JP2840134B2 - 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 - Google Patents
新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法Info
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- JP2840134B2 JP2840134B2 JP3002096A JP209691A JP2840134B2 JP 2840134 B2 JP2840134 B2 JP 2840134B2 JP 3002096 A JP3002096 A JP 3002096A JP 209691 A JP209691 A JP 209691A JP 2840134 B2 JP2840134 B2 JP 2840134B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、微生物由来の新規なア
ミノアシラーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。詳しく述べると、本発明は、ペニシリウム (Penici
llium)属に属する微生物を培養して得られる新規なアミ
ノアシラーゼおよびその製造方法に関するものである。
ミノアシラーゼおよびその製造方法に関するものであ
る。詳しく述べると、本発明は、ペニシリウム (Penici
llium)属に属する微生物を培養して得られる新規なアミ
ノアシラーゼおよびその製造方法に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】一般にアミノアシラーゼとは、Ｎ−アシ
ルアミノ酸を有機酸とアミノ酸に加水分解する酵素であ
り、動物組織、植物、微生物に広く存在している。ま
た、アミノアシラーゼは、光学特異性が高く、Ｌ−アミ
ノ酸にのみ作用するので、従来はアミノ酸の光学分割な
どを目的としてＮ−アセチル−アミノ酸などの短鎖のＮ
−アシル−アミノ酸を光学特異的に加水分解するアミノ
アシラーゼについて多く報告されてきた。
ルアミノ酸を有機酸とアミノ酸に加水分解する酵素であ
り、動物組織、植物、微生物に広く存在している。ま
た、アミノアシラーゼは、光学特異性が高く、Ｌ−アミ
ノ酸にのみ作用するので、従来はアミノ酸の光学分割な
どを目的としてＮ−アセチル−アミノ酸などの短鎖のＮ
−アシル−アミノ酸を光学特異的に加水分解するアミノ
アシラーゼについて多く報告されてきた。
【０００３】また、近年、Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸の
安全性や優れた生化学的分解性が確認され、さらにＮ−
長鎖アシル−アミノ酸は界面活性作用や殺菌作用等を有
しているため、石鹸、シャンプー、洗剤、乳化剤、抗菌
剤など幅広く用いられるようになり、様々な応用が注目
されている。これにともない、アミノアシラーゼを用い
たＮ−長鎖アシル−アミノ酸の加水分解およびその逆反
応のアミノアシラーゼを用いたＮ−長鎖アシル−アミノ
酸の合成等への応用が期待されている。
安全性や優れた生化学的分解性が確認され、さらにＮ−
長鎖アシル−アミノ酸は界面活性作用や殺菌作用等を有
しているため、石鹸、シャンプー、洗剤、乳化剤、抗菌
剤など幅広く用いられるようになり、様々な応用が注目
されている。これにともない、アミノアシラーゼを用い
たＮ−長鎖アシル−アミノ酸の加水分解およびその逆反
応のアミノアシラーゼを用いたＮ−長鎖アシル−アミノ
酸の合成等への応用が期待されている。
【０００４】しかし、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー (Journal of Biochemistry)、第９１巻１７３１
〜１７３８頁（１９８２年）にＮ−長鎖アシル−アミノ
酸を加水分解するアミノアシラーゼに関する報告が、ま
た、特開昭５７−１２９，６９６号にＮ−長鎖アシル−
アミノ酸の合成酵素であるアミノアシラーゼに関する報
告があるが、その数は非常に少なく、Ｎ−長鎖アシル−
アミノ酸を効率良く加水分解および合成できるアミノア
シラーゼは知られていない。
トリー (Journal of Biochemistry)、第９１巻１７３１
〜１７３８頁（１９８２年）にＮ−長鎖アシル−アミノ
酸を加水分解するアミノアシラーゼに関する報告が、ま
た、特開昭５７−１２９，６９６号にＮ−長鎖アシル−
アミノ酸の合成酵素であるアミノアシラーゼに関する報
告があるが、その数は非常に少なく、Ｎ−長鎖アシル−
アミノ酸を効率良く加水分解および合成できるアミノア
シラーゼは知られていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】従来、Ｎ−長鎖アシル
−アミノ酸を合成することができるアミノアシラーゼに
関する報告は少なく、特開昭５７−１２９，６９６にグ
ルタミン酸と各種脂肪酸の合成が報告されているが、３
日間の反応における合成率が５％以下と低く、また、他
のアミノ酸を用いた場合の報告はされていない。
−アミノ酸を合成することができるアミノアシラーゼに
関する報告は少なく、特開昭５７−１２９，６９６にグ
ルタミン酸と各種脂肪酸の合成が報告されているが、３
日間の反応における合成率が５％以下と低く、また、他
のアミノ酸を用いた場合の報告はされていない。
【０００６】したがって、本発明の目的は、加水分解能
及び合成能の優れた新規なアミノアシラーゼおよびその
製造方法を提供することにある。
及び合成能の優れた新規なアミノアシラーゼおよびその
製造方法を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、加水分解
能及び合成能の優れたアミノアシラーゼを生産する微生
物を求め、鋭意検討した。その結果、従来まで糸状菌で
は発見されていない長鎖アシル基に特異的に作用するア
ミノアシラーゼをペニシリウム (Penicillium)属に属す
る微生物が生産することを見出し、本発明を完成するに
至った。
能及び合成能の優れたアミノアシラーゼを生産する微生
物を求め、鋭意検討した。その結果、従来まで糸状菌で
は発見されていない長鎖アシル基に特異的に作用するア
ミノアシラーゼをペニシリウム (Penicillium)属に属す
る微生物が生産することを見出し、本発明を完成するに
