JP2816167B2 - α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ - Google Patents
α−アミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（以下γ−GTP
と略記）は動物組織および微生物のアミノ酸代謝および
グルタチオンサイクルにおいて重要な役割を果たしてい
る（Meth.Enzymol.77:237（1981））。このものはγ−
グルタミル誘導体の形態における種々のアミノ酸の輸
送、バチルス中におけるポリグルタミン酸の生成および
グルタチオン（γ−グルタミル−システイニル−グリシ
ン）の分解を担っている。
と略記）は動物組織および微生物のアミノ酸代謝および
グルタチオンサイクルにおいて重要な役割を果たしてい
る（Meth.Enzymol.77:237（1981））。このものはγ−
グルタミル誘導体の形態における種々のアミノ酸の輸
送、バチルス中におけるポリグルタミン酸の生成および
グルタチオン（γ−グルタミル−システイニル−グリシ
ン）の分解を担っている。
γ−GTPをアジピニルまたはグルタリル−モノアミノ
化合物の加水分解に使用することは既に提案されている
（EP 0,275,901）。
化合物の加水分解に使用することは既に提案されている
（EP 0,275,901）。
今驚くべきことにγ−GTPが式Ｉ （式中、R1はアミノ酸、ジペプチド、セフエム、セフア
ムあるいはそれらの誘導体を意味する）を有するα−ア
ミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解を触媒する
ことが見出された。
ムあるいはそれらの誘導体を意味する）を有するα−ア
ミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解を触媒する
ことが見出された。
これまでC4−側鎖もC6−側鎖もγ−GTPの活性中心に
は受容されないと思われていたので、上記のことはなお
さら驚くべきことであつた（Agric.Biol.Chem.42:371〜
81（1978））。
は受容されないと思われていたので、上記のことはなお
さら驚くべきことであつた（Agric.Biol.Chem.42:371〜
81（1978））。
それゆえ本発明は １） 下記性質、すなわち −分子量が40,000〜80,000、 −等電点がpH4.4〜5.9、 −基質としてのＬ−γ−グルタミルパラニトロアニリド
に対し最適pHが6.5〜10でpH8でのKmが９〜36μＭ、そし
て −式Ｉ （式中、R1はアミノ酸、ジペプチド、セフエム、セフア
ムまたはそれらの誘導体を意味する）を有するα−アミ
ノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性、 を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ。
に対し最適pHが6.5〜10でpH8でのKmが９〜36μＭ、そし
て −式Ｉ （式中、R1はアミノ酸、ジペプチド、セフエム、セフア
ムまたはそれらの誘導体を意味する）を有するα−アミ
ノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性、 を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ。
２） シユードモナス、プロテウス、アースロバクター
およびバチルス属の細菌を前記γ−GTPが栄養培地中に
蓄積するまで栄養培地中で培養することからなる、前記
１項記載の性質を有するγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの製法、および ３） 式Ｉを有するα−アミノアジピニルモノアミノ化
合物の加水分解への前記１項記載の性質を有するγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの使用、 に関する。
およびバチルス属の細菌を前記γ−GTPが栄養培地中に
蓄積するまで栄養培地中で培養することからなる、前記
１項記載の性質を有するγ−グルタミルトランスペプチ
ダーゼの製法、および ３） 式Ｉを有するα−アミノアジピニルモノアミノ化
合物の加水分解への前記１項記載の性質を有するγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼの使用、 に関する。
