KR0149656B1 - 알파-아미노아디피닐-모노아미노 화합물의 효소적 가수분해 방법 - Google Patents

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Description

α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물의 효소적 가수분해 방법

본 발명은 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물의 가수분해를 촉매하는 γ-글루타밀트랜스펩티다제, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것이다.

γ-글루타밀트랜스펩티다제(이후에서는 γ-GTP라 칭함)는 동물조직 및 미생물의 아미노산 대사 및 글루타티온 회로에서 중요한 역할을 한다[참조: Meth. Enzymol. 77, 237(1981)]. 이들은 각종 아미노산을 이들의 γ-글루타밀 유도체 형태로 수송, 바실러스(Bacillus)속에서 폴리글루탐산의 형성 및 글루타티온(γ-글루타밀-시스테이닐-글리신)의 분해 역할을 담당한다.

아디피닐-또는 글루타릴-모노아미노 화합물을 가수분해하기 위해 γ-GTP를 이용하는 것에 대하여는 이미 제안된 바 있다(유럽 특허원 제0,275,901호).

놀랍게도 본 발명에 이르러 γ-GTP가 일반식 (I)의 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물의 가수분해를 촉매한다는 사실이 밝혀졌다.

상기식에서, R¹은 아미노산, 디펩타이드, 세펨, 세팜 또는 이의 유도체를 나타낸다.

그런데, 이제까지는 상기 화합물의 C₄또는 C₆측쇄중 어느 것도 γ-GTP의 활성중심(active center)에 의해 수용되지 않는다고 생각되어져 왔기 때문에 더욱 놀라운 것이다[참조:Agric. Biol. Chem. 42, 1978, p371-81].

그러므로 본 발명은,

1. 분자량이 40,000 내지 80,000이고, 등전점이 pH 4.4 내지 5.9이며, 기질이 L-γ-글루타밀파라니트로아닐리드일 경우 최적 pH 범위는 6.5 내지 10이고, pH 8에서의 Km은 9 내지 36μM이며, 하기 일반식(I)의 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물을 가수분해시키는 특성을 지닌 γ-글루타밀트랜스펩티다제(γ-GTP)에 관한 것이다.

상기식에서, R¹은 아미노산, 디펩타이드, 세펨, 세팜 또는 이들의 유도체이다.

2. 수도모나스(Pseudomonas), 프로테우스(Proteus), 아르트로박터(Arthrobacter) 및 바실러스(Bacillus) 속의 세균을, 상기의 γ-GTP가 영양배지내에 축적될때까지, 영양배지중에서 배양시킴을 특징으로 하여, 상기 1.에서 언급한 특성을 지니는 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 제조하는 방법에 관한 것이다.

3. 일반식 (I)의 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물을 가수분해시키기 위한, 상기 1.에서 언급한 특성을 지닌 -글루타밀트랜스펩티다제의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 하기에서, 특히 이의 바람직한 양태에서 더욱 상세하게 기술된다. 본 발명은 또한 특허청구범위에서 정의된다.

γ-글루타밀트랜스펩티다제(γ-GTP)는 상술한 바와 같이. 일반식(I)의 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물의 가수분해를 촉매하여, 상응하는 산 및 모노아미노 화합물을 생성시킨다. 7-아미노세팔로스포란산 유도체를 기질로서 사용하는 것이 바람직하다.

상기 효소는 미생물의 외질(periplasm) 및 세포외에서 생성되며, 40,000 내지 80,000, 바람직하게는 50,000 내지 70,000, 특히 바람직하게는 55,000 내지 65,000의 분자량 및 pH 4.4 내지 5.9, 바람직하게는 4.8 내지 5.5에서의 등전점으로 특징화될 수 있다. 기질로서 L-γ-글루타밀파라니트로아닐리드가 사용될 때 최적의 pH는 6.5 내지 10이다. 본 발명에 따른 γ-트랜스펩티다제의 Km은 동일한 기질에 대해 pH 8에서 , 9 내지 36㎛, 바람직하게는 15 내지 20㎛, 특히 17.8㎛이다.

