請參照第2A圖和第2B圖，第2A圖為缺血性中風大鼠腦部皮質(cortex)的Bmi-1表現量分析圖，第2B圖為缺血性中風大鼠腦部海馬迴(hippocampus)的Bmi-1表現量分析圖。第2A圖之左圖為拍攝中風大鼠腦部皮質區域的顯微照片圖，其中方框即為觀察和拍攝區域，第2A圖之右圖為將大鼠腦部皮質區域中表現Bmi-1的細胞的統計結果。第2B圖之左圖為拍攝中風大鼠腦部海馬迴區域的顯微照片圖，其中方框即為觀察和拍攝區域，第2B圖之右圖為將大鼠腦部皮質區域中表現Bmi-1的細胞的統計結果。由第2A圖和第2B圖的結果顯示，中風大鼠與對照組的大鼠相較，中風大鼠的腦部可以偵測到更多表現Bmi-1(Bmi-1+)的細胞，且主要表現在大鼠腦部梗塞邊界附近的同側皮層區域和大腦海馬梗死邊界和海馬迴的齒狀核(dentate gyrus,DG)。此外，中風大鼠與對照組的大鼠相較後可發現，Bmi-1免疫反應增加具有時間依賴性，並在腦缺血後24小時達到Bmi-1的最高表現量。
本試驗進一步以西方墨點法偵測缺血性中風大鼠腦組織中Bmi-1和HIF-1α的表現量，實驗上先萃取腦缺血後4小時、16小時、1天、2天、4天、7天和10天中風大鼠的腦部組織的全部蛋白後，再以西方墨點法偵測蛋白表現量，並以中風大鼠腦組織(皮質區和紋狀體)中沒有阻塞的同源區域作為正常對照。請再參照第2C圖，為缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖。由第2C圖的結果顯示，中風大鼠腦組織中的Bmi-1和HIF-1α表現以時間依賴性方式增加，此結果與第2A圖和第2B圖的結果一致，可見腦缺血會增加大鼠腦內Bmi-1的表現。
試驗3-2. 腦缺血後的Bmi-1與神經膠質細胞共同表現
為進一步確定腦缺血後表現Bmi-1的為何種腦細胞，實驗上將缺血性中風大鼠的腦組織以免疫螢光雙染法標定神經細胞標記和Bmi-1，再以共軛焦顯微鏡拍照觀察，以確認神經細胞標記與Bmi-1共同表現的情況，並以4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)標定細胞核，特定細胞型態標記包含星形膠質細胞標記GFAP(glial fibrillary acidic protein)、神經元特異性細胞骨架蛋白MAP-2(microtubule-associated protein 2)、神經核標記NeuN(neuronal nuclear antigen)和神經幹細胞標記Nestin(neuroectodermal stem cell marker)。
請參照第3圖，為缺血性中風大鼠腦組織Bmi-1和神經細胞標記共同表現的顯微照片圖，其中比例尺代表50μm。結果顯示，在中風大鼠腦部中大量表現Bmi-1+細 胞的缺血皮質區域或齒狀核，可見Bmi-1+細胞分別與神經幹細胞標記(Nestin+)、成熟神經標記(MAP-2+和NeuN+)以及神經膠質細胞標記(GFAP+)共同表現。
試驗3-3. 缺氧增強Bmi1在初代大腦皮質細胞的表現
為了評估缺氧的環境是否影響Bmi-1在初代大腦皮質細胞中的表現，本試驗例分別以不同的氧氣量(21%、1%、3%和5%)缺氧處理初代大腦皮質細胞，或以不同時間(1小時、4小時、8小時、16小時和24小時)缺氧處理初代大腦皮質細胞，其中氧氣量21%之組別為對照組，再以免疫螢光染色和西方墨點法分析不同條件處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量。
請參照第4A圖至第4D圖，第4A圖為以不同氧氣量進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖，第4B圖為以不同氧氣量進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現的顯微照片圖，第4C圖為以不同時間進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞中表現Bmi-1的細胞統計圖，第4D圖為以不同時間進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖。數據結果以mean±SD值表示，n=8，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。其中第4A圖和第4B圖初代大腦皮質細胞進行缺氧處理的時間為8小時，第4C圖和第4D圖初代大腦皮質細胞進行缺氧處理的氧氣量為1%。免疫螢光染色或西方墨點法的結果皆顯示，與未經由缺氧處理的初代大腦皮質細胞相比，缺氧環境會使初代大腦皮質細胞增加Bmi-1的表 現，且此增加的情況具有時間依賴性(缺氧時間為16小時Bmi-1表現量最高)和劑量依賴性(氧氣量3%時Bmi-1表現量最高)。
試驗3-4. 抑制缺血大鼠的HIF-1α活性會負調控Bmi-1的表現
為證明缺血後是否藉由誘發HIF-1α正調控Bmi-1，本試驗例分別以HIF-1α抑制劑(2-Methoxyestradiol,2-ME2)處理中風大鼠，或使用HIF-1α基因剔除小鼠(HIF-1α knockout mice)，再以免疫螢光染色法和西方墨點法分析大鼠(或小鼠)缺血腦中Bmi-1的表現量。
試驗上先將2-ME2溶於二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)中，以獲得10mmol/L的儲備液。以2-ME2處理中風大鼠的方法參照Ricker JL等人提出的步驟(Clin Cancer Res 2004,10：8665-8673)。試驗之大鼠自處理腦缺血/再灌注前幾天至處理腦缺血/再灌注後，每天皆以腹腔注射含有不同劑量2-ME2(50mg/kg、100mg/kg或150mg/kg)脂質體(di-oleoyl-phosphotidylcholine；Avanti Polar Lipids,USA)，連續的天數為5-10天。
HIF-1α基因剔除小鼠帶有HIF-1α的loxP兩側等位基因，其來源為Johnson RS.團隊的贈予(Cancer Res,2000,60：4010-4015)。HIF-1α基因剔除小鼠自胚胎期第15天至產後第1天，每天餵食多西環素誘導(2mg/ml溶於5% w/v的蔗糖溶液中)以中斷HIF-1α的表現。HIF-1α基因 剔除小鼠亦同樣以腦缺血/再灌注模型來模擬小鼠中暫時性局部腦缺血的症狀。