至った。
【０００８】本発明のアミノアシラーゼは、次の理化学
的性質を有している。
的性質を有している。
【０００９】１）作用 Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸に作用し、Ｌ−アミノ酸を遊
離させる。
離させる。
【００１０】２）基質特異性 炭素数４以上のアシル基を有するＮ−アシル−アミノ酸
のＬ体に作用し、Ｄ体には作用しない。アシル基に対す
る特異性は広く、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、芳香族カ
ルボン酸からなるＮ−アシル化合物に作用する。
のＬ体に作用し、Ｄ体には作用しない。アシル基に対す
る特異性は広く、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、芳香族カ
ルボン酸からなるＮ−アシル化合物に作用する。
【００１１】３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適ｐＨは、３０℃、各種緩衝液（ｐＨ５．５〜６．
０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝液，
ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ９．５
〜１１．０：炭酸緩衝液）中で約８．５である。同緩衝
液中、３０℃、５時間処理においてｐＨ６〜９まで安定
である。
至適ｐＨは、３０℃、各種緩衝液（ｐＨ５．５〜６．
０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝液，
ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ９．５
〜１１．０：炭酸緩衝液）中で約８．５である。同緩衝
液中、３０℃、５時間処理においてｐＨ６〜９まで安定
である。
【００１２】４）至適温度および熱安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適温度は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて測定した
ところ、２５〜３５℃である。２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）中、４０℃、１５分処理において全く失
活せず、４５℃、１５分処理後の残存活性は約８０％で
ある。
至適温度は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて測定した
ところ、２５〜３５℃である。２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）中、４０℃、１５分処理において全く失
活せず、４５℃、１５分処理後の残存活性は約８０％で
ある。
【００１３】５）阻害剤の影響 パラクロロマーキュリーベンゾエートまたはジチオスレ
イトールにより阻害を受ける。
イトールにより阻害を受ける。
【００１４】６）金属イオンの影響 Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｍｇ2+などによって活性化され、Ｈｇ
2+により阻害を受ける。
2+により阻害を受ける。
【００１５】７）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では分子量約４
８，０００。
８，０００。
【００１６】８）分子量 ゲル瀘過法では約１９２，０００。
【００１７】本発明はまた、ペニシリウム (Penicilliu
m)属に属する前記性質を有するアミノアシラーゼの生産
菌を培養し、該培養物から前記アミノアシラーゼを分
離、回収することを特徴とするアミノアシラーゼの製造
方法である。
m)属に属する前記性質を有するアミノアシラーゼの生産
菌を培養し、該培養物から前記アミノアシラーゼを分
離、回収することを特徴とするアミノアシラーゼの製造
方法である。
【００１８】さらに、本発明は、ペニシリウム (Penici
llium)属に属する前記アミノアシラーゼの生産能を有す
る菌株がペニシリウム・フニコロサム (penicillium fu
niculosum)であるアミノアシラーゼの製造方法である。
llium)属に属する前記アミノアシラーゼの生産能を有す
る菌株がペニシリウム・フニコロサム (penicillium fu
niculosum)であるアミノアシラーゼの製造方法である。
【００１９】
【作用】本発明において使用される新規なアミノアシラ
ーゼは、微生物を用いて生産され、その生産菌としては
ペニシリウム (Penicillium)属に属し、上記性質を有す
る酵素を生産する能力を有していればよい。
ーゼは、微生物を用いて生産され、その生産菌としては
ペニシリウム (Penicillium)属に属し、上記性質を有す
る酵素を生産する能力を有していればよい。
【００２０】本菌株は微工研条寄第３１７６号（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３１７６）として寄託されており、その菌学
的性質は以下のとおりである。
Ｍ ＢＰ−３１７６）として寄託されており、その菌学
的性質は以下のとおりである。
【００２１】（Ａ）各種培地における生育状態 （ａ）ツアペック培地 速やかに生育し、２５℃、７日間で直径３０〜４０ｍｍ
に達する。コロニーは、黄色の栄養菌糸体と灰色から黄
緑色の分生子柄の混在した緻密な菌糸層からなる。ま
た、コロニーの裏面は、ピンクから深紅色である。ま
た、形態学的性質は以下の通りである。
に達する。コロニーは、黄色の栄養菌糸体と灰色から黄
緑色の分生子柄の混在した緻密な菌糸層からなる。ま
た、コロニーの裏面は、ピンクから深紅色である。ま
た、形態学的性質は以下の通りである。
【００２２】分生子柄：気生菌糸から分枝している ２５〜４０×２．０〜３．０μｍ メトレ：５〜８本が輪生状となる １０〜１３×２．０〜３．０μｍ フィアライド：３〜６本が輪生状となる ほこ先形 １０〜１２×１．５〜２．５μｍ 分生子：亜球形〜楕円形で小さい 表面は滑面〜微細な粗面 ２．５〜３．５×２〜２．５μｍ
【００２３】（ｂ）麦芽エキス寒天培地 生育状態および形態学的性質は、ツアペック寒天培地の
