KR930008972B1

KR930008972B1 - 신균주 슈도모나스속 y-132 및 이로부터 생산되는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제

Info

Publication number: KR930008972B1
Application number: KR1019910015753A
Authority: KR
Inventors: 이주경; 이상훈; 최세하
Original assignee: 영진약품공업 주식회사; 김생기
Priority date: 1991-09-10
Filing date: 1991-09-10
Publication date: 1993-09-17
Also published as: KR930006148A

Abstract

내용 없음.

Description

신균주 슈도모나스속 Y-132 및 이로부터 생산되는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제

제 1 도는 본 발명에 따른 신균주의 효소생산 활성을 황산망간의 농도에 따라 도시한 그래프이고,

제 2 도는 본 발명에 따른 신균주의 효소생산 활성을 티오디글리콜린산의 농도에 따라 도시한 그래프이고,

제 3 도는 본 발명의 따른 신균주의 효소생산 활성을 배양시간의 변화에 따라 도시한 그래프이고,

제 4 도는 본 발명에 따른 신균주로부터 정제한 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제의 이소일렉트릭 포커싱(Isoelectric focusing)사진을 나타낸 것이다.

본 발명의 신균주 슈도모나스(Pseudomonas)속 Y-132 및 이들 영양배지 중에서 호기적으로 배양하여 그 균체로부터 분리해낸 글리타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제(Glutartyl-7-aminocephalosporanic acid acylase)에 관한 것이다.

글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산에 작용하여 7-아미노세팔로스포린산으로 탈아실화시키는 효소이다.

7-아미노세팔로스포린산은 반합성 세팔로스포린 C의 모핵으로 이용되는 중요한 중간체 화합물로서 세파트리진(Cefatrizine), 세포탁심(Cefotaxime), 세포페라존(Cefoperazone)등 세펨계 항생제의 제조에 널리 이용된다.

이러한 7-아미노세팔로스포린산의 제조방법으로는 세팔로스포린 C를 원료로 하여 화학적인 방법으로 제조할 수도 있으나, 반응공정과 조작이 복잡하고 장시간을 요구된다. 더우기 -40℃~-60℃의 저온에서 반응을 해야하며 반응후에도 폐수처리 문제등 여러가지 결점을 갖고 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 효율적이며 간단한 효소를 이용하는 생물학적 방법이 개발되고 있다.

이러한 효소에 대한 연구로는 종래에도 슈도모나스속 SE-495 균주를 이용한 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제의 제조방법(일본특허 소62-48397)이 소개되어 있으나 효소의 역가 등에서, 다소 개선의 여지가 남아 있었다.

따라서, 본 발명의 목적은 종래에 소개되어 있는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제에 비하여 효소의 역가 등이 크게 개선되어 있는 등, 새로운 특성을 가진 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제 효소 및 이 효소를 생산하는 미생물을 제공하는데 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 생산하는 신균주 슈도모나스속 Y-132(기탁번호 : KCTC 0014 BP)인 것이다.

또한, 본 발명은 슈도모나스속 Y-132(기탁번호 : KCTC 0014 BP)를 황산망간 0.0015%, 티오디글리콜린산 0.1%를 함유하는 영양배지에서 배양하고 그 균체로부터 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 회수함을 특징으로 하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제의 제조방법인 것이다.

또한, 본 발명은 슈도모나스속 Y-132(기탁번호 : KCTC 0014 BP)가 생산하는 분자량이 약 56,000달톤이며, 등전점이 5.9인 것을 특징으로 하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제 효소인 것이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.

