JPS6120270B2 - - Google Patents
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Description
本発明は、クレアチニンイミノヒドロラーゼを
生産する好気性土壌微生物の増殖のための改善さ
れた水性栄養培地に関する。 クレアチニンイミノヒドロラーゼはクレアチニ
ンをアンモニアに加水分解する酵素である。従つ
て、クレアチニン含有水性液を本酵素と接触させ
てアンモニアを発生させ、発生アンモニアの水準
を検出することにより液中のクレアチニンの存在
及び／又は濃度を測定することができる。従つて
本酵素は臨床研究室に於て重要な役割を果すもの
であり、生物学的液体中のクレアチニン定量用診
断試薬として使用される。 クレアチニンイミノヒドロラーゼ、或いはクレ
アチニンデシミダーダゼ（desimidase）と称さ
れるものは各種微生物から得られている。例えば
J.Szulmajster、J.Bacteriolol、75：633（1958）
及びBiochim Biophys Acta、30：154（1958）に
は、嫌気性グラム陽性微生物クロストリジウムパ
ラブトリフイカム（Clostridium
paraputrificum）から得たクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼの調製について記載されている。クロ
ストリジウムパラプトリフイカム微生物の増殖方
法も記載されている。しかしながら、これらの文
献は嫌気性グラム陽性微生物に限定されており、
開示されている微生物増殖用の醗酵法は長時間を
要するものである。更に増殖した微生物細胞の量
及びそれから抽出される酵素収量は比較的少量で
ある。 米国特許第4087329号及び第4134793号には、ブ
レビバクテリウム（Brevibacterium）、コリネバ
クテリウム（Coryhebacterium）、シユードモナ
ス（Pseudomonas）及びアルスロバクター
（Arthrobacter）属の微生物を含む数種の好気性
微生物源の一種からのクレアチニンデシミダーゼ
の生産について記載されている。これらの特許に
は前記諸属微生物の培養に使用可能な栄養培地の
記載があり、この栄養培地の配合を広範に変え得
ること及び多数の特記された炭素及び窒素源のい
くつか、並びに無機成分及びクレアチニンインデ
ユーサーを含む他の任意の栄養を含むことが可能
であることが述べられている。 クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産する好
気性土壌微生物の増殖及び該微生物からのクレア
チニンイミノヒドロラーゼ収量増加のための改善
方法及び水性栄養培地は、明らかに利点を付加す
るものである。 本発明は、好気条件下で好気性土壌微生物を成
育し、それからクレアチニンイミノヒドロラーゼ
酵素組成を得るための水性栄養培地に関するもの
である。 本発明は、一実施態様として、PH5.0乃至10.0
の好気条件下でクレアチニン含有水性保存培地に
保存された好気性土壌微生物からクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼを生産するための醗酵方法に関
する。本醗酵方法は下記工程からなる。 (a) 微生物の触鮮な試料を保存培地からPH5.0乃
至10.0の微生物増殖培地に移して微生物を増殖
させ、微生物増殖培地が、実質的にクレアチニ
ンを含まず、植物蛋白加水分解物又は非ペプシ
ン性の乳蛋白加水分解物を含む栄養を含有し、
好気条件下で微生物増殖に有効な水性栄養培地
からなること、 (b) 工程(a)で得られた増殖微生物を含有する微生
物増殖培地を、PH5.0乃至10.0の範囲の生産培
地に移して好気条件下で微生物を発生させ、そ
の微生物中でクレアチニンイミノヒドロラーゼ
生産を誘導すること、 (c) 工程(b)で生産された微生物からクレアチニン
イミノヒドロラーゼを抽出すること、 工程(b)の記載の生産培地は、下記のものを含有
する水性栄養培地からなる。 (i) グルコース、又はアミノ基非含有の有機酸で
あるアミノ酸前駆物質、又はグルコースとアミ
ノ酸前駆物質の混合物を含有する炭素源、 (ii) クレアチニン及び好ましくは植物蛋白加水分
解物、又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物、又
は植物蛋白加水分解物と非ペプシン性乳蛋白加
水分解物の混合物も含有する窒素源、 (iii) 微量栄養分及び (iv) 緩衝剤。 好適実施態様として、ATCC31546等の好気性
土壌微生物からウレアーゼ（Urease）を含まぬ
クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産するのに
有用な、本発明の改善された水性栄養培地が知見
されたのである。“ウレアーゼを含まぬ”なる用
語は、酵素が生産される微生物細胞から抽出及び
分離されたままの粗な未精製形態でウレアーゼ作
用を実施的に示さぬことである。ウレアーゼ作用
測定の代表的検定は、後述工程５の“GDH”検
定法を用いて行うことが可能であり、該法にて尿
素をクレアチニンに置き換えるのである。 ATCC31546にて同定する微生物は、この命名
をthe American Type Culture Collection（米
国20852、メリーランド州ロツクビル）への寄託
に基き受けたものである。本微生物は仮にフラボ
バクテリウム（Flavobacterium）属に帰属され
ており、種名フイラメントサム
（filomentosum）が与えられている。本発明は
ATCC31546以外のクレアチニンイミノヒドロラ
ーゼ生産性好気土壌微生物にも使用可能である。
例えば本発明は、米国特許第4087329号及び第
4134793号に記載の属の好気性土壌微生物からク
レアチニンイミノヒドロラーゼを生産することに
も好都合に使用できる。 前記醗酵方法は微生物の良好な増殖を促進する
ものであり、酵素の収量を顕著に改善するもので
ある。これらの非常に有利な諸結果は、本方法に
於て、実質的にクレアチニンを含まず、植物蛋白
加水分解物又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物か
らなる栄養を特徴とする非特定の微生物増殖培地
中にて微生物を増殖し、次にクレアチニンを含む
明確に定義された炭素源及び窒素源を特徴とする
生産培地にて酵素形成を誘導することにより、期
せずして達成されたものである。 一好適実施態様として、少くとも１種の“直
接”アミノ酸前駆物質（以下にて定義）を含有す
る改善された水性栄養培地は本発明の生産培地と
して使用可能であり、培地リツトル当り500単位
以上のクレアチニンイミノヒドロラーゼと云う高
収量を与える。改善された水性栄養物がグルコー
スと直接アミノ酸前駆物質の少くとも１種を含有
する特に好適な実施態様に於ては、本発明はリツ
トル当り650単位以上の高生産収量のクレアチニ
ンイミノヒドロラーゼをもたらすものである。 生産培地 前記(i)〜(iv)の成分を有する水性栄養培地からな
る生産培地の配合に関し、従来の微生物用各種炭
素源を検討した。米国特許第4087329号及び同第
4134793号にて確認された従来炭素源の大多数の
ものは、ATCC31546号好気性微生物からのクレ
アチニンイミノドヒロラーゼの生産にほとんど無
効であつた。例えばグリセリン、スクロース、酢
酸、アスパラギン酸、グルタミン酸及びグリシン
等の炭素源は、少量のクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼしか産出しない微生物細胞を生産する。本
発明の方法にほとんど価値がないとした前記炭素
源のあるものは、微生物細胞の成育には良好であ
るが、生成微生物は所望のクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ酵素をほとんど産出しないのである。 有用であると知見された炭素源には、グルコー
ス及びアミノ基非含有有機酸であるアミノ酸前駆
物質が含まれる。“アミノ酸前駆物質”は、本発
明細書では、アミノ酸の“直接”前駆物質及び
“間接”前駆物質の双方を示す。直接前駆物質と
はアミノ酸から一段階の代謝反応を省略した物質
であり、間接前駆物質はアミノ酸の形成に二代謝
反応段階を必要とする。例えばフマル酸は単一反
応段階にて代謝的にアスパラギン酸に転化し得る
故“直接”アミノ酸前駆物質であり、一方乳酸は
先ず代謝的にピルビン酸（直接アミノ酸前駆物
質）に転化せねばならず、次にそれがアラニンに
代謝転化され得る故“間接”アミノ酸前駆物質で
ある。本発明に於ては、間接アミノ酸前駆物質よ
りも直接アミノ酸前駆物質が好適である。 生産培地の水性栄養培地に使用するアミノ酸前
駆物質は、アミノ基非含有有機酸として更に特徴
づけられる。直接アミノ酸前駆物質として好適な
有機酸の一部を例示すれば、フマル酸、α−ケト
グルタル酸及びピルビン酸が含まれる。間接アミ
ン酸前駆物質として有用な有機酸の一部の例示と
しては、リンゴ酸、乳酸、クエン酸及びコハク酸
が含まれる。 炭素源として用いるグルコース又は前記アミノ
酸前駆物質の量は種々変え得るものである。有用
な量は、水性栄養培地１リツトル当り1.0乃至
20.0グラムの範囲、好ましくは5.0乃至10.0グラ
ム／リツトルであることが知見されている。 特に好適な本発明の実施態様に於ては、生産培
地はグルコース及び／以上のアミノ酸前駆物質を
有する炭素源を含有する。本実施態様は微生物か
らのクレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素の収量
を実質的に増加させ得るものである。本実施態様
に於て、グルコース及び前記アミノ酸前駆物質の
全量を前記の5.0乃至10.0ｇ/の範囲内にし、グ
ルコース対アミノ酸前駆物質の重量比を１：10乃
至１：１の範囲にすることができる。 生産培地の水性栄養培地に用いる窒素源として
は、クレアチニンだけでよい。しかしながら、生
産培地として使用可能な好適栄養培地は、クレア
チニンと植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性乳
蛋白加水分解物の双方を含有する。本好適実施例
様に使用可能な植物蛋白加水分解物及び非ペプシ
ン性乳蛋白加水分解物には、トリプトン
（tryptone：米国ニユージヤージー州ユニオンの
Kraftco Corporation社Scheffield Chemical
Divislonの商品名Hy−Soy等の大豆蛋白加水分解
物）、トリプトンカゼイン加水分解物（米国メリ
ーランド州コツチイスビルのBioquest（BBL）社
製のTrypticasePeptone等）及びプロテアーゼ
カゼイン加水分解物がある。ペプシン性乳蛋白加
水分解物、即ちペプシンにより加水分解された乳
蛋白は、一般に微生物細胞の成長の速度が遅く、
且つ、微生物酵素の生産速度が遅い。 クレアチニン量は、生産培地として用いた水性
栄養培地のリツトル当り、0.5乃至20.0グラムの
範囲であり、4.0乃至12.0グラム／リツトル当
り、0.5乃至20.0グラムの範囲であり、4.0乃至
12.0グラム／リツトルが好適である。植物蛋白加
水分解物及び／又は非ペプシン性乳蛋白加水分解
物は1.0乃至10.0グラム／リツトルの範囲であ
り、1.0乃至5.0グラム／リツトルが好ましい。 生産培地である水性培地に含有される微量栄養
分には水溶性無機塩が含まれる。酵母抽出物が存
在してもよい。これら微量栄養分は、微生物の細
胞を促進し微生物の酵素産出の増加を促進するの
に有効な量が少量添加される。酵母抽出物の有用
量は培地１リツトル当り0.1グラム乃至２グラム
の範囲であり、0.5乃至1.5グラム／リツトルが好
適である。ビタミン類も任意微量栄養分として存