ものとほぼ同様である。ただし、分生糸形成がツアペッ
ク寒天培地のものに比べて優れている。
ものとほぼ同様である。ただし、分生糸形成がツアペッ
ク寒天培地のものに比べて優れている。
【００２４】（Ｂ）各生理的、生態的性質 ｐＨ：約６付近で、最良好な生育を示す 温度：５℃では生育はほとんど認められない 約２５〜３７℃で最適な生育が認められる。
【００２５】以上の菌学的性質を有する菌について同定
を行った結果、本菌株はペニシリウム (Penicillium)属
に属する菌株と同定された。また、本菌株を同属中の菌
株と比較すると、ペニシリウム・フニコロサム (penici
llium funiculosum)に近似していることがわかった。
を行った結果、本菌株はペニシリウム (Penicillium)属
に属する菌株と同定された。また、本菌株を同属中の菌
株と比較すると、ペニシリウム・フニコロサム (penici
llium funiculosum)に近似していることがわかった。
【００２６】本発明に用いる微生物としては、本菌株と
その変種、変異株に限定されるものではなく、上記性質
の酵素を有するものであればよい。
その変種、変異株に限定されるものではなく、上記性質
の酵素を有するものであればよい。
【００２７】本発明の新規なアミノアシラーゼ生産菌
は、発酵学の分野で公知の情報に従って培養することが
できる。使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物
およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体
培地または固体培地を用いて培養することができる。具
体的には炭素源として、グルコース、フラクトース、マ
ルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米などの天然炭水化物、グリ
セロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、
酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸等の脂肪酸
類、ノルマルパラフィン等の炭化水素類、グリシン、グ
ルタミン、アスパラギン等のアミノ酸類等の一般的な炭
素源より使用する微生物の資化性を考慮して、一種また
は二種以上選択して使用すればよい。窒素源としては、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
ィープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解
物等の有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素
化合物より使用微生物の資化性を考慮して、一種または
二種以上選択して使用する。
は、発酵学の分野で公知の情報に従って培養することが
できる。使用する培地としては炭素源、窒素源、無機物
およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能であり、液体
培地または固体培地を用いて培養することができる。具
体的には炭素源として、グルコース、フラクトース、マ
ルトース、ガラクトース、澱粉、澱粉加水分解物、糖
蜜、廃糖蜜等の糖類、麦、米などの天然炭水化物、グリ
セロール、メタノール、エタノール等のアルコール類、
酢酸、グルコン酸、ピルビン酸、クエン酸等の脂肪酸
類、ノルマルパラフィン等の炭化水素類、グリシン、グ
ルタミン、アスパラギン等のアミノ酸類等の一般的な炭
素源より使用する微生物の資化性を考慮して、一種また
は二種以上選択して使用すればよい。窒素源としては、
肉エキス、ペプトン、酵母エキス、大豆加水分解物、ミ
ルクカゼイン、カザミノ酸、各種アミノ酸、コーンステ
ィープリカー、その他の動物、植物、微生物の加水分解
物等の有機窒素化合物、アンモニア、硝酸アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム等のアンモニ
ウム塩、硝酸ナトリウム等の硝酸塩、尿素等の無機窒素
化合物より使用微生物の資化性を考慮して、一種または
二種以上選択して使用する。
【００２８】また、本アミノアシラーゼを効率的に生産
させるために、誘導物質として、Ｎ−長鎖アシル−アミ
ノ酸であるアミソフトＣＳ−１１、ＬＳ−１１、ＧＳ−
１１、ＨＳ−１１（味の素（株））およびその類似物質
を一種または二種以上選択して使用することができる。
させるために、誘導物質として、Ｎ−長鎖アシル−アミ
ノ酸であるアミソフトＣＳ−１１、ＬＳ−１１、ＧＳ−
１１、ＨＳ−１１（味の素（株））およびその類似物質
を一種または二種以上選択して使用することができる。
【００２９】さらに、無機塩として微量のマグネシウ
ム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
銅、亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩等より
一種または二種以上を選択して使用することができる。
また、必要に応じて植物油、界面活性剤等の消泡剤を添
加してもよい。
ム、マンガン、カルシウム、ナトリウム、カリウム、
銅、亜鉛等のリン酸塩、塩酸塩、硫酸塩、酢酸塩等より
一種または二種以上を選択して使用することができる。
また、必要に応じて植物油、界面活性剤等の消泡剤を添
加してもよい。
【００３０】培養は前記培地成分を含有する液体培地中
で振盪培養、通気撹拌培養、連続培養などの通常の培養
法を用いて行うことができる。
で振盪培養、通気撹拌培養、連続培養などの通常の培養
法を用いて行うことができる。
【００３１】培養条件は、培地の種類、培養法により適
宜選択すればよく、本菌株が増殖し、アミノアシラーゼ
を産生できる条件であれば特に問題はない。通常は、培
養開始時のｐＨを６ぐらいに調節し、２５〜３５℃の温
度条件下で培養することが望ましい。培養日数は５リッ
トルの三角フラスコを用いて培養を行う場合、４〜６日
が適当である。
宜選択すればよく、本菌株が増殖し、アミノアシラーゼ
を産生できる条件であれば特に問題はない。通常は、培
養開始時のｐＨを６ぐらいに調節し、２５〜３５℃の温
度条件下で培養することが望ましい。培養日数は５リッ
トルの三角フラスコを用いて培養を行う場合、４〜６日
が適当である。