본 발명에 따른 γ-GTP는 아자세린 또는 요오도아세트아미드의 존재하에서 비가역적으로 억제된다. 상기 효소는 구리, 수은 및 세린과 붕산염 혼합물의 존재하 뿐만 아니라 7-아미노세팔로스포란산의 존재하에서 가역적으로 억제된다.

γ-GTP는 문헌[참조; 유럽특허원 제0,275,901호]에 기술된 바와 같이 미생물에 의해 제조된다. 상기 문헌의 방법에서는 세균, 특히 수도모나스,프로테우스,아르트로박터 및 바실러스 속의 세균을, 영양배지내에 γ-GTP가 축적될때까지 영양배지중에서 배양한다. 이러한 목적으로 사용되는 세균의 적합한 예는 다음과 같다;수도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) ATCC 17390, 수도모나스 에어루기노사(P. aeruginosa) NCTC 10701, 프로테우스 불가리스(Proteus vulgaris) ATCC 9634, 아르트로박터 파라피네우스(Arthrobacter parafineus) ATCC 31917, 수도모나스 프라지(P. fragi) DSM 3881 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) IFO 3025, 바실러스 서브틸리스 IFO 3025에서 수득된 효소가 특히 바람직하다. 상기 미생물들의 돌연변이체 및 변이체도 또한 적합하다.

이 미생물을 호기조건하에서, 단독 또는 혼합 배양법으로, 예를 들어 진탕용 플라스크 또는 발효조 중에서 진탕시키거나 교반시켜 침액시키고, 경우에 따라 공기 또는 산소를 통과시키며 배양한다. 발효는 20 내지 37℃, 바람직하게는 25 내지 30℃, 특히 28 내지 30℃의 온도범위내에서 진행시킨다. 발효는 5 내지 8.5, 바람직하게는 5.5 내지 8.0의 pH 범위내에서 진행시킨다. 상기 조건하에서, 배양액은 통상적으로 1 내지 3일 경과후에 현저한 효소의 축적을 나타낸다. γ-GTP의 합성은 대수증식기 후기에 시작되어 성장 정체기에 최고치에 달한다.

외질성 효소의 생성정도는 HPLC 분석에 의한 활성분석 또는 측광법으로 확인될 수 있다.

γ-GTP를 생성시키는데 이용되는 영양용액은 0.2내지 5%, 바람직하게는 0.5 내지2%의 유기질소 화합물 및 무기염을 함유한다. 적합한 유기질소 화합물은 아미노산, 펩톤, 육류추출물, 종자가루.(예:옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 목화의 종자가루), 알콜제조시 생성되는 증류 잔사, 육류가루 또는 효모추출물이다. 영양용액에 함유될 수 있는 무기염의 예에는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금 속의 클로라이드, 탄산염, 황산염 또는 인산염, 철, 아연 및 망간 뿐만아니라 암모늄염 및 질산염이 있다.

동화성 탄수화물을 가하면 생체물질(Biomass)의 수율이 증대된다. 탄수화물은 상기 언급된 농도내에서 첨가할 수 있다. 바람직한 탄소원으로서, 예를 들어 당(예:글루코즈 또는 수크로즈), 및 탄수화물-함유 천연산물 (예:맥아추출물)을 영양용액에 가할수 있다.

적정 발효조건은 각 미생물마다 다르지만, 이것은 본 분야의 전문가에게 이미 공지된 것이거나, 용이한 예비 시험으로 설정될 수 있는 것 들이다.

정제는 라이소자임(lysozyme)분해, 황산암모늄 침전, 이온교환 및 겔 투과크로마토그래피법을 통한 통상적인 방법으로 수행될 수 있다. 효소는 통상적인 방법에 의해 커플링 될 수 있다[참조: Colowick and Kaplan, Meth. Enzymal. , vol. XLIV] .