請參照第5A圖至第5D圖，第5A圖為缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1和HIF-1α共同表現的顯微照片圖，第5B圖為以2-ME處理後之缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1表現之顯微照片圖及其量化圖，第5C圖為以2-ME處理後之缺血性中風大鼠腦部的Bmi-1表現之西方墨點法分析圖，第5D圖為HIF-1α基因剔除小鼠腦部的Bmi-1表現之西方墨點法分析圖，其中NL(normal littermate)代表與HIF-1α基因剔除小鼠同窩出生但未進行HIF-1α基因剔除的小鼠。由第5A圖的結果顯示，在缺血性中風大鼠腦部中增加Bmi-1表現的皮質區域，可見Bmi-1+細胞共同表現HIF-1α。而由第5B圖和第5C圖的結果顯示，腦缺血後大鼠腦中增加Bmi-1表現的現象，會因注射2-ME2而被抑制，且其抑制作用具有劑量依賴性。由第5D圖的結果顯示，正常小鼠經腦缺血處理後(以腦缺血/再灌注模型)與未經腦缺血處理的組別相比，其腦部的Bmi-1表現量增加。但HIF-1α基因剔除小鼠經腦缺血處理後，未見其腦部的Bmi-1表現量增加。由上述結果可知，抑制缺血性中風大鼠(或小鼠)的HIF-1α活性會負調控Bmi-1的表現。
試驗3-5. 缺氧引起初代大腦皮質細胞HIF-1α的轉位入核
本試驗例進一步以免疫螢光染色法確定HIF-1α和Bmi-1於缺氧環境下在初代大腦皮質細胞體內的位置。試驗上將初代大腦皮質細胞分為3個組別，分別為培 養於氧氣量21%的環境作為對照組，於氧氣量1%的環境下培養8小時作為缺氧組，以及先於培養基中加入1μM的2-ME2處理16小時後再於氧氣量1%的環境培養8小時作為缺氧+2-ME2組。
請參照第6A圖，為HIF-1α和Bmi-1於不同條件下在初代大腦皮質細胞體內位置的顯微照片圖。由第6A圖的結果顯示，在正常的環境下(對照組)，HIF-1α同時分布在細胞質(包括神經突)和細胞核中，在缺氧的環境下，HIF-1α的轉位到細胞核或細胞核周圍區域，且在缺氧的環境下HIF-1α和Bmi-1共同表現。而在先處理2-ME2的組別則會抑制HIF-1α在缺氧環境下轉位入核的情況。
本試驗再進一步以西方墨點法分析HIF-1α活化與Bmi-1表現之間的關係。請參照第6B圖，為暫時表現Bmi-1後再進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖，試驗上轉染LV-Bmi-1至初代大腦皮質細胞中，於初代大腦皮質細胞中暫時大量表現Bmi-1，以及先以1μM的2-ME2處理16小時後再轉染LV-Bmi-1至初代大腦皮質細胞中，試驗上亦轉染LV-GFP至初代大腦皮質細胞作為試驗對照組。第6B圖的結果顯示，轉染LV-Bmi-1後，初代大腦皮質細胞會大量表現Bmi-1，但此大量表現Bmi-1的結果不會受先處理2-ME2影響。
請再參照第6C圖，為抑制HIF-1α表現後再進行缺氧處理後的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖。試驗上使用慢病毒導入靶向HIF-1α的shRNA (LV-HIF-1α-sh,sc-35562-V,Santa Cruz Biotechnology)至培養基中培養初代大腦皮質細胞，以降低初代大腦皮質細胞中HIF-1α的表現，試驗上另以1μM的2-ME2處理16小時以降低初代大腦皮質細胞中HIF-1α的表現，試驗上亦使用慢病毒導入對照組的shRNA(LV-control-sh,sc-108080,Santa Cruz Biotechnology)至培養基培養初代大腦皮質細胞作為試驗對照組。第6C圖的結果顯示，不論導入LV-HIF-1α-sh或先處理2-ME2皆會降低初代大腦皮質細胞中的HIF-1α的表現量，同時也會降低初代大腦皮質細胞中的Bmi-1的表現量。
由上述結果可知，HIF-1α的活化會影響HIF-1α轉位入核和Bmi-1表現，且2-ME2不能單獨抑制Bmi-1表現，其僅能抑制由HIF-1α引導的Bmi-1表現。
試驗3-6. HIF-1α被徵召到Bmi-1基因啟動子以反應缺氧
為了證明在缺氧環境下Bmi表現量增加只有藉由HIF-1α正調控，試驗上分別降低HIF-1α表現或HIF-2α(缺氧誘導因子的另一成員)表現，再將初代大腦皮質細胞進行缺氧處理，以觀察HIF-1α和HIF-2α與Bmi-1之間的關係。降低HIF-1α或HIF-2α表現係使用慢病毒導入LV-HIF-1α-sh或靶向HIF-2α的shRNA(LV-HIF-2α-sh,sc-35316-V,Santa Cruz Biotechnology)至培養基中培養初代大腦皮質細胞。試驗上亦使用慢病毒導入對照組的LV-control-sh至培養基培養初代大腦皮質細胞作為試驗 對照組。
請參照第7A圖，為抑制HIF-1α或HIF-2α表現後再進行缺氧處理的初代大腦皮質細胞的Bmi-1表現量分析圖，第7A圖中係以西方墨點法分析Bmi-1表現量。結果顯示，抑制初代大腦皮質細胞的HIF-1α表現後，其亦未偵測到Bmi-1的表現，但抑制初代大腦皮質細胞的HIF-2α則不影響Bmi-1的表現，可見在缺氧環境下增加的Bmi-1表現受HIF-1α調控，但不受HIF-2α調控。
為了獲得HIF-1α和Bmi1的啟動子之間的相互作用的直接證據，本試驗例進一步以染色質免疫沉澱法(chromatin immunoprecipitation assay)來確定。試驗上先將初代大腦皮質細胞培養於氧氣量3%的環境中4小時後，1%以甲醛(formaldehyde)於37℃固定20分鐘，以利後續可逆交聯。再以商業化試劑套組(Upstate Biotechnology)進行染色質免疫沉澱法，偵測HIF-1α和Bmi-1啟動子(NCBI Accession number：NC_000010.10)的結合。DNA-蛋白質複合物以接有抗HIF-1α初級抗體的Protein A agarose beads進行免疫沉澱，再以1%的十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecylsulfate,SDS)和0.1M的碳酸氫鈉洗提。DNA-蛋白質的交聯可將複合物於65℃培養5小時而反轉，且可利用蛋白質酶K去除蛋白質。分離出之DNA以酚(phenol)/氯仿(chloroform)萃取後，再利用PCR放大，所使用之引子為Bmi-1啟動子之引子，正向引子之序列為5’-CCGCGGGTGGAAGGGGAGC C-3’，反向引子之序列為5’-GGGGCCGGCAGGCGCGGGGC-3’。