以下に本発明を特にその好ましい態様に関して詳細に
説明する。
説明する。
γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−GTP）は
前記定義された式Ｉを有するα−アミノアジビニルモノ
アミノ化合物の、対応する酸およびモノアミノ化合物へ
の加水分解を触媒する。基質として７−アミノセフアロ
スポラン酸誘導体を使用するのが好ましい。
前記定義された式Ｉを有するα−アミノアジビニルモノ
アミノ化合物の、対応する酸およびモノアミノ化合物へ
の加水分解を触媒する。基質として７−アミノセフアロ
スポラン酸誘導体を使用するのが好ましい。
この酵素は微生物の細胞質および細胞外に存在しそし
て分子量40,000〜80,000、好ましくは50,000〜70,000、
特に55,000〜65,000および等電点pH4.4〜5.9、好ましく
は4.8〜5.5により特徴づけられうる。基質としてのＬ−
γ−グルタミルｐ−ニトロアニリドにとつて最適のpHは
6.5〜10である。同じ基質に対し本発明によるトランス
ペプチダーゼはpH8でKmが９〜36μＭ、好ましくは15〜2
0μＭ、特に17.8μＭである。
て分子量40,000〜80,000、好ましくは50,000〜70,000、
特に55,000〜65,000および等電点pH4.4〜5.9、好ましく
は4.8〜5.5により特徴づけられうる。基質としてのＬ−
γ−グルタミルｐ−ニトロアニリドにとつて最適のpHは
6.5〜10である。同じ基質に対し本発明によるトランス
ペプチダーゼはpH8でKmが９〜36μＭ、好ましくは15〜2
0μＭ、特に17.8μＭである。
アザセリンまたはヨードアセトアミドの存在下で本発
明によるγ−GTPは不可逆的に阻害される。銅、水銀、
およびセリンと硝酸塩との混合物の存在下、ならびに７
−アミノセフアロスポラン酸の存在下でこの酵素は可逆
的な阻害を示す。
明によるγ−GTPは不可逆的に阻害される。銅、水銀、
およびセリンと硝酸塩との混合物の存在下、ならびに７
−アミノセフアロスポラン酸の存在下でこの酵素は可逆
的な阻害を示す。
γ−GTPはヨーロツパ特許出願EP 0,275,901号にも記
載されるように微生物を用いて調製される。この方法で
は細菌、特にシユードモナス、プロテウス、アースロバ
クターおよびバチルス属の細菌をγ−GTPが栄養培地中
に蓄積されるまで栄養培地中で培養する。適当な例をあ
げれば、シユードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）ATCC 17390、シユードモナス・アエルギノザ（P.aer
uginosa）NCTC 10701、プロテウス・プルガリス（Prote
us vulgaris）ATCC 9634、アースロバクター・パラフイ
ネウス（Arthrobacter parafineus）ATCC 31917ならび
にシユードモナス・フラグ（P.fragi）DSM 3881および
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）IFO 3025
である。バチルス・スブチリスIFO 3025から得られる酵
素が特に好ましい。前記微生物の突然変異体および変種
も適する。
載されるように微生物を用いて調製される。この方法で
は細菌、特にシユードモナス、プロテウス、アースロバ
クターおよびバチルス属の細菌をγ−GTPが栄養培地中
に蓄積されるまで栄養培地中で培養する。適当な例をあ
げれば、シユードモナス・プチダ（Pseudomonas putid
a）ATCC 17390、シユードモナス・アエルギノザ（P.aer
uginosa）NCTC 10701、プロテウス・プルガリス（Prote
us vulgaris）ATCC 9634、アースロバクター・パラフイ
ネウス（Arthrobacter parafineus）ATCC 31917ならび
にシユードモナス・フラグ（P.fragi）DSM 3881および
バチルス・スブチリス（Bacillus subtilis）IFO 3025
である。バチルス・スブチリスIFO 3025から得られる酵
素が特に好ましい。前記微生物の突然変異体および変種
も適する。
微生物は場合により空気または酸素を導入しながら例
えば振盪下あるいは振盪フラスコまたは発酵器中で撹拌
下に個々にあるいは混合培養にて好気適に深部培養され
る。発酵は温度約20〜37℃、好ましくは約25〜30℃、特
に28〜30℃で実施できる。pH5〜8.5好ましくは5.5〜8.0
