JPH0646939B2 - クリプトコッカス・ラウレンティｄｓｍ２７６２ - Google Patents
クリプトコッカス・ラウレンティｄｓｍ２７６２Info
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- JPH0646939B2 JPH0646939B2 JP3230695A JP23069591A JPH0646939B2 JP H0646939 B2 JPH0646939 B2 JP H0646939B2 JP 3230695 A JP3230695 A JP 3230695A JP 23069591 A JP23069591 A JP 23069591A JP H0646939 B2 JPH0646939 B2 JP H0646939B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
- C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)
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- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
- C12P41/006—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by reactions involving C-N bonds, e.g. nitriles, amides, hydantoins, carbamates, lactames, transamination reactions, or keto group formation from racemic mixtures
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
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- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Description
【０００１】本発明は巾広い基質範囲を有する新規なＬ
−アミノ酸オキシダーゼを生産、単離するのに用いるク
リプトコッカス（Cryptococcus）属の酵母に関する。
−アミノ酸オキシダーゼを生産、単離するのに用いるク
リプトコッカス（Cryptococcus）属の酵母に関する。
【０００２】Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（以下ＬＡＯと
略記する）はクリプトコッカス属の酵母中に誘導しうる
酵素である。それゆえその調製には誘導物質（Induce
r）としてアミノ酸またはアミノ酸を放出する物質を添
加して酵母を発酵させる。本発明の好ましい態様を以下
に詳細に説明する。
略記する）はクリプトコッカス属の酵母中に誘導しうる
酵素である。それゆえその調製には誘導物質（Induce
r）としてアミノ酸またはアミノ酸を放出する物質を添
加して酵母を発酵させる。本発明の好ましい態様を以下
に詳細に説明する。
【０００３】クリプトコッカス属のうちではクリプトコ
ッカス・ラウレンティ（C. laurentii）例えばクリプト
コッカス・ラウレンティ変種マグヌス（magnus）ＣＢＳ
５６９菌株、ならびにクリプトコッカス・アルビドウス
(C. albidus)種が好ましい。
ッカス・ラウレンティ（C. laurentii）例えばクリプト
コッカス・ラウレンティ変種マグヌス（magnus）ＣＢＳ
５６９菌株、ならびにクリプトコッカス・アルビドウス
(C. albidus)種が好ましい。
【０００４】特に好ましいのはクリプトコッカス・ラウ
レンティＤＳＭ２７６２菌株である。この菌株の出発物
質は唯一の窒素源としてＤ−グルタミン酸を含有するミ
ネラル培地中２８℃で数回の工程にわたりそれぞれ２〜
３日間保温培養されたボボジオブラシオ（Bobodiovlass
io）（Upper Volta）地方からの土壌試料であった。こ
れらの液体培養物をＤ−α−アミノアジピン酸エチルア
ミドを唯一の窒素源として含有する培地上で培養した。
さらに接種したのちなかんずくＤＳＭ２７６２菌株を純
粋な培養物として単離した。
レンティＤＳＭ２７６２菌株である。この菌株の出発物
質は唯一の窒素源としてＤ−グルタミン酸を含有するミ
ネラル培地中２８℃で数回の工程にわたりそれぞれ２〜