請參照第7B圖和第7C圖，第7B圖為Bmi-1之5’端基因組區域之示意圖，第7C圖為初代大腦皮質細胞之染色質免疫沉澱法結果圖。第7B圖中可見Bmi-1之5’端基因組區域包含Bmi-1啟動子區域、第一外顯子區域以及HRE(hormone response element)結合位點，其中HRE結合位點為核苷酸-272到-268(相對於推定的轉錄起始位點+1)。而第7C圖的結果顯示，初代大腦皮質細胞經4小時的缺氧處理後，HIF-1α被徵召(recruitment)和直接結合在Bmi-1啟動子上，但此現象在導入LV-HIF-1α-sh的初代大腦皮質細胞中則未見。由上述的結果可知，在缺氧的狀況下，HIF-1α被徵召並結合到Bmi-1基因啟動子上，以正調控Bmi-1的表現。
試驗3-7. 在缺氧條件下Bmi的正調控是藉由HIF-1α誘導的轉錄活性所調節
為了進一步確定在缺氧環境下細胞Bmi-1表現增加，是否是因HIF-1α活化後結合至Bmi-1啟動子的HRE結合位點上的結果。本試驗構築了不同的質體，並以螢光素酶測定法(luciferase reporter assay)偵測在缺氧環境下其螢光素酶活性。構築之質體包含pBmi-1-luc-1質體、pBmi-1-luc-2質體和pBmi-1mutHRE質體。
請參照第8A圖，為pBmi-1-luc-1質體、pBmi-1-luc-2質體和pBmi-1mutHRE質體之5’端基因組 區域之示意圖。試驗上先將包含5’端基因組區域的人類Bmi-1基因啟動子(約900bp)構築在pGL3-basic載體(Promega)上，即可獲得pBmi-1-luc-1質體，其中pGL3-basic載體具有HRE結合位點，且pGL3-basic載體為螢光素酶表現載體。而pBmi-1-luc-2質體為不包含HRE結合位點的質體，其他部分則與pBmi-1-luc-1質體相同。而pBmi-1mutHRE質體則為將pBmi-1-luc-1質體中HRE結合位點的序列由5’-GCGTG-3’置換為5’-AAAAG-3’。將所有構築好的質體分別以Lipofectamine 2000(Invitrogen)轉染至3T3細胞中，試驗上亦轉染pGL3-basic載體至3T3細胞中作為對照組。此外為了校正轉染效率，3T3細胞同時共轉染編碼Renilla螢光素酶基因的pRL-SV40載體，再將3T3細胞培養於缺氧環境下(氧氣量為3%)。測定螢光素酶活性時，先將細胞裂解後，使用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega)並以微量盤式冷光酵素分析儀(Molecular Devices)測定螢光素酶活性。
請參照第8B圖，為螢光素酶測定法之結果圖，其中數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05。結果顯示，pBmi-1-luc-1質體的螢光素酶活性顯著高於其他組別，而pBmi-1-luc-1質體與pBmi-1-luc-2質體和pBmi-1mutHRE質體相比，其具有Bmi-1基因啟動子完整的5’端基因組區域。由上述結果可知，在缺氧環境下HIF-1α的活化，需結合至Bmi-1啟動子的HRE結合位點 上，以促進Bmi-1的表現量增加。
試驗3-8. 缺氧藉由HIF-1α-Bmi-1訊息途徑刺激神經幹細胞體外的增殖和自我更新
為了確定HIF-1α-Bmi-1級聯反應是否調節神經幹細胞的增殖，在本試驗例中以非貼壁培養神經幹細胞，確認神經幹細胞是否會形成神經球，以確定HIF-1α-Bmi-1途徑對神經幹細胞自我更新的效果。
為了製備神經幹細胞，取成年小鼠(4週齡)側腦室的腦室下區(subventricular zone,SVZ)，除去腦膜後神經幹細胞的分離參照Viegas P等人提出的步驟(J Cell Sci 2006；119,4467-4474)，且所有步驟將無菌條件下操作。而神經球培養係將神經幹細胞培養於添加B-27補充物(2%；Gibco BRL)、L-麩醯胺酸(0.5mM；PAN Biotech)、青黴素(100U/ml；Gibco BRL)和鏈黴素(0.1mg/ml；Gibco BRL)的神經元細胞培養基(neurobasal medium,Gibco BRL)中。為維護和放大培養神經幹細胞，神經元細胞培養基額外添加2μg/mL的肝素(Sigma)、20ng/mL的FGF-2(R&D Systems)和20ng/mL的EGF(R&D Systems)，並將神經球培養物培養於37℃、5% CO2培養箱中。為了無性/低密度培養，將培養後高密度的初代神經球分離並稀釋接種於96孔微量盤中，每孔還有0.2mL的神經球培養物，而細胞的密度為100細胞/mL。培養7天後，計算新形成的神經球數量，並以免疫螢光染色確認神經球中Bmi-1、SOX2、Nestin、Musashi-1、BrdU和Ki-67的表 現。
請參照第9A圖，為神經幹細胞之神經球培養之顯微照片圖，其中比例尺代表50μm。結果顯示，在神經球中Bmi-1和幹細胞標記(Musashi-1、Nestin和SOX2)共同表現，而表現Nestin的細胞也與增生標記(BrdU和ki-67)共同表現。
本試驗另將神經幹細胞分別培養在不同氧氣量(21%、5%、3%和1%)的環境下，觀察在正常和缺氧的環境是否會影響神經球的形成數量。請參照第9B圖和第9C圖，為神經幹細胞經缺氧處理後神經球培養之顯微照片圖。結果顯示，在氧氣量3%的環境下，神經幹細胞形成神經球的數量最多。
本試驗進一步使用慢病毒分別導入LV-Bmi-sh或LV-HIF-1α-sh至神經幹細胞中，並在不同的氧氣量(21%、5%、3%和1%)進行神經球培養，觀察不同條件下神經球形成頻率、神經幹細胞自我更新潛力、神經球的大小以及神經幹細胞中表現BrdU(BrdU+)和ki-67(ki-67+)的細胞比例，其中神經幹細胞自我更新潛力係以神經幹細胞的Nestin表現量來評估。
此外本試驗中亦以Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)側腦的腦室下區製備神經幹細胞，和以與Bmi-1基因剔除小鼠同窩出生但未進行基因剔除的小鼠(NL)側腦的腦室下區製備神經幹細胞，Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)係經由帶有異型合子的Bmi-1+/-小鼠交配而 得，而Bmi-1+/-小鼠為Van Lohuizen團隊的贈予(J Clin Invest 2012,122：1920-1932)。將前述神經幹細胞進行神經球培養後，再使用慢病毒分別導入LV-HIF-1α-sh至神經幹細胞中，並在不同的氧氣量(21%和3%)進行神經球培養，觀察不同條件下神經球形成頻率、神經幹細胞自我更新潛力、神經球的大小以及神經幹細胞中BrdU+細胞比例和ki-67+細胞比例。