在させてもよい。 微量栄養分として存在し得る水溶性無機塩に
は、リン、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜
鉛、ナトリウムの水溶性塩及び他の水溶性塩が含
まれ、それらの陽イオン成分は元素の周期律表の
第３及び第４周期から選択されることが好まし
い。微量栄養分として数種の無機塩の混合物が存
在することも好ましい。特に有用であると判明し
た無機塩混合物の一つは、下記組成の0.1N HCl
水溶液であり、各表記成分の濃度は水溶液１リツ
トル中に存在する量である。 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ CaCl2・2H2O 0.076ｇ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ MnSO4・H2O 1.7 ｇ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ NaCl 0.6 ｇ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ 生産培地である水性栄養培地は緩衝剤も含有す
る。緩衝剤はリン酸塩緩衝剤のごとくリン含有緩
衝剤であることが好ましい。もつとも他の緩衝剤
も使用可能である。本好適ケースの場合、緩衝剤
は緩衝剤として作用の他に、微生物の微量リン源
としての働きもする。好適リン酸塩緩衝剤はリン
酸水素二カリウム、K2HPO4であり、存在量は3.0
乃至10.0グラム／リツトルの範囲、好ましくは
3.0乃至6.0グラム／リツトルである。 生産培地である水性培地栄養培地のPHは5.0乃
至10.0の範囲をとることができ、6.0乃至7.5が好
ましい。培養液のPHは、KOH又はNaOH、好ま
しくはNaOH等の塩基を添加することにより、容
易に前記範囲内の調節を行うことができる。続い
て前記緩衝剤を存在させることにより、PHをこの
範囲に維持するのである。 生産培地に、当業者には周多の他の任意成分を
含有させることもできる。大規模醗酵器にて微生
物を成育する場合しばしば発泡が生ずるので、発
泡調節剤を培地中に含有させてもよい。斯る発泡
調節剤の一つは、Polyqlycol Ｐ−2000（米国ミ
シガン州ミドランドのDow Chemical社の商品
名）のようなポリグリコールである。この発泡調
節剤は一般に0.5グラム／リツトルまでの量で使
用されるが、更に少い量例えば0.1グラム／リツ
トルでも一般に発泡調節を行うのに十分なことが
判明している。他の発泡調節剤も使用可能であ
り、主な選択基準は、発泡調節の濃度水準で微生
物増殖及び酵素合成を阻害しない或いは最小の影
響しか与えないことである。 酵素生産のための醗酵方法 前記生産培地は、ATCC31546のような好気性
土壌微生物からクレアチニンイミノヒドロラーゼ
を大規模生産するのに好適な醗酵方法の最終工程
に使用すると有利である。 本醗酵方法は、前記生産培地の場合と類似のPH
条件及び好気下に保存培地にて増殖せしめた微生
物試料を用いるものである。従つて塩基好ましく
はNaOH又はKOH（もつとも他の塩基も使用可
能である）を添加することにより、PHを5.0−
10.0、好ましくは6.0−7.5に調節する。保存培地
の温度は15乃至42℃の範囲、好ましくは25乃至30
℃である。 保存培地は、クレアチニンからなる窒素源、好
ましくはアミノ基非含有有機酸である前記アミノ
酸前駆物質の１種以上を含む炭素源、１種以上の
水溶性無機塩及び任意成分として酵母抽出物のよ
うな微量栄養分、及び緩衝剤を含有する水性培地
である。所望ならば他の通常の培地物質、例えば
寒天等も存在させてもよい。 特に有用であると判明した保存培地は下記組成
のものである。 寒 天 20.0ｇ フマル酸（炭素源） 10.0ｇ クレアチニン（窒素源） 5.0ｇ 緩衝剤K2HPO4（無水物） 5.0ｇ 酵母抽出物 1.0ｇ 塩溶液 10.0ml 蒸留水 800.0ml NaOHでPHを6.7に調節し、蒸留水で容量を１
リツトルにする。 塩溶液は0.1NHCl水溶液で下記組成を有し、各
表記成分の濃度は塩溶液１リツトル中に存在する
量である。 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ CaCl2・2H2O 0.076ｇ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ MnSO4・H2O 1.7 ｇ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ NaCl 0.6 ｇ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ 醗酵方法は、微生物の新鮮な試料を保存培地か
ら微生物増殖培地に移して微生物を成育する工程
(a)で始まる。微生物の“新鮮な試料”なる用語
は、保存培地に25℃にて比較的短期間の24乃至72
時間、好ましくは約48時間培地−保存したものを
意味する。それより長時間保存・培地した微生物
試料は、新鮮な微生物試料よりも有用性に於て劣
ることが判明している。 微生物の新鮮な試料を必要時に即時供給するた
め、微生物を凍結乾燥粉末として４乃至25℃の範
囲の温度にて貯蔵し、細胞増殖過程を中断させる
ことも可能である。前記保存培地の凍結乾燥粉末
から、必要時に時を隔てて新しい培養を開始する
ことができる。このようにして醗酵(a)工程の微生
物増殖培地に移すための新鮮な微生物試料を絶え
間なく供給することが可能である。 別法として、液体窒素中にて凍結貯蔵すること
により新鮮な微生物試料を供給することも可能で
ある。 醗酵過程の(a)工程中の微生物増殖培地の組成
は、重要なものではあるが、広範に変えることが
可能である。一般に微生物増殖培地は、微生物の
細胞増殖が最大且つ(b)及び(c)工程の酵素生産が良
好な収量となるように選択される。このことは、
ある種の通常の非特定栄養培地を工程(a)の微生物
増殖培地として、使用することにより達成され
る。（もつとも(b)工程の生産培地には、明確に定
義された炭素源と特定の窒素源が使用される。）
工程(a)並びに工程(b)の使用によりもたらされた有
益な結果は予期されたものでなく、ましてや予見
できるものではなかつた。即ち当業者と云えど
も、非構成的に酵素を生産する微生物（即ち所望
酵素の基質又は基質同族体を含有する培養液中で
の成長により、その内部で所望酵素の生産をする
微生物）が、醗酵過程を通じて、特定配合の明確
に定義された栄養培地を使用することなく、酵素
を最適収量にて生産するであろうと予見すること
は不可能だつたであろう。従つて、ATCC31546
等の好気性土壌微生物に関する本醗酵方法が、保
存培地と生産培地の双方に於ける栄養としてクレ
アチニンを使用し、工程(a)の微生物成育培養液に
クレアチニンを使用せずして改善された結果をも
たらすことは予期せず知見されたことである。 前記の特性は有利なことである。これは、通常
“複合”培地と称されるある種の非特定の商業的
に入手可能な予備・配合栄養培地から微生物増殖
培地を配合することを可能とする。この“複合”
培地は、通常、植物、牛乳、肉又は魚の栄養源か
ら得られる微生物栄養の複合混合物を含むため、
そのように命名されたものである。従つてこの培
地は典型的には窒素源として植物、牛乳、魚又は
肉の蛋白質を含有し、且つ、各種の他の無機塩及
び栄養源から抽出されたビタミン栄養を含有す
る。この複合培養液には、糖質等の補足的炭素源
並びに他の補足的ビタミン及び鉱物栄養が存在し
てもよい。本発明の微生物増殖培地として良好な
結果をもたらすこの複合培地は、植物又は牛乳の
栄養源からもたらされたものであり、植物蛋白加
水分解物は非ペプシン性乳蛋白加水分解物を含有
している。 従つて、この微生物増殖培地の主要な特性は、
実質的にクレアチニンを含有せず、植物蛋白加水
分解物及び／又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物
を含む栄養を含有することである。 微生物増殖培地のPH条件は保存培地のそれと同
様である。別の緩衝剤又は別の塩基を使用するこ
となく、非特定栄養培地を使用することにより、
所望のPH範囲を得ることができる。例えば前記の
複合培地の場合、該複合培地の製造時にしばしば
緩衝剤を培地中に添加して好適PH範囲の6.0乃至
7.0に維持しているのである。 増殖培地中での微生物の温度条件は変化させ得
るものである。一般に工程(a)に於ける増殖培地で
の細胞増殖には20゜乃至37℃の範囲の温度が良好
であり、25゜乃至30℃が好適である。 醗酵過程の(a)工程にて微生物増殖培地に移され
る微生物試料は、この増殖培地内に於て、微生物
細胞が溶菌（lysis即ち破裂）することなく細胞
増殖が最大となるのに有効な期間培養される。こ
の時間は培地の組成並びに増殖培地に移された細
胞数により変り得るものである。トリプ−ソイブ
ロス（Tryp−Soy Broth：米国ロードアイラン
ド州フイスケビルのScott Laboratories製）等の
植物蛋白加水分解から構成される好適微生物増殖
培養物の場合、25mlの微生物増殖培地を含有する
フラスコに微生物試料を接種したときの期間は約
５乃至11時間であり、７−９時間が好適である。 工程(a)では、微生物の細胞増殖を最大にするの
に十分な酸素を供給する必要がある。最適酸素量
の決定は、ある所与容量の微生物増殖培地に関
し、数点の空気酸素流量と（培地の）撹拌速度に
て細胞増殖を監視し、細胞増殖が最大となる点以
上の空気流速と撹拌速度を選択することにより、
容易に可能である。 工程(a)で微生物が成長を終えた後、増殖細胞を
含む微生物増殖培地を工程(b)にて生産培地に移
す。 工程(b)に於て、増殖細胞を含む全微生物増殖培
地を生産培地に移すことができる。この微生物増
殖培地（即ち微生物増殖培地及びその中に含有さ
れる増殖細胞）は生産培地への接種物となる。 生産培地を醗酵器に収納する。斯る醗酵器の容
量は少くとも25リツトルであり、代表的には150
リツトル乃至200000リツトルである。最終生産醗
酵器の大きさに応じて工程(a)で発生した増殖細胞
を含有する微生物増殖培地の調製を数段階で行
い、最終生産醗酵器用接種物として役立つ十分量
の微生物増殖培地を得ることができる。 例えば最終生産醗酵器の容量が約150リツトル
のとき、工程(a)を二段階行うのが有利である。各
段階で微生物増殖培地中の微生物細胞増殖を最大
にし、生産培養物（培地と増殖細胞の双方を含
有）を工程(a)の次の段階の接種物として新たな、
一般により大なる微生物増殖培地バツチに導入使
用するのである。 最終生産規模醗酵器が150リツトルより大なる
場合、工程(a)を二段階以上にて行い工程(b)の最終
生産規模醗酵器への導入に十分量の微生物増殖培
養物を得ることができる。代表的には、工程(a)の
最終段階で生産した微生物増殖培養物の容量と工
程(b)で用いる生産培地の容量の比は、１：50乃至
１：５の範囲内である。 本発明の醗酵過程で用いる生産培地の組成は、
本明細書の“生産培地”の節で記載した通りであ
る。同様に生産培地の微生物の培養時に維持され
るPH条件も“生産培地”の節にて記載したものと
同一である。微生物による酵素生産を最大に維持
するための十分な酸素も重要である。これは、所
与容量の生産培地に関して、酸素又は空気流量並
びに培地の撹拌速度が工程(b)の範囲で変化すると
き、工程(c)にて抽出される酵素の量がどう変化す
るかを監視することにより容易に決定できる。次
に、生産される酵素量が最大になる点以上の酸素
又は空気速度及び撹拌速度を選択するのである。
工程(b)の微生物培養時間は、生産培地の特定組
成、酸素輸送速度、温度その他の条件に応じて変
化する。150リツトル生産規模醗酵器の場合の代