３日間保温培養されたボボジオブラシオ（Bobodiovlass
io）（Upper Volta）地方からの土壌試料であった。こ
れらの液体培養物をＤ−α−アミノアジピン酸エチルア
ミドを唯一の窒素源として含有する培地上で培養した。
さらに接種したのちなかんずくＤＳＭ２７６２菌株を純
粋な培養物として単離した。
【０００５】この菌株は菌糸体も偽菌糸も形成しない単
細胞の卵形酵母である。増殖は種々の発芽により行われ
る。子のう胞子またはバリスト胞子の存在は検出され得
なかった。凸状の帯白色コロニーは粗くてそして平滑な
縁辺を有する。カロチノイドの形態をした顔料形成は起
らない。酵母澱粉の検出は沃素−沃化カリウムを用いて
行われ、コロニーにおいてもまた液体培養物中において
も検出された。生理学的な研究では葡萄糖、蔗糖、マル
トース、ラフィノース、ガラクトース、乳糖、澱粉、ラ
ムノース、メリビオース、デキストリンおよびイノシト
ールが炭素源として吸収されることが示された。糖の発
酵は起らなかった。硫酸アンモニウム、α−アミノアジ
ピン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、セリン、
トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの窒
素源としての利用は示され得なかった。これに対し硝酸
ナトリウムでの生育は観察されなかった。
細胞の卵形酵母である。増殖は種々の発芽により行われ
る。子のう胞子またはバリスト胞子の存在は検出され得
なかった。凸状の帯白色コロニーは粗くてそして平滑な
縁辺を有する。カロチノイドの形態をした顔料形成は起
らない。酵母澱粉の検出は沃素−沃化カリウムを用いて
行われ、コロニーにおいてもまた液体培養物中において
も検出された。生理学的な研究では葡萄糖、蔗糖、マル
トース、ラフィノース、ガラクトース、乳糖、澱粉、ラ
ムノース、メリビオース、デキストリンおよびイノシト
ールが炭素源として吸収されることが示された。糖の発
酵は起らなかった。硫酸アンモニウム、α−アミノアジ
ピン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン、セリン、
トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラニンの窒
素源としての利用は示され得なかった。これに対し硝酸
ナトリウムでの生育は観察されなかった。
【０００６】ＬＡＯが生育に平行して形成されそして対
数相の終りに向ってその最大活性に達することが見出さ
れた。好ましい誘導物質はＤ−アミノ酸特にＤ−Ｌｅ
ｕ、Ｄ−α−アミノアジピン酸（以下ＤαＡＡＡと略記
する）ならびにＤ−Ａｌａである。見出されたＬＡＯ活
性についての概略を表１に示す。
数相の終りに向ってその最大活性に達することが見出さ
れた。好ましい誘導物質はＤ−アミノ酸特にＤ−Ｌｅ
ｕ、Ｄ−α−アミノアジピン酸（以下ＤαＡＡＡと略記
する）ならびにＤ−Ａｌａである。見出されたＬＡＯ活
性についての概略を表１に示す。
【０００７】
【表１】
【０００８】好ましいＣ−源は溶性澱粉および特に乳糖
および蔗糖である。
および蔗糖である。
【０００９】知られた微生物性Ｌ−アミノ酸オキシダー
ゼと対照的に本発明によるＬＡＯは巾広い基質範囲を有
する。大抵の天然のアミノ酸と並んでＬ−α−アミノア
ジピン酸およびＬ−セファロスポリンＣのような他のア
ミノ酸も相当するα−ケト酸に変換される。しかしなが
らそれらと並んでアミノ酸の誘導体、すなわちそれらの
エステル特に低級アルキルエステルおよびベンジルエス
テル、ならびにエーテルしかもセリンのアルコール基の
エーテルのみならずチロシンのフェノール性ヒドロキシ
基のエーテル、およびシステインのチオエーテルも変換
される。ここでもまた低級アルキルおよびベンジル−エ
ーテルまたは−チオエーテルが好ましい。天然のチオエ
ーテルＬ−メチオニンも同様に変換される。
ゼと対照的に本発明によるＬＡＯは巾広い基質範囲を有
する。大抵の天然のアミノ酸と並んでＬ−α−アミノア
ジピン酸およびＬ−セファロスポリンＣのような他のア
ミノ酸も相当するα−ケト酸に変換される。しかしなが
らそれらと並んでアミノ酸の誘導体、すなわちそれらの
エステル特に低級アルキルエステルおよびベンジルエス
テル、ならびにエーテルしかもセリンのアルコール基の
エーテルのみならずチロシンのフェノール性ヒドロキシ
基のエーテル、およびシステインのチオエーテルも変換