【００３２】以上のようにして、培養物中に生産蓄積さ
れたアミノアシラーゼは、次のような方法で採取、分取
することができる。
れたアミノアシラーゼは、次のような方法で採取、分取
することができる。
【００３３】本アミノアシラーゼは菌体内に蓄積される
ので、培養終了後、菌体を瀘過、遠心分離等の方法で集
め、緩衝液等で菌体を洗浄後、例えば凍結融解処理、超
音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理等の物理
的手段、もしくはリゾチーム等の細胞壁溶解酵素処理の
ような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理等
の化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより
菌体を破砕し、アミノアシラーゼを抽出することができ
る。こうして得られた粗アミノアシラーゼは塩析、有機
溶媒による分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等のクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）および電気泳動等の手段を単独もしくは組
み合わせて用いて精製することができる。
ので、培養終了後、菌体を瀘過、遠心分離等の方法で集
め、緩衝液等で菌体を洗浄後、例えば凍結融解処理、超
音波処理、加圧処理、浸透圧差処理、磨砕処理等の物理
的手段、もしくはリゾチーム等の細胞壁溶解酵素処理の
ような生化学的処理もしくは界面活性剤との接触処理等
の化学的処理を単独または組み合わせて行うことにより
菌体を破砕し、アミノアシラーゼを抽出することができ
る。こうして得られた粗アミノアシラーゼは塩析、有機
溶媒による分別沈殿、イオン交換クロマトグラフィー、
ゲル瀘過クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィ
ー、色素クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトク
ロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー
等のクロマトグラフィーや高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）および電気泳動等の手段を単独もしくは組
み合わせて用いて精製することができる。
【００３４】その一例を挙げれば次の通りである。すな
わち、瀘過で集めた菌体をビード・ビーター (Bead-Bea
ter)（バイオスペック プロダクト (BIOSPEC PRODUCT
S) 社製）を用いて磨砕処理し、アミノアシラーゼ抽出
液を得、その後、硫安を用いた塩析処理、ＤＥＡＥ−ト
ヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー、トヨ
パールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラフィー、ブチル
（ＢＵＴＨＹＬ）−トヨパール６５０Ｍ疎水クロマトグ
ラフィー、トヨパールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラ
フィーを行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動的に単一に精製することができる。
わち、瀘過で集めた菌体をビード・ビーター (Bead-Bea
ter)（バイオスペック プロダクト (BIOSPEC PRODUCT
S) 社製）を用いて磨砕処理し、アミノアシラーゼ抽出
液を得、その後、硫安を用いた塩析処理、ＤＥＡＥ−ト
ヨパール６５０Ｍイオン交換クロマトグラフィー、トヨ
パールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラフィー、ブチル
（ＢＵＴＨＹＬ）−トヨパール６５０Ｍ疎水クロマトグ
ラフィー、トヨパールＨＷ５５Ｆゲル瀘過クロマトグラ
フィーを行うことによって、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動的に単一に精製することができる。
【００３５】なお、本アミノアシラーゼの活性測定法
は、１０ｍＭ Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を含
んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２５０μｌに蒸
留水２００μｌを加え、３０℃において５分間インキュ
ベートした後、酵素液５０μｌを加え、１５分間反応さ
せ、生成したＬ−グルタミン酸をニンヒドリン−ヒドリ
ンダンチン法（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー (Journal ofBiological Chemistry)、第２
１１巻、９０７頁（１９５７））に従って測定した。な
お、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＬ−グルタミン酸の
生成を触媒する酵素量とした。
は、１０ｍＭ Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を含
んだ１００ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７）２５０μｌに蒸
留水２００μｌを加え、３０℃において５分間インキュ
ベートした後、酵素液５０μｌを加え、１５分間反応さ
せ、生成したＬ−グルタミン酸をニンヒドリン−ヒドリ
ンダンチン法（ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケ
ミストリー (Journal ofBiological Chemistry)、第２
１１巻、９０７頁（１９５７））に従って測定した。な
お、１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＬ−グルタミン酸の
生成を触媒する酵素量とした。
【００３６】
【実施例】つぎに、実施例により本発明を説明するが、
これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでな
いことはいうまでもない。なお、下記実施例におけるパ
ーセンテージは、特にことわらない限り「重量％」を意
味する。
これらにより本発明の範囲がなんら制限されるものでな
いことはいうまでもない。なお、下記実施例におけるパ
ーセンテージは、特にことわらない限り「重量％」を意
味する。
【００３７】実施例１ 培養組成ペプトン２．０％、グルコース ０．５％、Ｎ
Ｈ4 ＮＯ3 ０．３％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．４％、Ｋ2
ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ ０．１％、ＭｇＳＯ4
０．０２％からなるｐＨ６の培地６０ｍｌを５００ｍ
ｌ容量の坂口フラスコに入れ、ペニシリウム・フニコロ
サム (penicillium funiculosum)の一白金耳を接種し、
３０℃で４８時間培養し、種培養液を得た。上記の培養
組成のものに０．５％アミソフトＧＳ−１１（味の素
（株））を加え、ｐＨ６に調製した培地１リットルを５
リットル容量の三角フラスコに入れ、これに種培養液６
０ｍｌを加え、約１２０時間培養した。計９リットルの
本培養を行い、培養終了後、吸引瀘過により得た菌体約
５７０ｇ（湿重量）を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で洗浄
後、菌体の湿重量に対して５倍量の５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）に菌体を懸濁させ、４分間の磨砕処
理（ビード・ビーター (Bead-Beater)、バイオスペック
プロダクト (BIOSPEC PRODUCTS) 社製）により菌体を
破砕した。得られた菌体処理液を遠心分離（２０，００
０×ｇ、３０分間）し、アミノアシラーゼ抽出液を得
た。その結果、該アミノアシラーゼの総活性は、２０，
８１７Ｕ、比活性１．５Ｕ／ｍｇであった。なお、タン
パクの定量は、色素結合法に準じて行った。
Ｈ4 ＮＯ3 ０．３％、ＫＨ2 ＰＯ4 ０．４％、Ｋ2
ＨＰＯ4 ０．１％、ＮａＣｌ ０．１％、ＭｇＳＯ4
０．０２％からなるｐＨ６の培地６０ｍｌを５００ｍ
ｌ容量の坂口フラスコに入れ、ペニシリウム・フニコロ
サム (penicillium funiculosum)の一白金耳を接種し、
３０℃で４８時間培養し、種培養液を得た。上記の培養
組成のものに０．５％アミソフトＧＳ−１１（味の素
（株））を加え、ｐＨ６に調製した培地１リットルを５
リットル容量の三角フラスコに入れ、これに種培養液６
０ｍｌを加え、約１２０時間培養した。計９リットルの
本培養を行い、培養終了後、吸引瀘過により得た菌体約
５７０ｇ（湿重量）を０．８５％ＮａＣｌ水溶液で洗浄
後、菌体の湿重量に対して５倍量の５０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）に菌体を懸濁させ、４分間の磨砕処
理（ビード・ビーター (Bead-Beater)、バイオスペック
プロダクト (BIOSPEC PRODUCTS) 社製）により菌体を
破砕した。得られた菌体処理液を遠心分離（２０，００
０×ｇ、３０分間）し、アミノアシラーゼ抽出液を得
た。その結果、該アミノアシラーゼの総活性は、２０，
８１７Ｕ、比活性１．５Ｕ／ｍｇであった。なお、タン
パクの定量は、色素結合法に準じて行った。
【００３８】実施例２ 実施例１に準じて得られた粗アミノアシラーゼ抽出液を
硫安３０％飽和にし、セライトを用いて沈殿を除去し
た。得られた上澄み液を硫安８０％飽和にし、遠心分離
（１２，０００×ｇ、３０分間）により沈殿を回収し
た。該沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に
溶解後、同緩衝液に対して透析した。その結果、該アミ
ノアシラーゼの総活性は２１，２８５Ｕ、比活性１０．
７Ｕ／ｍｇであった。
硫安３０％飽和にし、セライトを用いて沈殿を除去し
た。得られた上澄み液を硫安８０％飽和にし、遠心分離
（１２，０００×ｇ、３０分間）により沈殿を回収し
た。該沈殿を２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）に
溶解後、同緩衝液に対して透析した。その結果、該アミ
ノアシラーゼの総活性は２１，２８５Ｕ、比活性１０．
７Ｕ／ｍｇであった。
【００３９】このアミノアシラーゼ溶液を同緩衝液で平
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに通過させ、ア
ミノアシラーゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄
し、非吸着物質を除き、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線
的濃度勾配溶出法によりアミノアシラーゼを溶出した。
このアミノアシラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）＋０．１ＭＮａ
Ｃｌで平衡化したトヨパールＨＷ５５Ｆを用いてゲル瀘
過を行った。得られたアミノアシラーゼ活性画分を硫安
２５％飽和にし、硫安２５％飽和の２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したブチル（ＢＵＴＨＹ
Ｌ）−トヨパール６５０Ｍに通過させ、アミノアシラー
ゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄し、非吸着物
質を除き、硫安２５〜０％飽和の直線的濃度勾配溶出法
によりアミノアシラーゼを溶出した。得られたアミノア
シラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、上記のトヨパ
ールＨＷ５５Ｆを用いて同様の操作でゲル瀘過を行っ
た。得られたアミノアシラーゼ活性画分を集めたとこ
ろ、総活性３，４９７Ｕ、比活性６２４．５Ｕ／ｍｇで
あった。また、この活性画分をポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供したところ、該アミノアシラーゼは単一の
バンドを示したことより、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動的に単一に精製されたことが分かった。精製の結果