請參照第9C圖至第9H圖，第9C圖為神經幹細胞導入LV-Bmi-1-sh後Bmi-1的表現，第9D圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經球形成頻率之統計圖，第9E圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經幹細胞自我更新潛力之統計圖，第9F圖為以不同氧氣量進行神經球培養下神經球大小之統計圖，第9G圖為以不同氧氣量進行神經球培養下BrdU+細胞比例之統計圖，第9H圖為以不同氧氣量進行神經球培養下ki-67+細胞比例之統計圖。其中數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。
第9C圖的結果顯示，導入LV-Bmi-1-sh確實可以降低神經幹細胞中Bmi-1的表現，且與導入LV-control-sh但培養於常氧(氧氣量21%)下的組別相比，缺氧環境(氧氣量3%)會使神經幹細胞中Bmi-1大量表現。而由第9D圖至第9F圖的結果顯示，自未進行Bmi-1基因剔除小鼠製備的神經幹細胞，在缺氧的環境下可以增加神經球形成頻率、神經幹細胞自我更新潛力和神經球大小，尤 其是在氧氣量為3%的條件下。但在降低Bmi-1表現的組別(導入LV-Bmi-1-sh和自Bmi-1基因剔除小鼠製備之神經幹細胞)和在降低HIF-1α表現的組別(導入LV-HIF-1α-sh)，缺氧引導的神經幹細胞增生能力皆被抑制。另由第9G圖和第9H圖的結果顯示，缺氧的環境下可見更多的BrdU+細胞和ki-67+細胞，特別在氧氣量為3%的條件下，但此現象亦未見於降低Bmi-1表現的組別和降低HIF-1α表現的組別(導入LV-HIF-1α-sh)中。
由上述結果可知，在缺氧環境下，藉由調節HIF-1α-Bmi-1訊息途徑，可以促進神經幹細胞的增生和神經幹細胞的自我更新潛力。
四、本發明之環烯醚萜苷類化合物治療中風之效果
根據前述已知本發明之環烯醚萜苷類化合物具有保護神經幹細胞的能力，此部份之試驗例將探討本發明之環烯醚萜苷類化合物於體外和體內促進神經幹細胞增生和自我更新的能力，以及將本發明之環烯醚萜苷類化合物用於治療腦組織損傷個體之效果。以下試驗例以乳酸脫氫酶釋放率分析結果最佳的化合物為試驗的標的。應理解的是由純的化合物1產生的功效會出現在以化合物1為主要有效成分之混合物中。
試驗4-1. 化合物1藉由HIF-1α-Bmi-1途徑的促進體外的神經幹細胞增殖和自我更新 i. 化合物1對於體外的神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1表現 的影響
為了探討化合物1是否調節神經幹細胞的自我更新，本試驗例將檢驗化合物1對於神經幹細胞在常氧環境下(氧氣量21%)HIF-1α和Bmi-1表現的影響。
試驗上先於神經球培養基中分別加入不同濃度的化合物1(0.1μM、1μM、10μM和100μM)，再以西方墨點法觀察神經幹細胞的HIF-1α和Bmi-1表現。試驗上亦包含未添加化合物1的組別作為試驗對照組。請參照第10A圖，為化合物1影響神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖，結果顯示，於培養基添加化合物1後，會增加神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現，特別是添加1μM的化合物1的組別。
本試驗再進一步地先抑制神經幹細胞的HIF-1α表現，再於培養基中添加1μM的化合物1，並以西方墨點法觀察神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現。抑制神經幹細胞HIF-1α表現的方法為以1μM的2-ME2處理神經幹細胞16小時，或使用慢病毒導入LV-HIF-1α-shRNA和LV-control-shRNA至神經幹細胞中。請參照第10B圖，為抑制HIF-1α表現後再處理化合物1的神經幹細胞的HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。第10B圖和第10A圖的結果一致，加入化合物1會增加神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現，特別是添加1μM的化合物1，但神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1表現量因添加化合 物1而增加的現象，在抑制HIF-1α表現的組別(添加2-ME2和導入LV-HIF-1α-sh)中皆會被抑制。
本試驗例另添加1μM的化合物1至神經幹細胞的培養基中，並以不同時間(0.5小時、1小時、4小時、8小時、16小時和24小時)續培養神經幹細胞，再以西方墨點法觀察神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現。請參照第10C圖，為化合物1不同的處理時間下神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1的表現量分析圖，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。結果顯示，在HIF-1α表現的部分，以化合物1處理0.5小時的神經幹細胞其HIF-1α表現量最高，且神經幹細胞的HIF-1α表現量隨著化合物1的處理時間越長而遞減。而在Bmi-1表現的部分，神經幹細胞的Bmi-1表現量隨著化合物1的處理時間越長而遞增，且在第16小時達到最高Bmi-1表現量。由上述結果可知，化合物1增加HIF-1α和Bmi-1是存在時間依賴性的。
ii. 化合物1對於體外的神經幹細胞增生的影響
為了探討化合物1是否調節神經幹細胞的增生，本試驗例首先檢驗HIF-1α-Bmi-1訊息途徑對於神經幹細胞自我更新的影響。為檢測神經幹細胞的增生潛力，試驗上以CFSE(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester；Invitrogen)標定神經幹細胞，並續培養神經幹細胞5天後，以流式細胞儀(FACSCalibur,BD)檢測CFSE於神經幹細胞中的分佈狀況，並進一步以MODFIT軟體(Verity Software House,ME)計算神經幹細胞的增生指數(proliferation index,PI)，計算的方法參照先前研究提出的步驟(Nature Protocols 2007；2：2057-2067；STEM CELLS 2011；29：2062-2076)，所計算的增生指數越高，表示細胞增生能力越好。試驗上亦同時於神經幹細胞的培養基中分別加入不同濃度的化合物1(0.1μM、1μM和10μM)處理16小時，觀察加入化合物1是否會影響神經幹細胞的增生，試驗亦包含未添加化合物1的組別作為試驗對照組。
