JPH1156358A - 没食子酸脱炭酸酵素及びピロガロールの製造法 - Google Patents
没食子酸脱炭酸酵素及びピロガロールの製造法Info
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- JPH1156358A JPH1156358A JP9222339A JP22233997A JPH1156358A JP H1156358 A JPH1156358 A JP H1156358A JP 9222339 A JP9222339 A JP 9222339A JP 22233997 A JP22233997 A JP 22233997A JP H1156358 A JPH1156358 A JP H1156358A
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- decarboxylase
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- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 特定の酵素学的性質を有する没食子酸脱
炭酸酵素、これを用いるピロガロール製法、及び還元剤
を利用した没食子酸脱炭酸酵素の安定化、精製法。 【効果】 本発明により、従来精製が困難とされていた
没食子酸脱炭酸酵素が、分離できた。本発明酵素を用い
ればピロガロールが効率良く生産できる。
炭酸酵素、これを用いるピロガロール製法、及び還元剤
を利用した没食子酸脱炭酸酵素の安定化、精製法。 【効果】 本発明により、従来精製が困難とされていた
没食子酸脱炭酸酵素が、分離できた。本発明酵素を用い
ればピロガロールが効率良く生産できる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は没食子酸脱炭酸酵素
及びこれを利用したピロガロールの製造法に関する。
及びこれを利用したピロガロールの製造法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ピロガロールは還元力が強いことから写
真の現像液、金属の分析試薬、ガス分析における酸素吸
収剤、種々の染色剤、染料原料、医薬品原料等として広
く使用されている工業的に重要な化合物である。
真の現像液、金属の分析試薬、ガス分析における酸素吸
収剤、種々の染色剤、染料原料、医薬品原料等として広
く使用されている工業的に重要な化合物である。
【０００３】ピロガロールの製造法としては没食子酸の
加熱による脱炭酸反応が広く採用されているが、副生物
が多く純度の高いピロガロールが得難いという問題があ
る。
加熱による脱炭酸反応が広く採用されているが、副生物
が多く純度の高いピロガロールが得難いという問題があ
る。
【０００４】一方、タンニン酸や没食子酸にクレブシエ
ラ属（Antonie van Leeuvenhoek, 35, 325(1969)）、シ
トロバクター属（Agric. Biol. Chem., 46(10), 2539〜
2546(1982)）、エルヴィニア属及びエアロモナス属（特
開昭６１−１０８３９３号公報）、エンテロバクター属
（特開昭６３−４９０８８号公報）等の細菌を作用させ
てピロガロールを製造する方法が知られている。かかる
微生物によるピロガロールの生産が、該微生物の産生す
る没食子酸脱炭酸酵素の作用によるものであることは判
明している。
ラ属（Antonie van Leeuvenhoek, 35, 325(1969)）、シ
トロバクター属（Agric. Biol. Chem., 46(10), 2539〜
2546(1982)）、エルヴィニア属及びエアロモナス属（特
開昭６１−１０８３９３号公報）、エンテロバクター属
（特開昭６３−４９０８８号公報）等の細菌を作用させ
てピロガロールを製造する方法が知られている。かかる
微生物によるピロガロールの生産が、該微生物の産生す
る没食子酸脱炭酸酵素の作用によるものであることは判
明している。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、この没
食子酸脱炭酸酵素は、通常の緩衝液中で極めて不安定で
あり、未だ充分な精製がなされておらず、その酵素学的
性質は解明されていない（Agric. Biol. Chem., 46(1
0), p2544(1982)、及びJ. Food Hyg. Soc. Japan,Vol.
33, No.4, p373(1992)参照）。
食子酸脱炭酸酵素は、通常の緩衝液中で極めて不安定で
あり、未だ充分な精製がなされておらず、その酵素学的
性質は解明されていない（Agric. Biol. Chem., 46(1
0), p2544(1982)、及びJ. Food Hyg. Soc. Japan,Vol.