表的培養時間は、10乃至14時間の範囲内である。
前記のごとく抗発泡剤を生産培地に添加すること
は可能であり、あるいはそれらを多段醗酵過程の
比較的早い段階で微生物増殖培地に添加すること
もできる。 本発明醗酵方法の生産培地中で成育させた
ATCC31546等好気性土壌微生物を一般に妥当な
温度範囲にて成育し、クレアチニンイミノヒドロ
ラーゼ酵素を良好な収量にて生産することが可能
である。20゜乃至37℃の範囲の温度にて良好な結
果を得ることができる。25゜乃至30℃の温度だと
最良の結果が達成された。 工程(b)の完了に引続き、所望のウレアーゼ非含
有クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素を微生物
細胞から抽出する。これは、細胞を音波、粉砕等
で砕く従来法により行うことができ、所望酵素を
培地から、有機溶剤による分別沈澱その他の酵素
分離常法及び精製技術により分離するのである。 以下の実施例制限的なものでなく、本発明を更
に説明するためのものである。実施例では以下の
物質または材料を用いた。 物質： １ 微生物−好気性土壌別生物ATCC31546 ２ 培地No.1 寒 天 20.0ｇ/ フマル酸（炭素源） 10.0ｇ/ クレアチニン（窒素源） 5.0ｇ/ K2HPO4（無水物） 5.0ｇ/ 酵母抽出物 1.0ｇ/ 変性塩溶液Ｃ 10.0ml 蒸留水 800.0ml KOHでPHを6.7に調節し、蒸留水で本培地を
１リツトルにした。 変性塩溶液Ｃの組成 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ/ CaCl2・2H2O 0.076ｇ/ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ/ MnSO4・H2O 1.7 ｇ/ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ/ NaCl 0.6 ｇ/ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ/ 0.1NHClで１リツトルにした。 ３ 培地No.2 寒天を加えなかつた以外は培地No.1と同一
組成。 ４ 培地No.3 リツトル当りポリグリコール0.1ｇ（米国ミ
シガン州ミドランドのDow Chemical社製品
Poly qlycal Ｐ−2000）を加えた以外は培地
No.2と同一組成。 ５ 培地No.4−培養物純度試験用培地 グルコース 10.0ｇ/ 酵母抽出物 10.0ｇ/ リン酸カリウム（二塩基性） 1.0ｇ/ 塩溶液Ａ−１ 2.0ml/ 塩溶液Ａ−２ 2.0ml/ 寒 天 20.0ｇ/ PHを7.0に調節し、蒸留水で１リツトルにし
た。 塩溶液Ａ−１： MgSO4・7H2O 100.0ｇ/ FeSO4・7H2O 10.0ｇ/ MnSO4・H2O 1.0ｇ/ NaMoO4・2H2O 0.5ｇ/ 0.1NHClで１リツトルにした。 塩溶液Ａ−２： CaCl2 10.0ｇ/ 蒸留水 1.0にする。 ６ 薬品：酵母はデイフコ ラボラトリーズ社
（Difco Laboratories 米国ミシガン州デトロ
イト）の製品；寒天はメドツクス ケミカル社
（Medox Chemical カナダ国オンタリオ州オ
ツタワ）製；Ｌ−グルタミンデヒドロゲナー
ゼ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝剤（tris）、Ｎ・Ｎ−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）グリシン（bicine）、卵白リゾチー
ム、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン
酸塩の還元形（NADPH）、リボヌクレアーゼ
及び牛のすい臓からのデオキシリボヌクレアー
ゼはシグマケミカルズ社（Siqma Chemicals
米国ミズーリ州セントルイス）製。イーストマ
ンオーガニツクケミカルズ社（Eastman
Organic Chemicals米国ニユーヨーク州ロチエ
スター）は有機化学薬品の供給元であり、他の
薬品はすべて分析級の市販品であつた。 本例に於いては以下の操作を用いた。 操 作 １ 培養物の維持・保存 微生物ATCC31546培養物をトリプーソイプ
ロス中で30℃10時間増殖させて保存した。次に
細胞を無菌状態で分離し、無菌の10％グリセリ
ン水溶液中にアレン（Allen）の塩溶液
（Allen、M.N.、Archive of Aikrobiology、第
32巻第270−277頁（1959年）で再懸濁した。
0.5−2.0mlの少量の本培養物を無菌のガラスア
ンプルに加え、密封後液体窒素中に貯蔵した。
微生物試料が要るときはアンプル中の培養物を
解かして内容物を無菌状態でトリプーソイブロ
スに移し、30℃で10時間成育させた。本培養物
をループ一杯、無起状態で培地No.1の斜面に
移し30℃で培養した。 ２ 小規模酸素生産 手順１に前記のように培養物を培地No.1斜
面上で２日間成育さて新鮮試料を得た。この斜
面から培養物をループ一杯、本発明にて使用す
る型の微生物増培地25ml（250mlのエルレンマ
イヤーフラスコに収容）に接種した。使用した
微生物増殖培地はトリプーソイブロスからなる
ものであつた。培養物をエルレンマイヤーフラ
スコに接種後、該フラスコを200rpm、30℃に
て８時間振とうすると細胞は良好に増殖し微生
物細胞の崩壊は起らなかつた。その後フラスコ
内容物試料の培養物純度を顕微鏡で検査し、次
に冷凍遠心分離器にて15000×ｇで無菌的に遠
心分離して細胞とトリプーソイ ブロスを分離
した。トリプーソイ ブロスを含む上澄液を捨
て、沈澱微生物細胞を含む固体物質を遠心分離
前に存在した量の無菌蒸留水中に再懸濁させ
た。次にこの懸濁物２mlを、生産培養液25ml含
有の250mlエルレンマイヤーフラスコの接種物
として使用し、微生物による酵素生産を促進し
た。この生産培養物の特定組成は下記諸例に記
載のように変化させた。しかし各ケース共、微
生物を２mlの接種物としていつたんそれぞれの
生産培地含有フラスコに移したあとは、みな30
℃、200rpmで10時間フラスコを振とうした。
そのあと培養物試料を取り出して稀釈し、乾燥
細胞の重量を測定した。更に、該培養物の一部
分2.5mlを冷凍遠心分離にて15000×ｇで遠心分
離して細胞と生産培地を分離した。生産培地を
含む上澄液は廃棄した。沈澱細胞を下記操作４
のごとく粉砕して下記操作５記載のごとく酵素
活性を検定した。 ３ 大規模酵素生産 方法２と同一工程を経たあと、ATCC31546
培養物を培地No.1斜面にて２日間増殖した新
鮮試料を微生物増殖培地25ml（250mlエルレン
マイヤーフラスコ中に収容）に移した。微生物
増殖培地は操作２記載のものと同一であつた。
微生物増殖培地中での接種物増殖の第一段階
は、該フラスコを200rpm、25℃にて12時間振
とうすることにより行つた。そのあとフラスコ
内容物試料の培地物純度を顕微鏡で検査した。
次に微生物増殖培地中での接種物増殖の第二段
階に於て、第一段階培養物を含む２個の250ml
エルレンマイヤーフラスコの内容物を無菌状態
で14リツトルの醗酵器に移した。該醗酵器は操
作２記載の組成及び0.01重量％のポリグリコー
ルＰ−2000を有する無菌の微生物増殖培地10リ
ツトルを含有したものである。接種物成育の第
二段階に於て、14リツトル醗酵器を、温度25℃
に維持しながら1300rpmで12時間撹拌した。こ
の間醗酵器に5.5リツトル／分の空気流を通し
て適当な酸素供給を継続した。こうして150リ
ツトル醗酵器用の接種物として十分量の細胞が
得られた。14リツトル醗酵器の内容物を無菌的
に150リツトル醗酵器に移した。該醗酵器には
予め以下の諸例に記載する夫々の組成の無菌生
産培地100を仕込んでおいた。その後150リツ
トル醗酵器の内容物250rpmで12時間撹拌し
た。この間46リツトル／分の空気流を醗酵器に
通し、溶解酵素濃度及びPHを12時間連続して監
視した。１時間毎に醗酵器から試料を抜き取り
乾燥細胞重量を測定した。更に１時間毎に醗酵
器から一部分2.5mlを抜き取り、操作２記載の
ごとく処理して細胞を分離した。次に細胞を粉
砕し操作４及び５記載のごとく検定した。 ４ 前記操作２及び３と以下の諸例に於て細胞粉
砕を行つた。0.05Mトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（tris）の緩衝剤、PH8.5及び
10-3M（エチレンジニトリロ）、四酢酸二カリ
ウム塩（K2EDTA）の溶液1.4mlに、酵素溶液
0.2ml及び細胞懸濁物0.4mlを添加した。前記酵
素溶液は脱イオン水１ml当りリゾチーム2.5
mg、牛すい臓のデオキシリボヌクレアーゼ１mg
及び牛すい臓のリボヌクレアーゼ１mgを含有す
るものであつた。細胞懸濁物の量は最終光学密
度が約1.0になるよう調節し、tris緩衝液で最終
容量を2.0mlにした。該懸濁物を水浴中37℃で
20分間振とうした。冷凍遠心分離器にて27000
×ｇで遠心して細胞デブリス（debris）を除去
し、上澄液の酵素活性検定を下記操作５記載の
ごとく行つた。 ５ クレアチニン イミノヒドロラーゼの検定 諸例記載のクレアチニンイミノヒドロラーゼ
活性を測定するため、Ｌ−グルタミンデヒドロ
ゲナーゼ、“GDH”検定法を用いた。GDH検定
法では、以下のごとくGDH−触媒反応に
NADPH（ニコチナミド−アデニジヌクレオチ
ドリン酸塩）を用いて、クレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ酵素組成物の活性を表わすクレアチ
ニンからのアンモニア生産を測定する。クレア
チニンをクレアチニンイミノヒドロラーゼ試料
の未知作用を介してアンモニアに加水分解し、
触媒のGDHの存在下にアンモニアをα−ケト
グルタル酸試薬と反応させてグルタミン酸を生
産する。GDHを触媒とする後者の反応は
NADPH酸化反応（NADPH→NADP）を用いる
ものであり、340nｍでのNADPH吸収ピークの
消失が検定を監視する光学検出手段となる。す
なわちNADPH消失速度がグルタミン酸生産速
度を与え、これがアンモニア生産速度を与え
る。GDH検定法で使用する反応混合物は、全
容量１ミリリツトル中にPH7.6の0.1M Ｎ・Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン−
KOH緩衝溶液、（エチレンジニトリロ）四酢酸
二ナトリウム塩（Na2−EDTA）0.4mg、α−ケ
トグルタル酸1.6mg、NADPH0.24mg、GDH（ア
ンモニア非含有）15単位及びクリアチニン4.52
mgを含むものであつた。GDH活性の一単位と
は、PH7.6及び37℃に於て１分間にα−ケトグ
ルタル酸１μモルをグルタミン酸塩に還元する
触媒作用の酵素量と定義されるものである。反
応は、前記反応混合物が37℃で平衝に達した後
所望クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素組成
物の少量試料（約２−10ミリ単位）を添加する
ことにより、該反応混合物内で始まる。クレア
チニンイミノヒドロラーゼ活性は、スペクトロ
ホトメーターで340nｍ（NADPHの340nｍに於
ける分子消失係数は6.22×103）に於ける
NADPHの消失速度を測定して計算される。酵
素活性の一単位とは、前記GDH検定反応条件
下で、１分間にクレアチニン１μモルがアンモ
ニア１μモルに転化する触媒作用に必要な酵素
量と定義されるものである。 実施例 １ 微生物増殖培地 本実施例は、本発明の醗酵方法に有用な微生物
増殖培地を決定するための試験結果を報ずるもの
である。本発明で用いる方法では第表に示すよ