を表１に示す。
衡化したＤＥＡＥ−トヨパール６５０Ｍに通過させ、ア
ミノアシラーゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄
し、非吸着物質を除き、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌの直線
的濃度勾配溶出法によりアミノアシラーゼを溶出した。
このアミノアシラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、
２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８）＋０．１ＭＮａ
Ｃｌで平衡化したトヨパールＨＷ５５Ｆを用いてゲル瀘
過を行った。得られたアミノアシラーゼ活性画分を硫安
２５％飽和にし、硫安２５％飽和の２０ｍＭトリス−塩
酸緩衝液（ｐＨ８）で平衡化したブチル（ＢＵＴＨＹ
Ｌ）−トヨパール６５０Ｍに通過させ、アミノアシラー
ゼを吸着させた後、同緩衝液で充分に洗浄し、非吸着物
質を除き、硫安２５〜０％飽和の直線的濃度勾配溶出法
によりアミノアシラーゼを溶出した。得られたアミノア
シラーゼ活性画分を限外瀘過膜で濃縮後、上記のトヨパ
ールＨＷ５５Ｆを用いて同様の操作でゲル瀘過を行っ
た。得られたアミノアシラーゼ活性画分を集めたとこ
ろ、総活性３，４９７Ｕ、比活性６２４．５Ｕ／ｍｇで
あった。また、この活性画分をポリアクリルアミドゲル
電気泳動に供したところ、該アミノアシラーゼは単一の
バンドを示したことより、ポリアクリルアミドゲル電気
泳動的に単一に精製されたことが分かった。精製の結果
を表１に示す。
【００４０】
【表１】
【００４１】実施例３ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭホウ酸−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を用いた）に従い、分解活性を比較し
た。
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭホウ酸−塩酸緩衝液
（ｐＨ８．５）を用いた）に従い、分解活性を比較し
た。
【００４２】その結果の例を表２、表３に示す。表２、
表３中の酵素活性は、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン
酸に対する分解活性を１００とした相対活性（％）で表
した。
表３中の酵素活性は、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン
酸に対する分解活性を１００とした相対活性（％）で表
した。
【００４３】
【表２】
【００４４】
【表３】
【００４５】実施例４ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭトリシン−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）を用いた。また、反応時間を３０分と
した）に従い、各種金属イオン及び阻害剤の存在下で分
解活性を比較した。
い、前述した活性測定法（但し、１００ｍＭリン酸緩衝
液（ｐＨ７）の代わりに１００ｍＭトリシン−塩酸緩衝
液（ｐＨ８．５）を用いた。また、反応時間を３０分と
した）に従い、各種金属イオン及び阻害剤の存在下で分
解活性を比較した。
【００４６】その結果の一例を表４に示す。表４中の酵
素活性は、無添加の分解活性を１００とした相対活性
（％）で表した。
素活性は、無添加の分解活性を１００とした相対活性
（％）で表した。
【００４７】
【表４】
【００４８】実施例５ ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動に供したところ、
単一のバンドを示し、その分子量は約４８，０００であ
った。ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲル瀘過法
（移動層：０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７））では、分
子量は１９２，０００であった。但し、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９７，４００）、血清アルブミン（６５，４
００）、卵白アルブミン（４２，７００）、炭酸脱水酵
素（２９，０００）、トリプトファンインヒビター（２
０，１００）、α−ラクトアルブミン（１４，４００）
をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によるアミノア
シラーゼの分子量決定の標準物質とし、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（２９０，０００）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（１４２，０００）、エノラーゼ（６７，００
０）、アデニル酸キナーゼ（３２，０００）、チトクロ
ムＣ（１２，４００）をゲル瀘過によるアミノアシラー
ゼの分子量決定の標準物質とした。
単一のバンドを示し、その分子量は約４８，０００であ
った。ＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷを用いたゲル瀘過法
（移動層：０．２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７））では、分
子量は１９２，０００であった。但し、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量９７，４００）、血清アルブミン（６５，４
００）、卵白アルブミン（４２，７００）、炭酸脱水酵
素（２９，０００）、トリプトファンインヒビター（２
０，１００）、α−ラクトアルブミン（１４，４００）
をＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動によるアミノア
シラーゼの分子量決定の標準物質とし、グルタミン酸デ
ヒドロゲナーゼ（２９０，０００）、乳酸デヒドロゲナ
ーゼ（１４２，０００）、エノラーゼ（６７，００
０）、アデニル酸キナーゼ（３２，０００）、チトクロ