33, No.4, p373(1992)参照）。
【０００６】従って、本発明の目的はピロガロールの生
産に有用な没食子酸脱炭酸酵素を単離精製すること、及
びこれを利用したピロガロールの製造法を提供すること
にある。
産に有用な没食子酸脱炭酸酵素を単離精製すること、及
びこれを利用したピロガロールの製造法を提供すること
にある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、ピ
ロガロール生産性のより高い微生物及び没食子酸脱炭酸
酵素の単離をすべく種々検討した結果、パントエア属に
属する微生物中にタンニン酸又は没食子酸からピロガロ
ールを著量生産する微生物を見出した。さらに研究を続
けたところ還元剤の存在下において没食子酸脱炭酸酵素
が極めて安定化し、還元剤の存在下で精製すれば該酵素
が効率良く精製でき、没食子酸脱炭酸酵素の単離精製に
初めて成功し、本発明を完成するに至った。
ロガロール生産性のより高い微生物及び没食子酸脱炭酸
酵素の単離をすべく種々検討した結果、パントエア属に
属する微生物中にタンニン酸又は没食子酸からピロガロ
ールを著量生産する微生物を見出した。さらに研究を続
けたところ還元剤の存在下において没食子酸脱炭酸酵素
が極めて安定化し、還元剤の存在下で精製すれば該酵素
が効率良く精製でき、没食子酸脱炭酸酵素の単離精製に
初めて成功し、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は次の酵素学的性質を有
する没食子酸脱炭酸酵素を提供するものである。 （１）作用 没食子酸を脱炭酸しピロガロールを生成する。 （２）作用pH及び至適pH 少なくともpH４．５〜８．５で作用し、至適pHは５．５
〜６．５である。 （３）作用温度及び至適温度 少なくとも２０〜７０℃で作用し、至適温度は５０℃付
近である。 （４）温度安定性 ６０℃までは６０％以上安定であるが、７０℃以上では
失活する（pH６．０で１５分間インキュベート）。 （５）分子量 ＨＰＬＣゲル濾過用カラムを用いた分析による分子量は
４４２ｋＤａであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析では５８ｋＤａである。 （６）種々の化合物による影響 水銀、銀、銅、クロム又はｐ−クロロメルクリ安息香酸
の添加により強い阻害を受け、キレート剤の添加によっ
て阻害を受ける。 （７）金属の含有 鉄を含有する。 （８）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列は、Ser-Asn-Thr-Glu-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg-である。
する没食子酸脱炭酸酵素を提供するものである。 （１）作用 没食子酸を脱炭酸しピロガロールを生成する。 （２）作用pH及び至適pH 少なくともpH４．５〜８．５で作用し、至適pHは５．５
〜６．５である。 （３）作用温度及び至適温度 少なくとも２０〜７０℃で作用し、至適温度は５０℃付
近である。 （４）温度安定性 ６０℃までは６０％以上安定であるが、７０℃以上では
失活する（pH６．０で１５分間インキュベート）。 （５）分子量 ＨＰＬＣゲル濾過用カラムを用いた分析による分子量は
４４２ｋＤａであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析では５８ｋＤａである。 （６）種々の化合物による影響 水銀、銀、銅、クロム又はｐ−クロロメルクリ安息香酸
の添加により強い阻害を受け、キレート剤の添加によっ
て阻害を受ける。 （７）金属の含有 鉄を含有する。 （８）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列は、Ser-Asn-Thr-Glu-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg-である。
【０００９】また、本発明は上記の没食子酸脱炭酸酵素
又は該没食子酸脱炭酸酵素生産菌を没食子酸に作用させ
ることを特徴とするピロガロールの製造法を提供するも
のである。また、本発明はパントエア属に属するピロガ
ロール生産菌をタンニン酸又は没食子酸に作用させるこ
とを特徴とするピロガロールの製造法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、還元剤を添加することを特徴
とする没食子酸脱炭酸酵素の安定化方法を提供するもの
である。さらにまた、本発明は、還元剤の存在下で精製
することを特徴とする没食子酸脱炭酸酵素の精製方法を
提供するものである。
又は該没食子酸脱炭酸酵素生産菌を没食子酸に作用させ
ることを特徴とするピロガロールの製造法を提供するも
のである。また、本発明はパントエア属に属するピロガ
ロール生産菌をタンニン酸又は没食子酸に作用させるこ
とを特徴とするピロガロールの製造法を提供するもので
ある。さらに、本発明は、還元剤を添加することを特徴
とする没食子酸脱炭酸酵素の安定化方法を提供するもの
である。さらにまた、本発明は、還元剤の存在下で精製
することを特徴とする没食子酸脱炭酸酵素の精製方法を
提供するものである。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明の没食子酸脱炭酸酵素を生
産する微生物としては、特に制限されないが、本発明者
らが土壌から分離したＴ−７−１株が挙げられる。該Ｔ
−７−１株の菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態的性質 （１）細胞の形及び大きさ：０．５〜０．８×２〜３μ
ｍの桿菌 （２）細胞の多形性の有無：なし （３）運動性の有無と鞭毛の着生状態：あり、周鞭毛 （４）胞子の有無：なし