うに各種微生物増殖培地及び生産培地として前記
の培地No.2を使用する。培地No.2は植物蛋白加
水分解物又は非ペプシン性の牛乳蛋白加水分解を
含まず、本発明の改善された水性栄養培地ではな
い。本実施例で用いる方法の操作は以下の通りで
ある。 試験すべき培地を各25ml含むフラスコに、培地
No.1斜面にて30℃18時間成長させた培養物をル
ープ一杯接種した。各フラスコの細胞成長を測定
し、培地リツトル当りの乾燥細胞重量として第
表に記した。第表の第一欄に示すように、培養
物はトリブーソイブロス、マイクロ イノキユラ
ム ブロス（Micro Inoculum Broth）及び培地
No.2中で良好に増殖した。次に生産培地として
培地No.255mlを含むフラスコに、試験する各微
生物増殖培地の懸濁物２mlを接種した。第表に
示すように、トリプーソイ ブロス及びマイクロ
イノキユラム ブロスから得た培地物接種のフ
ラスコのものが、生産培地中の増殖が良好であり
酵素生産が優れていた。培地No.2の培養物接種
のフラスコのものは細胞増殖は良好であつたが、
酵素生産の水準は高くなかつた。サブラウド デ
キストラーゼ ブロス（Sabouraud Dextrose
Broth）及びニユートリエンス ブロス
（Nutrient Broth）で接種したフラスコのものの
結果は悪かつた。サブラウドデキストラーゼ ブ
ロスは細胞増殖が不良で酵素生産はほとんどな
く、ニユートリエントブロスでは若干酵素は生産
されたが細胞増殖が不良であつた。
生産する好気性土壌微生物の増殖のための改善さ
れた水性栄養培地に関する。 クレアチニンイミノヒドロラーゼはクレアチニ
ンをアンモニアに加水分解する酵素である。従つ
て、クレアチニン含有水性液を本酵素と接触させ
てアンモニアを発生させ、発生アンモニアの水準
を検出することにより液中のクレアチニンの存在
及び／又は濃度を測定することができる。従つて
本酵素は臨床研究室に於て重要な役割を果すもの
であり、生物学的液体中のクレアチニン定量用診
断試薬として使用される。 クレアチニンイミノヒドロラーゼ、或いはクレ
アチニンデシミダーダゼ（desimidase）と称さ
れるものは各種微生物から得られている。例えば
J.Szulmajster、J.Bacteriolol、75：633（1958）
及びBiochim Biophys Acta、30：154（1958）に
は、嫌気性グラム陽性微生物クロストリジウムパ
ラブトリフイカム（Clostridium
paraputrificum）から得たクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼの調製について記載されている。クロ
ストリジウムパラプトリフイカム微生物の増殖方
法も記載されている。しかしながら、これらの文
献は嫌気性グラム陽性微生物に限定されており、
開示されている微生物増殖用の醗酵法は長時間を
要するものである。更に増殖した微生物細胞の量
及びそれから抽出される酵素収量は比較的少量で
ある。 米国特許第4087329号及び第4134793号には、ブ
レビバクテリウム（Brevibacterium）、コリネバ
クテリウム（Coryhebacterium）、シユードモナ
ス（Pseudomonas）及びアルスロバクター
（Arthrobacter）属の微生物を含む数種の好気性
微生物源の一種からのクレアチニンデシミダーゼ
の生産について記載されている。これらの特許に
は前記諸属微生物の培養に使用可能な栄養培地の
記載があり、この栄養培地の配合を広範に変え得
ること及び多数の特記された炭素及び窒素源のい
くつか、並びに無機成分及びクレアチニンインデ
ユーサーを含む他の任意の栄養を含むことが可能
であることが述べられている。 クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産する好
気性土壌微生物の増殖及び該微生物からのクレア
チニンイミノヒドロラーゼ収量増加のための改善
方法及び水性栄養培地は、明らかに利点を付加す
るものである。 本発明は、好気条件下で好気性土壌微生物を成
育し、それからクレアチニンイミノヒドロラーゼ
酵素組成を得るための水性栄養培地に関するもの
である。 本発明は、一実施態様として、PH5.0乃至10.0
の好気条件下でクレアチニン含有水性保存培地に
保存された好気性土壌微生物からクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼを生産するための醗酵方法に関
する。本醗酵方法は下記工程からなる。 (a) 微生物の触鮮な試料を保存培地からPH5.0乃
至10.0の微生物増殖培地に移して微生物を増殖
させ、微生物増殖培地が、実質的にクレアチニ
ンを含まず、植物蛋白加水分解物又は非ペプシ
ン性の乳蛋白加水分解物を含む栄養を含有し、
好気条件下で微生物増殖に有効な水性栄養培地
からなること、 (b) 工程(a)で得られた増殖微生物を含有する微生
物増殖培地を、PH5.0乃至10.0の範囲の生産培
地に移して好気条件下で微生物を発生させ、そ
の微生物中でクレアチニンイミノヒドロラーゼ
生産を誘導すること、 (c) 工程(b)で生産された微生物からクレアチニン
イミノヒドロラーゼを抽出すること、 工程(b)の記載の生産培地は、下記のものを含有
する水性栄養培地からなる。 (i) グルコース、又はアミノ基非含有の有機酸で
あるアミノ酸前駆物質、又はグルコースとアミ
ノ酸前駆物質の混合物を含有する炭素源、 (ii) クレアチニン及び好ましくは植物蛋白加水分
解物、又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物、又
は植物蛋白加水分解物と非ペプシン性乳蛋白加
水分解物の混合物も含有する窒素源、 (iii) 微量栄養分及び (iv) 緩衝剤。 好適実施態様として、ATCC31546等の好気性
土壌微生物からウレアーゼ（Urease）を含まぬ
クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産するのに
有用な、本発明の改善された水性栄養培地が知見
されたのである。“ウレアーゼを含まぬ”なる用
語は、酵素が生産される微生物細胞から抽出及び
分離されたままの粗な未精製形態でウレアーゼ作
用を実施的に示さぬことである。ウレアーゼ作用
測定の代表的検定は、後述工程５の“GDH”検
定法を用いて行うことが可能であり、該法にて尿
素をクレアチニンに置き換えるのである。 ATCC31546にて同定する微生物は、この命名
をthe American Type Culture Collection（米
国20852、メリーランド州ロツクビル）への寄託
に基き受けたものである。本微生物は仮にフラボ
バクテリウム（Flavobacterium）属に帰属され
ており、種名フイラメントサム
（filomentosum）が与えられている。本発明は
ATCC31546以外のクレアチニンイミノヒドロラ
ーゼ生産性好気土壌微生物にも使用可能である。
例えば本発明は、米国特許第4087329号及び第
4134793号に記載の属の好気性土壌微生物からク
レアチニンイミノヒドロラーゼを生産することに
も好都合に使用できる。 前記醗酵方法は微生物の良好な増殖を促進する
ものであり、酵素の収量を顕著に改善するもので
ある。これらの非常に有利な諸結果は、本方法に
於て、実質的にクレアチニンを含まず、植物蛋白
加水分解物又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物か
らなる栄養を特徴とする非特定の微生物増殖培地
中にて微生物を増殖し、次にクレアチニンを含む
明確に定義された炭素源及び窒素源を特徴とする
生産培地にて酵素形成を誘導することにより、期
せずして達成されたものである。 一好適実施態様として、少くとも１種の“直
接”アミノ酸前駆物質（以下にて定義）を含有す
る改善された水性栄養培地は本発明の生産培地と
して使用可能であり、培地リツトル当り500単位
以上のクレアチニンイミノヒドロラーゼと云う高
収量を与える。改善された水性栄養物がグルコー
スと直接アミノ酸前駆物質の少くとも１種を含有
する特に好適な実施態様に於ては、本発明はリツ
トル当り650単位以上の高生産収量のクレアチニ
ンイミノヒドロラーゼをもたらすものである。 生産培地 前記(i)〜(iv)の成分を有する水性栄養培地からな
る生産培地の配合に関し、従来の微生物用各種炭
素源を検討した。米国特許第4087329号及び同第
4134793号にて確認された従来炭素源の大多数の
ものは、ATCC31546号好気性微生物からのクレ
アチニンイミノドヒロラーゼの生産にほとんど無
効であつた。例えばグリセリン、スクロース、酢
酸、アスパラギン酸、グルタミン酸及びグリシン
等の炭素源は、少量のクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼしか産出しない微生物細胞を生産する。本
発明の方法にほとんど価値がないとした前記炭素
源のあるものは、微生物細胞の成育には良好であ
るが、生成微生物は所望のクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ酵素をほとんど産出しないのである。 有用であると知見された炭素源には、グルコー
ス及びアミノ基非含有有機酸であるアミノ酸前駆
物質が含まれる。“アミノ酸前駆物質”は、本発
明細書では、アミノ酸の“直接”前駆物質及び
“間接”前駆物質の双方を示す。直接前駆物質と
はアミノ酸から一段階の代謝反応を省略した物質
であり、間接前駆物質はアミノ酸の形成に二代謝
反応段階を必要とする。例えばフマル酸は単一反
応段階にて代謝的にアスパラギン酸に転化し得る
故“直接”アミノ酸前駆物質であり、一方乳酸は
先ず代謝的にピルビン酸（直接アミノ酸前駆物
質）に転化せねばならず、次にそれがアラニンに
代謝転化され得る故“間接”アミノ酸前駆物質で
ある。本発明に於ては、間接アミノ酸前駆物質よ
りも直接アミノ酸前駆物質が好適である。 生産培地の水性栄養培地に使用するアミノ酸前
駆物質は、アミノ基非含有有機酸として更に特徴
づけられる。直接アミノ酸前駆物質として好適な
有機酸の一部を例示すれば、フマル酸、α−ケト
グルタル酸及びピルビン酸が含まれる。間接アミ
ン酸前駆物質として有用な有機酸の一部の例示と
しては、リンゴ酸、乳酸、クエン酸及びコハク酸
が含まれる。 炭素源として用いるグルコース又は前記アミノ
酸前駆物質の量は種々変え得るものである。有用
な量は、水性栄養培地１リツトル当り1.0乃至
20.0グラムの範囲、好ましくは5.0乃至10.0グラ
ム／リツトルであることが知見されている。 特に好適な本発明の実施態様に於ては、生産培
地はグルコース及び／以上のアミノ酸前駆物質を
有する炭素源を含有する。本実施態様は微生物か
らのクレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素の収量
を実質的に増加させ得るものである。本実施態様
に於て、グルコース及び前記アミノ酸前駆物質の
全量を前記の5.0乃至10.0ｇ/の範囲内にし、グ
ルコース対アミノ酸前駆物質の重量比を１：10乃
至１：１の範囲にすることができる。 生産培地の水性栄養培地に用いる窒素源として
は、クレアチニンだけでよい。しかしながら、生
産培地として使用可能な好適栄養培地は、クレア
チニンと植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性乳
蛋白加水分解物の双方を含有する。本好適実施例
様に使用可能な植物蛋白加水分解物及び非ペプシ
ン性乳蛋白加水分解物には、トリプトン
（tryptone：米国ニユージヤージー州ユニオンの
Kraftco Corporation社Scheffield Chemical
Divislonの商品名Hy−Soy等の大豆蛋白加水分解
