JPH08187078A - 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 - Google Patents
新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法Info
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- JPH08187078A JPH08187078A JP335495A JP335495A JPH08187078A JP H08187078 A JPH08187078 A JP H08187078A JP 335495 A JP335495 A JP 335495A JP 335495 A JP335495 A JP 335495A JP H08187078 A JPH08187078 A JP H08187078A
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- alkali phosphatase
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高い安定性を有するアルカリフォスファター
ゼを提供する。 【構成】 アクレモニウム属に属するカビが産生する、
下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼお
よびその製造法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリ
セロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡ
ＤＰに作用する。 ３．至適温度：５０℃ ４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上 ５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間） ６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ８．分子量：（ゲルろ過法） ６３０，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ５６，０００ ９．糖鎖を有する。
ゼを提供する。 【構成】 アクレモニウム属に属するカビが産生する、
下記理化学的性質を有するアルカリフォスファターゼお
よびその製造法。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリ
セロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡ
ＤＰに作用する。 ３．至適温度：５０℃ ４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上 ５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間） ６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ８．分子量：（ゲルろ過法） ６３０，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ５６，０００ ９．糖鎖を有する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、熱安定性に優れた新規
なアルカリフォスファターゼおよびその製造法に関する
ものである。
なアルカリフォスファターゼおよびその製造法に関する
ものである。
【０００２】
【従来の技術】アルカリフォスファターゼは、主として
抗体、抗原、核酸等の生体物質量をそれらに結合できる
物質量で評価する際に、その結合できる物質の標識用酵
素として様々なバイディングアッセイに用いてられてい
る。例えばイムノアッセイの分野では、ヘテロジニアス
・イムノアッセイ法にペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素とともに
よく利用されており、抗原、抗体に直接に、またはアビ
ジンやビオチンなどを介して、間接に結合させて利用さ
れている。また、近年は遺伝子解析の分野においてもＤ
ＮＡプローブ等に直接に、またはアビジンやビオチンを
介して、間接に結合して利用されている。
抗体、抗原、核酸等の生体物質量をそれらに結合できる
物質量で評価する際に、その結合できる物質の標識用酵
素として様々なバイディングアッセイに用いてられてい
る。例えばイムノアッセイの分野では、ヘテロジニアス
・イムノアッセイ法にペルオキシダーゼ、グルコースオ
キシダーゼ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素とともに
よく利用されており、抗原、抗体に直接に、またはアビ
ジンやビオチンなどを介して、間接に結合させて利用さ
れている。また、近年は遺伝子解析の分野においてもＤ
ＮＡプローブ等に直接に、またはアビジンやビオチンを
介して、間接に結合して利用されている。
【０００３】抗原、抗体または核酸の検出に適したアル
カリフォスファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ジオキセ
タン発光基質（ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤなど）が従来から使
用されている。これらの基質とアルカリフォスファター
ゼとの反応により生じた可視光線、蛍光、発光を測定す
ることにより、生体物質の量が測定できる。
カリフォスファターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェ
ニルリン酸、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル
リン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ジオキセ
タン発光基質（ＰＰＤ、ＡＭＰＰＤなど）が従来から使
用されている。これらの基質とアルカリフォスファター
ゼとの反応により生じた可視光線、蛍光、発光を測定す
ることにより、生体物質の量が測定できる。
【０００４】標識用酵素が備える条件としては、高純
度、高い安定性、ターンオーバーが高い、標識しやすい
官能基を持つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグラ
ウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられ
る。様々な標識酵素の中でアルカリフォスファターゼが
もつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低
いことおよび検出に適した基質があることなどである。
上記した性質を最も兼ね備えたアルカリフォスファター
ゼとしては、仔牛小腸由来のもの、大腸菌のもの等が従
来から知られている。
度、高い安定性、ターンオーバーが高い、標識しやすい
官能基を持つ、基質に対するＫｍ値が低い、バックグラ