産する微生物としては、特に制限されないが、本発明者
らが土壌から分離したＴ−７−１株が挙げられる。該Ｔ
−７−１株の菌学的性質は以下の通りである。 （ａ）形態的性質 （１）細胞の形及び大きさ：０．５〜０．８×２〜３μ
ｍの桿菌 （２）細胞の多形性の有無：なし （３）運動性の有無と鞭毛の着生状態：あり、周鞭毛 （４）胞子の有無：なし
【００１１】（ｂ）培養的性質 （１）肉汁寒天平板培養 生育の程度：良好な生育 コロニーの形：点状 コロニーの隆起：半レンズ状 コロニー周辺の形状：全縁 コロニー表面の形状：平滑 コロニーの色：薄クリーム色 コロニーの光沢：光沢あり（２）肉汁液体培養 生育の程度：中程度の生育 沈殿、菌膜は認められない （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：液化しない
【００１２】（ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性：陰性 （２）硝酸塩の還元：（＋） （３）脱窒反応：（−） （４）ＭＲテスト：（＋） （５）ＶＰテスト：（−） （６）インドールの生成：（−） （７）硫化水素の生成：（−） （８）でんぷんの加水分解：（−） （９）クエン酸の利用： Koser の培地：利用する Christensen の培地：利用する （１０）無機窒素源の利用：利用する （１１）色素の生成：（−） （１２）ウレアーゼ：（−） （１３）オキシダーゼ：（−） （１４）カタラーゼ：（＋） （１５）生育の範囲：pH４．５〜９．０、温度１４〜４
０℃ （１６）酸素に対する態度：通性嫌気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：発酵的
０℃ （１６）酸素に対する態度：通性嫌気性 （１７）Ｏ−Ｆテスト：発酵的
【００１３】
【表１】 （１８）糖類から酸及びガスの生成 酸の生成 ガスの生成 （１）Ｌ−アラビノース ＋ − （２）Ｄ−キシロース ＋ − （３）Ｄ−グルコース ＋ − （４）Ｄ−マンノース ＋ − （５）Ｄ−フラクトース ＋ − （６）Ｄ−ガラクトース ＋ − （７）マルトース ＋ − （８）シュークロース ＋ − （９）ラクトース ＋ − （10）トレハロース ＋ − （11）Ｄ−ソルビトール ＋ − （12）Ｄ−マンニトール ＋ − （13）イノシトール ＋ − （14）グリセリン ＋ −
【００１４】（ｄ）その他の諸性質 （１）オルニチンデカルボキシラーゼ：（＋） （２）リジンデカルボキシラーゼ：（−） （３）アルギニンデカルボキシラーゼ：（＋） （４）アルギニンデイミナーゼ：（−） （５）ゼラチンの分解：（＋） （６）β−ガラクトシダーゼ：（＋） （７）トリプトファンデアミナーゼ：（−）
【００１５】以上の菌学的性質に基づいて本菌株はパン
トエア アグロメランス（Pantoeaagglomerans）に属す
る菌株であると、英国 The National Collections of I
ndustrial & Marine Bacteria Ltd.（NCIMB）により同
定された。そこで本出願人は本菌株をパントエア アグ
ロメランス Ｔ−７−１と命名し、工業技術院生命工学
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６３７５として寄託し
た。
トエア アグロメランス（Pantoeaagglomerans）に属す
る菌株であると、英国 The National Collections of I
ndustrial & Marine Bacteria Ltd.（NCIMB）により同
定された。そこで本出願人は本菌株をパントエア アグ
ロメランス Ｔ−７−１と命名し、工業技術院生命工学
技術研究所にＦＥＲＭ Ｐ−１６３７５として寄託し
た。
【００１６】上記微生物を用いて本発明の没食子酸脱炭
酸酵素を得るには、該微生物を適当な培地に接種し、常
法に従って培養すればよい。該培地中には適当な炭素源
及び窒素源を含有せしめておくことが好ましい。
酸酵素を得るには、該微生物を適当な培地に接種し、常
法に従って培養すればよい。該培地中には適当な炭素源
及び窒素源を含有せしめておくことが好ましい。
【００１７】ここで炭素源としては、グルコース、アラ
ビノース、マンニトール、シュークロース、グリセリン
等が挙げられる。また窒素源としては、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー等の天
然窒素源、各種無機塩類が用いられる。また微量栄養素
として各種ビタミン類、アミノ酸類、核酸類を含有させ
てもよい。
ビノース、マンニトール、シュークロース、グリセリン
等が挙げられる。また窒素源としては、ペプトン、肉エ
キス、酵母エキス、コーン・スティープ・リカー等の天
然窒素源、各種無機塩類が用いられる。また微量栄養素
として各種ビタミン類、アミノ酸類、核酸類を含有させ
てもよい。
【００１８】培養は、pH４．５〜９．０、１４〜４０℃
で好気的に行うのが好ましい。培養手段は、静置、振と
うのいずれでもよい。
で好気的に行うのが好ましい。培養手段は、静置、振と
うのいずれでもよい。
【００１９】培養物から本発明酵素を採取、精製するに
は、培養物に還元剤を添加して、本発明酵素を安定化さ
せて行うのが好ましい。還元剤としては、アスコルビン
酸塩、亜二チオン酸塩、ジチオトレイトール、チオ硫酸
塩等が挙げられる。還元剤の添加濃度は特に制限されな
いが、０．１mM〜１Ｍが好ましい。
は、培養物に還元剤を添加して、本発明酵素を安定化さ
せて行うのが好ましい。還元剤としては、アスコルビン
酸塩、亜二チオン酸塩、ジチオトレイトール、チオ硫酸
塩等が挙げられる。還元剤の添加濃度は特に制限されな
