JPS60214881A - 微生物増殖用栄養培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産する
好気性土壌微生物の増殖のための改善された水性栄養培
地に関する。

クレアチニンイミノヒドロラーゼはクレアチニンをアン
モニアに加水分解する酵素である。従って、クレアチニ
ン含有水性液を本酵素と接触させてアンモニア全発生さ
せ、発生アンモニアの水準を検出することにより液中の
クレアチニンの存在及び／又は濃度を測定することがで
きる。従って本酵素は臨床研究室に於て重要な役割を果
すものであり、生物学的液体中のクレアチニン定量用診
断試薬として使用れる。

クレアチニンイミノヒドロラーゼ、或いはクレアチニン
デシミダーゼ（ｄｅｓｉｒｒｂｉｔｉａｓｅ）と称式れ
るものは各種微生物から得られている。例えばＪ。

Ｓｚｕｌｍａｊｓｔｅｒ、Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｌ
、　７５　：　６３３（１９５８）及びＥｉｏｃｈｉｍ
　Ｂｉｏｐｈ’ｌｓ　Ａｃｔａ、３０：１５４（１９５
８）には、嫌気性ダラム陽性微生物りロストリジウムパ
ラブトリフイカム（Ｃ１ｏｓ−ｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｒ
ａｐｕｔｒｉｆｉｃｕｍ）から得たクレアチニンイミノ
ヒドロラーゼの調製について記載されている。クロスト
リジウムパラプトリフイカム微生物の増殖方法も記載さ
れている。しかしながら、これらの文献は嫌気性ダラム
陽性倣生物に限定されており、開示されている微生物増
殖用の醗酵法は長時間を要するものである。更に増殖し
た微生物細胞の量及びそれから抽出される酵素収量は比
較的少量である。

米国特許第４，０８７，３２９号及び第４，１３４，７
９３号には、ブレビバクテリウム（Ｂｒｅυｉｂａｃ−
１ｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｈｅｂ
ａｃ−ｔｅｒｉｕｍ）、シュードモナス（Ｐｓ　ｅｕｄ
ｏｍｏｎａｓ　）及びアルスロバクタ−（Ａｒｔｈｒｏ
ｂａｃｔｅｒｊｆ４の微生物を含む数種の好気性微生物
源の一種からのクレアチニンデンミダーゼの生産につい
て記載されている。

これらの特許には前記諸属微生物の培養に使用可能な栄
費培地の記載があり、この栄養培地の配合を広範に変え
得ること及乙ｌ多数の特記でれた炭素及び窒素源のいく
つか、並びに無機成分及びクレアチニンインデューサー
を含む他の任意の栄養を含むことが可能であることが述
べられている。

クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産する好気性土壌
微生物の増殖及び該微生物からのクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ収量増加のための改善方法及び水性栄養培地
は、明らかに利点を付加するものである。

本発明は、好気条件下で好気性土壌微生物を成育し、そ
れからクレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素組成を得る
ための水性栄養培地に関するものである。

本発明は、一実施態様として、ｐＨ５，０乃至１０．０
の好気条件下でクレア′テニン含有水性保存培地に保存
きれた好気性土壌微生物からクレアチニンイミノヒドロ
ラーゼを生産するための醗酵方法に関する。本醗酵方法
は下記工程からなる。

ａ）微生物の新鮮な試料を保存培地からｐＨ５，０乃至
１０．０の微生物増殖培地に移して微生物を増殖させ、
微生物増殖培地が、実質的にクレアチニンを含まず、植
物蛋白加水分解物又は非にブンン件の乳蛋白加水分解物
を含む栄養を含有し、好気条件下で微生物増殖に有効な
水性栄養培地からなること、 ｂ）工程＜ａ＞て得られた増殖微生物を含有する微生物
増殖培地を、ｐ１１５．０乃至１０．０の範囲の生産培
地に移して好気条件下で微生物を発生させ、その微生物
中てクレアチニンイミノヒドロラービ生産を誘導するこ
と、 Ｃ）工程Ｃｂ）て生産された微生物からクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼを抽出すること、 工程Ｃｂ）記載の生産培地は、下記のものを含有する水
性栄養培地からなる。

１）グルコース、又はアミノ基非含有の有機酸であるア
ミノ酸前駆物質、又はグルコースとアミノ酸前駆物質の
混合物を含有する炭素源、ＩＩ）クレアチニン及び好１
しくは植物蛋白加水分解物、又は非ペプシン性乳蛋白加
水分屑物、又は植物蛋白加水分解物と非ペプシン性乳蛋
白加水分屑物の混合物も含有する窒素源、 １ｉｉ）　微量栄養分及び ｖｉ）緩衝剤。

好適実施態様とし゛て、ＡＴＣＣ３１５４６等の好気性
土壌微生物からウレアーゼ（Ｕγｅａ、ｓｅ）を含まぬ
クレアチニンイミノヒドロラーゼを生産するのに有用な
、本発明の改善された水性栄養培地が知見されたのであ
る。１ウレアーゼを含まぬ”なる用語は、酵素が生産さ
れる微生物細胞から抽出及び分離されたままの粗な未精
製形態でウレアーゼ作用を実質的に示づめことである。

ウレアーゼ作用測定の代表的検定は、後述工程５の゛”
ＧＤＩＩ”検定法を用いて行うことが可能であり、該法
にて尿素をクレアチニンに置き換えるのである。

ＡＴＣＣ３１５４６にて同定する微生物は、この命名を
ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔ’／ｐｇ　Ｃｕ１ｔｕｒ
ｅ　Ｃｏ１１−ｅｃｔｉｏｎ　（米国２０８５２、メリ
ーランド州ロックビル）への寄託に基き受けたものであ
る。本微生物は仮にフラボバクテリウムＣ１；’ｌａυ
ｏｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ）属に帰属はれており、種名フ
ィラメントサム（ｆｉｌｏｍｅｎｔｏｓｕｍ）が与えら
れている。本発明はＡＴＣＣ３１５４６以外のクレアテ
ニンイミノヒトミラーゼ生産性好気土壌微生物にも使用
可能である。例えば本発明は、米国特許第４．０８７．
３２９号及び第４，１３４，７９３号に記載の属の好気
性土壌微生物からクレアチニンイミノヒドロラーゼを生
産することにも好都合に使用できる。

前記醗酵方法は微生物の良好な増殖を促進するものであ
り、酵素の収量を顕著に改善するものである。これらの
非常に有利な諸結果は、本方法に於て、実質的にクレア
チニンを含まず、植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性
乳蛋白加水分解物からなる栄養を特徴とする特定の微生
物増殖培地中にて微生物を増殖し、次にクレアチニンを
含む明確に定義された炭素源及び窒素源を特徴上する生
産培地にて酵素形成を誘導することにより、期せずして
達成されたものである。

一好適実施態様として、少くとも１種の”直接”アミノ
酸前駆物質（以下にて定義）を含有する改善された水性
栄養培地は本発明の生産培地として使用可能であり、培
地リットル当り５００単位以上のクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼと云つ高収量を与える。改善された水性栄養
物がグルコースと直接アミノ酸前駆物質の少くとも１種
を含有する特に好適な実施態様に於ては、本発明はリッ
トル当り６５０単位以上の高生産収量のクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼをもたらすものである。