ムＣ（１２，４００）をゲル瀘過によるアミノアシラー
ゼの分子量決定の標準物質とした。
【００４９】実施例６ 実施例２に準じて得られた精製アミノアシラーゼを用い
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質をしたと
きの酵素の至適ｐＨ及びｐＨ安定範囲を測定した。
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質をしたと
きの酵素の至適ｐＨ及びｐＨ安定範囲を測定した。
【００５０】その結果を図１及び図２に示す。図１にお
いて、活性測定は、３０℃で各種緩衝液（ｐＨ５．５〜
６．０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝
液，ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ
９．５〜１１．０：炭酸緩衝液）を用いて行った。ま
た、活性は最高値における活性値を１００としたときの
相対活性（％）で表した。図２において、酵素液はｐＨ
３〜１１の各種緩衝液中においてインキュベートし、５
時間後に残存活性を測定した。活性はインキュベート前
の酵素の活性値を１００としたときの活性残存率（％）
で表した。
いて、活性測定は、３０℃で各種緩衝液（ｐＨ５．５〜
６．０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝
液，ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ
９．５〜１１．０：炭酸緩衝液）を用いて行った。ま
た、活性は最高値における活性値を１００としたときの
相対活性（％）で表した。図２において、酵素液はｐＨ
３〜１１の各種緩衝液中においてインキュベートし、５
時間後に残存活性を測定した。活性はインキュベート前
の酵素の活性値を１００としたときの活性残存率（％）
で表した。
【００５１】また、前記精製アミノアシラーゼを用い
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたと
きの酵素の至適温度と熱安定性を測定した。
て、Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたと
きの酵素の至適温度と熱安定性を測定した。
【００５２】その結果を図３及び図４に示す。図３にお
いて活性測定は各温度において行った。また、活性は最
高値における活性値を１００としたときの相対活性
（％）で表した。図４において、横軸に示された各温度
で酵素液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８））を
１５分間処理した後、氷冷し、残存活性を測定した。活
性は、未処理の酵素の活性値を１００としたときの活性
残存率（％）で表した。
いて活性測定は各温度において行った。また、活性は最
高値における活性値を１００としたときの相対活性
（％）で表した。図４において、横軸に示された各温度
で酵素液（２０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８））を
１５分間処理した後、氷冷し、残存活性を測定した。活
性は、未処理の酵素の活性値を１００としたときの活性
残存率（％）で表した。
【００５３】実施例７ 本アミノアシラーゼの合成能の一例を示す。８ｍｌ容量
のバイアルビンに、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶かした３Ｍグリシン溶液：１ｍｌ、オレイ
ン酸：１００ｍｇ、酵素液：２０μｌ（２０Ｕ）を入
れ、４０℃、１２０ｒｐｍ（往復振盪）の条件下で１５
時間反応させた。反応終了後、塩酸で反応を止め、ホル
ヒ法によりＮ−オレオイル−グリシンを抽出し、ＨＰＬ
Ｃ（カラム：ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＦＬＣ−ＮＨ2 、移
動層：ヘキサン／２−プロパノール／１０％リン酸，９
５：５：０．１ｖ／ｖ／ｖ、検出：２０８ｎｍ）で定量
したところ、約３０ｍｇのＮ−オレオイル−グリシンの
合成が確認できた。
のバイアルビンに、０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
８．５）に溶かした３Ｍグリシン溶液：１ｍｌ、オレイ
ン酸：１００ｍｇ、酵素液：２０μｌ（２０Ｕ）を入
れ、４０℃、１２０ｒｐｍ（往復振盪）の条件下で１５
時間反応させた。反応終了後、塩酸で反応を止め、ホル
ヒ法によりＮ−オレオイル−グリシンを抽出し、ＨＰＬ
Ｃ（カラム：ｓｈｉｍ−ｐａｃｋ ＦＬＣ−ＮＨ2 、移
動層：ヘキサン／２−プロパノール／１０％リン酸，９
５：５：０．１ｖ／ｖ／ｖ、検出：２０８ｎｍ）で定量
したところ、約３０ｍｇのＮ−オレオイル−グリシンの
合成が確認できた。
【００５４】
【発明の効果】以上述べたように、本発明は、前記のご
とき理化学的性質を有する新規のアミノアシラーゼ及び
ペニシリウム属の微生物によるアミノアシラーゼの製造
方法であるから、該アミノアシラーゼを用いることによ
り、Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸、Ｎ−長鎖アシル−ペプ
チド、Ｎ−長鎖アシル−タンパク質の低コストでの生産
が可能となる。
とき理化学的性質を有する新規のアミノアシラーゼ及び
ペニシリウム属の微生物によるアミノアシラーゼの製造
方法であるから、該アミノアシラーゼを用いることによ
り、Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸、Ｎ−長鎖アシル−ペプ
チド、Ｎ−長鎖アシル−タンパク質の低コストでの生産
が可能となる。
【図１】 図１は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの至適ｐＨを示すものである。
ゼの至適ｐＨを示すものである。
【図２】 図２は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼのｐＨ安定性を示すものである。
ゼのｐＨ安定性を示すものである。
【図３】 図３は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの至適温度を示すものである。