いが、０．１mM〜１Ｍが好ましい。
【００２０】すなわち、培養物より菌体を集め、還元剤
の存在下において、該菌体より破砕、遠心分離、硫安分
画、限外濾過、ゲル濾過等の分離操作を行うのが好まし
い。
の存在下において、該菌体より破砕、遠心分離、硫安分
画、限外濾過、ゲル濾過等の分離操作を行うのが好まし
い。
【００２１】このように没食子酸脱炭酸酵素が還元剤を
共存させると安定化し、精製が可能になることは全く新
しい知見であり、従来分離不可能であった没食子酸脱炭
酸酵素も還元剤存在下で精製できることは明らかであ
る。より具体的には、没食子酸脱炭酸酵素を含有する粗
酵素液、培養液又は培養物に還元剤（例えば０．１mM〜
１Ｍ）を添加して、遠心分離、硫安分画、限外濾過、ゲ
ル濾過等の精製操作を行えばよい。かくして得られる本
発明酵素のより詳細な酵素学的性質は以下の通りであ
る。
共存させると安定化し、精製が可能になることは全く新
しい知見であり、従来分離不可能であった没食子酸脱炭
酸酵素も還元剤存在下で精製できることは明らかであ
る。より具体的には、没食子酸脱炭酸酵素を含有する粗
酵素液、培養液又は培養物に還元剤（例えば０．１mM〜
１Ｍ）を添加して、遠心分離、硫安分画、限外濾過、ゲ
ル濾過等の精製操作を行えばよい。かくして得られる本
発明酵素のより詳細な酵素学的性質は以下の通りであ
る。
【００２２】（１）作用 没食子酸を脱炭酸とピロガロールを生成する。 （２）作用pH及び至適pH 酵素標品をそれぞれpH４〜１０に調製した５０mMのクエ
ン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス
塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で活
性を測定したところ、少なくともpH４．５〜８．５で作
用し、至適pHは５．５〜６．５であった。 （３）作用温度及び至適温度 酵素標品を２０〜７０℃の各温度で５分間没食子酸と反
応させて酸酵素活性を測定したところ、少なくとも２０
〜７０℃で作用し、至適温度は５０℃であった。 （４）温度安定性 酵素標品をpH６．０で２０〜７０℃に１５分間インキュ
ベートした。その後３０℃にて没食子酸と１０分間反応
させて活性を測定したところ、６０℃までは６０％以上
安定であったが、７０℃では完全に失活した。 （５）分子量 東ソー社製 TSK-Gel SW3000 を用いたＨＰＬＣ分析によ
り、本酵素の分子量は４４２ｋＤａであった。また、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析で
は、５８ｋＤａの分子量であったことから、本酵素は同
一のサブユニット８量体から構成される。 （６）種々の化合物による酵素活性への影響 以下に示す各化合物が１mMの濃度となるように添加した
５０mMのリン酸カルシウム緩衝液（pH６．０）に酵素標
品を添加し、没食子酸脱炭酸酵素活性を測定した。化合
物を添加していない条件での活性を１００％として、残
存活性を求めたところ、本酵素はｏ−フェナントロリ
ン、α，α′−ジピリジル、タイロン、シアン化カリウ
ム等のキレート剤の添加により阻害を受け、ｐ−クロロ
メルクリ安息香酸や銀、銅、水銀、クロム等の添加によ
り強い阻害を受けた。 （７）金属の含有量 酵素標品の金属分析を行った結果、本酵素には１分子あ
たり約９．６グラム原子の鉄が含まれていた。 （８）Ｎ末端アミノ酸配列 酵素標品をエドマン分解法により分析した結果、本酵素
のＮ末端アミノ酸配列はSer-Asn-Thr-Glu-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg-であった。
ン酸ナトリウム緩衝液、リン酸カリウム緩衝液、トリス
塩酸緩衝液、グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液中で活
性を測定したところ、少なくともpH４．５〜８．５で作
用し、至適pHは５．５〜６．５であった。 （３）作用温度及び至適温度 酵素標品を２０〜７０℃の各温度で５分間没食子酸と反
応させて酸酵素活性を測定したところ、少なくとも２０
〜７０℃で作用し、至適温度は５０℃であった。 （４）温度安定性 酵素標品をpH６．０で２０〜７０℃に１５分間インキュ
ベートした。その後３０℃にて没食子酸と１０分間反応
させて活性を測定したところ、６０℃までは６０％以上
安定であったが、７０℃では完全に失活した。 （５）分子量 東ソー社製 TSK-Gel SW3000 を用いたＨＰＬＣ分析によ
り、本酵素の分子量は４４２ｋＤａであった。また、Ｓ
ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析で
は、５８ｋＤａの分子量であったことから、本酵素は同
一のサブユニット８量体から構成される。 （６）種々の化合物による酵素活性への影響 以下に示す各化合物が１mMの濃度となるように添加した
５０mMのリン酸カルシウム緩衝液（pH６．０）に酵素標
品を添加し、没食子酸脱炭酸酵素活性を測定した。化合
物を添加していない条件での活性を１００％として、残
存活性を求めたところ、本酵素はｏ−フェナントロリ
ン、α，α′−ジピリジル、タイロン、シアン化カリウ
ム等のキレート剤の添加により阻害を受け、ｐ−クロロ
メルクリ安息香酸や銀、銅、水銀、クロム等の添加によ
り強い阻害を受けた。 （７）金属の含有量 酵素標品の金属分析を行った結果、本酵素には１分子あ
たり約９．６グラム原子の鉄が含まれていた。 （８）Ｎ末端アミノ酸配列 酵素標品をエドマン分解法により分析した結果、本酵素
のＮ末端アミノ酸配列はSer-Asn-Thr-Glu-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg-であった。