物）、トリプトンカゼイン加水分解物（米国メリ
ーランド州コツチイスビルのBioquest（BBL）社
製のTrypticasePeptone等）及びプロテアーゼ
カゼイン加水分解物がある。ペプシン性乳蛋白加
水分解物、即ちペプシンにより加水分解された乳
蛋白は、一般に微生物細胞の成長の速度が遅く、
且つ、微生物酵素の生産速度が遅い。 クレアチニン量は、生産培地として用いた水性
栄養培地のリツトル当り、0.5乃至20.0グラムの
範囲であり、4.0乃至12.0グラム／リツトル当
り、0.5乃至20.0グラムの範囲であり、4.0乃至
12.0グラム／リツトルが好適である。植物蛋白加
水分解物及び／又は非ペプシン性乳蛋白加水分解
物は1.0乃至10.0グラム／リツトルの範囲であ
り、1.0乃至5.0グラム／リツトルが好ましい。 生産培地である水性培地に含有される微量栄養
分には水溶性無機塩が含まれる。酵母抽出物が存
在してもよい。これら微量栄養分は、微生物の細
胞を促進し微生物の酵素産出の増加を促進するの
に有効な量が少量添加される。酵母抽出物の有用
量は培地１リツトル当り0.1グラム乃至２グラム
の範囲であり、0.5乃至1.5グラム／リツトルが好
適である。ビタミン類も任意微量栄養分として存
在させてもよい。 微量栄養分として存在し得る水溶性無機塩に
は、リン、マグネシウム、カルシウム、鉄、亜
鉛、ナトリウムの水溶性塩及び他の水溶性塩が含
まれ、それらの陽イオン成分は元素の周期律表の
第３及び第４周期から選択されることが好まし
い。微量栄養分として数種の無機塩の混合物が存
在することも好ましい。特に有用であると判明し
た無機塩混合物の一つは、下記組成の0.1N HCl
水溶液であり、各表記成分の濃度は水溶液１リツ
トル中に存在する量である。 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ CaCl2・2H2O 0.076ｇ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ MnSO4・H2O 1.7 ｇ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ NaCl 0.6 ｇ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ 生産培地である水性栄養培地は緩衝剤も含有す
る。緩衝剤はリン酸塩緩衝剤のごとくリン含有緩
衝剤であることが好ましい。もつとも他の緩衝剤
も使用可能である。本好適ケースの場合、緩衝剤
は緩衝剤として作用の他に、微生物の微量リン源
としての働きもする。好適リン酸塩緩衝剤はリン
酸水素二カリウム、K2HPO4であり、存在量は3.0
乃至10.0グラム／リツトルの範囲、好ましくは
3.0乃至6.0グラム／リツトルである。 生産培地である水性培地栄養培地のPHは5.0乃
至10.0の範囲をとることができ、6.0乃至7.5が好
ましい。培養液のPHは、KOH又はNaOH、好ま
しくはNaOH等の塩基を添加することにより、容
易に前記範囲内の調節を行うことができる。続い
て前記緩衝剤を存在させることにより、PHをこの
範囲に維持するのである。 生産培地に、当業者には周多の他の任意成分を
含有させることもできる。大規模醗酵器にて微生
物を成育する場合しばしば発泡が生ずるので、発
泡調節剤を培地中に含有させてもよい。斯る発泡
調節剤の一つは、Polyqlycol Ｐ−2000（米国ミ
シガン州ミドランドのDow Chemical社の商品
名）のようなポリグリコールである。この発泡調
節剤は一般に0.5グラム／リツトルまでの量で使
用されるが、更に少い量例えば0.1グラム／リツ
トルでも一般に発泡調節を行うのに十分なことが
判明している。他の発泡調節剤も使用可能であ
り、主な選択基準は、発泡調節の濃度水準で微生
物増殖及び酵素合成を阻害しない或いは最小の影
響しか与えないことである。 酵素生産のための醗酵方法 前記生産培地は、ATCC31546のような好気性
土壌微生物からクレアチニンイミノヒドロラーゼ
を大規模生産するのに好適な醗酵方法の最終工程
に使用すると有利である。 本醗酵方法は、前記生産培地の場合と類似のPH
条件及び好気下に保存培地にて増殖せしめた微生
物試料を用いるものである。従つて塩基好ましく
はNaOH又はKOH（もつとも他の塩基も使用可
能である）を添加することにより、PHを5.0−
10.0、好ましくは6.0−7.5に調節する。保存培地
の温度は15乃至42℃の範囲、好ましくは25乃至30
℃である。 保存培地は、クレアチニンからなる窒素源、好
ましくはアミノ基非含有有機酸である前記アミノ
酸前駆物質の１種以上を含む炭素源、１種以上の
水溶性無機塩及び任意成分として酵母抽出物のよ
うな微量栄養分、及び緩衝剤を含有する水性培地
である。所望ならば他の通常の培地物質、例えば
寒天等も存在させてもよい。 特に有用であると判明した保存培地は下記組成
のものである。 寒 天 20.0ｇ フマル酸（炭素源） 10.0ｇ クレアチニン（窒素源） 5.0ｇ 緩衝剤K2HPO4（無水物） 5.0ｇ 酵母抽出物 1.0ｇ 塩溶液 10.0ml 蒸留水 800.0ml NaOHでPHを6.7に調節し、蒸留水で容量を１
リツトルにする。 塩溶液は0.1NHCl水溶液で下記組成を有し、各
表記成分の濃度は塩溶液１リツトル中に存在する
量である。 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ CaCl2・2H2O 0.076ｇ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ MnSO4・H2O 1.7 ｇ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ NaCl 0.6 ｇ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ 醗酵方法は、微生物の新鮮な試料を保存培地か
ら微生物増殖培地に移して微生物を成育する工程
(a)で始まる。微生物の“新鮮な試料”なる用語
は、保存培地に25℃にて比較的短期間の24乃至72
時間、好ましくは約48時間培地−保存したものを
意味する。それより長時間保存・培地した微生物
試料は、新鮮な微生物試料よりも有用性に於て劣
ることが判明している。 微生物の新鮮な試料を必要時に即時供給するた
め、微生物を凍結乾燥粉末として４乃至25℃の範
囲の温度にて貯蔵し、細胞増殖過程を中断させる
ことも可能である。前記保存培地の凍結乾燥粉末
から、必要時に時を隔てて新しい培養を開始する
ことができる。このようにして醗酵(a)工程の微生
物増殖培地に移すための新鮮な微生物試料を絶え
間なく供給することが可能である。 別法として、液体窒素中にて凍結貯蔵すること
により新鮮な微生物試料を供給することも可能で
ある。 醗酵過程の(a)工程中の微生物増殖培地の組成
は、重要なものではあるが、広範に変えることが
可能である。一般に微生物増殖培地は、微生物の
細胞増殖が最大且つ(b)及び(c)工程の酵素生産が良
好な収量となるように選択される。このことは、
ある種の通常の非特定栄養培地を工程(a)の微生物
増殖培地として、使用することにより達成され
る。（もつとも(b)工程の生産培地には、明確に定
義された炭素源と特定の窒素源が使用される。）
工程(a)並びに工程(b)の使用によりもたらされた有
益な結果は予期されたものでなく、ましてや予見
できるものではなかつた。即ち当業者と云えど
も、非構成的に酵素を生産する微生物（即ち所望
酵素の基質又は基質同族体を含有する培養液中で
の成長により、その内部で所望酵素の生産をする
微生物）が、醗酵過程を通じて、特定配合の明確
に定義された栄養培地を使用することなく、酵素
を最適収量にて生産するであろうと予見すること
は不可能だつたであろう。従つて、ATCC31546
等の好気性土壌微生物に関する本醗酵方法が、保
存培地と生産培地の双方に於ける栄養としてクレ
アチニンを使用し、工程(a)の微生物成育培養液に
クレアチニンを使用せずして改善された結果をも
たらすことは予期せず知見されたことである。 前記の特性は有利なことである。これは、通常
“複合”培地と称されるある種の非特定の商業的
に入手可能な予備・配合栄養培地から微生物増殖
培地を配合することを可能とする。この“複合”
培地は、通常、植物、牛乳、肉又は魚の栄養源か
ら得られる微生物栄養の複合混合物を含むため、
そのように命名されたものである。従つてこの培
地は典型的には窒素源として植物、牛乳、魚又は
肉の蛋白質を含有し、且つ、各種の他の無機塩及
び栄養源から抽出されたビタミン栄養を含有す
る。この複合培養液には、糖質等の補足的炭素源
並びに他の補足的ビタミン及び鉱物栄養が存在し
てもよい。本発明の微生物増殖培地として良好な
結果をもたらすこの複合培地は、植物又は牛乳の
栄養源からもたらされたものであり、植物蛋白加
水分解物は非ペプシン性乳蛋白加水分解物を含有
している。 従つて、この微生物増殖培地の主要な特性は、
実質的にクレアチニンを含有せず、植物蛋白加水
分解物及び／又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物
を含む栄養を含有することである。 微生物増殖培地のPH条件は保存培地のそれと同
様である。別の緩衝剤又は別の塩基を使用するこ
となく、非特定栄養培地を使用することにより、
所望のPH範囲を得ることができる。例えば前記の
複合培地の場合、該複合培地の製造時にしばしば
緩衝剤を培地中に添加して好適PH範囲の6.0乃至
7.0に維持しているのである。 増殖培地中での微生物の温度条件は変化させ得
るものである。一般に工程(a)に於ける増殖培地で
の細胞増殖には20゜乃至37℃の範囲の温度が良好
であり、25゜乃至30℃が好適である。 醗酵過程の(a)工程にて微生物増殖培地に移され
る微生物試料は、この増殖培地内に於て、微生物
細胞が溶菌（lysis即ち破裂）することなく細胞
増殖が最大となるのに有効な期間培養される。こ
の時間は培地の組成並びに増殖培地に移された細
胞数により変り得るものである。トリプ−ソイブ
ロス（Tryp−Soy Broth：米国ロードアイラン
ド州フイスケビルのScott Laboratories製）等の
植物蛋白加水分解から構成される好適微生物増殖
培養物の場合、25mlの微生物増殖培地を含有する
フラスコに微生物試料を接種したときの期間は約
５乃至11時間であり、７−９時間が好適である。 工程(a)では、微生物の細胞増殖を最大にするの
に十分な酸素を供給する必要がある。最適酸素量
の決定は、ある所与容量の微生物増殖培地に関
し、数点の空気酸素流量と（培地の）撹拌速度に
て細胞増殖を監視し、細胞増殖が最大となる点以
上の空気流速と撹拌速度を選択することにより、
容易に可能である。 工程(a)で微生物が成長を終えた後、増殖細胞を
含む微生物増殖培地を工程(b)にて生産培地に移
す。 工程(b)に於て、増殖細胞を含む全微生物増殖培
地を生産培地に移すことができる。この微生物増
殖培地（即ち微生物増殖培地及びその中に含有さ
れる増殖細胞）は生産培地への接種物となる。 生産培地を醗酵器に収納する。斯る醗酵器の容
量は少くとも25リツトルであり、代表的には150
リツトル乃至200000リツトルである。最終生産醗
酵器の大きさに応じて工程(a)で発生した増殖細胞
を含有する微生物増殖培地の調製を数段階で行
い、最終生産醗酵器用接種物として役立つ十分量
の微生物増殖培地を得ることができる。 例えば最終生産醗酵器の容量が約150リツトル
のとき、工程(a)を二段階行うのが有利である。各
段階で微生物増殖培地中の微生物細胞増殖を最大
にし、生産培養物（培地と増殖細胞の双方を含
有）を工程(a)の次の段階の接種物として新たな、
一般により大なる微生物増殖培地バツチに導入使