生産培地 前記（１）〜（１ｖ）の成分を有する水性栄養培地から
なる生産培地の配合に関し、従来の微生物用各種炭素源
を検討した。米国特許第４，０８７，３２９号及び同第
４，１３４，７９３号にて確認された従来炭素源の大多
数のものは、ＡＴＣＣ３１５４６等好気性微生物からの
クレアチニンイミノヒドラーゼの生産にほとんど無効で
あった。例えばグリセリン、スクロース、酢酸、アスパ
ラギン酸、グルタミン酸及びクリシン等の炭素源は、少
量のクレアチニンイミノヒドロラーゼしが産出しない微
生物細胞を生産する。本発明の方法にほとんど価値がな
いとした前記炭素源のあるものは、微生物細胞の成育に
は良好であるが、生成微生物は所望のクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ酵素をほとんど産出しないのである。

１用であると知見された炭素源には、グルコース及びア
ミノ基非含有有機酸であるアミノ酸前駆物質が含１れる
。゛アミノ酸前駆物質”は、本明細書では、アミノ酸の
°°直接”前駆物質及び゛°間接”前駆物質の双方を示
す。直接前駆物質とはアミノ酸から一段階の代謝反応を
省略した物質であり、間接前駆物質はアミノ酸の形成に
二代謝反応段階を必要とする。例えばフマル酸は単一反
応段階にて代謝的にアス・々ラギン酸に転化し得る故°
“面接“アミノ酸前駆物質であり、一方乳酸は先ず代謝
的にピルビン酸（直接アミノ酸前駆物質）に転化せねば
ならず、次にそれがアラニンに代謝転化され得る故”間
接”アミノ酸前駆物質である。

本発明に於ては、間接アミノ酸前駆物質よりも直接アミ
ノ酸前駆物質が好適である。

生産培地の水性栄養培地に使用するアミノ酸前駆物質は
、アミノ基非含有有機酸として更に特徴つけられる。面
接アミノ酸前駆物質として好適な有機酸の一部金例示す
れば、フマル酸、α−ケトグルタル酸及びピルビン酸が
含まれる。間接アミノ酸前駆物質として有用な有機酸の
一部の例示としては、リンゴ酸、乳酸、クエン酸及びコ
ハク酸が含１れる。

炭素源として用いるグルコース又は前記アミノ酸前駆物
質の量は種々変え得るものである。有用な量は、水性栄
養培地１リットル当り１．０乃至２０．０グラムの範囲
、好ましくは５．０乃至１０．０グラム／リツトルであ
ることが知見されている。

特に好適な本発明の実施態様に於ては、生産培地はグル
コース及び７以上のアミノ酸前駆物質を有する炭素源を
含有する。本実施態様は微生物からのクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ酵素の収量を実質的に増加きせ得るもの
である。本実施態様に於て、グルコ一ス及び前記アミノ
酸前駆物質の全量を前記の５．０乃至１０．０ｇ／Ｍの
範囲内にし、グルコース対アミノ酸前駆物質の重量比を
１：１０乃至１：１の範囲にするこ七ができる。

生産培地の水性栄養培地に用いる窒素源としては、クレ
アチニンだけでよい。しかしながら、生産培地として使
用可能な好適栄養培地は、クレアチニンと植物蛋白加水
分解物又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物の双方を含有
する。本好適実施態様に使用可能な植物蛋白加水分解物
及び非ペプシン性乳蛋白加水分解物には、トリプトン（
ｔｒｙｐｔｏｎｅ　：米国ニューシャーシー州ユニオン
のに’ｒａｆｔｃ。

Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社５ｃｈｅｆｆｉｅｌｄ　Ｃｈ
ｅｒｎｉｃａｌ　Ｄｉｖｉ−ｓｌｏｎの商品名Ｂｙ−８
ｏ”／　等の大豆蛋白加水分解物）、ｌ・リプトンカゼ
イン加水分解物（米国メリーランド州コソチイスビルの
Ｂｉｏｑｕｅｓｔ（ＢＢＬ）社製のＴｒ’／ｐｔｉｃａ
ｓｅ＠　Ｐｅｐｔｏｎｅ等）及びプロテアーゼカゼイン
加水分解物がある。ペプシン性乳蛋白加水分解物、即ち
にプシンにより加水分解された乳蛋白は、一般に微生物
細胞の成長の速度が遅く、且つ、微生物酵素の生産速度
が遅い。

クレアチニン量は、生産培地として用いた水性栄養培地
のリットル当り、０．５乃至２０．０グラムの範囲であ
り、４．０乃至１２．０グラム／リットル当り、０．５
乃至２０．０グラムの範囲であり４．０乃至１２．０グ
ラム／リツトルが好適である。植物蛋白加水分解物及び
／又は非ペプシン性乳蛋白加水分解物は１．０乃至１０
．０グラム／リツトルの範囲であり、１．０乃至５．０
グラム／リツトルが好ましい。

生産培地である水性培地に含有される微量栄養分には水
溶性無機塩が含まれる。酵母抽出物が存在してもよい。

これら微量栄養分は、微生物の細胞を促進し微生物の酵
素産出の増加を促進するのに有効な量が少量添加される
。酵母抽出物の有用量は培地１リットル当り０．１グラ
ム乃至２グラムの範囲であり、０．５乃至１．５グラム
／リツトルが好適である。ビタミン類も任意微量栄養分
として存在きせてもよい。

微量栄養分として存在し得る水溶性無機塩には、リン、
マグネシウム、カルシウム、鉄、亜鉛、ナトリウムの水
溶性塩及び他の水溶性塩が含壕れ、それらの陽イオン成
分は元素の周期律表の第３及び第４周期から選択される
ことが好ましい。微量栄養分として数種の無機塩の混合
物が存在することも好ましい。特に有用であると判明し
た無機塩混合物の一つは、下記組成の０．１ＮＩｉＣ１
水溶液であり、各表記成分の濃度は水溶液１リツトル中
に存在する量である。

ｕｇｓｏ、・７１１２０　１２．２　ｇＣａＣＴｏ　・
２Ｈ２００，０７６、ｌｉ’Ｆｅ　ＳＯ２・７１１２０
２．８　ｆ／ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ１，７ｇ Ｚｎ５Ｏ＜・７１１２Ｑ　Ｏ８０６ｆｊＮａＣＩＪ　Ｏ
１６ｇ ＮａＭｏＯ，・２１１２００．１ｇ 生産培地である水性栄養培地は緩衝剤も含有する。緩衝
剤はリン酸塩緩衝剤のごとくリン含有緩衝剤であること
が好ましい。もつとも他の緩衝剤も使用可能である。本
好適ケースの場合、緩衝剤は緩衝剤としての作用の他に
、微生物の微量リン源としての働きもする。好適リン酸
塩緩衝剤はリン酸水素二カリウム、Ｋ２ＨＰ　Ｑ、であ
り、存在量は３．０乃至１０．０グラム／リツトルの範
囲、好ましくは３．０乃至６．０グラム／リツトルであ
る。