【００２３】本発明酵素を用いてピロガロールを生産す
るには、没食子酸に本発明酵素を作用させればよいが、
本発明酵素を単離することなく、没食子酸に本発明酵素
生産菌を作用させることによっても行うことができる。
るには、没食子酸に本発明酵素を作用させればよいが、
本発明酵素を単離することなく、没食子酸に本発明酵素
生産菌を作用させることによっても行うことができる。
【００２４】没食子酸に本発明酵素を作用させるには、
本発明酵素の作用pH及び作用温度、より好ましくは至適
pH及び至適温度の条件下で、没食子酸を１〜２０重量％
添加して１〜数十時間インキュベートするのがよい。よ
り好ましくは、反応系に還元剤を０．１mM〜１Ｍとなる
ように添加して反応を行う。
本発明酵素の作用pH及び作用温度、より好ましくは至適
pH及び至適温度の条件下で、没食子酸を１〜２０重量％
添加して１〜数十時間インキュベートするのがよい。よ
り好ましくは、反応系に還元剤を０．１mM〜１Ｍとなる
ように添加して反応を行う。
【００２５】一方、没食子酸に本発明酵素生産菌を作用
させるには、当該生産菌の培地中に没食子酸を添加して
培養すればよく、その培養条件は前記と同様であればよ
い。ここで没食子酸の添加量は、０．１〜２０重量％が
好ましい。また、かかる培養においても、培地中に還元
剤を添加するのが好ましく、還元剤の添加濃度は０．１
mM〜１Ｍが好ましい。
させるには、当該生産菌の培地中に没食子酸を添加して
培養すればよく、その培養条件は前記と同様であればよ
い。ここで没食子酸の添加量は、０．１〜２０重量％が
好ましい。また、かかる培養においても、培地中に還元
剤を添加するのが好ましく、還元剤の添加濃度は０．１
mM〜１Ｍが好ましい。
【００２６】また、本発明酵素生産菌に代表されるパン
トエア属に属するピロガロール生産菌は、没食子酸脱炭
酸酵素以外にタンナーゼも産生するので、これをタンニ
ン酸に作用させてもピロガロールを製造することができ
る。パントエア属に属するピロガロール生産菌をタンニ
ン酸に作用させるには、前記の本発明酵素生産菌に没食
子酸を作用させる場合と同様に、該ピロガロール生産菌
の培地中にタンニン酸を添加して培養すればよい。ここ
で、タンニン酸の添加量は０．１〜２０重量％が好まし
い。なお、該ピロガロール生産菌が、没食子酸脱炭酸作
用に比してタンナーゼ活性が低い場合には、タンナーゼ
又はタンナーゼ生産菌を添加して反応を行うのが好まし
い。また、タンニン酸を基質として用いる場合にも、培
地に還元剤（好ましくは０．１mM〜１Ｍ）を添加して反
応を行うのが好ましい。
トエア属に属するピロガロール生産菌は、没食子酸脱炭
酸酵素以外にタンナーゼも産生するので、これをタンニ
ン酸に作用させてもピロガロールを製造することができ
る。パントエア属に属するピロガロール生産菌をタンニ
ン酸に作用させるには、前記の本発明酵素生産菌に没食
子酸を作用させる場合と同様に、該ピロガロール生産菌
の培地中にタンニン酸を添加して培養すればよい。ここ
で、タンニン酸の添加量は０．１〜２０重量％が好まし
い。なお、該ピロガロール生産菌が、没食子酸脱炭酸作
用に比してタンナーゼ活性が低い場合には、タンナーゼ
又はタンナーゼ生産菌を添加して反応を行うのが好まし
い。また、タンニン酸を基質として用いる場合にも、培
地に還元剤（好ましくは０．１mM〜１Ｍ）を添加して反
応を行うのが好ましい。
【００２７】生成したピロガロールはペーパークロマト
グラフィー、薄層クロマトグラフィーにより定性、硫酸
バニリン法、高速液体クロマトグラフィーにより定量す
ることができる。ピロガロールは酸性ジエチルエーテル
抽出、昇華法等公知の方法により精製、単離することが
できる。
グラフィー、薄層クロマトグラフィーにより定性、硫酸
バニリン法、高速液体クロマトグラフィーにより定量す
ることができる。ピロガロールは酸性ジエチルエーテル
抽出、昇華法等公知の方法により精製、単離することが
できる。
【００２８】本発明酵素の活性測定方法は次の通りであ
る。酵素活性は１０mMの没食子酸を含む５０mMのリン酸
カリウム緩衝液（pH６．０）に酵素溶液を添加し、３０
℃にて１０分間インキュベートし、生成するピロガロー
ル量をＨＰＬＣにて分析することにより測定した。酵素
活性は、１分間に１μmol のピロガロールを生成するの
に用いられる酵素量を１Ｕとした。
る。酵素活性は１０mMの没食子酸を含む５０mMのリン酸
カリウム緩衝液（pH６．０）に酵素溶液を添加し、３０
℃にて１０分間インキュベートし、生成するピロガロー
ル量をＨＰＬＣにて分析することにより測定した。酵素
活性は、１分間に１μmol のピロガロールを生成するの
に用いられる酵素量を１Ｕとした。
【００２９】 ＨＰＬＣ分析条件 カラム：Ｍ＆Ｓ Ｐａｃｋ Ｃ−１８ ４．６×１５０mm 溶離液：Ａ液 １０mMリン酸カリウム／リン酸緩衝液（pH２．８） Ｂ液 アセトニトリル Ａ：Ｂ＝９９：１（ｖ／ｖ） 流 速：１．０ml／min 検 出：ＵＶ２３０nm 試料注入量：５μＬ
【００３０】
【実施例】次に実施例を挙げて本発明を詳細に説明する
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
が、本発明はこれにより何ら制限されるものではない。
【００３１】実施例１（菌の取得） 表２に示す培地を内径２１mmの試験管に１０ml入れ、滅
菌後、岡山県内より採取した土壌、腐葉土、落ち葉、計
３００試料を０．５ｇ〜１ｇそれぞれ添加して３０℃に
て７日間好気的に振とう培養を行った。培養により微生
物の成育が認められたものについては、その培養液を新
たな同培地に接種し集積培養を４回繰り返して行った。
その後、得られた培養液をそれぞれ上記培地に寒天を加
えて作成した寒天培地に撒き、生じたコロニーをタンニ