[신균주의 분리]

토양으로 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 생성하는 균주를 분리하기 위해 희석법을 이용하여 균원시료를 액체배지(배지Ⅰ)에 접종하고 30℃에서 5일간 배양한 후, 생육이 우수한 배양액을 또다시 액체배지(배지Ⅰ)에 이식하여 생육하였다. 이 배양액 0.1ml를 평판배지(배지Ⅱ)에 도말하여 30℃에서 5일간 배양한 후 생성된 집락들을 사면배지(배지Ⅱ)에 이식하여 생육하였다. 이렇게 하여 분리된 균주들을 액체배지(배지Ⅰ)에 접종하여 30℃에서 3일간 배양한 후, 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제에 대한 활성이 가장 높은 균주를 본 발명의 균주로 선정하였다.

효소활성을 측정하기 위해서는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산을 기질로 사용하여 pH9.0, 37℃에서 30분간 반응시킨 뒤, 파라디메틸아미노벤즈알데하이드 용액으로 발색시켜 415nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 효소 1유니트는 1분당 1마이크로몰의 7-아미노세팔로스포린산을 생산하는데 필요한 효소의 양으로 결정하였다.

배지Ⅰ : 효모추출물 0.1%, 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 2.0%, 염화암모늄 0.2%, 염화칼륨 0.05%, 인산제2칼륨 0.1%, 황산마그네슘 0.05%, 황산제1철 0.0005%, 황산아연 0.005%, 탄산칼륨 0.05%, pH 7.0

배지Ⅱ : 펩톤 1.0%, 우육추출물 0.5%, 효모추출물 0.2%, 글루타릴산 0.1%, 염화나트륨 0.5%, pH 7.0

[신균주의 동정]

본 발명에서 선정해낸 균주는 그람염색 음성의 단간균으로서 호기성이며 운동성을 가지고 포자는 존재하지 않았다. 또한 카탈라아제(Catalase)양성, 옥시다아제(Oxidase)양성, 우레아제(Urease)양성을 나타내었다. 이상의 결과를 토대로 호기성 미생물동정 기계장치인 애보트아반테이지 세균동정 기계장치(Abbott Avantage Bacterial Identification System)를 이용하여 동정한 결과, 슈도모나스속 미생물로 판정되었다. 그래서 종래에 알려진 슈도모나스속 SE-495와 미생물학적 특성을 비교한 결과, 다음 표 1과 같이 균학적 성질이 서로 크게 다른 특성을 갖고 있음을 알 수 있다.

따라서, 본 발명자들은 이균주를 신균주로 단정하고, 슈도모나스속 Y-132라고 명명하였으며, 1991년 7월 4일 한국과학기술원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 0014 BP로 기탁하였다.

[표 1] 본 발명의 균주인 슈도모나스 KCTC 0014 BP와 공지균주인 슈도모나스 SE-495와의 미생물학적 성질비교

1. 형태적 특성

2. 배양학적 특성

3. 생물학적 특성

4. 당의 발효성

[효소생산 및 분리]

본 발명의 따른 신균주 슈도모나스속 Y-132는 효모추출물 1.25%, 어육추출물 1.0%, 모노소디움 글루타민산 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 황산망간 0.015% 티오디글리콜린산 0.1%를 증류수에 용해시킨 pH 7.0의 배지에서 30℃의 호기적인 조건으로 배양할 때 최대의 효소생산을 얻을 수 있다.

또한, 균체로부터 효소를 분리해내기 위해서는 통상적인 방법, 예를들면 황산암모늄 침전에 이어 PEAE-Sephacel 이온교환크로마토그라피와 Sephacryl S-200겔 여과크로마토그라피를 실시한다.

이렇게 하여 얻어진 효소인 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 공지의 균주인 슈도모나스속 SE-495로부터 얻어진 효소와 비교해 보면 표 2와 같다.

[표 2] 본 발명에 따른 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제의 효소학적 특성비교

본 발명의 균주로부터 얻어진 효소는 표 2에서 나타난 바와같이 효소의 분자량이 56,000달톤, 등전점이 5.9, 최적 pH 9.0, 최적온도는 37℃인 효소이다.

이하, 본 발명에 대한 실시예를 들어보면 다음과 같다.

