JP3778297B2 - 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 - Google Patents
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Description
【産業上の利用分野】
本発明は、熱安定性に優れた新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法に関するものである。
【0002】
【従来の技術】
アルカリフォスファターゼは、主として抗体、抗原、核酸等の生体物質量をそれらに結合できる物質量で評価する際に、その結合できる物質の標識用酵素として様々なバイディングアッセイに用いてられている。例えばイムノアッセイの分野では、ヘテロジニアス・イムノアッセイ法にペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素とともによく利用されており、抗原、抗体に直接に、またはアビジンやビオチンなどを介して、間接に結合させて利用されている。また、近年は遺伝子解析の分野においてもDNAプローブ等に直接に、またはアビジンやビオチンを介して、間接に結合して利用されている。
【0003】
抗原、抗体または核酸の検出に適したアルカリフォスファターゼの基質としては、p−ニトロフェニルリン酸、5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルリン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、ジオキセタン発光基質(PPD、AMPPDなど)が従来から使用されている。これらの基質とアルカリフォスファターゼとの反応により生じた可視光線、蛍光、発光を測定することにより、生体物質の量が測定できる。
【0004】
標識用酵素が備える条件としては、高純度、高い安定性、ターンオーバーが高い、標識しやすい官能基を持つ、基質に対するKm値が低い、バックグラウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられる。様々な標識酵素の中でアルカリフォスファターゼがもつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低いことおよび検出に適した基質があることなどである。上記した性質を最も兼ね備えたアルカリフォスファターゼとしては、仔牛小腸由来のもの、大腸菌のもの等が従来から知られている。
【0005】
【発明が解決しようとする課題】
仔牛小腸由来のアルカリフォスファターゼは、比活性が高いことおよび糖鎖を有しているため、様々な標識法が使用できる。しかし、その一方で、安定性に乏しいことが知られている(Besman,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)) 。また、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼは安定性が高く、純度も高い標品を容易に得ることが出来るが、比活性が低く、仔牛小腸由来のものの3%程度しかないことが知られている。また糖鎖を有さないので、標識すべき生体物質と結合させる方法が限られている(Reid,R.W.,wilson,I.B. in “The enzymes", 3rd.Ed.(Boyer,P.D.,Ed),373(1971)。このため高純度のものが得やすい微生物より安定性が高く、しかも糖鎖を有するアルカリフォスファターゼが求められていた。
【0006】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アクレモニウム(Acremonium)属に属する微生物から、熱安定性に優れ、糖鎖を有する新規アルカリフォスファターゼを見い出し、本発明を完成するに至った。
【0007】
すなわち、本発明は下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼである。
1.次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル + H2 O → アルコール + オルソリン酸
2.基質特異性:p−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、NADPに作用する。
3.至適温度:50℃
4.至適pH:pH11以上
5.熱安定性:55℃以下(pH7.5、15分間)
6.安定pH:pH6〜11(25℃、16時間)
7.Km値:0.41mM(p−ニトロフェニルリン酸に対する)
8.分子量:(ゲルろ過法) 630,000
(SDS−PAGE) 56,000
9.糖鎖を有する。
【0008】
また本発明はアクレモニウム属に属し、アルカリフォスファターゼ生産能を有する菌株を培地にて培養し、培養物より該アルカリフォスファターゼを採取することを特徴とするアルカリフォスファターゼの製造法である。
【0009】
本発明の酵素の起源は、上記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼを産生するものであれば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良い。好ましくは、上記性質を有するアルカリフォスファターゼを産生しうるアクレモニウム(Acremonium)属カビであって、好適な例としてはアクレモニウム・ストリクタム(Acremonium strictum)TE5084が挙げられる。アクレモニウム・ストリクタムTE5084(FERM P-14682)は福井県敦賀市の土壌より分離した菌株であり、その菌学的性質は以下の通りである。
【0010】
(a)培養的・形態的性質
(1)麦芽エキス寒天培地:20℃、10日間培養で集落の直径は14〜16mmに成長した。集落表面の色は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しくはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ8〜25μmであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさは4〜6×1〜2μm、楕円形から円筒状で滑面を有していた。厚膜胞子は形成しなかった。
(2)オートミール寒天培地:20℃、10日間培養で集落の直径は22〜24mmに成長した。集落表面の色は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しくはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ8〜25μmであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさは4〜6×1〜2μm、楕円形から円筒状で滑面を有していた。厚膜胞子は形成しなかった。
【0011】
【0012】
上記菌学的性質同定のための実験法および分類同定の基準は、主として宇田川俊一、松田良男監訳「食品菌学ハンドブック」(1984)医歯訳出版およびK.H.Domsch and W.Gams “Compendium of Soil fungi",volume 1(1993)IHW-Verlag を参考にした。以上の文献および菌学的性質を参考にすると、アクレモニウム・ストリクタム(Acremonium strictum)TE5084(FERM P−14682)と命名した。