ン酸含有培地に接種し、これに生育する６２株の微生物
を取得した。これら６２株の培養液についてピロガロー
ルの蓄積量を測定した結果、Ｔ−７−１株が最も高い値
を示した。また、上記培地のタンニン酸の代わりに没食
子酸を添加した培地により、上記６２株を培養し、同様
にピロガロールの蓄積量を測定した結果も、Ｔ−７−１
株が最も高い蓄積を示した。そこで、このＴ−７−１株
を没食子酸並びにピロガロール生産に最も適した菌株と
して取得した。尚、培養液中に含まれる没食子酸、ピロ
ガロールの測定はＨＰＬＣを用い、表３に示す条件によ
り行った。
菌後、岡山県内より採取した土壌、腐葉土、落ち葉、計
３００試料を０．５ｇ〜１ｇそれぞれ添加して３０℃に
て７日間好気的に振とう培養を行った。培養により微生
物の成育が認められたものについては、その培養液を新
たな同培地に接種し集積培養を４回繰り返して行った。
その後、得られた培養液をそれぞれ上記培地に寒天を加
えて作成した寒天培地に撒き、生じたコロニーをタンニ
ン酸含有培地に接種し、これに生育する６２株の微生物
を取得した。これら６２株の培養液についてピロガロー
ルの蓄積量を測定した結果、Ｔ−７−１株が最も高い値
を示した。また、上記培地のタンニン酸の代わりに没食
子酸を添加した培地により、上記６２株を培養し、同様
にピロガロールの蓄積量を測定した結果も、Ｔ−７−１
株が最も高い蓄積を示した。そこで、このＴ−７−１株
を没食子酸並びにピロガロール生産に最も適した菌株と
して取得した。尚、培養液中に含まれる没食子酸、ピロ
ガロールの測定はＨＰＬＣを用い、表３に示す条件によ
り行った。
【００３２】
【表２】
【００３３】
【表３】 ＨＰＬＣによる没食子酸、ピロガロールの測定条件 カラム Ｍ＆Ｓ Pack C-18, 4.6×150mm 溶離液 １０mM KH2PO4-H3PO4(pH2.8)/CH3CN 99:1(v/v) 流速 １．０ml／min 検出 ＵＶ２３０nm 試料注入量 ５マイクロリットル
【００３４】実施例２ Ｔ−７−１株を表４に示す生産培地５０mlを含むフラス
コにて２８℃で２４時間培養した。その後培養液中に含
まれるピロガロールの濃度を測定したところ、２５mM
（３．２ｇ／Ｌ）の生産が確認された。
コにて２８℃で２４時間培養した。その後培養液中に含
まれるピロガロールの濃度を測定したところ、２５mM
（３．２ｇ／Ｌ）の生産が確認された。
【００３５】
【表４】
【００３６】実施例３ 表４の培地において、タンニン酸の代わりに没食子酸を
２０ｇ添加する以外は実施例２と同様にＴ−７−１株を
培養した結果、３０mM（３．８ｇ／Ｌ）のピロガロール
が生産された。また、同様にして４８時間培養した場合
は６０mM（７．６ｇ／Ｌ）のピロガロールが生産され
た。
２０ｇ添加する以外は実施例２と同様にＴ−７−１株を
培養した結果、３０mM（３．８ｇ／Ｌ）のピロガロール
が生産された。また、同様にして４８時間培養した場合
は６０mM（７．６ｇ／Ｌ）のピロガロールが生産され
た。
【００３７】実施例４ 表４のタンニン酸培地４０mlにＴ−７−１株を生育さ
せ、遠心分離により集菌を行い０．１Ｍリン酸カリウム
バッファーに再懸濁し１mlの休止菌体濃縮液を作成し
た。表５に示す組成の反応液を作成し、タンニン酸と反
応させた結果、１時間の反応で１７mM（２．２ｇ／
Ｌ）、２時間の反応で２５mM（３．２ｇ／Ｌ）のピロガ
ロールが生産された。
せ、遠心分離により集菌を行い０．１Ｍリン酸カリウム
バッファーに再懸濁し１mlの休止菌体濃縮液を作成し
た。表５に示す組成の反応液を作成し、タンニン酸と反
応させた結果、１時間の反応で１７mM（２．２ｇ／
Ｌ）、２時間の反応で２５mM（３．２ｇ／Ｌ）のピロガ
ロールが生産された。
【００３８】
【表５】 休止菌体による反応液組成 成 分 添加量 ０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（pH６．０） ０．５ml タンニン酸（１０ｇ／Ｌ） ０．５ml 菌体濃縮液 １．０ml 合 計 ２．０ml
【００３９】実施例５ アスペルギルス由来のタンナーゼ（tannin acylhydrola
se, EC3.1. 1. 20,和光純薬株式会社）を２０Ｕ／ml添
加した以外は実施例４と同様に休止菌体濃縮液を用いて
反応を行わせた結果、１時間の反応で２８mM（３．５ｇ
／Ｌ）のピロガロールが生産された。
se, EC3.1. 1. 20,和光純薬株式会社）を２０Ｕ／ml添
加した以外は実施例４と同様に休止菌体濃縮液を用いて
反応を行わせた結果、１時間の反応で２８mM（３．５ｇ
／Ｌ）のピロガロールが生産された。
【００４０】実施例６ 表６の没食子酸培地中にＴ−７−１株を生育させ、遠心
分離により集菌を行い、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（pH６．０）に懸濁し菌体濃縮液を作成した。表７に示
す反応液を作成し、没食子酸と反応させた結果、１時間
の反応で２０mMのピロガロールの生産が確認された。
分離により集菌を行い、０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液
（pH６．０）に懸濁し菌体濃縮液を作成した。表７に示
す反応液を作成し、没食子酸と反応させた結果、１時間
の反応で２０mMのピロガロールの生産が確認された。
【００４１】
【表６】
【００４２】
【表７】 反応液組成 成 分 添加濃度 アスコルビン酸 ５０mM リン酸カリウム（pH６．０） ２５mM 没食子酸（pH６．０） ２０mM 菌体 ７．０mg 全 量 ２．０ml
【００４３】実施例７ 培地に図１に示す還元剤（アスコルビン酸ナトリウム、
ジチオトレイトール、チオ硫酸ナトリウム、亜ジオチン