[실시예 1]

효모추출물 1.25%, 어육추출물 1%, 모노소디움 글루타민산 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 티오디글리콜린산 0.1%를 함유한 배지에다 각종 금속염을 1mM되게 첨가하고, 여기에다 슈도모나스속 Y-132(KCTC 0014 BP)균주를 30℃에서 3일간 진탕배양한후, 그 효소활성을 측정한 결과 다음 표 3과 같이 나타났다.

금속염들은 대체로 효소생산을 증가시켰으며, 특히 황산망간, 염화망간등은 효소생산을 현저하게 증가시켰다. 가장 효과가 높은 황산망간에 대해 농도별로 효소생산을 측정한 결과는 도면 제 1 도에 나타난 바와 같이 0.015%농도일때 가장 우수하였다.

[표 3] 효소생산에 대한 금속염의 효과

[실시예 2]

효모추출물 1.25%, 어육추출물 1%, 모노소디움 글루타민산 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 황산망간 0.015%를 함유한 배지에다 각종 효소생산을 증가시키기 위해 각종 유도물질을 0.1%되게 첨가하고, 여기에다 슈도모나스속 Y-132(KCTC 0014 BP)균주를 30℃에서 3일간 진탕배양한후, 효소활성을 측정한 결과, 다음 표 4에 나타난 바와같이 0.1%에서 가장 우수하였다.

[표 4] 효소생산에 대한 유도물질들의 효과

[실시예 3]

효모추출물 1.25%, 어육추출물 1%, 모노소디움 글루타민산 0.5%, 염화나트륨 0.25%, 황산망간 0.015%, 티오디글리콜린산 0.1%를 증류수에 용해한 배지(pH 7.0)에다, 슈도모나스속 Y-132(KCTC 0014 BP) 균주를 배양하면서, 그 균주의 생육과 효소의 생산 및 pH변화를 경시적으로 관찰하고, 그 결과를 첨부한 도면 제 3 도에 나타내었다. 이도면에서 보는 바와같이 균의 생육은 배양 50시간까지 증가하여 정지기에 들어갔으며 그 이후부터 서서히 감소하기 시작하였다.

또한, 배지의 pH 변화는 pH 8.5까지 서서히 증가하는 현상을 보였으며 효소생산은 배양 10시간 이후부터 점차 증가하여 50시간 때에 최대활성을 보였으며 이후 활성이 감소하는 현상을 보였다.

[실시예 4]

신균주 슈도모나스속 Y-132(KCTC 0014 BP) 균체로부터 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 분리하기 위해 통상적인 방법인 황산암모늄침전, DEAE-Sephacel 이온교환 크로마토그라피 및 Sephacryl S-200겔 여과크로마토그라피를 실시하였다. 이렇게 하여 정제된 효소에 대해 이소일렉크릭포커싱(Isoelectric focusing)을 실시한 결과 제 4 도에서 보는 바와같이 등전점 5.9에서 단일밴드가 확인되었다.

또한, Sephacryl S-200겔 여과크로마토그라피에 의해 분자량을 측정한 결과 56,000달톤이었다. 참고로 공지의 균지인 슈도모나스속 SE-495로부터 얻은 효소는 등전점이 4.5이고 분자량이 58,000달톤이었다.

Claims

글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제를 생산하는 신균주 슈도모나스속 Y-132(기탁번호 ; KCTC 0014 BP).
슈도모나스속 Y-132(기탁번호 ; KCTC 0014 BP)를 황산망간 0.015%, 티오디글리콜린산 0.1%를 함유하는 영양배지에서 배양하고, 그 균체로부터 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라제를 회수함을 특징으로 하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제의 제조방법.
슈도모나스속 Y-132(기탁번호 ; KCTC 0014 BP)로부터 생산되고, 분자량이 약 56,000달톤이며, 등전점이 5.9인 것을 특징으로 하는 글루타릴-7-아미노세팔로스포린산 아실라아제.