ウンドが低い、検出に適した基質がある等が挙げられ
る。様々な標識酵素の中でアルカリフォスファターゼが
もつ大きな利点は、バックグラウンドが他の酵素より低
いことおよび検出に適した基質があることなどである。
上記した性質を最も兼ね備えたアルカリフォスファター
ゼとしては、仔牛小腸由来のもの、大腸菌のもの等が従
来から知られている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】仔牛小腸由来のアルカ
リフォスファターゼは、比活性が高いことおよび糖鎖を
有しているため、様々な標識法が使用できる。しかし、
その一方で、安定性に乏しいことが知られている（Besm
an,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)) 。
また、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼは安定性
が高く、純度も高い標品を容易に得ることが出来るが、
比活性が低く、仔牛小腸由来のものの３％程度しかない
ことが知られている。また糖鎖を有さないので、標識す
べき生体物質と結合させる方法が限られている（Reid,
R.W.,wilson,I.B. in "The enzymes", 3rd.Ed.(Boyer,
P.D.,Ed),373(1971)。このため高純度のものが得やすい
微生物より安定性が高く、しかも糖鎖を有するアルカリ
フォスファターゼが求められていた。
リフォスファターゼは、比活性が高いことおよび糖鎖を
有しているため、様々な標識法が使用できる。しかし、
その一方で、安定性に乏しいことが知られている（Besm
an,M.,Coleman,J.E.,J.Biol.Chem.,260,1190(1985)) 。
また、大腸菌由来のアルカリフォスファターゼは安定性
が高く、純度も高い標品を容易に得ることが出来るが、
比活性が低く、仔牛小腸由来のものの３％程度しかない
ことが知られている。また糖鎖を有さないので、標識す
べき生体物質と結合させる方法が限られている（Reid,
R.W.,wilson,I.B. in "The enzymes", 3rd.Ed.(Boyer,
P.D.,Ed),373(1971)。このため高純度のものが得やすい
微生物より安定性が高く、しかも糖鎖を有するアルカリ
フォスファターゼが求められていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アクレモニウム
（Acremonium）属に属する微生物から、熱安定性に優
れ、糖鎖を有する新規アルカリフォスファターゼを見い
出し、本発明を完成するに至った。
を解決するため鋭意研究を重ねた結果、アクレモニウム
（Acremonium）属に属する微生物から、熱安定性に優
れ、糖鎖を有する新規アルカリフォスファターゼを見い
出し、本発明を完成するに至った。
【０００７】すなわち、本発明は下記理化学的性質を有
するアルカリフォスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリ
セロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡ
ＤＰに作用する。 ３．至適温度：５０℃ ４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上 ５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間） ６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ８．分子量：（ゲルろ過法） ６３０，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ５６，０００ ９．糖鎖を有する。
するアルカリフォスファターゼである。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリ
セロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡ
ＤＰに作用する。 ３．至適温度：５０℃ ４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上 ５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間） ６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ８．分子量：（ゲルろ過法） ６３０，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ５６，０００ ９．糖鎖を有する。
【０００８】また本発明はアクレモニウム属に属し、ア
ルカリフォスファターゼ生産能を有する菌株を培地にて
培養し、培養物より該アルカリフォスファターゼを採取
することを特徴とするアルカリフォスファターゼの製造
法である。
ルカリフォスファターゼ生産能を有する菌株を培地にて
培養し、培養物より該アルカリフォスファターゼを採取
することを特徴とするアルカリフォスファターゼの製造
法である。
【０００９】本発明の酵素の起源は、上記理化学的性質
を有するアルカリフォスファターゼを産生するものであ
れば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用
いても良い。好ましくは、上記性質を有するアルカリフ
ォスファターゼを産生しうるアクレモニウム（Acremoni
um）属カビであって、好適な例としてはアクレモニウム
・ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４が
挙げられる。アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８
４(FERM P-14682)は福井県敦賀市の土壌より分離した菌
株であり、その菌学的性質は以下の通りである。
を有するアルカリフォスファターゼを産生するものであ
れば、動物、植物、微生物など如何なる起源のものを用
いても良い。好ましくは、上記性質を有するアルカリフ
ォスファターゼを産生しうるアクレモニウム（Acremoni
um）属カビであって、好適な例としてはアクレモニウム
・ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４が
挙げられる。アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８
４(FERM P-14682)は福井県敦賀市の土壌より分離した菌
株であり、その菌学的性質は以下の通りである。
【００１０】（ａ）培養的・形態的性質 （１）麦芽エキス寒天培地：２０℃、１０日間培養で集
落の直径は１４〜１６ｍｍに成長した。集落表面の色は
明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色か
ら黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しく
はビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ
８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさ
は４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有し
ていた。厚膜胞子は形成しなかった。 （２）オートミール寒天培地：２０℃、１０日間培養で
集落の直径は２２〜２４ｍｍに成長した。集落表面の色
は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色
から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若し
くはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長
さ８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大き
さは４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有
していた。厚膜胞子は形成しなかった。
落の直径は１４〜１６ｍｍに成長した。集落表面の色は
明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色か
ら黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若しく
はビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長さ
８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大きさ
は４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有し
ていた。厚膜胞子は形成しなかった。 （２）オートミール寒天培地：２０℃、１０日間培養で
集落の直径は２２〜２４ｍｍに成長した。集落表面の色
は明るいオレンジからピンク色を呈し、裏面の色は黄色
から黄褐色を呈していた。集落表面の組織は羊毛状若し
くはビロード状若しくは粘質状であった。分生子柄は長
さ８〜２５μｍであり、分生子は粘塊状に形成し、大き
さは４〜６×１〜２μｍ、楕円形から円筒状で滑面を有
していた。厚膜胞子は形成しなかった。
【００１１】（ｂ）生理学的性質
【００１２】上記菌学的性質同定のための実験法および
分類同定の基準は、主として宇田川俊一、松田良男監訳
「食品菌学ハンドブック」（１９８４）医歯訳出版およ
びK.H.Domsch and W.Gams "Compendium of Soil fung
i",volume 1(1993)IHW-Verlagを参考にした。以上の文
献および菌学的性質を参考にすると、アクレモニウム・
ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４６８２）と命名した。
分類同定の基準は、主として宇田川俊一、松田良男監訳
「食品菌学ハンドブック」（１９８４）医歯訳出版およ
びK.H.Domsch and W.Gams "Compendium of Soil fung
i",volume 1(1993)IHW-Verlagを参考にした。以上の文
献および菌学的性質を参考にすると、アクレモニウム・
ストリクタム（Acremonium strictum)ＴＥ５０８４（Ｆ
ＥＲＭ Ｐ−１４６８２）と命名した。
【００１３】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記アルカリフォスファターゼ生産菌を栄養培地に培養
し、該培養物からアルカリフォスファターゼを採取する
ことにより製造できる。アルカリフォスファターゼ生産
菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が
資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地い
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例
えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天
然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の
無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が使用される。またアルカリフォスファターゼの生産誘
導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培
養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養
ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御する
のが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育
すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、
菌体内および菌体外にアルカリフォスファターゼが生産
蓄積される。
記アルカリフォスファターゼ生産菌を栄養培地に培養
し、該培養物からアルカリフォスファターゼを採取する
ことにより製造できる。アルカリフォスファターゼ生産
菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が
資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地い
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例
えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天
然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の
無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が使用される。またアルカリフォスファターゼの生産誘
導として、リン酸濃度を低くしておくことが望ましい。
培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培養で行う。培
養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜３０℃、培養
ｐＨ５〜１１の範囲で、好ましくは６〜１０に制御する
のが良い。これら以外の条件下でも使用する菌株が生育
すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日で生育し、
菌体内および菌体外にアルカリフォスファターゼが生産
蓄積される。
【００１４】本発明の酵素の精製法は、一般に使用され
る精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地