される。ここでもまた低級アルキルおよびベンジル−エ
ーテルまたは−チオエーテルが好ましい。天然のチオエ
ーテルＬ−メチオニンも同様に変換される。
【００１０】すべての反応は厳密に立体特異的である。
Ｌ−形が相当するケト酸またはケト酸誘導体に変換され
る。従って本発明によりラセミ化合物も分割でき、その
場合Ｌ−形がケト誘導体に変換され一方Ｄ−形は未変化
のまま残る。
Ｌ−形が相当するケト酸またはケト酸誘導体に変換され
る。従って本発明によりラセミ化合物も分割でき、その
場合Ｌ−形がケト誘導体に変換され一方Ｄ−形は未変化
のまま残る。
【００１１】Ｌ−アミノ酸の反応は好ましくはpH６.５
〜８.５好ましくは７〜８特に７.５で遂行される。それ
ゆえ適当な緩衝剤は燐酸カリウム緩衝液およびトリス−
ＨＣｌ緩衝液である。
〜８.５好ましくは７〜８特に７.５で遂行される。それ
ゆえ適当な緩衝剤は燐酸カリウム緩衝液およびトリス−
ＨＣｌ緩衝液である。
【００１２】好ましい反応温度は約３０〜６０℃、好都
合には４０〜５５℃特に５０℃である。
合には４０〜５５℃特に５０℃である。
【００１３】ＬＡＯはＬ−α−ＡＡＡに対しKm値０.２
５mMおよびVmax ２mMを有する。
５mMおよびVmax ２mMを有する。
【００１４】本発明によるＬＡＯは高い保存安定性によ
り優れている。これは４℃で数日間そして−１８℃で数
カ月間活性の低下を伴うことなく使用されうる。
り優れている。これは４℃で数日間そして−１８℃で数
カ月間活性の低下を伴うことなく使用されうる。
【００１５】本発明によるＬＡＯは外側の細胞質胞に局
在する。それゆえ透過性となされてない完全な細胞中に
おける酵素活性はセチル−トリメチル−アンモニウムブ
ロマイドで処理された細胞中における場合と同じであ
る。細胞を凍結しそして解凍すると３０〜４０％の活性
増大がひき起される。
在する。それゆえ透過性となされてない完全な細胞中に
おける酵素活性はセチル−トリメチル−アンモニウムブ
ロマイドで処理された細胞中における場合と同じであ
る。細胞を凍結しそして解凍すると３０〜４０％の活性
増大がひき起される。
【００１６】本発明によるＬＡＯは細胞質膜からの濃縮
物として使用されうる。しかしながら特に好ましいのは
固定された細胞の形態における使用である。前記したよ
うに酵素は外側の細胞質膜上に局在するので、細胞を固
定する場合無毒性条件下に保持する必要はない。
物として使用されうる。しかしながら特に好ましいのは
固定された細胞の形態における使用である。前記したよ
うに酵素は外側の細胞質膜上に局在するので、細胞を固
定する場合無毒性条件下に保持する必要はない。
【００１７】より高い安定性および改良された取扱い容
易性なる知られた酵素固定の利点と並んで、全細胞の埋
め込みにおいては酵素の単離および精製が不要である。
易性なる知られた酵素固定の利点と並んで、全細胞の埋
め込みにおいては酵素の単離および精製が不要である。
【００１８】酵素または細胞の固定は知られた方法で天
然または合成の重合体を用いて遂行される（Nachr. Che
m. Tech. Lab. 第２９巻第８５０頁（１９８１年）、西
ドイツ特許公開公報第２,２５２,８１５号、 同第２,３
４３,６３３号、 同第２,４１４,１２８号、 同第２,４２
０,１０２号および同第２,８０５,６０７号参照）。
然または合成の重合体を用いて遂行される（Nachr. Che
m. Tech. Lab. 第２９巻第８５０頁（１９８１年）、西
ドイツ特許公開公報第２,２５２,８１５号、 同第２,３
４３,６３３号、 同第２,４１４,１２８号、 同第２,４２
０,１０２号および同第２,８０５,６０７号参照）。
【００１９】以下の実施例において本発明の特に好まし
い態様を詳細に説明する。
い態様を詳細に説明する。
【００２０】実施例１ 酵母クリプトコッカス・アルビドウス（C. albidus）を
下記固形栄養培地上に保持する。 「栄養肉汁」 ８ｇ 寒 天 １５ｇ 蒸留水 １リットル
下記固形栄養培地上に保持する。 「栄養肉汁」 ８ｇ 寒 天 １５ｇ 蒸留水 １リットル
【００２１】培地を試験管に分配しそして１２１℃で３
０分間滅菌し、次に冷却し、培養物を接種しそして２５
℃で３〜４日間保温培養する。生育した培養物を滅菌食
塩溶液１０mlで洗い流しそして下記組成の培地に加え
る。
０分間滅菌し、次に冷却し、培養物を接種しそして２５
℃で３〜４日間保温培養する。生育した培養物を滅菌食
塩溶液１０mlで洗い流しそして下記組成の培地に加え
る。