生産培地である水性栄養培地のｐＨは５．０乃至１０．
０の範囲をとることができ、６．０乃至７，５が好まし
い。培養液のｐＨは、ＫＯＨ又はＮａＯＨ。

好ましくはＮαＯＨ等の塩基を添加することにより、容
易に前記範囲内の調節を行うことができる。続いて前記
緩衝剤を存在させることにより、ｐＨをこの範囲に維持
するのである。

生産培地に、当業者には周知の他の任意成分を含有させ
ることもできる。大規模醗酵器にて微生物を成育する場
合しばしば発泡が生ずるので、発泡調節剤を培地中に含
有させてもよい。斯る発泡調節剤の一つは、Ｐｏ１ｙｑ
ｌｙｃｏｌ　Ｐ−２０００（米国ミシガン州ミドランド
のＤｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社の商品名）のようなポリ
グリコールである。この発泡調節剤は一般に０．５グラ
ム／リツトルまでの量で使用されるが、更に少い量例え
ば０．１グラム／リツトルでも一般に発泡調節を行うの
に十分なことが判明している。他の発泡調節剤も使用可
能であり、主な選択基準は、発泡調節の濃度水準で微生
物増殖及び酵素合成を阻害しない或いは最小の影響しか
与えないことである。

酵素生産のための醗酵方法 前記生産培地は、ＡＴＣＣ３１５４６のような好気性土
壌微生物からクレアチニンイミノヒドロラーゼを大規模
生産するのに好適な醗酵方法の最終工程に使用すると有
利である。

本醗酵方法は、前記生産培地の場合と類似のｐＨ条件及
び好気東件下に保存培地にて増殖せしめた微生物試料を
用いるものである。従って塩基好ましくはＮａ０１ｉ又
はＫＯＨ（もつとも他の塩基も使用可能である）を添加
することにより、ｐＨを５．０−１０．０、好ましくは
６．０−７．５に調節する。保存培地の温度は１５乃至
４２℃の範囲、好ましくは２５乃至３０℃である。

保存培地は、クレアチニンからなる窒素源、好１しくは
アミノ基非宮有有機酸である前記アミノ酸前駆物質の１
種以上を含む炭素源、１種以上の水溶性無機塩及び任意
成分として酵母抽出物のような微量栄養分、及び緩衝剤
を含有する水性培地である。所望ならば他の通常の培養
物質、例えば寒天等を存在させてもよい。

特に有用であると判明した保存培地は下記組成のもので
ある。

寒天　２０．０ｇ フマル酸（炭素源）　１０．０ｇ クレアチニン（窒素源）　５．０ｇ 緩衝剤に２ＨＰＯ４Ｃ無水物）　５．０５１酵母抽出物
　１．０ｇ 塩溶液　１０．０＋ｎＡ 蒸留水　８００．０ｍ１ ＮａＯＨでｐＨを６．７に調節し、蒸留水で容量を１リ
ツトルにする。

塩溶液は０．１　Ｎｌ１Ｃ１水溶液で下記組成を有し、
各表記成分の濃度は塩溶液１リツトル中に存在する量で
ある。

Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７Ｈ２０１２，：ＩＣ（ＬＣ１２’
　２Ｈ２００−０７６ｊｊＦ　ｅ　ＳＣｈ　・７Ｈ２０
２，８ＥＩＭ　ｎ　Ｓ　Ｏ４・＆　ＯＬ　７　ｇ ＺｎＳＯ＋　’　７＆ＯＯ−０６７ｉ ＮａＣ６Ｏ，６ｇ ＃　ａＭ　ｏ　Ｏ＜　・２１１２０　０−１　ｇ醗酵方
法は、微生物の新鮮な試料を保存培地から微生物増殖培
地に移して微生物を成育する工程＜ａ＋て始する。微生
物の”新鮮な試料”なる用語は、保存培地に２５℃にて
比較的短期間の２４乃至７２時間、好ましくは約４８時
間培養−保存したものを意味する。それより長時間保存
・培養した微生物試料は、新鮮な微生物試料よりも有用
性に於て劣ることが判明している。

微生物の新鮮な試料を必要時に即時供給するため、微生
物を凍結乾燥粉末として４乃至２５℃の範囲の温度にて
貯蔵し、細胞増殖過程を中断させることも可能である。

前記保存培地の凍結乾燥粉末から、必要時に時を隔てて
新しい培養を開始することができる。このようにして醗
５’ｆｆ　（ａ）工程の微生物増殖培地に移すための新
鮮な微生物試料を絶え間なく供給することが可能である
。

別法として、液体望素中にて凍結貯蔵することにより新
鮮な微生物試料乏供給することも可能である。

醗酵過程の（α）工程中の微生物増殖培地の組成は、重
要なものではあるが、広範に変えることが可能である。

一般に微生物増殖培地は、微生物の細胞増殖が最大且つ
Ｃｂ）及び（Ｃ）工程の酵素生産が良好な収量となるよ
う選択される。このことは、ある種の通常の非特定栄養
培地を工程（α）の微生物増殖培地として、使用するこ
とにより達成される。（もつともＣｂ）工程の生産培地
には、明確に定義された炭素源と特定の窒素源が使用さ
れる。）工程（ＣＬ）並びに工程（ｂ）の使用によりも
たらされた有益な結果は予期されたものでなく、まして
や予見できるものではなかった。即ち当業者と云えども
、非構成的に酵素を生産する微生物（即ち所望酵素の基
質又は基質同族体を含有する培養液中での成長により、
その内部で所望酵素の生産をする微生物）が、醗酵過程
を通じて、特定配合の明確に定義された栄養培地を使用
することなく、酵素を最適収量にて生産するであろうと
予見することは不可能だったであろう。従って、ＡＴＣ
Ｃ３１５４６等の好気性土壌微生物に関する本醗酵方法
が、保存培地と生産培地の双方に於ける栄養としてクレ
アチニンを使用し、工程（ａ２）の微生物成育培養液に
クレアチニンを使用せずして改善された結果をもたらす
ことは予期せず％ｌ見はれたことである。

前記の特性は有利なことである。これは、通常“襟合°
゛培地と称されるある種の非特定の商業的に入手可能な
予備・配合栄養培地から微生物増殖培地を配合すること
を可能とする。この”複合”培地は、通常、植物、牛乳
、肉又は魚の栄養源から得られる微生物栄養の複合混合
物を含むため、そのように命名されたものである。従っ
てこの培地は典型的には窒素源として植物、牛乳、魚又
は肉の蛋白質を含有し、且つ、各種の他の無機塩及び栄
養源から抽出されたビタミン栄養を含有する。

この複合培養液には、糖質等の補足的炭素源並び。

に他の補足的ビタミン及び鉱物栄養が存在してもよい。

本発明の微生物増殖培地として良好な結果をもたらすこ
の複合培地は、植物又は牛乳の栄養源からもたらされた
ものであり、植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性乳蛋
白加水分解物を含有している。