【0013】
本発明の酵素を製造するにあたっては、上記アルカリフォスファターゼ生産菌を栄養培地に培養し、該培養物からアルカリフォスファターゼを採取することにより製造できる。
アルカリフォスファターゼ生産菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地いずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコース、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等が使用される。またアルカリフォスファターゼの生産誘導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培養温度は20〜35℃、好ましくは25〜30℃、培養pH5〜11の範囲で、好ましくは6〜10に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常1〜7日で生育し、菌体内および菌体外にアルカリフォスファターゼが生産蓄積される。
【0014】
本発明の酵素の精製法は、一般に使用される精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはDEAE(ジエチルアミノエチル)−セルロース、CM(カルボキシメチル)−セファロースなどのイオン交換クロマト法などにより精製することができる。またこれらの方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【0015】
次に、本発明のアルカリフォスファターゼの活性測定法を示す。
まず下記反応混液をキュベットに調製し、37℃で約5分予備加温する。
2.6ml 1Mジエタノールアミン緩衝液、pH10.25
0.3ml 0.1Mp−ニトロフェニルリン酸(上記緩衝液に溶解)
次に、酵素溶液0.1mlを加え、緩やかに混和後、水を対照に37℃で制御された分光光度計で405nmの吸光度変化を3〜4分間記録し、その初期直線部分から1分間当たり吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵素溶液の代わりに酵素希釈液(0.25mM MgCl2 を含む0.1Mジエタノールアミン緩衝液)を加え、上記同様に操作を行って1分間当りの吸光度を求めた。上記条件下で1分間に1マイクロモルのp−ニトロフェノールを生成する酵素量を1単位(U)とする。
【0016】
【発明の効果】
本発明によって熱安定性に優れた、糖鎖を有するアルカリフォスファターゼを得ることができる。
【0017】
【実施例】
以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。
実施例1
0.5%β−グリセロリン酸二ナトリウム、0.5%ポリペプトン、0.5%酵母エキス、0.02%硫酸マグネシウム、0.002%リン酸一カリウム、1%炭酸ナトリウムを含む培地100mlを500ml容坂口フラスコに移し、121℃、15分間オートクレーブを行った。種菌として、アクレモニウム・ストリクタムTE5084(FERM P−14682)を一白金耳植菌し、30℃で48時間培養し、種培養液とした。次に同培地6Lを10lジャーファーメンターに移し、121℃で15分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液100mlを移し、300rpm,通気量2l/分、30℃で72時間培養した。得られた培養液について遠心分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、DEAE−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロースクロマトグラフィー、セファデックスG−200によるゲルろ過により比活性2,000U/mgにまで精製した。
得られたアルカリフォスファターゼは下記特性を有していた。
1.下記反応を触媒した。
【0018】
オルソリン酸モノエステル + H2 O → アルコール + オルソリン酸
【0019】
2.基質特異性
【0020】
【表1】
【0021】
3.Km値
p−ニトロフェノールに対するKm値は、0.41mMであった。
4.至適pH
0.97Mジエタノールアミン緩衝液(pH8.0〜11.0)中での酵素活性を測定した。その結果は図1に示す通りであって、至適pHは11以上であった。
5.安定pH
グリシン塩酸緩衝液(pH2〜3)、酢酸緩衝液(pH3〜6)、K−リン酸緩衝液(pH6〜8)、トリス塩酸緩衝液(pH8〜9)、グリシンNaOH緩衝液(pH9〜10)で25℃、16時間保存してその残存活性を測定した。その結果、図2に示す通りであって、安定pHはpH6〜11であった。
6.至適温度
各温度における酵素活性を測定した。その結果は図3に示す通りであって、至適温度は50℃であった。
7.熱安定性
本発明の酵素を50mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)中で15分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。その結果は図4に示す通りであって、55℃まで安定であった。
8.金属要求性
Mg++が必須であるが、Co++、Mn++、Ca++、Ni++で代替できた。
9.分子量 630,000(ゲルろ過法)
56,000(SDS−PAGE)
10.糖含量 37%(フェノール硫酸法)
【図面の簡単な説明】
【図1】本発明酵素の反応pHと相対活性との関係を示すグラフである。
【図2】本発明酵素のpH安定性を示すグラフである。
【図3】本発明酵素の反応温度と相対活性との関係を示すグラフである。
【図4】本発明酵素の熱安定性を示すグラフである。
Claims (3)
- 下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼ。
1.次の反応を触媒する。
オルソリン酸モノエステル + H2O → アルコール + オルソリン酸
2.基質特異性:p−ニトロフェニルリン酸、β−グリセロリン酸、4−メチルウンベリフェリルリン酸、NADPに作用する。
3.至適温度:50℃
4.至適pH:pH11以上
5.熱安定性:55℃以下(pH7.5、15分間)
6.安定pH:pH6〜11(25℃、16時間)
7.Km値:0.41mM(p−ニトロフェニルリン酸に対する)
8.分子量:(ゲルろ過法) 630,000
(SDS−PAGE) 56,000
9.糖鎖を有する。 - アクレモニウム属に属し、アルカリフォスファターゼ生成能を有する菌株を培地にて培養し、培養物よりアルカリフォスファターゼを採取することを特徴とする請求項1に記載のアルカリフォスファターゼの製造法。
- アルカリフォスファターゼ生成能を有する菌株が、アクレモニウム・ストリクタムTE5084(FERM P−14682)である請求項2記載のアルカリフォスファターゼの製造法。
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