효소 반응을 위해서, 유리형 또는 고정형의 전(whole) 세포에 β-락타마제불활성화제(예:클라불란산 또는 티에나마이신), 및 담체가 결합될 수 있는 분리상태의 효소를 가하여 이용할수 있다. 전세포의 고정화에 적합한 물질은 예를들어 치토산, 알지네이트, K-카라기난, 폴리아크릴로하이드라지드 및 문헌[참조; K.Venkatsubramanian, Immob. Cells(1979), ACS Symposium Series, p 106]에 공지된 물질이다.

가수분해 반응은 약 pH 6.6 내지 8 및 약 28 내지 38℃의 온도에서 수행하는 것이 가장 바람직하다. 일반식(I)의 바람직한 화합물은 R¹이 라디칼

γ-GTP는 세팔로스포린 C로부터 7-아미노세팔로스포란산을 수득하는데 있어서 특히 산업적으로 중요하다. 그러나 지금까지 효모(Trigonopsis variabilis)는 세팔로스포린 C로부터 효소적으로만 가수분해시킬 수 있는 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 제조하고, 두 번째 반응 단계로, 7-아미노세팔로스포란산을 수득하는 데 항상 이용되고 있다. 본 발명에 따라, 세팔로스포린 C로부터 단일 단계를 통해 7-아미노세팔로스포란산을 수득할 수 있게 되었다.

본 발명은 하기 실시예에서 더욱 상세하게 기술된다. 별도의 언급이 없는한, % 데이터는 중량을 기준으로 한 것이다.

[실시예 1]

γ-GTP-생성 미생물 균주를 하기 성분의 한천 사면 배지에서 유지시킨다.

글루코즈 1%

카제인 펩톤 0.4%

육류 추출물 0.4%

효모 추출물 0.05%

간(liver) 추출물 0.05%

NaCl 0.25%

pH 7.2

사면배지 튜브를 28℃에서 2일간 배양한다. 이어서 세포를 생리식염수 10ml로 세정하고, 상기 현탁액 1ml를 사용하여 300ml 용량의 삼각 플라스크중 하기 조성의 예비 배양액 50ml에 접종한다.

펩톤 1%

맥아 추출물 0.5%

pH 7.0

플라스크를 30℃에서, 회전식 진탕기내에서 190rpm으로 24시간동안 배양한다. 이 배양액 2.5ml를 하기 조성의 본 배양액 50ml에 접종하기 위해 사용한다.

바실러스(Bacilli)

펩톤 0.12%

효모 추출물 0.12%

글루코즈 0.25%

Na 락테이트(60%) 5.6ml

NH₄Cl 0.12%

K₂HPO₄0.12%

KH₂PO₄0.034%

MgSO₄× 7H₂O 0.025%

NaCl 0.5%

KCl 0.5%

CaCl₂× 2H₂O 0.0015%

MnCl₂× 4H₂O 0.0007%

Fe(NH₄)시트레이트 0.00015%

이 배양액을 28℃에서 190rpm의 진탕 빈도로 24시간 동안 배양한 다음, 원심 분리하여 수집한다.

몇몇 균주의 γ-GTP 활성은 하기 표에 기재되어 있다.

[실시예 2]

바실러스 서브틸리스 IFO 3025의 예비배양물을 실시예 1에서와 동일하게 배양한다. 상기 배양물 50ml를 5ℓ 용량의 발효조중의 본 배양액 2ℓ에 접종하는데 사용한다. 균주를 34℃에서, 산소분압 70%로 배양한다. γ-GTP의 생성은 측광법으로 확인하고, 효소역가가 최대일 때 배양물을 수집한다. 상기 조건하에서, γ-GTP 역가는 배양액 ml당 150mU에 달한다.

[실시예 3]

배양액 9ℓ를 교차-유동여과법(배출한계:300,000달톤)을 사용하여 배양여액 및 생체물질로 분리한다. 상기와 같이 수득된 배양여액은 1350U의 γ-GTP 활성을 나타낸다.