用するのである。 最終生産規模醗酵器が150リツトルより大なる
場合、工程(a)を二段階以上にて行い工程(b)の最終
生産規模醗酵器への導入に十分量の微生物増殖培
養物を得ることができる。代表的には、工程(a)の
最終段階で生産した微生物増殖培養物の容量と工
程(b)で用いる生産培地の容量の比は、１：50乃至
１：５の範囲内である。 本発明の醗酵過程で用いる生産培地の組成は、
本明細書の“生産培地”の節で記載した通りであ
る。同様に生産培地の微生物の培養時に維持され
るPH条件も“生産培地”の節にて記載したものと
同一である。微生物による酵素生産を最大に維持
するための十分な酸素も重要である。これは、所
与容量の生産培地に関して、酸素又は空気流量並
びに培地の撹拌速度が工程(b)の範囲で変化すると
き、工程(c)にて抽出される酵素の量がどう変化す
るかを監視することにより容易に決定できる。次
に、生産される酵素量が最大になる点以上の酸素
又は空気速度及び撹拌速度を選択するのである。
工程(b)の微生物培養時間は、生産培地の特定組
成、酸素輸送速度、温度その他の条件に応じて変
化する。150リツトル生産規模醗酵器の場合の代
表的培養時間は、10乃至14時間の範囲内である。
前記のごとく抗発泡剤を生産培地に添加すること
は可能であり、あるいはそれらを多段醗酵過程の
比較的早い段階で微生物増殖培地に添加すること
もできる。 本発明醗酵方法の生産培地中で成育させた
ATCC31546等好気性土壌微生物を一般に妥当な
温度範囲にて成育し、クレアチニンイミノヒドロ
ラーゼ酵素を良好な収量にて生産することが可能
である。20゜乃至37℃の範囲の温度にて良好な結
果を得ることができる。25゜乃至30℃の温度だと
最良の結果が達成された。 工程(b)の完了に引続き、所望のウレアーゼ非含
有クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素を微生物
細胞から抽出する。これは、細胞を音波、粉砕等
で砕く従来法により行うことができ、所望酵素を
培地から、有機溶剤による分別沈澱その他の酵素
分離常法及び精製技術により分離するのである。 以下の実施例制限的なものでなく、本発明を更
に説明するためのものである。実施例では以下の
物質または材料を用いた。 物質： １ 微生物−好気性土壌別生物ATCC31546 ２ 培地No.1 寒 天 20.0ｇ/ フマル酸（炭素源） 10.0ｇ/ クレアチニン（窒素源） 5.0ｇ/ K2HPO4（無水物） 5.0ｇ/ 酵母抽出物 1.0ｇ/ 変性塩溶液Ｃ 10.0ml 蒸留水 800.0ml KOHでPHを6.7に調節し、蒸留水で本培地を
１リツトルにした。 変性塩溶液Ｃの組成 MgSO4・7H2O 12.2 ｇ/ CaCl2・2H2O 0.076ｇ/ FeSO4・7H2O 2.8 ｇ/ MnSO4・H2O 1.7 ｇ/ ZnSO4・7H2O 0.06 ｇ/ NaCl 0.6 ｇ/ NaMoO4・2H2O 0.1 ｇ/ 0.1NHClで１リツトルにした。 ３ 培地No.2 寒天を加えなかつた以外は培地No.1と同一
組成。 ４ 培地No.3 リツトル当りポリグリコール0.1ｇ（米国ミ
シガン州ミドランドのDow Chemical社製品
Poly qlycal Ｐ−2000）を加えた以外は培地
No.2と同一組成。 ５ 培地No.4−培養物純度試験用培地 グルコース 10.0ｇ/ 酵母抽出物 10.0ｇ/ リン酸カリウム（二塩基性） 1.0ｇ/ 塩溶液Ａ−１ 2.0ml/ 塩溶液Ａ−２ 2.0ml/ 寒 天 20.0ｇ/ PHを7.0に調節し、蒸留水で１リツトルにし
た。 塩溶液Ａ−１： MgSO4・7H2O 100.0ｇ/ FeSO4・7H2O 10.0ｇ/ MnSO4・H2O 1.0ｇ/ NaMoO4・2H2O 0.5ｇ/ 0.1NHClで１リツトルにした。 塩溶液Ａ−２： CaCl2 10.0ｇ/ 蒸留水 1.0にする。 ６ 薬品：酵母はデイフコ ラボラトリーズ社
（Difco Laboratories 米国ミシガン州デトロ
イト）の製品；寒天はメドツクス ケミカル社
（Medox Chemical カナダ国オンタリオ州オ
ツタワ）製；Ｌ−グルタミンデヒドロゲナー
ゼ、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
緩衝剤（tris）、Ｎ・Ｎ−ビス（２−ヒドロキ
シエチル）グリシン（bicine）、卵白リゾチー
ム、ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン
酸塩の還元形（NADPH）、リボヌクレアーゼ
及び牛のすい臓からのデオキシリボヌクレアー
ゼはシグマケミカルズ社（Siqma Chemicals
米国ミズーリ州セントルイス）製。イーストマ
ンオーガニツクケミカルズ社（Eastman
Organic Chemicals米国ニユーヨーク州ロチエ
スター）は有機化学薬品の供給元であり、他の
薬品はすべて分析級の市販品であつた。 本例に於いては以下の操作を用いた。 操 作 １ 培養物の維持・保存 微生物ATCC31546培養物をトリプーソイプ
ロス中で30℃10時間増殖させて保存した。次に
細胞を無菌状態で分離し、無菌の10％グリセリ
ン水溶液中にアレン（Allen）の塩溶液
（Allen、M.N.、Archive of Aikrobiology、第
32巻第270−277頁（1959年）で再懸濁した。
0.5−2.0mlの少量の本培養物を無菌のガラスア
ンプルに加え、密封後液体窒素中に貯蔵した。
微生物試料が要るときはアンプル中の培養物を
解かして内容物を無菌状態でトリプーソイブロ
スに移し、30℃で10時間成育させた。本培養物
をループ一杯、無起状態で培地No.1の斜面に
移し30℃で培養した。 ２ 小規模酸素生産 手順１に前記のように培養物を培地No.1斜
面上で２日間成育さて新鮮試料を得た。この斜
面から培養物をループ一杯、本発明にて使用す
る型の微生物増培地25ml（250mlのエルレンマ
イヤーフラスコに収容）に接種した。使用した
微生物増殖培地はトリプーソイブロスからなる
ものであつた。培養物をエルレンマイヤーフラ
スコに接種後、該フラスコを200rpm、30℃に
て８時間振とうすると細胞は良好に増殖し微生
物細胞の崩壊は起らなかつた。その後フラスコ
内容物試料の培養物純度を顕微鏡で検査し、次
に冷凍遠心分離器にて15000×ｇで無菌的に遠
心分離して細胞とトリプーソイ ブロスを分離
した。トリプーソイ ブロスを含む上澄液を捨
て、沈澱微生物細胞を含む固体物質を遠心分離
前に存在した量の無菌蒸留水中に再懸濁させ
た。次にこの懸濁物２mlを、生産培養液25ml含
有の250mlエルレンマイヤーフラスコの接種物
として使用し、微生物による酵素生産を促進し
た。この生産培養物の特定組成は下記諸例に記
載のように変化させた。しかし各ケース共、微
生物を２mlの接種物としていつたんそれぞれの
生産培地含有フラスコに移したあとは、みな30
℃、200rpmで10時間フラスコを振とうした。
そのあと培養物試料を取り出して稀釈し、乾燥
細胞の重量を測定した。更に、該培養物の一部
分2.5mlを冷凍遠心分離にて15000×ｇで遠心分
離して細胞と生産培地を分離した。生産培地を
含む上澄液は廃棄した。沈澱細胞を下記操作４
のごとく粉砕して下記操作５記載のごとく酵素
活性を検定した。 ３ 大規模酵素生産 方法２と同一工程を経たあと、ATCC31546
培養物を培地No.1斜面にて２日間増殖した新
鮮試料を微生物増殖培地25ml（250mlエルレン
マイヤーフラスコ中に収容）に移した。微生物
増殖培地は操作２記載のものと同一であつた。
微生物増殖培地中での接種物増殖の第一段階
は、該フラスコを200rpm、25℃にて12時間振
とうすることにより行つた。そのあとフラスコ
内容物試料の培地物純度を顕微鏡で検査した。
次に微生物増殖培地中での接種物増殖の第二段
階に於て、第一段階培養物を含む２個の250ml
エルレンマイヤーフラスコの内容物を無菌状態
で14リツトルの醗酵器に移した。該醗酵器は操
作２記載の組成及び0.01重量％のポリグリコー
ルＰ−2000を有する無菌の微生物増殖培地10リ
ツトルを含有したものである。接種物成育の第
二段階に於て、14リツトル醗酵器を、温度25℃
に維持しながら1300rpmで12時間撹拌した。こ
の間醗酵器に5.5リツトル／分の空気流を通し
て適当な酸素供給を継続した。こうして150リ
ツトル醗酵器用の接種物として十分量の細胞が
得られた。14リツトル醗酵器の内容物を無菌的
に150リツトル醗酵器に移した。該醗酵器には
予め以下の諸例に記載する夫々の組成の無菌生
産培地100を仕込んでおいた。その後150リツ
トル醗酵器の内容物250rpmで12時間撹拌し
た。この間46リツトル／分の空気流を醗酵器に
通し、溶解酵素濃度及びPHを12時間連続して監
視した。１時間毎に醗酵器から試料を抜き取り
乾燥細胞重量を測定した。更に１時間毎に醗酵
器から一部分2.5mlを抜き取り、操作２記載の
ごとく処理して細胞を分離した。次に細胞を粉
砕し操作４及び５記載のごとく検定した。 ４ 前記操作２及び３と以下の諸例に於て細胞粉
砕を行つた。0.05Mトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（tris）の緩衝剤、PH8.5及び
10-3M（エチレンジニトリロ）、四酢酸二カリ
ウム塩（K2EDTA）の溶液1.4mlに、酵素溶液
0.2ml及び細胞懸濁物0.4mlを添加した。前記酵
素溶液は脱イオン水１ml当りリゾチーム2.5
mg、牛すい臓のデオキシリボヌクレアーゼ１mg
及び牛すい臓のリボヌクレアーゼ１mgを含有す
るものであつた。細胞懸濁物の量は最終光学密
度が約1.0になるよう調節し、tris緩衝液で最終
容量を2.0mlにした。該懸濁物を水浴中37℃で
20分間振とうした。冷凍遠心分離器にて27000
×ｇで遠心して細胞デブリス（debris）を除去
し、上澄液の酵素活性検定を下記操作５記載の
ごとく行つた。 ５ クレアチニン イミノヒドロラーゼの検定 諸例記載のクレアチニンイミノヒドロラーゼ
活性を測定するため、Ｌ−グルタミンデヒドロ
ゲナーゼ、“GDH”検定法を用いた。GDH検定
法では、以下のごとくGDH−触媒反応に
NADPH（ニコチナミド−アデニジヌクレオチ
ドリン酸塩）を用いて、クレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ酵素組成物の活性を表わすクレアチ
ニンからのアンモニア生産を測定する。クレア
チニンをクレアチニンイミノヒドロラーゼ試料
の未知作用を介してアンモニアに加水分解し、
触媒のGDHの存在下にアンモニアをα−ケト
グルタル酸試薬と反応させてグルタミン酸を生
産する。GDHを触媒とする後者の反応は
NADPH酸化反応（NADPH→NADP）を用いる
ものであり、340nｍでのNADPH吸収ピークの
消失が検定を監視する光学検出手段となる。す
なわちNADPH消失速度がグルタミン酸生産速
度を与え、これがアンモニア生産速度を与え
る。GDH検定法で使用する反応混合物は、全
容量１ミリリツトル中にPH7.6の0.1M Ｎ・Ｎ
−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン−
KOH緩衝溶液、（エチレンジニトリロ）四酢酸
二ナトリウム塩（Na2−EDTA）0.4mg、α−ケ
トグルタル酸1.6mg、NADPH0.24mg、GDH（ア
ンモニア非含有）15単位及びクリアチニン4.52
mgを含むものであつた。GDH活性の一単位と
は、PH7.6及び37℃に於て１分間にα−ケトグ
ルタル酸１μモルをグルタミン酸塩に還元する
触媒作用の酵素量と定義されるものである。反
応は、前記反応混合物が37℃で平衝に達した後
所望クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素組成