従って、この微生物増殖培地の主要な特性は、実質的に
クレアチニンを含有せず、植物蛋白加水分解物及び／又
は非ペプシン性乳蛋白加水分解物を含む栄養を含有する
ことである。

微生物増殖培地の７）Ｈ条件は保存培地のそれと同様で
ある。別の緩衝剤又は別の塩基を使用することなく、非
特定栄養培地を使用することにより、所望の７）Ｈ範囲
を得ることができる。例えば前記の複合培地の場合、該
複合培地の製造時にしばしば緩衝剤を培地中に添加して
好適ｐＨ範囲の６．０乃至７．０に維持しているのであ
る。

増殖培地中での微生物の温度条件は変化させ得るもので
ある。一般に工程（ａ）に於ける増殖培地ての細胞増殖
には２０°乃至３７℃の範囲の温度が良好であり、２５
°乃至３０℃が好適である。

醗酵過程の（ａ）工程にて微生物増殖培地に移される微
生物試料は、この増殖培地内に於て、微生物細胞が溶菌
（１ｙｓｉｓ即ち破裂）することなく細胞増殖が最大と
なるのに有効な期間培養はれる。この時間は培地の組成
並びに増殖培地に移これた細胞数により変り得るもので
ある。ｉ・リプーノイブロス（Ｔｒ’ｊｐ−８ｏ’／　
Ｂｒｏｔ、ｈ：米国ロードアイランド州フィスケビルの
５ｃｏｔｔ　Ｌａｂｏｒａ、ｔｏｒｉｅｓ製）等の値物
蛋白加水分Ｍ物から構成される好適微生物増殖培養物の
場合、２５ｍｔ！の微生物増殖培地を官有するフラスコ
に微生物試料を接種したときの期間は約５乃至１１時間
てあり、７−９時間が好適である。

工程（Ｑ、）では、微生物の細胞増殖を最大にするのに
十分な酸素を供給する必要がある。最適酸素量の決定は
、ある所与容量の微生物増殖培地に関し、数点の空気酸
素流量と（培地の）撹拌速度にて細胞増殖を監視し、細
胞増殖が最大となる点以上の？ν気流速と撹拌速度を選
択することにより、容易に可能である。

工程（ａ５）で微生物が成長ケ終えた後、増殖細胞を含
む微生物増殖培地全工程（ｂ）にて生産培地に移す。

］二程（ｂ）に於て、増殖細胞を含む全微生物増殖培地
を生産培地に移すことができる。この微生物増殖培地（
即ち微生物増殖培地及びその中に含有される増殖細胞）
は生産培地への接種物となる。

生産培地を醗酵器に収納する。斯る醗酵器の容量は少と
とも２５リツトルであり、代表的には１５０リツトル乃
至２００，０００リツトルである。

最終生産醗酵器の大きさに応じて工程（α）で発生した
増殖細胞を含有する微生物増殖培地の調製を数段階で行
い、最終生産醗酵器用接種物として役立つ十分量の微生
物増殖培地を得ることができる。

例えは最終生産醗酵器の容量が約１５０リツトルのとき
、工程（（Ｌ）を二段階行うのが有利である。

各段階で微生物増殖培地中の微生物細胞増殖を最大にし
、生産培養物（培地と増殖細胞の双方を含有）を工程（
（Ｌ）の次の段階の接種物として新たな、一般により犬
なる微生物増殖培地バッチに導入使用するのである。

最終生産規模醗酵器が１５０リツトルより犬なる場合、
工程（α）を二段階以上にて行い工程Ｃｂ）の最終生産
規模醗酵器への導入に十分量の微生物増殖培養物を得る
ことができる。代表的には、工程（ａ）の最終段階で生
産した微生物増殖培養物の容量と工程（ｂ）で用いる生
産培地の容量の比は、１：５０乃全ｌ；５の範囲内であ
る。

本発明の醗酵過程て用いる生産培地の組成は、本明細書
の°゛生産培地”の節で記載した通りである。同様に生
産培地の微生物の培養時に維持される７］／−／条件も
“生産培地”の節にて記載したものと同一である。微生
物による酵素生産を最大に維持するための十分な酸素も
重要である。これは、所与容量の生産培地に関して、酸
素又は空気流量並びに培地の撹拌速度が工程Ｃｂ）の範
囲で変化するとき、工程（Ｃ）にて抽出はれる酵素の量
がどう変化するかを監視することにより容易に決定でき
る。

次に、生産される酵素量が最大になる点板上の酸素又は
空気速度及び撹拌速度を選択するのである。

］二工程ｂ））の微生物培養時間は、生産培地の特定組
成、酸素輸送速度、温度その他の条件に応じて変化する
。１５０リツトル生産規模醗酵器の場合の代表的培養時
間は、１０乃至１４時間の範囲内である。

前記のごとく挑発泡剤を生産培地に添加することは可能
であり、あるいはそれらを多段醗酵過程の比較的早い段
階で微生物増殖培地に添加することもできる。

本発明醗酵方法の生産培地中で成育させたＡＴＣＣ３１
５４６等好気性土壌微生物を一般に妥当な温度範囲にて
成育し、クレアチニンイミノヒドロラーゼ酵素を良好な
収量にて生産することが可能である。２０°乃至３７℃
の範囲の温度にて良好な結果を得ることができる。２５
°乃至３０℃の温度だと最良の結果が達成された。

工程（ｂ）の完了に引続き、所望のウレアーゼ非含有ク
レアチニンイミノヒドロラーゼ酵素を微生物細胞から抽
出する。これは、細胞を音波、粉砕等で砕〈従来法によ
り行うことができ、所望酵素を培地から、有機溶剤によ
る分別沈澱その他の酵素分離常法及び精製技術により分
離するのである。

以下の実施例制限的なものでなく、本発明を更に説明す
るためのものである。実施例では以下の物質または材料
を用いた。

物質： １、微生物−好気性士御微生物Ａｉ’ＣＣ３Ｌ５４６２
、培地Δ６１ 餠天　２０．０ｇ／ｌ フマルＩｆｌ（炭素源）　ｔｏ、ｏｇ／ｌクレアチニジ
（望素源）　ｓ、ｏｇ／１Ｋ２１１ＰＯ４（無水物）　
５．０ｇ／１１酵ｔＵ抽出物　１．０ｇ／ｌ 変性塩Ｍ液Ｃ１０，０ｍ／（ 蒸留水　ｓｏｏ、ｏ罰 Ｋ　Ｏ１１てｐＨを６．７に調節し、蒸留水で本培地を
ｌリットルにした。

質性塩溶液Ｃの組成 Ｍ　（７ＳＯ４・７１１２０　１２．２ｇ／ｌＧＱ、Ｃ
１２・２１１２０　０．０７６　ｊｊ／１１ＦｅＳＯ４
−７１１２０２，８ｇ／Ｉ Ｍ　ｎ５ｏ４・１ｉ２Ｃ）　Ｌ７　Ｆ！　／　（ＩＺル
ＳＯ４・７Ｈ２０ｏ、ｕ　６　ｇ／ＩＮａ、Ｃ１，０−
６ｇ／ｌ Ａｔ　ａＭ　ｏ　Ｏ４・２Ｈ２００−１ｇ／　１１０、
１　Ｎ１１（＃て１リツトルにした。