請參照第11A圖至第11D圖，第11A圖為對照組之神經幹細胞的增生指數測量結果圖，第11B圖為0.1μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖，第11C圖為1μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖，第11D圖為10μM化合物1處理組別之神經幹細胞的增生指數測量結果圖。結果顯示，於神經幹細胞培養基中添加化合物1可以促進神經幹細胞的增生，特別是添加1μM的化合物1，可以使神經幹細胞的增生指數由4.37提高至6.77。
請再參照第11E圖，為添加不同濃度(0.1μM、1μM和10μM)的化合物1於神經幹細胞培養基中神經球培養之顯微照片圖，其中比例尺代表50μm，第11E圖與第11A圖至第11D圖的結果一致，於神經幹細胞培養基中添加化合物1可以促進神經球的形成，特別在添加1μM化合物1的組別。
試驗上另於神經幹細胞培養液中分別加入不同 濃度的化合物1(0.1μM、1μM和10μM)處理16小時，並在處理1μM化合物1的組別中，另有組別使用慢病毒分別導入LV-Bmi-sh或LV-HIF-1α-sh至神經幹細胞中，再進行神經球培養，觀察不同條件下神經球形成頻率、神經幹細胞自我更新潛力和神經球的大小其中所使用之細胞包含製備自正常小鼠、Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)和NL小鼠的神經幹細胞。
請參照第11F圖至第11H圖，第11F圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經球形成頻率之統計圖，第11G圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經幹細胞自我更新潛力之統計圖，第11H圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中神經球大小之統計圖，其中數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。結果顯示，添加化合物1可以增加神經幹細胞形成神經球的頻率、神經幹細胞自我更新潛力和神經球大小，尤其是添加1μM的化合物1，顯示化合物1增加神經幹細胞的增生是具有劑量依賴性。但在降低Bmi-1表現的組別(導入LV-Bmi-1-sh和自Bmi-1基因剔除小鼠製備之神經幹細胞)和在降低HIF-1α表現的組別(導入LV-HIF-1α-sh)，化合物1引導的神經幹細胞增生能力皆被抑制。
本試驗另以免疫螢光染色法檢測添加化合物1是否會影響神經幹細胞增生標記的表現，試驗上於神經幹細胞培養液中分別加入不同濃度的化合物1(0.1μM、1μM和 10μM)處理16小時，而在處理1μM化合物1的組別中，另有組別使用慢病毒分別導入LV-Bmi-sh或LV-HIF-1α-sh至神經幹細胞中，以降低神經幹細胞Bmi的表現或HIF-1α的表現，再免疫螢光染色法確定神經幹細胞的Nestin、BrdU和Ki-67表現，觀察不同條件下神經幹細胞表現BrdU+細胞和ki-67+細胞的比例，其中所使用之細胞包含製備自正常小鼠、Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)和NL小鼠的神經幹細胞。
請參照第12A圖至第12C圖，第12A圖為以免疫螢光染色法檢測神經幹細胞增生標記表現之顯微照片圖，第12B圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中表現BrdU的細胞比例之統計圖，第12C圖為添加不同濃度化合物1於神經幹細胞培養基中表現ki-67的細胞比例之統計圖，其中比例尺代表50μm，統計數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。
第12A圖的結果顯示，在神經幹細胞中Nestin會與增生標記(BrdU和ki-67)共同表現。第12B圖和第12C圖的結果顯示，添加化合物1可以增加神經幹細胞中BrdU+細胞和ki-67+細胞的比例，特別是處理1μM化合物1的組別，顯示化合物1增加神經幹細胞中BrdU+細胞和ki-67+細胞的比例是具有劑量依賴性，但此現象卻未見於降低Bmi-1表現的組別和降低HIF-1α表現的組別(導入LV-HIF-1α-sh)中。顯示降低Bmi-1表現和HIF-1α表現會 抑制化合物1促進神經幹細胞增生的作用。
由上述的結果顯示，化合物1藉由調節HIF-1α-Bmi-1訊息途徑，可以促進體外的神經幹細胞增生和自我更新潛力。
試驗4-2. 系統性注射化合物1增加體內的神經幹細胞增生 i. 化合物1對中風大鼠腦內的神經幹細胞HIF-1α和Bmi-1表現的影響
為了探討化合物1對於體內神經幹細胞自我更新的影響，本試驗例首先檢驗化合物1的施用是否影響中風大鼠腦內HIF-1α和Bmi-1的正調控。
試驗上將進行腦缺血/再灌注模型的大鼠於右側大腦中動脈阻塞後4小時，以腹腔注射不同劑量的化合物1(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)至大鼠體中，並連續注射3天。本試驗中另有假手術組(sham)的大鼠，其為經歷上述相同的手術步驟，但未阻塞假手術組的雙側頸總動脈和右側大腦中動脈，以及僅注射vehicle至大鼠體中的組別作為對照組，分別在化合物1處理後4小時、16小時、24小時、36小時和72小時，犧牲中風大鼠取其大腦組織，進行西方墨點法偵測中風大鼠腦內HIF-1α和Bmi-1的表現。