物の少量試料（約２−10ミリ単位）を添加する
ことにより、該反応混合物内で始まる。クレア
チニンイミノヒドロラーゼ活性は、スペクトロ
ホトメーターで340nｍ（NADPHの340nｍに於
ける分子消失係数は6.22×103）に於ける
NADPHの消失速度を測定して計算される。酵
素活性の一単位とは、前記GDH検定反応条件
下で、１分間にクレアチニン１μモルがアンモ
ニア１μモルに転化する触媒作用に必要な酵素
量と定義されるものである。 実施例 １ 微生物増殖培地 本実施例は、本発明の醗酵方法に有用な微生物
増殖培地を決定するための試験結果を報ずるもの
である。本発明で用いる方法では第表に示すよ
うに各種微生物増殖培地及び生産培地として前記
の培地No.2を使用する。培地No.2は植物蛋白加
水分解物又は非ペプシン性の牛乳蛋白加水分解を
含まず、本発明の改善された水性栄養培地ではな
い。本実施例で用いる方法の操作は以下の通りで
ある。 試験すべき培地を各25ml含むフラスコに、培地
No.1斜面にて30℃18時間成長させた培養物をル
ープ一杯接種した。各フラスコの細胞成長を測定
し、培地リツトル当りの乾燥細胞重量として第
表に記した。第表の第一欄に示すように、培養
物はトリブーソイブロス、マイクロ イノキユラ
ム ブロス（Micro Inoculum Broth）及び培地
No.2中で良好に増殖した。次に生産培地として
培地No.255mlを含むフラスコに、試験する各微
生物増殖培地の懸濁物２mlを接種した。第表に
示すように、トリプーソイ ブロス及びマイクロ
イノキユラム ブロスから得た培地物接種のフ
ラスコのものが、生産培地中の増殖が良好であり
酵素生産が優れていた。培地No.2の培養物接種
のフラスコのものは細胞増殖は良好であつたが、
酵素生産の水準は高くなかつた。サブラウド デ
キストラーゼ ブロス（Sabouraud Dextrose
Broth）及びニユートリエンス ブロス
（Nutrient Broth）で接種したフラスコのものの
結果は悪かつた。サブラウドデキストラーゼ ブ
ロスは細胞増殖が不良で酵素生産はほとんどな
く、ニユートリエントブロスでは若干酵素は生産
されたが細胞増殖が不良であつた。
【表】
【表】
実施例 ２
炭素源の効果
小規模醗酵生産用の前記操作２を用い、操作２
の生産培地として使用する水性栄養培地用として
最適の炭素源をきめるため、酸、アルコール及び
糖質を含む数種の化合物の試験を行つた。本実施
例にて試験した各水性栄養培地は、炭素源を以下
の第表で示す特定化合物に置き換えた以外は前
記培地No.2と同一であつた。これらの水性栄養
培地は植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性カゼ
イン蛋白加水分解物を含有せず、本発明の改善さ
れた水性栄養培地ではない。各炭素源の最適濃度
を決定するため、第表に示す夫々の炭素源に関
し一連の水性培地の試験を行つた。最適濃度は、
最高のクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を与
える濃度とした。試験する各炭素源の一連の培地
を、炭素源として1.0重量％のフマル酸を含有す
る対照培地と比較した。即ち第表にて試験した
各炭素源の乾燥細胞重量及びクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼ活性を、対照フマル酸に対する相対
百分率として測定した。第表に示すように、グ
リセリン、スクロース、酢酸及びグリシンは培養
物増殖を支援せぬが、或いは検出可能量の酸素を
生産しなかつた。アスパラギン酸及びグルタミン
酸の場合、培養物の増殖は良好であつたが、酸素
合成は制限された。前記炭素源とは対照的に、炭
素源としてグルコース又は間接アミノ酸前駆物質
例えば乳酸、リンゴ酸、クエン酸、又はコハク酸
を用いた培地では、微生物増殖及び酵素生産は許
容可能水準であつた。第表に示すように、直接
アミノ酸前駆物質であるピルビン酸は、微生物の
増殖は幾分低かつたが、酵素生産を良好に支援し
た。第表で用いた直接アミノ酸前駆物質で且つ
対照物質であるフマル酸に於ても酵素生産並びに
微生物増殖は良好であつた。α−ケトグルタル酸
は微生物の増殖も良好であり且つ対照物質の２倍
以上の酵素を生産し、最高の結果をもたらした。
これらの結果は、グルコース及び間接アミノ酸前
駆物質が炭素源として有用であること、一方フマ
ル酸、α−ケトグルタル酸及びピルビン酸等の直
接アミノ酸前駆物質は更に良好な炭素源であり、
とくにα−ケトグルタル酸は例外的な結果を与え
ることを示している。
の生産培地として使用する水性栄養培地用として
最適の炭素源をきめるため、酸、アルコール及び
糖質を含む数種の化合物の試験を行つた。本実施
例にて試験した各水性栄養培地は、炭素源を以下
の第表で示す特定化合物に置き換えた以外は前
記培地No.2と同一であつた。これらの水性栄養
培地は植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性カゼ
イン蛋白加水分解物を含有せず、本発明の改善さ
れた水性栄養培地ではない。各炭素源の最適濃度
を決定するため、第表に示す夫々の炭素源に関
し一連の水性培地の試験を行つた。最適濃度は、
最高のクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を与
える濃度とした。試験する各炭素源の一連の培地
を、炭素源として1.0重量％のフマル酸を含有す
る対照培地と比較した。即ち第表にて試験した
各炭素源の乾燥細胞重量及びクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼ活性を、対照フマル酸に対する相対
百分率として測定した。第表に示すように、グ
リセリン、スクロース、酢酸及びグリシンは培養
物増殖を支援せぬが、或いは検出可能量の酸素を
生産しなかつた。アスパラギン酸及びグルタミン
酸の場合、培養物の増殖は良好であつたが、酸素
合成は制限された。前記炭素源とは対照的に、炭
素源としてグルコース又は間接アミノ酸前駆物質
例えば乳酸、リンゴ酸、クエン酸、又はコハク酸
を用いた培地では、微生物増殖及び酵素生産は許
容可能水準であつた。第表に示すように、直接
アミノ酸前駆物質であるピルビン酸は、微生物の
増殖は幾分低かつたが、酵素生産を良好に支援し
た。第表で用いた直接アミノ酸前駆物質で且つ
対照物質であるフマル酸に於ても酵素生産並びに
微生物増殖は良好であつた。α−ケトグルタル酸
は微生物の増殖も良好であり且つ対照物質の２倍
以上の酵素を生産し、最高の結果をもたらした。
これらの結果は、グルコース及び間接アミノ酸前
駆物質が炭素源として有用であること、一方フマ
ル酸、α−ケトグルタル酸及びピルビン酸等の直
接アミノ酸前駆物質は更に良好な炭素源であり、
とくにα−ケトグルタル酸は例外的な結果を与え
ることを示している。
【表】
ルタル酸
【表】
実施例 ３
フマル酸とクレアチニンの効果
小規模酵素生産用前記操作２を用いた生産培地
である水性栄養培地中で、フマル酸（炭素源）と
クレアチニン（窒素源）の濃度試験を行つた。こ
れらの水性栄養培地は植物蛋白加水分解物又は非
ペプシン性牛乳カゼイン加水分解物を含有してお
らず、本発明の改良された水性栄養培地ではな
い。フマル酸とクレアチニンの濃度を下記第表
記載のごとく同時に変え、それ以外は前記培地
No.2と同一の水性培地を用いて試験をした。第
表は炭素源としてのフマル酸の最適濃度が1.0
％であり、クレアチニンの最適濃度が0.5％であ
ることを示している。試験した他の組合せはすべ
て細胞増殖、酵素収量共に低かつた。
である水性栄養培地中で、フマル酸（炭素源）と
クレアチニン（窒素源）の濃度試験を行つた。こ
れらの水性栄養培地は植物蛋白加水分解物又は非
ペプシン性牛乳カゼイン加水分解物を含有してお
らず、本発明の改良された水性栄養培地ではな
い。フマル酸とクレアチニンの濃度を下記第表
記載のごとく同時に変え、それ以外は前記培地
No.2と同一の水性培地を用いて試験をした。第
表は炭素源としてのフマル酸の最適濃度が1.0
％であり、クレアチニンの最適濃度が0.5％であ
ることを示している。試験した他の組合せはすべ
て細胞増殖、酵素収量共に低かつた。
【表】
実施例 ４
追加窒素源の効果
前記実施例２及び３の各々に於て、操作２の小
規模酵素生産方法の生産培地で使用した窒素源は
クレアチニンのみであつた。本実施例に於ては、
植物蛋白分解物のハイ−ソイ（Hy−Soy、米国ニ
ユージヤージー州ユニオンのシエフイールドケミ
カル（Scheffield Chemical）社製の大豆蛋白加
水分解物の商品名）及び非ペプシン性牛乳蛋白加
水分解物のトリブチカーゼペプトン
（TrypticasePeptone、米国MDコツケイスビル
のビオケスト（Bioquest；BBL）社製のトリプシ
ン性カゼイン加水分解物）を生産培地に追加使用
し、操作２記載の小規模酵素生産方法で評価し
た。追加窒素源の効果は下記第表記載の濃度水
準にて測定した。これらの水性栄養培地は本発明
の改善された水性栄養培地である。生産培地の残
りの成分は培地No.2と同一であつた。第表に
示すように、ハイ−ソイの場合、濃度水準約0.5
重量％にて最良の結果が得られ、トリプチカーゼ
ペプトンの場合濃度水準0.1重量％にて最良の結
果が得られた。ハイソイ及びトリプチカーゼペプ
トンを夫々0.5及び0.1重量％以上の水準で使用す
ることは可能であるが、これらの高水準では酵素
の生産抑制が始つた。
規模酵素生産方法の生産培地で使用した窒素源は
クレアチニンのみであつた。本実施例に於ては、
植物蛋白分解物のハイ−ソイ（Hy−Soy、米国ニ
ユージヤージー州ユニオンのシエフイールドケミ
カル（Scheffield Chemical）社製の大豆蛋白加
水分解物の商品名）及び非ペプシン性牛乳蛋白加
水分解物のトリブチカーゼペプトン
（TrypticasePeptone、米国MDコツケイスビル
のビオケスト（Bioquest；BBL）社製のトリプシ
ン性カゼイン加水分解物）を生産培地に追加使用
し、操作２記載の小規模酵素生産方法で評価し
た。追加窒素源の効果は下記第表記載の濃度水
準にて測定した。これらの水性栄養培地は本発明
の改善された水性栄養培地である。生産培地の残
りの成分は培地No.2と同一であつた。第表に
示すように、ハイ−ソイの場合、濃度水準約0.5
重量％にて最良の結果が得られ、トリプチカーゼ
ペプトンの場合濃度水準0.1重量％にて最良の結
果が得られた。ハイソイ及びトリプチカーゼペプ
トンを夫々0.5及び0.1重量％以上の水準で使用す
ることは可能であるが、これらの高水準では酵素
の生産抑制が始つた。
【表】
養物
実施例 ５ 炭素源組合わせの効果 本実施例では、グルコースとアミノ酸前駆物質
の双方から構成される組合わせ炭素源の微生物成
長及び酵素生産に及ぼす効果を測定検討した。本
実施例の試験は、操作２の小規模酵素生産方法及
び操作３の大規模酵素生産方法の双法を用いて行
なつた。以下の第表に示した濃度のグルコース
を添加した以外は各ケース共その最終生産培養液
の組成は培地No.2と同一であつた。第表の結
果の示すところ、グルコースを添加したグルコー
スとアミノ酸前駆物質の組合せ炭素源に於ては、
微生物の増殖は僅かにすぎなかつたが酵素生産増
加は顕著であつた。
実施例 ５ 炭素源組合わせの効果 本実施例では、グルコースとアミノ酸前駆物質
の双方から構成される組合わせ炭素源の微生物成
長及び酵素生産に及ぼす効果を測定検討した。本
実施例の試験は、操作２の小規模酵素生産方法及
び操作３の大規模酵素生産方法の双法を用いて行
なつた。以下の第表に示した濃度のグルコース
を添加した以外は各ケース共その最終生産培養液
の組成は培地No.2と同一であつた。第表の結
果の示すところ、グルコースを添加したグルコー