３、培地／１６２ 寒天を加えなかった以外は培地／＋６１と＝」−ｘ＋ｑ
　ｒ戊。

４、培地／１６３ リットル当りポリグリコール０．１ｇ（米１匍ミンガン
州ミドランドのＤｏｗ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製品Ｐｏ１
ｙ　ｑｌｙｃａｌ　Ｐ　−２０００）　を力１］えた以
外（ま培地Ａ６２と同一組成。

５、培地扁４−培養物純度試験用培地 ダルコース　１０．Ｏソ／ｌ 酵母抽出物　１００ｇ／ｌ リン酸カリウム（二塩基性）　ＬＯｇ７１１ｍ溶液Ａ　
−１２，０ｍｌ／　１２ 塩溶Ｗ　Ａ　−２２，０ｍｌ／　１ 寒天　２０．０ｇ／ＩＩ ｐ１ノを７．ＯＫ調節し、蒸留水で１リツト／しにした
。

塩溶ＭＡ−１： Ｍｇ５Ｏ＋　”　７Ｈ２０１００，０ｇ／　１２Ｆ’ｅ
　ＳＯ＋　’　７Ｈ２０１０，０、！ｌｉ’　／　ｌＭ
ｎＳＯ４・Ｎ２０　１．Ｏｇ　／　ＩｔＮａＭ　ｏ　Ｑ
４　・２Ｈ２００，５ｊｉ　／　１０．１　＃　ｌ１Ｃ
１で１リツトルにした。

塩溶液Ａ−２： ＣａＣＴｏ　１０．Ｏｇ／　ｌｌ 蒸留水’　１．０／にする。

６、薬品：酵母はディフコ　ラボラド１７一ズ社（Ｊ）
ｉｆｃｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ米国ミシガン州デ
トロイト）の製品；寒天はメドックス　ケミカル社（Ｍ
ｔｔｄｏｘ　Ｃｈｅｍｉｃαｌ　カナダ国オンタリオ州
オツタワ）製；Ｌ−グルタミンデヒドロゲナーゼ、トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝剤、＋　（１
ｒｉｓ）、Ｎ、Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリ
シン（ｂｉｔｉｎｅ）、卵白リゾチーム、ニコチナミド
アデニンジヌクレオチドリン販塩の還元形（ＮＡＤＰＩ
ｉ）、リボヌクレアーゼ及び牛のすい臓からのデオキシ
リボヌクレアーゼはシグマケミカルズ社（５ｉｑｔ間Ｃ
ｈｅｍｉｃα１８米国ミズーリ州セントルイス）製。イ
ーストマンオーガニツクケミカルズ社（Ｅａｓｔｍａｎ
υｒｇａｎｉｃ　Ｃんｅｍｉｃａｌｓ米国ニューヨ米国
ニューヨークーロチェスター薬品の供給元であり、他の
薬品はすべて分析級の市１Ｎ品であった。

本例に於ては以下の操作を用いた。

操作 １、培養物の維持・保存 微生物ＡＴＣＣ３１５４６培養物をトリブーソイプロス
中で３０℃１０時間増殖させて保存した。

次に細胞を無菌状態で分離し、無菌の１０％グリセリン
水溶液中にアレン（Ａ１１ｅｎ）の塩溶液（Ａｌｌｅｎ
、Ｍ、Ｂ、、Ａｒｃｈｉｖｅ　ｏｆ　Ｍｉｋｒｏｂｉｏ
ｌｏｇｙ。

第３２巻第２７０−２７７頁（１９５９年）で再懸濁し
た。０．５−２．Ｏｒｎｌの少量の本培養物を無菌のガ
ラスアンプルに加え、密封後液体窒素中に貯蔵した。微
生物試料が要るときはアンプル甲の培養物を解かして内
容物を無菌状態でトリブーツイブロスに移し、３叫で１
０時間成育させた。本培養物をループ一杯、無菌状態で
培地層１の斜面に移し３０℃で培養した。

２、小規模酵素生産 手順１に前記のように培養物を培地／Ｉ６１斜面上て２
日間成育させ新鮮試料を得た。この斜面から培養物をル
ープ一杯、本発明にて使用する型の微生物増殖培地２５
ｍｌ（２５０ｍ／のエルレンマイヤーフラスコに収容）
に接種した。使用した微生物増殖培地はトリブーツイブ
ロスからなるものであった。培養物をエルレンマイヤー
フラスコに接種後、該フラス＝＋を２００ｒｐｒｎ、３
０℃にて８時間振とうすると細胞は良好に増殖し微生物
細胞の崩壊は起らなかった。その後フラスコ内容物試料
の培養物純度を顕微鏡で検査し、次に冷凍遠心分離器に
て１５．ＵＯＯＸｇで無菌的に遠心分離して細胞とトリ
ブーソイ　プロスを分離した。トリブーソイ　プロスを
含む上澄液を捨て、沈澱微生物細胞を含む固体物質を遠
心分離前に存在した量の無菌蒸留水中に再懸濁させた。

次にこの懸濁物２ｍｌを、生産培養液２５　ｍｇ金含有
２５０ｍ１エルレンマイヤーフラスコの接種物として使
用し、微生物による酵素生産を促進した。この生産培養
物の特定組成は下記諸例に記載のように変化させた。し
かし各ケース共、微生物を２ｍｌの接種物としていつた
んそれぞれの生産培地含有フラスコに移したあとは、み
な３０℃、２０　Ｏｒｐｍで１０時間フラスコを振とう
した。そのあと培養物試料を取り出して稀釈し、乾燥細
胞の重量を測定した。更に、該培養物の一部分２．５ｄ
を冷凍遠心分離にて１５，０００ｘｇで遠心分離して細
胞と生産培地を分離した。

生産培地を含む上澄液は廃棄した。沈澱細胞を下記操作
４のごとく粉砕して下記操作５記載のごとく酵素活性を
検定した。

３、大規模酵素生産 方法２と同一の工程を経たあと、ＡＴＣＣ３１５４６培
養物を培地／１６．１叫面にて２日間増殖した新鮮試料
を微生物増殖培地２５ｍＪ（２５０ｍＡ！エルレンマイ
ヤーフラスコ中に収容）に移した。微生物増殖培地は操
作２記載のものと同一であった。

微生物増殖培地中での接種物増殖の第一段階は、該フラ
スコを２０Ｏｒｐｍ、２５℃にて１２時間振とうするこ
とにより行った。そのあとフラスコ内容物試料の培養物
純度を顕微鏡で検査した。次に微生物増殖培地中での接
種物増殖の第二段階に於て、第一段階培養物を含む２個
の２５０ｍ１エルレンマイヤーフラスコの内容物を無菌
状態で１４リツトルの醗酵器に移した。該醗酵器は操作
２記載の組成及び００１重量％のポリグリコールＰ−２
０００を有する無菌の微生物増殖培地１０リツトルを含
有したものである。接種物成育の第二段階に於て、１４
リツトル醗酵器を、温度２５℃に維持しなから１３００
γｐｍで１２時間撹拌した。