請參照第13A圖和第13B圖，第13A圖為以不同時間進行化合物1處理的中風大鼠腦內Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖，第13A圖中化合物1的劑量為1mg/kg。第13B圖為以不同劑量進行化合物1處理的中風大鼠腦內Bmi-1和HIF-1α表現量分析圖，第13B圖中化合物1處理的 時間為36小時。其中n=8，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。由第13A圖和第13B圖的結果顯示，在HIF-1α表現的部分，注射化合物1至大鼠體內4小時的組別和注射1mg/kg的化合物1至大鼠體內的組別可見最高的HIF-1α表現量。在Bmi-1表現的部分，注射化合物1至大鼠體內36小時的組別和注射1mg/kg的化合物1至大鼠體內的組別可見最高的Bmi-1表現量。因此與對照組和sham相比，施用化合物1確實會顯著增加中風大鼠腦內Bmi-1和HIF-1α的表現，且此增加的現象是具有劑量依賴性和時間依賴性的。
本試驗例另外分別以100mg/kg的2-ME2處理或立體定位注射LV-Bmi-1-sh和LV-control-sh至中風大鼠腦中，以降低中風大鼠HIF-1α和Bmi-1的表現，再注射1mg/kg的化合物1於中風大鼠體內，並以西方墨點法觀察施用化合物1對於低HIF-1α表現中風大鼠和低Bmi-1表現中風大鼠腦內Bmi-1表現的影響。
請參考第13C圖，為抑制Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦內Bmi-1表現量分析圖，其中n=8，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。結果顯示，施用化合物1確實會顯著增加中風大鼠腦內Bmi-1的表現，特別是施用1mg/kg的化合物1，但此增加的效果卻會因降低中風大鼠的Bmi-1和HIF-1α表現而被抑制。
本試驗亦將不同劑量的化合物1(0.1mg/kg、1 mg/kg和10mg/kg)處理的中風大鼠，進行免疫螢光染色偵測中風大鼠腦中神經幹細胞(以Nestin標定)Bmi-1的表現。試驗上另有組別分別降低中風大鼠HIF-1α的表現或降低中風大鼠Bmi-1的表現，再注射1mg/kg的化合物1於中風大鼠體內，並以西方墨點法觀察施用化合物1對於低HIF-1α表現中風大鼠和低Bmi-1表現中風大鼠腦內Bmi-1表現的影響。降低中風大鼠HIF-1α的表現的組別，為腹腔注射100mg/kg的2-ME2至大鼠體內。而降低中風大鼠Bmi-1的表現的組別，為立體定位注射LV-Bmi-1-sh和LV-control-sh至中風大鼠腦中，或將Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)處理腦缺血/再灌注模型，並同樣將NL小鼠處理腦缺血/再灌注模型作為對照組。
請參照第14A圖至第14D圖，第14A圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區中神經幹細胞Bmi-1表現的顯微照片圖，第14B圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區中神經幹細胞Bmi-1表現量分析圖，第14C圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核中神經幹細胞Bmi-1表現的顯微照片圖，第14D圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核中神經幹細胞Bmi-1表現量分析圖，其中n=8，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01，而比例尺代表50μm。結果顯示，不論在中風大鼠的腦室下區或齒狀核，注射化合物1將能增加神經幹細胞Bmi-1的表現 (Bmi-1+Nestin+細胞)，特別是注射1mg/kg化合物1的組別，顯示化合物1增加神經幹細胞Bmi-1表現的效果是具有劑量依賴性。但在降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠中，化合物1增加神經幹細胞Bmi-1表現的效果卻會被抑制。
ii. 化合物1對中風大鼠體內的神經幹細胞增生的影響
本試驗例另將不同劑量的化合物1(0.1mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)處理的中風大鼠，以及降低HIF-1α和Bmi-1表現後再處理1mg/kg化合物1的中風大鼠，犧牲後取其腦組織進行免疫螢光染色，以偵測中風大鼠腦中增生標記BrdU和ki-67的表現。
請參照第15A圖至第15H圖，第15A圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區內BrdU表現的顯微照片圖，第15B圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區內表現BrdU的細胞數統計圖，第15C圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核內BrdU表現的顯微照片圖，第15D圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核內表現BrdU的細胞數統計圖，第15E圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠腦室下區內ki-67表現的顯微照片圖，第15F圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後腦室下區內表現ki-67的細胞數統計圖，第15G圖為處理不同劑量的化合物1後中風大鼠齒狀核內ki-67表現的顯微照片圖，第15H圖為降低Bmi-1和HIF-1α表現的中風大鼠施用化合物1後齒狀核內表現ki-67的細胞數統計圖。其中n=8，數據結果以mean±SD值表 示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01，而比例尺代表50μm。
第15A圖至第15H圖的結果顯示，不論在中風大鼠腦部的腦室下區或齒狀核，施用化合物1將可增加中風大鼠腦內BrdU+細胞和ki-67+細胞的數量，尤其是施用1mg/kg的化合物1，顯示化合物1可促進中風大鼠腦中的細胞增生。但此化合物1促進中風大鼠腦中細胞增生的效果卻會因降低中風大鼠的Bmi-1和HIF-1α表現而被抑制。
由上述的結果顯示，化合物1可誘發HIF-1α-Bmi-1訊息途徑，進而促進體內的神經幹細胞增生和自我更新潛力。
試驗4-3.系統性給予化合物1可縮小腦缺血後的梗塞體積
根據前述試驗例已知化合物1可以促進體外和體內的神經幹細胞增生和自我更新，本試驗例將探討將化合物1用於治療腦組織損傷個體之效果。