ゼの至適温度を示すものである。
【図４】 図４は、本発明で使用されるアミノアシラー
ゼの熱安定性を示すものである。
ゼの熱安定性を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭57−129696（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−22188（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−42535（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−209982（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−237992（ＪＰ，Ａ) 特開 昭51−121591（ＪＰ，Ａ) 特公 昭35−10692（ＪＰ，Ｂ１) 特公 昭31−2891（ＪＰ，Ｂ１) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 以下の理化学的性質を有するアミノアシ
ラーゼ １）作用 Ｎ−長鎖アシル−アミノ酸に作用し、Ｌ−アミノ酸を遊
離させる。 ２）基質特異性 炭素数４以上のアシル基を有するＮ−アシル−アミノ酸
のＬ体に作用し、Ｄ体には作用しない。アシル基に対す
る特異性は広く、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、芳香族カ
ルボン酸からなるＮ−アシル化合物に作用する。 ３）至適ｐＨおよびｐＨ安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適ｐＨは、３０℃、各種緩衝液（ｐＨ５．５〜６．
０：酢酸緩衝液、ｐＨ６．０〜８．０：リン酸緩衝液，
ｐＨ８．０〜９．５：ホウ酸−塩酸緩衝液、ｐＨ９．５
〜１１．０：炭酸緩衝液）中で約８．５である。同緩衝
液中、３０℃、５時間処理においてｐＨ６〜９まで安定
である。 ４）至適温度および熱安定性 Ｎ−オレオイル−Ｌ−グルタミン酸を基質としたときの
至適温度は、リン酸緩衝液（ｐＨ７）を用いて測定した
ところ、２５〜３５℃である。２０ｍＭトリス−塩酸緩
衝液（ｐＨ８）中、４０℃、１５分処理において全く失
活せず、４５℃、１５分処理後の残存活性は約８０％で
ある。 ５）阻害剤の影響 パラクロロマーキュリーベンゾエートまたはジチオスレ
イトールにより阻害を受ける。 ６）金属イオンの影響 Ｎｉ2+、Ｃｕ2+、Ｍｇ2+などによって活性化され、Ｈｇ
2+により阻害を受ける。 ７）サブユニットの分子量 ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動では分子量約４
８，０００。 ８）分子量 ゲル瀘過法では約１９２，０００。 - 【請求項２】 ペニシリウム (Penicillium)属に属する
請求項１記載のアミノアシラーゼの生産菌を培養し、該
培養物から前記アミノアシラーゼを分離、回収すること
を特徴とするアミノアシラーゼの製造方法。 - 【請求項３】 ペニシリウム (Penicillium)属に属する
請求項１記載のアミノアシラーゼの生産能を有する菌株
がペニシリウム・フニコロサム (penicillium funiculo
sum)である請求項２記載のアミノアシラーゼの製造方
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3002096A JP2840134B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3002096A JP2840134B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05328972A JPH05328972A (ja) | 1993-12-14 |
| JP2840134B2 true JP2840134B2 (ja) | 1998-12-24 |
Family
ID=11519820
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3002096A Expired - Lifetime JP2840134B2 (ja) | 1991-01-11 | 1991-01-11 | 新規なアミノアシラーゼおよびその製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2840134B2 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000041684A (ja) | 1998-07-29 | 2000-02-15 | Daicel Chem Ind Ltd | 新規なｄ−アミノアシラーゼおよびその製造方法、並びに該ｄ−アミノアシラーゼを利用したｄ−アミノ酸の製造方法 |
| JP2008307006A (ja) * | 2007-06-15 | 2008-12-25 | Toyobo Co Ltd | Ｌ−アミノ酸の製造方法 |
| WO2009136500A1 (ja) | 2008-05-07 | 2009-11-12 | 東洋紡績株式会社 | Ｌ－サクシニルアミノアシラーゼ、およびこれを用いたｌ－アミノ酸の製造方法 |
| US8728771B2 (en) | 2008-12-11 | 2014-05-20 | Toyo Boseki Kabushiki Kaisha | L-succinylaminoacylase and process for producing L-amino acid using it |
| JP2011041550A (ja) * | 2009-08-24 | 2011-03-03 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | アミダーゼの保存剤、活性賦活剤及び失活予防剤 |
-
1991
- 1991-01-11 JP JP3002096A patent/JP2840134B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05328972A (ja) | 1993-12-14 |
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