【００２２】葡萄糖 １０ｇ Ｄ−α−ＡＡＡ ０.３ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ０.８７５ｇ Ｋ2ＨＰＯ4 ０.１２５ｇ ＮａＣｌ ０.１ｇ ＭｇＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０.５ｇ ＣａＣｌ2・７Ｈ2Ｏ ０.１ｇ 痕跡元素溶液1) １ml ビタミン溶液2) １０ml 蒸留水（pH７.２） １リットル
【００２３】１）痕跡元素溶液： ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.２５ｇ ＮｉＣｌ2・６Ｈ2Ｏ ０.０１ｇ ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ０.０１ｇ ＺｎＣｌ2 ０.１ｇ Ｈ3ＢＯ3 ０.５ｇ Ｎａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏ ０.３ｇ ＮａＳｅＯ3・３Ｈ2Ｏ ０.１ｇ ＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.２ｇ 蒸留水 １リットル （ＨＣｌを用いてpH２〜３に調整）
【００２４】２）ビタミン溶液： ビオチン ０.００１ｇ ビタミンＢ１２ ０.００５ｇ チアミンＨＣｌ ０.０３ ニコチン酸 ０.０３５ ｐ−アミノ安息香酸 ０.０２ ピリドキサール・ＨＣｌ ０.０１ パントテン酸カルシウム ０.０１ ５０％エタノール １リットル
【００２５】この培地５００mlを２リットルのエレンマ
イヤーフラスコ中に入れそして１２１℃で３０分間滅菌
する。
イヤーフラスコ中に入れそして１２１℃で３０分間滅菌
する。
【００２６】１０mlの接種物を接種したフラスコを次に
２８℃および１９０rpmで回転振盪器中に保温培養す
る。７２時間後生育した培養物を収穫し、洗浄しそして
燐酸カリウム緩衝液（pH７.５，５０mM）中にとる。完
全な細胞のＬＡＯ活性を基質としてのＬ−α−ＡＡＡを
用いｏ−フェニレンジアミン−ペルオキシダーゼ依存性
試験において測定すると細胞１ｇ当り１.３４であっ
た。
２８℃および１９０rpmで回転振盪器中に保温培養す
る。７２時間後生育した培養物を収穫し、洗浄しそして
燐酸カリウム緩衝液（pH７.５，５０mM）中にとる。完
全な細胞のＬＡＯ活性を基質としてのＬ−α−ＡＡＡを
用いｏ−フェニレンジアミン−ペルオキシダーゼ依存性
試験において測定すると細胞１ｇ当り１.３４であっ
た。
【００２７】実施例２ クリプトコッカス・ラウレンティ（C. laurentii)ＤＳ
Ｍ２７６２株を実施例１の記載に従い栄養溶液５００ml
中で生育させそして３日後に、同じ培地９リットルを有
するがしかしＤ−α−ＡＡＡの代りにＤ−ロイシンを含
有する１２リットルの発酵器中に移しそして２８℃、４
００rpmおよび通気率毎時４００リットルで保温培養す
る。
Ｍ２７６２株を実施例１の記載に従い栄養溶液５００ml
中で生育させそして３日後に、同じ培地９リットルを有
するがしかしＤ−α−ＡＡＡの代りにＤ−ロイシンを含
有する１２リットルの発酵器中に移しそして２８℃、４
００rpmおよび通気率毎時４００リットルで保温培養す
る。
【００２８】４日後に細胞１ｇ当りＬＡＯ活性３.５Ｕ
が測定された。
が測定された。
【００２９】実施例３ χ−カラゲエニン（Marine Colloids社製、 Rockland, M
aine, USA）の６％溶液を７５℃で溶解させ、４０℃に
冷却しそして生理食塩溶液中のクリプトコッカス細胞の
４％細胞懸濁液と１：１の割合で混合する。この懸濁液
をカニューレから沈殿床（ＣａＣｌ2 １０mM、ＫＣｌ
３００mM）中に注射するとビードが形成される。１時間
撹拌後０.３Ｍ ＫＣｌで３回洗う。カラゲエニンビード
を０.０２％のナトリウムアジドを含有する０.１３Ｍ燐
酸カリウム緩衝液（pH７.５）中４℃で保存する。ビー
ドの活性は触媒の湿った塊１ｇ当り約８０mUであった。
aine, USA）の６％溶液を７５℃で溶解させ、４０℃に
冷却しそして生理食塩溶液中のクリプトコッカス細胞の
４％細胞懸濁液と１：１の割合で混合する。この懸濁液
をカニューレから沈殿床（ＣａＣｌ2 １０mM、ＫＣｌ
３００mM）中に注射するとビードが形成される。１時間
撹拌後０.３Ｍ ＫＣｌで３回洗う。カラゲエニンビード
を０.０２％のナトリウムアジドを含有する０.１３Ｍ燐
酸カリウム緩衝液（pH７.５）中４℃で保存する。ビー