を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩
化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチ
レンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチル
アミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチ
ル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などに
より精製することができる。またこれらの方法で得られ
た粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍
結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定
化して固定化酵素として使用できる。
る精製法を用いれば良い。例えば、菌体除去後の培地
を、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグネシウムや塩
化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミンやポリエチ
レンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡＥ（ジエチル
アミノエチル）−セルロース、ＣＭ（カルボキシメチ
ル）−セファロースなどのイオン交換クロマト法などに
より精製することができる。またこれらの方法で得られ
た粗酵素液や精製酵素液は、例えばスプレードライや凍
結乾燥により粉末化できる。さらには適当な担体に固定
化して固定化酵素として使用できる。
【００１５】次に、本発明のアルカリフォスファターゼ
の活性測定法を示す。まず下記反応混液をキュベットに
調製し、３７℃で約５分予備加温する。 ２．６ｍｌ １Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ１
０．２５ ０．３ｍｌ ０．１Ｍｐ−ニトロフェニルリン酸（上記
緩衝液に溶解） 次に、酵素溶液０．１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水
を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍの
吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から
１分間当たり吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵
素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 を含む０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液）を加え、
上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。
上記条件下で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェ
ノールを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
の活性測定法を示す。まず下記反応混液をキュベットに
調製し、３７℃で約５分予備加温する。 ２．６ｍｌ １Ｍジエタノールアミン緩衝液、ｐＨ１
０．２５ ０．３ｍｌ ０．１Ｍｐ−ニトロフェニルリン酸（上記
緩衝液に溶解） 次に、酵素溶液０．１ｍｌを加え、緩やかに混和後、水
を対照に３７℃で制御された分光光度計で４０５ｎｍの
吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から
１分間当たり吸光度変化を求める。盲検は反応混液に酵
素溶液の代わりに酵素希釈液（０．２５ｍＭ ＭｇＣｌ
2 を含む０．１Ｍジエタノールアミン緩衝液）を加え、
上記同様に操作を行って１分間当りの吸光度を求めた。
上記条件下で１分間に１マイクロモルのｐ−ニトロフェ
ノールを生成する酵素量を１単位（Ｕ）とする。
【００１６】
【発明の効果】本発明によって熱安定性に優れた、糖鎖
を有するアルカリフォスファターゼを得ることができ
る。
を有するアルカリフォスファターゼを得ることができ
る。
【００１７】
【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示
す。実施例１ ０．５％β−グリセロリン酸二ナトリウム、０．５％ポ
リペプトン、０．５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグ
ネシウム、０．００２％リン酸一カリウム、１％炭酸ナ
トリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行っ
た。種菌として、アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５
０８４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８２）を一白金耳植菌
し、３０℃で４８時間培養し、種培養液とした。次に同
培地６Ｌを１０ｌジャーファーメンターに移し、１２１
℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液
１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３
０℃で７２時間培養した。得られた培養液について遠心
分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ
−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロ
ースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００に
よるゲルろ過により比活性２，０００Ｕ／ｍｇにまで精
製した。得られたアルカリフォスファターゼは下記特性
を有していた。 １．下記反応を触媒した。
す。実施例１ ０．５％β−グリセロリン酸二ナトリウム、０．５％ポ
リペプトン、０．５％酵母エキス、０．０２％硫酸マグ
ネシウム、０．００２％リン酸一カリウム、１％炭酸ナ
トリウムを含む培地１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラ
スコに移し、１２１℃、１５分間オートクレーブを行っ
た。種菌として、アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５
０８４（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８２）を一白金耳植菌
し、３０℃で４８時間培養し、種培養液とした。次に同
培地６Ｌを１０ｌジャーファーメンターに移し、１２１
℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷後、種培養液
１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量２ｌ／分、３
０℃で７２時間培養した。得られた培養液について遠心
分離を行い、上清液を得た。本液を硫安分画、ＤＥＡＥ
−セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロ
ースクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００に
よるゲルろ過により比活性２，０００Ｕ／ｍｇにまで精
製した。得られたアルカリフォスファターゼは下記特性
を有していた。 １．下記反応を触媒した。
【００１８】オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ
→ アルコール ＋ オルソリン酸
→ アルコール ＋ オルソリン酸
【００１９】２．基質特異性
【００２０】
【表１】
【００２１】３．Ｋｍ値 ｐ−ニトロフェノールに対するＫｍ値は、０．４１ｍＭ
であった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨは１１以上であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２５℃、１６時間保存してその残存活性
を測定した。その結果、図２に示す通りであって、安定
ｐＨはｐＨ６〜１１であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は５０℃であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）中で１５分間保温した後、残存する酵素活性を測定
した。その結果は図４に示す通りであって、５５℃まで
安定であった。 ８．金属要求性 Ｍｇ++が必須であるが、Ｃｏ++、Ｍｎ++、Ｃａ++、Ｎｉ
++で代替できた。 ９．分子量 ６３０，０００（ゲルろ過法） ５６，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 ３７％（フェノール硫酸
法）
であった。 ４．至適ｐＨ ０．９７Ｍジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８．０〜１
１．０）中での酵素活性を測定した。その結果は図１に
示す通りであって、至適ｐＨは１１以上であった。 ５．安定ｐＨ グリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２〜３）、酢酸緩衝液（ｐＨ
３〜６）、Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ６〜８）、トリス塩
酸緩衝液（ｐＨ８〜９）、グリシンＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ９〜１０）で２５℃、１６時間保存してその残存活性
を測定した。その結果、図２に示す通りであって、安定
ｐＨはｐＨ６〜１１であった。 ６．至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は５０℃であった。 ７．熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．
５）中で１５分間保温した後、残存する酵素活性を測定
した。その結果は図４に示す通りであって、５５℃まで
安定であった。 ８．金属要求性 Ｍｇ++が必須であるが、Ｃｏ++、Ｍｎ++、Ｃａ++、Ｎｉ
++で代替できた。 ９．分子量 ６３０，０００（ゲルろ過法） ５６，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） １０．糖含量 ３７％（フェノール硫酸
法）
【図１】本発明酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を示
すグラフである。
すグラフである。
【図２】本発明酵素のｐＨ安定性を示すグラフである。
【図３】本発明酵素の反応温度と相対活性との関係を示
すグラフである。
すグラフである。
【図４】本発明酵素の熱安定性を示すグラフである。
Claims (3)
- 【請求項１】 下記理化学的性質を有するアルカリフォ
スファターゼ。 １．次の反応を触媒する。 オルソリン酸モノエステル ＋ Ｈ2 Ｏ → アルコー
ル ＋ オルソリン酸 ２．基質特異性：ｐ−ニトロフェニルリン酸、β−グリ
セロリン酸、４−メチルウンベリフェリルリン酸、ＮＡ
ＤＰに作用する。 ３．至適温度：５０℃ ４．至適ｐＨ：ｐＨ１１以上 ５．熱安定性：５５℃以下（ｐＨ７．５、１５分間） ６．安定ｐＨ：ｐＨ６〜１１（２５℃、１６時間） ７．Ｋｍ値：０．４１ｍＭ（ｐ−ニトロフェニルリン酸
に対する） ８．分子量：（ゲルろ過法） ６３０，０００ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） ５６，０００ ９．糖鎖を有する。 - 【請求項２】 アクレモニウム属に属し、アルカリフォ
スファターゼ生成能を有する菌株を培地にて培養し、培
養物よりアルカリフォスファターゼを採取することを特
徴とするアルカリフォスファターゼの製造法。 - 【請求項３】 アルカリフォスファターゼ生成能を有す
る菌株が、アクレモニウム・ストリクタムＴＥ５０８４
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４６８２）である請求項２記載のア
ルカリフォスファターゼの製造法。
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| JP335495A JP3778297B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 |
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|---|---|---|---|
| JP335495A JP3778297B2 (ja) | 1995-01-12 | 1995-01-12 | 新規なアルカリフォスファターゼおよびその製造法 |
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| JPH08187078A true JPH08187078A (ja) | 1996-07-23 |
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|---|---|
| JP (1) | JP3778297B2 (ja) |
-
1995
- 1995-01-12 JP JP335495A patent/JP3778297B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| JP3778297B2 (ja) | 2006-05-24 |
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