本試驗首先觀察Bmi-1表現對於中風小鼠梗塞區域大小的影響，試驗上分別將Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)和NL小鼠處理腦缺血/再灌注模型，並於2天後犧牲小鼠取其腦部組織觀察小鼠腦部梗塞區域的大小。請參照第16圖，為Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)和NL小鼠中風後腦部梗塞區域的照片圖，其中下圖中箭頭所指之處即為梗塞區域。結果顯示，Bmi-1基因剔除小鼠(Bmi-1-/-)中風後，其梗塞區域明顯大於中風NL小鼠的梗塞區域。
本試驗例另將不同劑量的化合物1(0.1 mg/kg、1mg/kg和10mg/kg)以腹腔注射至中風大鼠體內，以及僅注射vehicle至中風大鼠體內作為對照組，3天後犧牲中風大鼠取其腦部組織，以氯化三苯基四唑(triphenyltetrazolium chloride,TTC；Research Organics Inc)染色，經氯化三苯基四唑染色後，非梗塞區域會呈現磚紅色，梗死區域會呈現黃白色，可觀察中風大鼠腦內的梗塞區域大小，以確定施用化合物1是否可以保護中風大鼠因缺血所造成的損傷。
請參照第17A圖和第17B圖，第17A圖為施用化合物1對於中風大鼠腦內梗塞體積影響的照片圖，第17B圖為第17A圖的量化圖，其中n=8，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。結果顯示，施用化合物1的中風大鼠，其腦部梗塞體積明顯的小於對照組，特別是施用1mg/kg化合物1的組別。
本試驗進一步將中風大鼠分為5個組別，包含4組試驗組和1組對照組，試驗組分別注射1mg/kg的化合物1、30mg/kg的梔子素(30mg/kg)、1mg/kg的化合物1+100mg/kg的2-ME2以及1mg/kg的化合物1和LV-Bmi-1-sh至中風大鼠體內，對照組僅注射vehicle至中風大鼠體中。7天後將先中風大鼠麻醉，再以磁振造影(magnetic resonance imaging，MRI)觀察不同組別的中風大鼠腦中的梗塞體積。
請參照第18A圖和第18B圖，第18A圖為中風 大鼠經前述條件處理7天後的磁振造影圖，第18B圖為第18A圖的量化圖，其中n=8，數據結果以mean±SD值表示，*表示與對照組相比p<0.05，**表示與對照組相比p<0.01。結果顯示，施用化合物1可以大幅降低中風大鼠腦內的梗塞體積和最大梗塞區域的面積。雖施用梔子素亦可降低中風大鼠腦內的梗塞體積和最大梗塞區域的面積，但化合物1降低中風大鼠腦內梗塞區域大小的效果比梔子素更好。而降低HIF-1α表現(處理2-ME2)和降低Bmi-1表現(處理LV-Bmi-sh)則會抑制化合物1降低中風大鼠腦內梗塞區域大小的效果。
試驗4-4.注射化合物1可促進腦缺血後的運動改善
本試驗例係進一步透過3種神經功能缺損模式檢測中風前後大鼠的神經行為，以評估注射化合物1至中風大鼠體內是否可幫助中風大鼠恢復神經功能。
試驗的中風大鼠分為4組，包含3組試驗組和1組對照組，試驗組分別注射1mg/kg的化合物1、1mg/kg的化合物1+100mg/kg的2-ME2以及1mg/kg的化合物1和LV-Bmi-1-sh至中風大鼠體內，對照組僅注射vehicle至中風大鼠體中。神經行為的檢測時間點為腦缺血/再灌注前5天、細胞移植後第1天、第7天、第14天和第28天。3種神經功能缺損模式分別為評估中風大鼠的身體左右不對稱、活動能力和前肢抓握力。
i. 身體擺動測試
中風大鼠的身體左右不對稱係利用身體擺動測試評估，試驗上先將中風大鼠懸空放置在尾巴上方10公分的飼養籠底板上，並記錄中風大鼠的橫向移動次數，特別是缺血側對側的頭部擺動頻率是以連續20計數，並以基線評分進行標準化。
請參照第19A圖，為中風大鼠身體擺動測試的結果圖。結果顯示，施用化合物1的組別相較於對照組有顯著的神經功能恢復，但此神經功能恢復情況會因注射2-ME2降低中風大鼠HIF-1α的表現或注射LV-Bmi-1-sh降低中風大鼠的Bmi-1表現後，使試驗組大鼠的神經功能恢復結果和對照組相當，顯示降低中風大鼠HIF-1α和Bmi-1的表現會抑制化合物1的治療效果。
ii. 活動能力測試
大鼠的活動能力係使用VersaMax動物活動監測系統(Accuscan Instruments)偵測大鼠2小時。VersaMax動物活動監測系統包含16水平紅外線感測器和8個垂直紅外感測器，垂直感測器分別位於腔室底板上方10cm處，大鼠的活動能力運動由腔室內大鼠因運動打斷光束的次數進行定量。測量的3個垂直運動參數為：垂直活動、垂直活動時間以及垂直運動數量。
請參照第19B圖至第19D圖，第19B圖為中風大鼠垂直運動數量測試的結果圖，第19C圖為中風大鼠垂直活動測試的結果圖，第19D圖為中風大鼠垂直活動時間測試的結果圖。由第19B圖至第19D圖的結果顯示，施用化合物1 的組別相較於對照組有顯著的活動能力改善，但此活動能力改善情況會因注射2-ME2降低中風大鼠HIF-1α的表現或注射LV-Bmi-1-sh降低中風大鼠的Bmi-1表現後，使試驗組大鼠的活動能力改善結果和對照組相當，顯示降低中風大鼠HIF-1α和Bmi-1的表現會抑制化合物1的治療效果。
iii. 前肢抓握力測試
大鼠的前肢抓握力測試係使用握力儀(TSE-Systems)偵測。實驗上分開測量大鼠每隻前肢的抓握力，計算大鼠拉20次抓握力的平均值，並計算同側：對側的抓握力比率。此外，本試驗例亦計算細胞治療前和細胞治療後大鼠抓握力的比率，以評估細胞治療後大鼠抓握力的改變。
請參照第20圖，為大鼠前肢抓握力測試的結果圖。由第20圖的結果顯示，施用化合物1的組別相較於對照組的大鼠，在施用化合物1後大鼠的前肢抓握力大幅度的改善，但此改善情況會因注射2-ME2降低中風大鼠HIF-1α的表現或注射LV-Bmi-1-sh降低中風大鼠的Bmi-1表現後，使試驗組大鼠的前肢抓握力和對照組相當，顯示降低中風大鼠HIF-1α和Bmi-1的表現會抑制化合物1的治療效果。
上述3個神經功能缺損模式試驗呈現相似的結果，顯示施用化合物1可改善中風大鼠的神經行為，且此神經行為改善係透過HIF-1α-Bmi-1訊息途徑。
根據上述試驗結果，式(I)所示環烯醚萜苷類化合物係以草本藥物純化合之梔子素(genipin)為主體結構 (backbone)，再於側鏈(side chain)進行化學結構修飾後的衍生物，其保護神經細胞死亡的功效更優於梔子素。此外，式(I)所示之環烯醚萜苷類化合物，可降低腦部受損區域，避免腦組織功能的損害，且其藉由HIF-1α-Bmi-1訊息途徑刺激神經幹細胞生長和自我更新的能力，在中風(特別是缺血性中風)的動物腦部驅使神經幹細胞分裂並且移動到腦部受損區域，因此式(I)所示之環烯醚萜苷類化合物可作為一種治療中風的藥物或藥學組合物。