で発酵が行われる。これらの条件下で培養ブロス中に一
般に１〜３日後に酵素がかなり蓄積する。γ−GTPの合
成は対数増殖後期に始まりそして定常期に最大に達す
る。細胞質の酵素の生成はHPLC分析により活性を検査す
ることによるかあるいは測光的に追跡できる。
えば振盪下あるいは振盪フラスコまたは発酵器中で撹拌
下に個々にあるいは混合培養にて好気適に深部培養され
る。発酵は温度約20〜37℃、好ましくは約25〜30℃、特
に28〜30℃で実施できる。pH5〜8.5好ましくは5.5〜8.0
で発酵が行われる。これらの条件下で培養ブロス中に一
般に１〜３日後に酵素がかなり蓄積する。γ−GTPの合
成は対数増殖後期に始まりそして定常期に最大に達す
る。細胞質の酵素の生成はHPLC分析により活性を検査す
ることによるかあるいは測光的に追跡できる。
γ−GTPの生成に使用される栄養溶液は0.2〜５％、好
ましくは0.5〜２％の有機窒素化合物ならびに無機塩を
含有する。有機窒素化合物としては下記のもの、すなわ
ち、アミノ酸、ペプトン、さらに肉エキス、例えばとう
もろこし、小麦、豆類、大豆、あるいは木綿植物の粉砕
された種子、アルコール製造の蒸留残留物、肉粉あるい
は酵母エキスが適当である。栄養溶液は無機塩として例
えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛および
マンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩、または燐酸塩を含
有でき、アンモニウム塩および硝酸塩も含有できる。
ましくは0.5〜２％の有機窒素化合物ならびに無機塩を
含有する。有機窒素化合物としては下記のもの、すなわ
ち、アミノ酸、ペプトン、さらに肉エキス、例えばとう
もろこし、小麦、豆類、大豆、あるいは木綿植物の粉砕
された種子、アルコール製造の蒸留残留物、肉粉あるい
は酵母エキスが適当である。栄養溶液は無機塩として例
えばアルカリ金属、アルカリ土類金属、鉄、亜鉛および
マンガンの塩化物、炭酸塩、硫酸塩、または燐酸塩を含
有でき、アンモニウム塩および硝酸塩も含有できる。
同化可能な炭水化物を添加するとバイオマス収量が高
まる。炭水化物も同様に前記濃度で添加されうる。好ま
しい炭素源として例えばグルコースあるいはスクロース
のような糖、ならびに麦芽エキスをような炭水化物含有
天然産物が栄養溶液に添加されうる。
まる。炭水化物も同様に前記濃度で添加されうる。好ま
しい炭素源として例えばグルコースあるいはスクロース
のような糖、ならびに麦芽エキスをような炭水化物含有
天然産物が栄養溶液に添加されうる。
最適の発酵条件はそれぞれの微生物で異なるが、当業
者にはすでに知られているかあるいは簡単な予備試験に
より設定できる。
者にはすでに知られているかあるいは簡単な予備試験に
より設定できる。
精製は古典的な方法に従いリゾチーム消化、硫酸アン
モニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフイーおよびゲ
ル透過クロマトグラフイーにより行うことができる。酵
素の場合は慣用の方法により行うことができる（Colowi
ck法、Meth.Enzymol.X L IV）。
モニウム沈澱、イオン交換クロマトグラフイーおよびゲ
ル透過クロマトグラフイーにより行うことができる。酵
素の場合は慣用の方法により行うことができる（Colowi
ck法、Meth.Enzymol.X L IV）。
酵素反応には、β−ラクタマーゼ不活性剤例えばクラ
ブラン酸またはチエナマイシンを添加して細胞全体を遊
離または固定化された形態で用いることもできるし、あ
るいは同様に担体に結合されていることができる単離さ
れた酵素を用いることもできる。細胞全体を固定するの
に適する物質の例をあげれば、キサトン、アルギネー
ト、κ−カラゲーニン、ポリアクリルヒドラジドおよび
文献（K.Venkatsubramanian氏のImmob.Cells（1979）、
ACS Symposium Series、106頁）記載の方法から知られ
た他の物質である。
ブラン酸またはチエナマイシンを添加して細胞全体を遊
離または固定化された形態で用いることもできるし、あ
るいは同様に担体に結合されていることができる単離さ
れた酵素を用いることもできる。細胞全体を固定するの
に適する物質の例をあげれば、キサトン、アルギネー
ト、κ−カラゲーニン、ポリアクリルヒドラジドおよび
文献（K.Venkatsubramanian氏のImmob.Cells（1979）、