酸ナトリウム）を添加する以外は実施例６と同様にして
３０℃、１０分間反応させた。その結果、図１に示すよ
うに、還元剤を添加した場合にピロガロールの生産量が
増大することが判明した。図中の相対活性は、還元剤未
添加の場合を１００％として示した。
ジチオトレイトール、チオ硫酸ナトリウム、亜ジオチン
酸ナトリウム）を添加する以外は実施例６と同様にして
３０℃、１０分間反応させた。その結果、図１に示すよ
うに、還元剤を添加した場合にピロガロールの生産量が
増大することが判明した。図中の相対活性は、還元剤未
添加の場合を１００％として示した。
【００４４】実施例８ 添加した没食子酸の濃度を２５０mMに、菌体量を３５．
３mgとした以外は実施例６と同様にして１時間の反応を
させた結果、２４０mMのピロガロールを生産した。
３mgとした以外は実施例６と同様にして１時間の反応を
させた結果、２４０mMのピロガロールを生産した。
【００４５】実施例９ 供試菌としてP. agglomerans Ｔ−７−１株を用い、表
６に示す培地により２８℃にて７時間培養を行った。そ
の後遠心分離により集菌し、１００mM リン酸カリウム
緩衝液（pH６．０）に再懸濁し、以下に示す条件で還元
剤を添加し、超音波処理による菌体破砕を行った。菌体
破砕後、遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無
細胞抽出液を４℃にて保存し、破砕直後、２４時間、４
８時間後に没食子酸脱炭酸酵素の活性を測定した。その
結果、表８に示すように還元剤を添加することにより本
酵素活性は安定化させることが可能であった。
６に示す培地により２８℃にて７時間培養を行った。そ
の後遠心分離により集菌し、１００mM リン酸カリウム
緩衝液（pH６．０）に再懸濁し、以下に示す条件で還元
剤を添加し、超音波処理による菌体破砕を行った。菌体
破砕後、遠心分離を行い上清を無細胞抽出液とした。無
細胞抽出液を４℃にて保存し、破砕直後、２４時間、４
８時間後に没食子酸脱炭酸酵素の活性を測定した。その
結果、表８に示すように還元剤を添加することにより本
酵素活性は安定化させることが可能であった。
【００４６】
【表８】
【００４７】実施例１０ 実施例９と同様にしてＴ−７−１株を１Ｌの培地で培養
し、５０mMのチオ硫酸ナトリウム、１mMのＤＴＴ存在下
で無細胞抽出液を調製した。以下の工程では全て５０mM
のチオ硫酸ナトリウム、１mMのＤＴＴ存在下、０〜４℃
にて実施した。無細胞抽出液から硫酸アンモニウム沈殿
により、３０〜５０％（飽和）濃度の沈殿画分を活性画
分として取得した。活性画分を集めて１０mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH７．０）に透析し、１０mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH７．０）にて平衡化したDEAE-Sephacel
（ファルマシアバイオテク社）カラム（３．０×３５c
m）に吸着させた。その後、溶離液のリン酸濃度を５０m
Mに上げ、没食子酸脱炭酸酵素活性画分を取得した。再
度、硫酸アンモニウムによる塩析を行い、４５〜６０％
（飽和）沈殿分を活性画分として取得した。活性画分を
集めて１mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に透析
し、同緩衝液で平衡化した１．０×１０cmのヒドロキシ
アパタイトカラム（生化学工業社製）に吸着させ、その
後緩衝液のリン酸濃度を１００mMまで上昇させて溶出を
行い、活性画分を得た。活性画分は２０％飽和硫酸アン
モニウムを含む１００mMのリン酸緩衝液にて平衡化した
１．０×１０cmのブチルトヨパール（東ソー社製）カラ
ムに吸着させ、その後、硫酸アンモニウム濃度を５％ず
つ段階的に低下させ、１０％の飽和硫酸アンモニウム濃
度による溶出で、活性画分を得た。このようにして得ら
れた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により純度検定を行ったところ、単一なバンドのみ
が確認され、純粋な没食子酸脱炭酸酵素を得た。
し、５０mMのチオ硫酸ナトリウム、１mMのＤＴＴ存在下
で無細胞抽出液を調製した。以下の工程では全て５０mM
のチオ硫酸ナトリウム、１mMのＤＴＴ存在下、０〜４℃
にて実施した。無細胞抽出液から硫酸アンモニウム沈殿
により、３０〜５０％（飽和）濃度の沈殿画分を活性画
分として取得した。活性画分を集めて１０mMリン酸カリ
ウム緩衝液（pH７．０）に透析し、１０mMリン酸カリウ
ム緩衝液（pH７．０）にて平衡化したDEAE-Sephacel
（ファルマシアバイオテク社）カラム（３．０×３５c
m）に吸着させた。その後、溶離液のリン酸濃度を５０m
Mに上げ、没食子酸脱炭酸酵素活性画分を取得した。再
度、硫酸アンモニウムによる塩析を行い、４５〜６０％
（飽和）沈殿分を活性画分として取得した。活性画分を
集めて１mMリン酸カリウム緩衝液（pH７．０）に透析
し、同緩衝液で平衡化した１．０×１０cmのヒドロキシ
アパタイトカラム（生化学工業社製）に吸着させ、その
後緩衝液のリン酸濃度を１００mMまで上昇させて溶出を
行い、活性画分を得た。活性画分は２０％飽和硫酸アン
モニウムを含む１００mMのリン酸緩衝液にて平衡化した
１．０×１０cmのブチルトヨパール（東ソー社製）カラ
ムに吸着させ、その後、硫酸アンモニウム濃度を５％ず
つ段階的に低下させ、１０％の飽和硫酸アンモニウム濃
度による溶出で、活性画分を得た。このようにして得ら
れた活性画分をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により純度検定を行ったところ、単一なバンドのみ
が確認され、純粋な没食子酸脱炭酸酵素を得た。