上述藥劑或藥學組合物可根據眾所接受的藥學製程來製備，可包含能和製劑中其他成分相容且與生物體相容的藥學上可接受的包覆物。在此處稱「藥學上可接受的包覆物」(pharmaceutically acceptable carrier)係指一種藥學上可接受的材料、組合物或媒劑(vehicle)，諸如液體或固體填充物(liquid or solid filler)、稀釋劑(diluent)、賦型劑(excipient)、溶劑(solvent)或包覆材料(encapsulating material)，其可用以攜帶或運送標的成分由身體的一器官或部分到達身體的另一器官或部份。
然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

Claims (12)

  1. 一種環烯醚萜苷類化合物，該環烯醚萜苷類化合物如下所示之結構：
    Figure TWI641594B_C0001
  2. 一種用於治療中風之醫藥組合物，其包含有效量之一環烯醚萜苷類化合物，該環烯醚萜苷類化合物具有如下所示之結構：
    Figure TWI641594B_C0002
  3. 如申請專利範圍第2項所述之用於治療中風之醫藥組合物，其中該有效劑量為0.1-10mg/Kg。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之用於治療中風之醫藥組合物，其中該有效劑量為1mg/Kg。
  5. 如申請專利範圍第2項所述之用於治療中風之醫藥組合物，其中該醫藥組合物為液態、粉末、錠劑、膠囊或注射劑。
  6. 一種環烯醚萜苷類化合物之用途，該環烯醚萜苷類化合物具有下式之結構：
    Figure TWI641594B_C0003
    其係用於製備治療中風之藥物。
  7. 如申請專利範圍第6項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該中風為缺血性中風。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該治療中風之藥物為降低腦部中風受損區域之藥物。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該治療中風之藥物為保護神經幹細胞之藥物。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該治療中風之藥物為促進神經幹細胞增生之藥物。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該治療中風之藥物為促進神經幹細胞自我更新之藥物。
  12. 如申請專利範圍第9-11項任一項所述之環烯醚萜苷類化合物之用途，其中該治療中風之藥物為促進神經幹細胞之HIF-1α-Bmi-1訊息途徑之藥物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116120271B (zh) * 2023-04-06 2023-06-20 广东工业大学 一种京尼平衍生物及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7649014B2 (en) * 2003-03-31 2010-01-19 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Genipin derivatives and uses thereof
CN104523676A (zh) * 2014-12-16 2015-04-22 中国中医科学院中药研究所 京尼平用于预防或治疗缺血性脑损伤的用途

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0995445A (ja) * 1995-07-24 1997-04-08 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 脳神経細胞障害に対する治療薬
KR100197744B1 (ko) * 1996-10-18 1999-06-15 이병언 항 b형 간염 바이러스 활성을 갖는 신규한 제니핀 유도체
FR3003860B1 (fr) * 2013-03-29 2015-11-27 Oreal Composes derives d'iridoides proteges ou non, composition les comprenant, utilisation comme colorant des fibres keratiniques et dispositifs

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7649014B2 (en) * 2003-03-31 2010-01-19 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Genipin derivatives and uses thereof
US8093288B2 (en) * 2003-03-31 2012-01-10 Beth Israel Deaconess Medical Center Genipin derivatives and uses thereof
CN104523676A (zh) * 2014-12-16 2015-04-22 中国中医科学院中药研究所 京尼平用于预防或治疗缺血性脑损伤的用途

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
【化學通報】2015年 第78卷「血腦屏障通透性增效方法的研究進展」
【國際藥學研究雜誌】2008年10月 第35卷第5期 377-387
【國際藥學研究雜誌】2008年10月 第35卷第5期 377-387 【化學通報】2015年 第78卷「血腦屏障通透性增效方法的研究進展」 Brain Res. 2014 Jan 16;1543:308-314 *
Brain Res. 2014 Jan 16;1543:308-314

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