ドの活性は触媒の湿った塊１ｇ当り約８０mUであった。
【００３０】実施例４ ０.１Ｍ燐酸カリウム緩衝液（pH８.０）中に溶解した１
０mMのＬ−フェニルアラニン１０mlを実施例３記載の操
作により固定されたクリプトコッカス・ラウレンティＤ
ＳＭ２７６２細胞４ｇと３７℃で通気しながら反応させ
る。工業上のカタラーゼ（Boehringer社製、 Mannheim）
１０μｌを添加すると生成した過酸化水素が分解されそ
して生成物の品質が損なわれるのを阻止する。基質の消
失および生成物の形成は薄層クロマトグラフィーにより
追跡されうる。生成物の検出は薄層クロマトグラフィー
に２,４−ジニトロフェニルヒドラジンを噴霧すること
により遂行される。同様に、アンモニウムイオンの形成
はニトロプルシッド法により追跡されうる。
０mMのＬ−フェニルアラニン１０mlを実施例３記載の操
作により固定されたクリプトコッカス・ラウレンティＤ
ＳＭ２７６２細胞４ｇと３７℃で通気しながら反応させ
る。工業上のカタラーゼ（Boehringer社製、 Mannheim）
１０μｌを添加すると生成した過酸化水素が分解されそ
して生成物の品質が損なわれるのを阻止する。基質の消
失および生成物の形成は薄層クロマトグラフィーにより
追跡されうる。生成物の検出は薄層クロマトグラフィー
に２,４−ジニトロフェニルヒドラジンを噴霧すること
により遂行される。同様に、アンモニウムイオンの形成
はニトロプルシッド法により追跡されうる。
【００３１】５時間後に出発物質は定量的に反応した。
【００３２】以下の表２および表３に示される結果は実
施例４により得られたものである。基質濃度は別に記載
がなければ４mMである。
施例４により得られたものである。基質濃度は別に記載
がなければ４mMである。
【００３３】
【表２】
【００３４】
【表３】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645） 7804−4Ｂ
Claims (1)
- 【請求項１】 巾広い基質範囲を有するＬ−アミノ酸オ
キシダーゼを生産するクリプトコッカス・ラウレンティ
ＤＳＭ２７６２。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19833333453 DE3333453A1 (de) | 1983-09-16 | 1983-09-16 | L-aminosaeure-oxidase aus hefen der gattung cryptococcus, ihre herstellung und verwendung |
| DE33334536 | 1983-09-16 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190726A Division JPS6087786A (ja) | 1983-09-16 | 1984-09-13 | クリプトコツカス属の酵母からのｌ−アミノ酸オキシダ−ゼ、それらの調製および使用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04365473A JPH04365473A (ja) | 1992-12-17 |
| JPH0646939B2 true JPH0646939B2 (ja) | 1994-06-22 |
Family
ID=6209234
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190726A Granted JPS6087786A (ja) | 1983-09-16 | 1984-09-13 | クリプトコツカス属の酵母からのｌ−アミノ酸オキシダ−ゼ、それらの調製および使用 |
| JP3230695A Expired - Lifetime JPH0646939B2 (ja) | 1983-09-16 | 1991-09-11 | クリプトコッカス・ラウレンティｄｓｍ２７６２ |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190726A Granted JPS6087786A (ja) | 1983-09-16 | 1984-09-13 | クリプトコツカス属の酵母からのｌ−アミノ酸オキシダ−ゼ、それらの調製および使用 |
Country Status (18)
| Country | Link |
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