ACS Symposium Series、106頁）記載の方法から知られ
た他の物質である。
加水分解反応はpH約6.6〜８および温度約28〜38℃で
実施するのが最も適当である。好ましい式Ｉの化合物は
R1が基 （式中R2は水素、OHまたは−Ｏ−CO−CH3である）を意
味する化合物である。
実施するのが最も適当である。好ましい式Ｉの化合物は
R1が基 （式中R2は水素、OHまたは−Ｏ−CO−CH3である）を意
味する化合物である。
γ−GTPは特にセフアロスポリンＣから７−アミノセ
フアロスポラン酸を得るのに工業的に重要である。しか
しながらこれまでは常にはじめに酵母（Trigonopsis va
riabilis）を用いてセフアロスポリンＣからグルタリル
−７−アミノセフアロスポラン酸を生成させ、次にこれ
を第２の反応段階ではじめて酵素的に加水分解して７−
アミノセフアロスポラン酸を生成させていた。本発明方
法を用いることにより、セフアロスポリンＣからただ一
つの段階で７−アミノセフアロスポラン酸を製造するこ
とが可能となつた。
フアロスポラン酸を得るのに工業的に重要である。しか
しながらこれまでは常にはじめに酵母（Trigonopsis va
riabilis）を用いてセフアロスポリンＣからグルタリル
−７−アミノセフアロスポラン酸を生成させ、次にこれ
を第２の反応段階ではじめて酵素的に加水分解して７−
アミノセフアロスポラン酸を生成させていた。本発明方
法を用いることにより、セフアロスポリンＣからただ一
つの段階で７−アミノセフアロスポラン酸を製造するこ
とが可能となつた。
以下の実施例により本発明を詳細に説明する。％表示
は別に断わりなければ重量によるものとする。
は別に断わりなければ重量によるものとする。
実施例 １ γ−GTP産生性微生物菌株を下記組成の斜面寒天上で
維持する。
維持する。
グルコース 1 ％ カゼインペプトン 0.4 ％ 肉エキス 0.4 ％ 酵母エキス 0.05％ 肝臓エキス 0.05％ NaCl 0.25％ pH7.2 斜面管を28℃で２日間インキユベートする。次に細胞
を生理食塩溶液10mlで洗い去り、そしてこの懸濁液1ml
を容量300mlの三角フラスコ中の下記組成の前培養物50m
lを接種するのに使用する。
を生理食塩溶液10mlで洗い去り、そしてこの懸濁液1ml
を容量300mlの三角フラスコ中の下記組成の前培養物50m
lを接種するのに使用する。
ペプトン １ ％ 麦芽エキス 0.5％ pH7.0 このフラスコを回転振盪器上30℃で24時間190rpmでイ
ンキユベートする。この培養物2.5mlを主培養物50mlの
接種原として用いる。
ンキユベートする。この培養物2.5mlを主培養物50mlの
接種原として用いる。
バチルス ペプトン 0.12 ％ 酵母エキス 0.12 ％ グルコース 0.25 ％ Na−ラクテート（60％） 5.6 ml NH4Cl 0.12 ％ K2HPO4 0.12 ％ KH2PO4 0.034 ％ MgSO4×7H2O 0.025 ％ NaCl 0.5 ％ KCl 0.5 ％ CaCl2×2H2O 0.0015 ％ MnCl2×4H2O 0.0007 ％ Fe（NH4）サイトレート 0.00015％ この培養物を28℃および振盪頻度190rpmで24時間イン
キユベーシヨンしそして次に遠心分離することにより収
穫する。
キユベーシヨンしそして次に遠心分離することにより収
穫する。
下記の表にいくつかの菌株のγ−GTP活性を示す。
実施例 ２ 実施例１と同様にしてB.subtilis IFO 3025を用いて
前培養物を調製する。この培養物50mlを５−発酵器中
の主培養溶液２の接種原として用いる。菌株は34℃お
よび酸素分圧70％で培養する。γ−GTPの形成を測光に
より追跡しそして酵素力価が最高になつたところで培養
物を収穫する。所定の条件下にγ−GTPの力価は150mU/m
l培養液に達する。
前培養物を調製する。この培養物50mlを５−発酵器中
の主培養溶液２の接種原として用いる。菌株は34℃お
よび酸素分圧70％で培養する。γ−GTPの形成を測光に
より追跡しそして酵素力価が最高になつたところで培養
物を収穫する。所定の条件下にγ−GTPの力価は150mU/m
l培養液に達する。
実施例 ３ ９の培養溶液を十字流過（排除限界300,000ダル
トン）により培養液とバイオマスに分離する。かくし
て得られた培養液は1350Uのγ−GTP活性を含有する。
トン）により培養液とバイオマスに分離する。かくし
て得られた培養液は1350Uのγ−GTP活性を含有する。