この間醗酵器に５．５リットル／分の空気流を通して適
当な酸素供給を継続した。こうして１５０リツトル醗酵
器用の接種物として十分量の細胞が得られた。１４リツ
トル醗酵器の内容物を無菌的に１５０　！Ｊ−ットル醗
酵器に移した。該醗酵器には予め以下の語例に記載する
夫々の組成の無菌生産培地１００１を仕込んでおいた。

その後１５０リツトル醗酵器の内容物２５０　ｒｐｍで
１２時間撹拌した。この間４６リツトル／分の空気流全
醗酵器に通し、溶解酸素濃度及びｐＨを１２時間連続し
て監視した。１時間毎に醗酵器から試料を抜き取り乾燥
細胞重量を測定した。更に１時間毎に醗ｉ器から一部分
２．５ｍｌを抜き取り、操作２記載のごとく処理して細
胞を分離した。次に細胞を粉砕し操作４及び５記載のご
とく検定した。

４、細胞粉砕 前記操作２及び３と以下の語例に於て細胞粉砕を行った
。０．０５Ｍ）リス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
（ｔｒｉｓ）の緩衝剤、ｐＨ８，５及び１０−”Ａ／（
エチレンジニトリロ）、四酢酸二カリウム塩ＣＫ、ＥＤ
ＴＡ）　の溶液１．４プに、酵素溶液０．２ｄ及び細胞
懸濁物０．４ｍｌを添加した。前記酵素溶液は脱イオン
水１ｍｌ当りリゾチーム２．５〜、牛すい臓のデオキシ
リボヌクレアーゼ１ｍ＆及び牛すい臓のりボヌクレアー
ゼ１ｍｇを含有するものであった。細胞懸濁物の量は最
終光学密度が約１．０になるよう調節し、ｔｒｉｓ緩衝
液で最終容量を２．０Ｔｎｌにした。該懸濁物を水浴中
３７℃で２０分間振とうした。冷凍遠心分離器にて２７
，０ＯＯＸ、！９で遠心して細胞デブリス（ｄｅｂｒｉ
ｓ）を除去し、上澄液の酵素活性検定を下記操作５記載
のごとく行った。

５、クレアチニン　イミノヒドロラーゼの検定語例記載
のクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を測定するため
、Ｌ−グルタミンデヒドロゲナーゼ、”　ＧＤＩｉ”検
定法を用いた。ＧＤＩｉ検定法では、以下のとと＜Ｇｌ
）Ｈ−触媒反応にＮＡＤＰＨにコチナミドーアデニンジ
ヌクレオチドリン酸塩）ｋ用いて、クレアチニンイミノ
ヒドロラーゼ酵素組成物の活性を表わすクレアチニンか
らのアンモニア生産を測定する。クレアチニンをクレア
チニンイミノヒドロラーゼ試料の未知作用を介してアン
モニアに加水分解し、触媒のＧＤＨの存在下にアンモニ
アをα−ケトグルタル酸試薬と反応はぜてグルタミン酸
を生産する。ＧＤＨを触媒とする後者の反応はＮＡＤＰ
Ｈ酸化反応（Ｎ’ＡＤＰＨ→ＮＡＤＰ）を用いるもので
あり、３４０　ｎｍでのＮＡＤＰＨ吸収ピークの消失が
検定を監視する光学検出手段となる。すなわちＮＡＤＰ
Ｈ消失速度がグルタミン酸生産速度を与え、これがアン
モニア生産速度を与える。ＧＤＨ検定法で使用する反応
混合物は、全容量１ミリリツトル中にｐＨ７，６の０．
１Ｍ　ＡＩ、＃−ビス（２−ヒドロキシルエチル）グリ
シン−ＫＯＨ緩衝溶液、（エチレンジニトリロ）四酢酸
二ナトリウム塩（＃（Ｌ２　ＥＤＴＡ）　０．４ｍｇ、
α−ケトグルタル酸１．６■、ＮＡＤＰＨ０，２４■、
ＧＤＨ（アンモニア非含有）１５単位及びクリアチニ７
４．５２Ｉｎ９を含むものであった。ＧＤＨ活性の一単
位とは、ｐＨ７，６及び３７℃に於て１分間にα−ケト
グルタル酸１μモルをグルタミン酸塩に還元する触媒作
用の酵素量と定義されるものである。反応は、前記反応
混合物が３７℃で平衡に達した後所望クレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ酵素組成物の少量試料（約２−１０ミＩ
Ｊ単位）を添加することにより、該反応混合物内で始ま
る。

クレアチニンイミノヒドロラーゼ活性ハ、スＱトロホト
メーターで３４０　ｎｍ　（ＮＡＤＰＨの３４０ｎｍに
於ける分子消失係数は６．２２　Ｘ　１０３）に於ける
ＮＡＤＰＨの消失速度を測定して計算される。

酵素活性の一単位とは、前記ＧＤＨ検定反応条件下で、
１分間にクレアチニン１μモルがアンモニア１μ 定義されるものである。

実施例１ 微生物増殖培地 本実施例は、本発明の醗酵方法に有用な微生物増殖培地
を決定するための試験結果を報するものである。本実施
て用いる方法では第１表に示すように各種微生物増殖培
地及び生産培地として前記の培地／Ｉ６２を使用する。

培地／Ｉ６２は植物蛋白加水分解物又は非被プシン件の
牛乳蛋白加水分解を含まず、本発明の改善された水性栄
養培地ではない。

本実施例で用いる方法の操作は以下の通りである。

試験すべき培地を各２５ｒｎｌ含むフラスコに、培地Δ
６１斜面にて３０℃１８時間成長させた培養物をループ
一杯接種した。各フラスコの細胞成長を測定し、培地リ
ットル当りの乾燥細胞重量として第１表に記した。第１
表の第−欄に示すように、培養物はトリブーソイブロス
、マイクロ　イノキュラム　ブロスＣＭｉｃｒｏ　Ｉｎ
ｏｃｕｌｗｍ　Ｂｒｏｔｈ）及び培地／１６２中で良好
に増殖した。次に生産培地として培地Ａ６２２５ｍ１％
−含むフラスコに、試験する各微生物増殖培地の懸濁物
２ｗＬｌを接種した。第１表−に示すように、トリブー
ソイ　ブロス及びマイクロ　イノキュラム　ブロスから
得た培養物接種のフラスコのものが、生産培地中の増殖
が良好であり酵素生産が優れていた。培地涜２の培養物
接種のフラスコのものは細胞増殖は良好であったが、酵
素生産の水準は高くなかった。サブラウド　デキストラ
ーゼ　ブロス（Ｓａｂｏｗｒａｕｄ　Ｄｅｘｔｒｏｓｅ
Ｂｒｏｔｈ）及びニュートリエンス　ブロス（Ｎｕｔｒ
ｉ−ｅｒｂｔ　Ｂｒｏｔｈ）で接種したフラスコのもの
の結果は悪かった。サブラウドデキストラーゼ　ブロス
は細胞増殖が不良で酵素生産はほとんどなく、ニュート
リエンドブロスでは若干酵素は生産はれたが細胞増殖が
不良であった。