スとアミノ酸前駆物質の組合せ炭素源に於ては、
微生物の増殖は僅かにすぎなかつたが酵素生産増
加は顕著であつた。
【表】
実施例 ６
大規模醗酵生産に於ける培地変性の結果
本実施例では実施例２−５記載生産培地の変性
の組合せ効果を、操作３記載の大規模酵素生産方
法を用いて検討した。対照生産培地は培地No.2
であつた。本実施例の残りの試験では第表記載
のように培地No.2の変性を行つた。実施例２−
５にて議論しなかつた第表の変性は、培地
No.2のKOHをNaOHで置換したことのみであつ
た。そうすると酵素生産が改善可能なことが判明
したので行つたのである。第表中培地Ｂ、Ｃ及
びＤはすべて本発明で使用する型の改善された水
性栄養培地であり、対照培地Ａと比較して酵素活
性水準の改善が顕著であり、一方対照培地Ａは前
記培地No.2と同一であつた。特に追加窒素源並
びに組合わせ炭素源を含有する培地Ｃ及びＤの酵
素生産の増加は顕著であつた。本実施例の大規模
生産方法を行つている間、150リツトル醗酵器中
の醗酵過程の動力学を培地Ｂ、Ｃ及びＤの各々に
ついて観察した。培地Ｂではクレアチニンの増殖
はほとんど即刻開始して指数的に増加し、約10時
間で一定値38ｇ/に達した。培地Ｂの酵素生産
は４時間遅れで始まり、増殖度とほぼ平行して指
数的に増加し、約10時間後最大酵素生産水準に達
した。培地Ｃの微生物増殖は最初の３時間指数的
に増加し、約10時間で一定値４ｇ/に達した。
培地Ｃの酵素開始後約4.5時間で始まり、増殖に
平行して大よそ指数的に増加した。培地Ｃの最大
酵素生産水準は約11−13時間で得られ、その後は
活性が低下し始めた。培地Ｄの微生物増殖は最初
の４時間指数的に増加し、その後約４ｇ/で一
定になつた。培地Ｄの酵素生産は約５時間後に始
まり、これも成長と平行して大よそ指数的に増加
し、約11−13時間後に最大酵素生産水準に達し
た。
の組合せ効果を、操作３記載の大規模酵素生産方
法を用いて検討した。対照生産培地は培地No.2
であつた。本実施例の残りの試験では第表記載
のように培地No.2の変性を行つた。実施例２−
５にて議論しなかつた第表の変性は、培地
No.2のKOHをNaOHで置換したことのみであつ
た。そうすると酵素生産が改善可能なことが判明
したので行つたのである。第表中培地Ｂ、Ｃ及
びＤはすべて本発明で使用する型の改善された水
性栄養培地であり、対照培地Ａと比較して酵素活
性水準の改善が顕著であり、一方対照培地Ａは前
記培地No.2と同一であつた。特に追加窒素源並
びに組合わせ炭素源を含有する培地Ｃ及びＤの酵
素生産の増加は顕著であつた。本実施例の大規模
生産方法を行つている間、150リツトル醗酵器中
の醗酵過程の動力学を培地Ｂ、Ｃ及びＤの各々に
ついて観察した。培地Ｂではクレアチニンの増殖
はほとんど即刻開始して指数的に増加し、約10時
間で一定値38ｇ/に達した。培地Ｂの酵素生産
は４時間遅れで始まり、増殖度とほぼ平行して指
数的に増加し、約10時間後最大酵素生産水準に達
した。培地Ｃの微生物増殖は最初の３時間指数的
に増加し、約10時間で一定値４ｇ/に達した。
培地Ｃの酵素開始後約4.5時間で始まり、増殖に
平行して大よそ指数的に増加した。培地Ｃの最大
酵素生産水準は約11−13時間で得られ、その後は
活性が低下し始めた。培地Ｄの微生物増殖は最初
の４時間指数的に増加し、その後約４ｇ/で一
定になつた。培地Ｄの酵素生産は約５時間後に始
まり、これも成長と平行して大よそ指数的に増加
し、約11−13時間後に最大酵素生産水準に達し
た。
【表】
りにα−ケト
グルタル酸
a：対照物−培地No.2にて増殖させた培養物
実施例 ７ 本発明の水性栄養培地にて成育した好気性土壌
微生物がクレアチニンヒドロラーゼ酵素の収量を
増加させることを示すため、二種の好気性クレア
チニンイミノヒドロラーゼ生産微生物、即ちブレ
ビバクテリウム ジバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ATCC14020（米
国特許第4087329号及び同第4134793号参照）とウ
レアーゼを含有せぬクレアチニンイミノヒドロラ
ーゼを生産する微生物ATCC31546（操作１に前
記）を二種の水性栄養培地で増殖させた。特に、
これら二種の微生物の各々を、米国特許第
4087329号実施例１記載（本明細書の第表に記
載）組成の対照培地の同量中にて増殖させた。こ
れらの培地の操作は米国特許第4087329号実施例
６記載の操作（本明細書第表に記載）と同一で
あつた。その後二種の各微生物細胞を冷凍遠心分
離器にて1500×ｇ15分間遠心して収得した。50ml
酸酵肉汁から得た細胞ペレツトをPH7.5の0.1Mリ
ン酸カリウム緩衝液10ml中に再懸濁させ、微生物
細胞内で生産された酵素を抽出するため該懸濁物
を５分間音波処理した。冷凍遠心分離器にて
27000×ｇ15分間遠心して細胞テブリスを除去し
た。次に、二種の微生物の夫々から得られた未精
製酵素含有の粗上澄液を、操作５記載のごとく検
定してクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を測
定し、各微生物に於けるクレアチニンイミノヒド
ロラーゼの収量を定量的に評価した。そのあと前
記微生物の各々について前記の操作を繰り返し
た。但しこのときの各微生物の増殖は実施例６の
培地Ｄと同一組成の本発明の改良された水性栄養
培地の同一量中にて行なつた。培地Ｄにて増殖さ
せた二種の微生物から得られたクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ収量即ちクレアチニンイミノヒド
ロラーゼ活性を、前記と同一の方法にて定量し
た。結果を下記第表に示す。第表に示すよう
に、各二種の微生物により生産されたクレアチニ
ンイミノヒドロラーゼの収量は、本発明の改良さ
れた栄養培地中にて微生物を増殖させることによ
り、著るしく増加したのである。 第 表 対 照 培 地 リツトル当り グルコース 20.0ｇ クレアチニン塩酸塩 5.0ｇ K2HPO4 1.0ｇ MgSO4・7H2O 0.5ｇ KCl 0.5ｇ 酵母抽出物 1.0ｇ PHを7.5に調節して蒸留水にて１リツトルにし
た。 第 表 培 養 条 件 条件 内 容 培地容量 250mlエルレンマイヤーフラスコ中に
25ml 温 度 30℃ 攪拌速度 200rpm 時 間 24時間
グルタル酸
a：対照物−培地No.2にて増殖させた培養物
実施例 ７ 本発明の水性栄養培地にて成育した好気性土壌
微生物がクレアチニンヒドロラーゼ酵素の収量を
増加させることを示すため、二種の好気性クレア
チニンイミノヒドロラーゼ生産微生物、即ちブレ
ビバクテリウム ジバリカタム
（Brevibacterium divaricatum）ATCC14020（米
国特許第4087329号及び同第4134793号参照）とウ
レアーゼを含有せぬクレアチニンイミノヒドロラ
ーゼを生産する微生物ATCC31546（操作１に前
記）を二種の水性栄養培地で増殖させた。特に、
これら二種の微生物の各々を、米国特許第
4087329号実施例１記載（本明細書の第表に記
載）組成の対照培地の同量中にて増殖させた。こ
れらの培地の操作は米国特許第4087329号実施例
６記載の操作（本明細書第表に記載）と同一で
あつた。その後二種の各微生物細胞を冷凍遠心分
離器にて1500×ｇ15分間遠心して収得した。50ml
酸酵肉汁から得た細胞ペレツトをPH7.5の0.1Mリ
ン酸カリウム緩衝液10ml中に再懸濁させ、微生物
細胞内で生産された酵素を抽出するため該懸濁物
を５分間音波処理した。冷凍遠心分離器にて
27000×ｇ15分間遠心して細胞テブリスを除去し
た。次に、二種の微生物の夫々から得られた未精
製酵素含有の粗上澄液を、操作５記載のごとく検
定してクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を測
定し、各微生物に於けるクレアチニンイミノヒド
ロラーゼの収量を定量的に評価した。そのあと前
記微生物の各々について前記の操作を繰り返し
た。但しこのときの各微生物の増殖は実施例６の
培地Ｄと同一組成の本発明の改良された水性栄養
培地の同一量中にて行なつた。培地Ｄにて増殖さ
せた二種の微生物から得られたクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ収量即ちクレアチニンイミノヒド
ロラーゼ活性を、前記と同一の方法にて定量し
た。結果を下記第表に示す。第表に示すよう
に、各二種の微生物により生産されたクレアチニ
ンイミノヒドロラーゼの収量は、本発明の改良さ
れた栄養培地中にて微生物を増殖させることによ
り、著るしく増加したのである。 第 表 対 照 培 地 リツトル当り グルコース 20.0ｇ クレアチニン塩酸塩 5.0ｇ K2HPO4 1.0ｇ MgSO4・7H2O 0.5ｇ KCl 0.5ｇ 酵母抽出物 1.0ｇ PHを7.5に調節して蒸留水にて１リツトルにし
た。 第 表 培 養 条 件 条件 内 容 培地容量 250mlエルレンマイヤーフラスコ中に
25ml 温 度 30℃ 攪拌速度 200rpm 時 間 24時間
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ PH5.0乃至10.0に於ける好気条件下にて、ク
レアチニンを含有する水性保存培地に保存された
好気性土壌微生物からクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼを生産する醗酵方法に於て、 (a) 保存培地から、微生物の新鮮な資料を、PH
5.0乃至10.0の微生物増殖培地に移して微生物
を増殖させ、該増殖培地が実質的にクレアチニ
ンを含まずかつ植物蛋白加水分解物又は非ペプ
シン性乳蛋白加水分解物を含む栄養を含有する
好気条件下で微生物増殖に有効な水性栄養培地
からなり； (b) 工程(a)で得られた増殖微生物を含有する微生
物増殖培地を、PH5.0乃至10.0の範囲の生産培
地に移して好気条件下で微生物を発生させ、そ
の微生物中でクレアチニンイミノヒドロラーゼ
生産を誘導し、該生産培地が (i) グルコース、又はアミノ基非含有の有機酸
であるアミノ酸前駆物質、又はそれらの混合
物を含む炭素源、 (ii) クレアチニンを含む窒素源、 (iii) 微量栄養成分及び (iv) 緩衝剤、 を含む水性栄養培地であり、 (c) 工程(b)で発生した微生物からクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼを抽出すること、 の諸工程からなることを特徴とする、クレアチニ
ンイミノヒドロラーゼ生産のための醗酵方法。
Applications Claiming Priority (1)
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Publications (2)
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Family Applications (2)
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| JP60034259A Granted JPS60214881A (ja) | 1979-11-05 | 1985-02-22 | 微生物増殖用栄養培地 |
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|---|---|---|---|
| JP60034259A Granted JPS60214881A (ja) | 1979-11-05 | 1985-02-22 | 微生物増殖用栄養培地 |
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