70％飽和となるまで硫酸アンモニウムを添加すること
により酵素を沈澱させそしてこの量の1/10中に再びと
る。pH8.0の20mMトリスで透析したのち、DEAEセルロー
スカラム（DE52、Whatman）によりさらに酵素を精製す
る。活性溶出液を合して濃縮する。かくして得られたγ
−GNP製品（γ−GTP約25U/ml）を反応に用いる。
により酵素を沈澱させそしてこの量の1/10中に再びと
る。pH8.0の20mMトリスで透析したのち、DEAEセルロー
スカラム（DE52、Whatman）によりさらに酵素を精製す
る。活性溶出液を合して濃縮する。かくして得られたγ
−GNP製品（γ−GTP約25U/ml）を反応に用いる。
実施例 ４ デアセチル−CPCを調製的に反応させるのに下記混合
物が選択される。
物が選択される。
実施例３におけるようにして精製された酵素濃縮物10
0μ、およびpH7.3の20mM燐酸カリウム緩衝液中に溶解
した40mMデアセチル−CPC100μを33℃でインキユベー
トする。
0μ、およびpH7.3の20mM燐酸カリウム緩衝液中に溶解
した40mMデアセチル−CPC100μを33℃でインキユベー
トする。
選択された条件下に16％までのデアセチル−７−アミ
ノセフアロスポラン酸が生成する。
ノセフアロスポラン酸が生成する。
実施例 ５ 実施例４に記載のインキユベーシヨン条件と同様にし
て３％の７−アミノセフアロスポラン酸がCPCから遊離
される。
て３％の７−アミノセフアロスポラン酸がCPCから遊離
される。
実施例 ６ γ−GTP活性の測定 ａ） HPLCアツセイ 80mMデアセチル−CPCの50μをpH5.0の250mM燐酸カ
リウム緩衝液100〜140μおよび酵素溶液10〜50μと
混合し、33℃でインキユベーシヨンする。10分後毎に試
料20μを採取する。メタノール20μを用いて反応を
停止させる。これを遠心分離しそして水で1:10に希釈す
る。試料10μを７−アミノセフアロスポラン酸の含量
に関しHPLCで検査する。
リウム緩衝液100〜140μおよび酵素溶液10〜50μと
混合し、33℃でインキユベーシヨンする。10分後毎に試
料20μを採取する。メタノール20μを用いて反応を
停止させる。これを遠心分離しそして水で1:10に希釈す
る。試料10μを７−アミノセフアロスポラン酸の含量
に関しHPLCで検査する。
定常相:C−18シリカゲル 移動相:H2O中の50mM KH2PO4/MeOH（80:20） ＋0.001％硫酸テトラブチルアンモニウム ｂ） 測光アツセイ Ｌ−γ−グルタミル−ｐ−ニトロアニリド（166μ
Ｍ）600μ、燐酸カリウム緩衝液（pH5.7、50mM）300
μ、および培養溶液100μを相互に混合し、37℃で
インキユベートする。
Ｍ）600μ、燐酸カリウム緩衝液（pH5.7、50mM）300
μ、および培養溶液100μを相互に混合し、37℃で
インキユベートする。
Claims (5)
- 【請求項１】バチルス・スブチリスを栄養培地中で培養
することにより得られる、下記性質： −分子量が40,000〜80,000、 −等電点がpH4.4〜5.9、 −基質としてのＬ−γ−グルタミルパラニトロアニリド
に対し最適pHが6.5〜10でpH8でのKmが９〜36μＭ、そし
て −式Ｉ （式中、R1はアミノ酸、ジペプチド、セフェム、セファ
ムあるいはそれらの誘導体を意味する）を有するα−ア
ミノアジピニルモノアミノ化合物の加水分解性 を有するγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（γ−GT
P）。 - 【請求項２】バチルス・スブチリスを請求項１記載のγ
−GTPが栄養培地中に蓄積されるまで栄養培地中で培養
することからなる、請求項１記載のγ−グルタミルトラ
ンスペプチダーゼの製法。 - 【請求項３】バチルス・スブチリスIFO 3025を培養する
ことによりγ−グルタミルトランスペプチダーゼを得る
ことからなる請求項２記載の方法。 - 【請求項４】式Ｉ （式中、R1はアミノ酸、ジペプチド、セフェム、セファ
ムまたはそれらの誘導体を意味する）を有するα−アミ
ノアジピニルモノアミノ化合物を請求項１記載のγ−グ
ルタミルトランスペプチダーゼを使用して加水分解する
方法。 - 【請求項５】式Ｉ〔式中R1は基 （式中R2は水素、OHまたは−Ｏ−CO−CH3である）を意
味する〕を有する化合物を加水分解することからなる、
請求項４記載の方法。
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