第　１ 実施例２゜ 炭素源の効果 小規模酵素生産用の前記操作２を用い、操作２の生産培
地として使用する水性栄養培地用として最適の炭素源を
きめるため、酸、アルコール及び糖質を含む数種の化合
物の試験を行った。本実施例にて試験した各水性栄養培
地は、炭素源を以下の第り表で示す特定化合物に置き換
えた以外は前記培地、４６２と同一であった。これらの
水性栄誉培地は植物蛋白加水分解物又は非ペプンン性カ
ゼイン蛋白加水分解物を含有せず、本発明の改善された
水性栄誉培地ではない。゛各炭素源の最適濃度を決定す
るため、第■表に示す夫々の炭素源に関し一連の水性培
地の試験を行った。最適濃度は、最高のクレアチニンイ
ミノヒドロラーゼ活性を与える濃度とした。試験する各
炭素源の一連の培地を、炭素源として１．０重量％のフ
マル酸を含有する対照培地と比較した。即ち第■表にて
試験した各炭素源の乾燥細胞重量及びクレアチニンイミ
ノヒドロラーゼ活性を、対照フマル酸に対する相ｐ百μ
率として測定した。第■表に示すように、グリセリン、
スクロース、酢酸及びグリシンは培養物増殖を支援せぬ
が、或いは検出可能量の酵素を生産しなかった。アスパ
ラギン酸及びグルタミン酸の場合、培養物の増殖は良好
であったが、酵素合成は制限された。前記炭素源とは対
照的に、炭素源としてグルコース又は間接アミノ酸前駆
物質例えば乳酸、リンゴ酸、クエン酸、又はコハク酸を
用いた培地では、微生物増殖及び酵素生産は許容可能水
準であった。第■表に更に示すように、面接アミノ酸前
駆物質であるピルビン酸は、微生物の増殖は幾分低かっ
たが、酵素生産を良好に支援した。第■表で用いた直接
アミノ酸前駆物負で且つ対照物質であるフマル酸に於て
も酵素生理並びに微生物増殖は良好であった。α−ケト
グルタル酸は微生物の増殖も良好であり且つ対照物質の
２倍以上の酵素を生産し、最高の結果をもたらした。

これらの結果は、グルコース及び間接アミノ酸前駆物質
が炭素源として有用であること、一方フマル酸、α−ケ
トグルタル酸及びピルビン酸等の直接アミノ酸ｍ１駆物
質は更に良好な炭素源であり、とくにα−ケトグルタル
酸は例外的な結果を与えることを示している。

第■表 炭素源の効果 フマル酸ａ　１．０　１００　１００ グルコ＝ス　１．０　７２　５１ グリセリン　Ｑ、５　１８　マ スクロース　０．５　１６　− 西′１酸　Ｑ、ｌ　１６　− 乳酸　０．５　８３　８ ピルビン酸　０．５　７１　１０５ クエン酸　１．０　７６　７１ コハク酸　１．０　６０　４９ リンコゝを駿　１．０　７４　１００ α−ケトグルタル酸　１．０　１０４　２０５アスパラ
ギ／酸　１．０　９６　− グルタミン酸　１．０　１１７　− ブラニン　１．０　６４　３５ グリシン　０．５　７　− 一：クレアチニンイミノヒドロラーゼ検定の検定限界の
２０単位／リットル未満 α：対照物質としてフマル酸（１，ＯＮ）を使用実施例
ａ フマル酸とクレアチニンの効果 小規模酵素生産用前記操作２を用し・た生産培地である
水性栄養培地中で、フマル酸（炭素源）とクレアチニン
（窒素源）の濃度試験を行った。これらの水性栄養培地
は植物蛋白加水分解物又は非ペプシン性牛乳カゼイン加
水分解物を含有しておらず、本発明の改良された水性栄
養培地ではな℃・。

フマル酸とクレアチニンの濃度を下記箱■表記載のごと
く同時に変え、それ以外は前記培地腐２と同一の水性培
地を用いて試験をした。第１１１表は炭素源としてのフ
マル酸の最適濃度が１．５％であり、クレアチニンの最
適濃度が帆５％であることを示している。試験した他の
組合せはすべて細胞増殖、酵素収量共に低かった。

第１１１表 フマル酸とクレアチニンの効果 １．０　３．４１　１６０ ａ：クレアチニンイミノヒドロラーゼ検定の検出限界の
１０単位／リットル未満 実施例４゜ 追加窒素源の効果 前記実施例２及び３の各々に於て、操作２の小規模酵素
生産方法の生産培地で使用した窒素源（まクレアチニン
のみであった。本実施例に於ては、植物蛋白分解物の）
・イーソイ（Ｈｙ−８ｏｙ、米国ニューシャーシｍ−ユ
ニオンのシェフイールドケミカル（Ｓｃｈｅｆｆｉｅｌ
ｄ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　）社製の大豆蛋白加水分解物の
商品名）及び非ペプシン性牛乳蛋白加水分解物のトリブ
チカーゼペプトン（Ｔｒｙｐｔ♂ｃ−ａｓｅ■Ｐｅｐｔ
ｏｎｅ　、米国ＭＤ−３ツケイスビルのビオケスト（Ｂ
ｉｏｑｕｅｓｔ　；　ＢＥＬ　）社製のトリプシン性カ
ゼイン加水分解物）を生産培地に追加使用し、操作２記
載の小規模酵素生産方法で評価した。追加窒素源の効果
は下記用■表記載の濃度水準にて測定した。これらの水
性栄養培地は本発明の改善された水性栄養培地である。

生産培地の残りの成分は培地／１６２と同一であった。

第１Ｖ表に示すように、ハイーソイの場合、濃度水準約
０．５重量％にて最良の結果が得られ、トリブチカーゼ
ペプトンの場合濃度水準０．１重量光にて最良の結果が
得られた。ハイソイ及びトリブチカーゼペプトンを夫々
０．５及び０．１重量Ｓ以上の水準で使用することは可
能であるが、これらの高水準では酵素の生産抑制が始っ
た。

第１Ｖ表 追加窒素源の効果 ；１１１１ａ　−１００１００ ハイ−ソイ　０．１　１１４　１０４ ０．５　１０８　１２０ １．０　１２８　−７５ ０．５　１０６　５９ １．０　１０２　３５ ａ　対照物−培地／１６２にて成育させた培養物実施例
＆ 炭素源組合わせの効果 本実施例では、グルコースとアミノ酸前駆物質の双方か
ら構成される組合わせ炭素源の微生物成長及び酵ズ生産
に及ぼす効果を測定検討した。本実施例の試験は、操作
２の小規模酵素生産方法及び操作３０大規模酵素生産方
法の双方を用いて行なった。以下の第７表に示した濃度
のグルコースを添加した以外は各ケース共その最終生産
培養液の組成は培地／Ｉ６２と同一であった。第ｖ表の
結果の示すところ、グルコースを添加したグルコースと
アミノ酸前駆物質の組合せ炭素源に於ては、微生物の増
殖は僅かにすぎなかったが酵素生産増加は顕著であった
。