효소는 황산 암모늄을 가하여 70% 포화도로 침전시키고, 다시 1/10의 용적으로 용해시킨다. 20mM 트리스(pH 8.0)에 대해 투석시킨후, 효소를 DEAE-셀룰로즈칼럼(DE52, Whatman)상에서 더욱 정제시킨다. 활성 용출물을 합하고 용출시킨다. 이렇게하여 수득한 γ-GTP 생성물(ml당 약 25U의 γ-GTP를 함유)은 전환 과정에 사용된다.

[실시예 4]

하기의 혼합물은 디아세틸-CPC의 전환과정을 위해 선택된 것이다:실시예 3에서 제조된 효소 농축물 100μl, 및 40mM의 디아세틸-CPC 100μl를 인산 칼륨 완충액(20mM, pH 7.39)에 용해시키고, 33℃의 온도에서 반응시킨다.

16% 이하의 디아세틸-7-아미노세팔로스포란산을 선택된 조건하에서 생성시킨다.

[실시예 5]

실시예 4에 기술된 것과 동일한 반응조건으로, CPC로부터 3%의 7-아미노세팔로스포란산을 유리시킨다.

[실시예 6]

γ-GTP 활성의 측정

a) HPLC 분석

80mM 데아세틸-CPC 50μl를 250mM의 인산 칼륨 완충액(pH 5.0) 100 내지 140μl 및 효소용액 10 내지 50μl와 혼합하고 33℃에서 배양한다. 시료 20μl를 매 10분마다 용해시킨다. 반응을 메탄올 20μl로 종료시킨다. 원심분리한후, 물을 사용하여 1:10의 비율로 희석한다. 시료 10μl를 HPLC로 분석하여 7-아미노세팔로스로란산 함량을 측정한다.

고정상:C-18 실리카겔

이동상:HO/MeOH(80:20) 중의 50mM KHPO+0.001% 테트라부틸암모늄 셀페이트

b) 측광법 분석

L-γ-글루타밀-p-니트로아닐리드(166μM) 660μl, 50mM 인산칼륨 완충액(pH 5.7) 300μl 및 배양용액 100μl를 함께 혼합하고 37℃에서 배양한다.

Claims (7)

1. 분자량이 40,000 내지 80,000이고, 등전점이 pH 4.4 내지 5.9이며, 기질이 L-γ-글루타밀파라니트로아닐리드일 경우 최적 pH 범위가 6.5 내지 10이고, pH 8에서의 Km은 9 내지 36㎛이며, 일반식 (I)의 α-아미노아디피닐-모노아미노 화합물을 가수분해시키는 특성을 지닌, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 배양에 의해 생성되는 γ-글루타밀트랜스펩티다제(γ-GTP).

   

   상기식에서, R¹은 아미노산, 디펩타이드, 세펨, 세팜 또는 이의 유도체이다.
2. 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 상기 제1항에 따른 γ-GTP가 영양배지내에 축적될때까지, 영양배지중에서 배양시킴을 특징으로 하여, 제1항에 따른 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 제조하는 방법.
3. 제2항에 있어서, γ-글루타밀트랜스펩티다제가 바실러스 서브틸리스(B. subtilis) IFO 3025를 배양시킴으로써 수득되는 방법.
4. 제1항에 따른 γ-글루타밀트랜스펩티다제를 사용하여 일반식(I)의 α-아미노 아디피닐-모노아미노 화합물을 가수분해시키는 방법.

   

   상기식에서, R¹은 아미노산, 디펩타이드, 세펨, 세팜 또는 이의 유도체를 나타낸다.
5. 제4항에 있어서, R¹이 라디칼

   

   나타내는 일반식(I)의 화합물을 가수분해시키는 방법.
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, pH 6.6 내지 8.0에서 가수분해시키는 방법.
7. 제4항 또는 제5항에 있어서, 28 내지 38℃에서 가수분해시키는 방법.