【００４８】
【発明の効果】本発明により、従来精製が困難とされて
いた没食子酸脱炭酸酵素が分離できた。本発明酵素を用
いればピロガロールが効率良く生産できる。
いた没食子酸脱炭酸酵素が分離できた。本発明酵素を用
いればピロガロールが効率良く生産できる。
【図１】本発明酵素を用いてピロガロール生産における
還元剤の添加効果を示す図である。
還元剤の添加効果を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 渡辺 喜久男 埼玉県幸手市権現堂1134−２ 株式会社コ スモ総合研究所研究開発センター内 (72)発明者 長澤 透 岐阜県岐阜市柳戸１−１ 岐阜大学内
Claims (11)
- 【請求項１】 次の酵素学的性質を有する没食子酸脱炭
酸酵素。 （１）作用 没食子酸を脱炭酸しピロガロールを生成する。 （２）作用pH及び至適pH 少なくともpH４．５〜８．５で作用し、至適pHは５．５
〜６．５である。 （３）作用温度及び至適温度 少なくとも２０〜７０℃で作用し、至適温度は５０℃付
近である。 （４）温度安定性 ６０℃までは６０％以上安定であるが、７０℃以上では
失活する（pH６．０で１５分間インキュベート）。 （５）分子量 ＨＰＬＣゲル濾過用カラムを用いた分析による分子量は
４４２ｋＤａであり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動による分析では５８ｋＤａである。 （６）種々の化合物による影響 水銀、銀、銅、クロム又はｐ−クロロメルクリ安息香酸
の添加により強い阻害を受け、キレート剤の添加によっ
て阻害を受ける。 （７）金属の含有 鉄を含有する。 （８）Ｎ末端アミノ酸配列 Ｎ末端アミノ酸配列は、Ser-Asn-Thr-Glu-Asn-Leu-Pro-
Ala-Asn-Asp-Val-Tyr-Asp-Leu-Arg-である。 - 【請求項２】 請求項１記載の没食子酸脱炭酸酵素又は
該没食子酸脱炭酸酵素生産菌を没食子酸に作用させるこ
とを特徴とするピロガロールの製造法。 - 【請求項３】 没食子酸脱炭酸酵素生産菌が、パントエ
ア（Pantoea）属に属するものである請求項２記載の製
造法。 - 【請求項４】 没食子酸脱炭酸酵素生産菌が、パントエ
ア アグロメランスに属するものである請求項２記載の
製造法。 - 【請求項５】 没食子酸脱炭酸酵素生産菌が、パントエ
ア アグロメランスＴ−７−１（ＦＥＲＭ Ｐ−１６３
７５）である請求項２記載の製造法。 - 【請求項６】 没食子酸脱炭酸酵素又は該酵素生産菌
を、還元剤の存在下で没食子酸に作用させるものである
請求項２〜５のいずれか１項記載の製造法。 - 【請求項７】 パントエア属に属するピロガロール生産
菌をタンニン酸又は没食子酸に作用させることを特徴と
するピロガロールの製造法。 - 【請求項８】 原料がタンニン酸の場合、タンナーゼ又
はタンナーゼ生産菌を添加して反応を行う請求項７記載
の製造法。 - 【請求項９】 さらに還元剤を添加して反応を行う請求
項７又は８記載の製造法。 - 【請求項１０】 還元剤を添加することを特徴とする没
食子酸脱炭酸酵素の安定化方法。 - 【請求項１１】 還元剤の存在下で精製することを特徴
とする没食子酸脱炭酸酵素の精製方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9222339A JPH1156358A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | 没食子酸脱炭酸酵素及びピロガロールの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9222339A JPH1156358A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | 没食子酸脱炭酸酵素及びピロガロールの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1156358A true JPH1156358A (ja) | 1999-03-02 |
Family
ID=16780802
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9222339A Pending JPH1156358A (ja) | 1997-08-19 | 1997-08-19 | 没食子酸脱炭酸酵素及びピロガロールの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1156358A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178552A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-12-03 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 一种高产没食子酸脱羧酶(gad)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法 |
-
1997
- 1997-08-19 JP JP9222339A patent/JPH1156358A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104178552A (zh) * | 2014-07-28 | 2014-12-03 | 中国林业科学研究院林产化学工业研究所 | 一种高产没食子酸脱羧酶(gad)菌种筛选及降解没食子酸制备焦性没食子酸的方法 |
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