第７表 組合わせ炭素源の効果−グルコース ０．０ａ／１６２　３．２９　１０１　１００１、ＯＡ
２　３．３１　１３６　１３５０．０ｃＬＡ３　３．６
１　５３８　１００１、ＯＡ３　３．９２　７２０　１
３４α：対照物−培地７ｇ６２で成育した培養物実施例
Ｇ 大規模酵素生産に於ける培地変性の結果本実施例では実
施例２−５記載生産培地の変性の組合せ効果を、操作３
記載の大規模酵素生産方法を用いて検討した。対照生産
培地は培地／１６２であった。本実施例の残りの試験で
は第■表記載のように培地／１６２の変性を行った。実
施例２−５にて議論しなかった第Ｖ１表の変性は、培地
廓２のＫＯＨをＨａ（ｊＨで置換したことのみであった
。そうすると酵素生産が改善可能なことが判明したので
行ったのである。第■表中培地Ｂ、Ｃ及びＤはすべて本
発明で使用する型の改善された水性栄養培地であり、対
照培地Ａと比較して酵素活性水準の改善が顕著であり、
一方対照培地Ａは前記培地／ｆ６２と同一であった。特
に追加窒素源並びに組合わせ炭素源を含有する培地Ｃ及
びＤの酵素生産の増加は顕著であった。本実施例の大規
模生産方法を行っている間、１５０　リットル醗酵器中
の醗酵過程の動力学を培地Ｅ、Ｃ及びＤの各々について
観察した。培地Ｂでは微生物の増殖はほとんど即刻開始
して指数的に増加し、約１０時間で一定値３８ｉ／１１
に達した。培地Ｂの酵素生産は４時間遅れで始寸り、増
殖度とほぼ平行して指数的に増加し、約１０時間抜最大
酵素生産水準に達した。

培地Ｃの微生物増殖は最初の３時間指数的に増加し、約
１０時間で一定値４　ｇ／１３に達した。培地Ｃの酵素
生産は醗酵開始後約４．５時間で始まり、増殖に平行し
て大よそ指数的に増加した。培地Ｃの最大酵素生産水準
は約１１−１３時間で得られ、その後は活性が低下し始
めた。培地りの微生物増殖は最初の４時間指数的に増加
し、その後約４ｇ／ｌで一定になった。培地りの酵素生
産は約５時間後に始まり、これも成長と平行して大よそ
指数的に増加し、約１１−１３時間後に最大酵素生産水
準に達した。

第Ｖ１表 大規模酵素生産に及ぼす培地変性の効果Ａ　ｕ、ｌ１Ｌ
ａ　２９５　１００ １．０％ タル酸 α：対照物−培地Ａ６．２にて増殖させた培養物実施例
７ 本発明の水性栄養培地にて成育した好気性土壌微生物が
クレアチニンヒドロラーゼ酵素の収量を増加させること
を示すため、二種の好気性クレアチニンイミノヒドロラ
ーゼ生産微生物、即ちブレビバクテリウム　シバリカタ
ム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅ−ｒｉｕｍ　ｄｉｖａｒｉｃ
ａｔｕｍ）　ＡＴＣＣ１４０２０（米国特許第４，０８
７，３２９号及び同第４，１３４，７９３号参照）とウ
レアーゼを含有せぬクレアチニンイミノヒドロラーゼを
生産する微生物ＡＴＣＣ３１５４６（操作１に前記）を
二種の水性栄養培地で増殖させた。特に、これら二種の
微生物の各々を、米国特許第４，０８７，３２９号実施
例１記載（本明細書の第■表に記載）組成の対照培地の
同量中にて増殖させた。これらの培養の操作は米国特許
第４，０８７，３２９号実施例６記載の操作（本明細書
第■表に記載）と同一であった。その後二種の各微生物
細胞を冷凍遠心分離器にて１５００Ｘｐ１５分間遠心し
て収得した。５０ｒｎｌ醗酵肉汁から得た細胞ペレット
をｐＨ７，５の０．１ＭＩＪン酸カリウム緩衝液ＬＯｍ
ｌ中に再懸濁させ、微生物細胞内で生産された酵素を抽
出するため該懸濁物を５分間音波処理した。冷凍遠心分
離器にて２７０００ｘｇｔ５分間遠心して細胞デブリス
を除去した。次に、二種の微生物の夫々から得られた未
精製酵素含有の組上澄液を、操作５記載のごとく検定し
てクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性を測定し、各微
生物に於けるクレアチニンイミノヒドロラーゼの収量を
定置的に評価した。そのあと前記微生物の各々について
前記の操作を繰り返した。但しこのときの各微生物の増
殖は実施例６の培地りと同一組成の本発明の改良された
水性栄養培地の同一量中にて行なった。培地りにて増殖
させた二種の微生物から得られたクレアチニンイミノヒ
ドロラーゼ収量即ちクレアチニンイミノヒドロラーゼ活
性を、前記と同一の方法にて定量した。結果を下記第７
表に示す。第７表に示すように、各二種の微生物により
生産されたクレアチニンイミノヒドロラーゼの収量は、
本発明の改良された栄養培地中にて微生物を増殖させる
ことにより、著るしく増加したのである。

第■表 対照培地 リットル当り グルコース　２０．０　ｇ タレアチニン塩酸塩　５．０ｇ Ｋ２ＨＰＯ４１，０、＠ ＭＱＳＯ，・７Ｈ２００，５ｉ ＫＣ１０，５ｇ 酵母抽出物　１．０９ ｐＨを７．５に調節して蒸留水にて１リツトルにした。

第１表 培養条件 条件　内　容 温度　３０℃ 撹拌速度　２００　ｒｐｍ 時間　２４時間 第７表 クレアチニンイミノヒドロラーゼの収量ＡＴＣＣ１４０
２０第ｖ１表の対照培地　１００ＡＴＣＣ１４０２０実
施例６の培地Ｄ　３５８ＡＴＣＣ３１５４６第■１表の
対照培地　１００．４７’ＣＣ３１５４６実施例６の培
地Ｄ　３００纂　第１表の対照培地にて増殖させた各微
生物から得られたクレアチニンイミノヒドロラーゼ活性
水準の絶対値を１００とした。次に実施例６の培地りに
て増殖させた各微生物から得られた未精製上澄液のクレ
アチニンイミノヒドロラーゼ活性水準を、第■表対照培
地に対する相対６分率として第７表に表わした。

特許出願人　イーストマン・コダック・カンパニー（外
２名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 栄養培地が７）ＩＩ　５．０乃至１０．０の範囲にあり
   、ル　グルコース及び／又はアミノ基非含有の有機酸で
   あるアミノ酸前駆物質を含有する炭素源、Ｂ、１）クレ
   アチニン及び ２）植物蛋白加水分解物及び／又は非ペプトン性乳蛋白
   加水分解物、 を含有する窒素源、 Ｃ０微量栄養分；及び り、緩衝剤、 を含有することを特徴とする、好気条件下にてクレアチ
   ニンイミノヒドロラーゼを生産する好気性土壌微生物を
   成育するための水性栄養培地。