JPS6087786A - クリプトコツカス属の酵母からのｌ−アミノ酸オキシダ−ゼ、それらの調製および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は巾広い基質範囲を有する新規なＬ−アミノ酸オ
キシダーゼ、クリプトコツカス（Ｏｒｙｐｔｏｃｏｃｃ
ｕｅ）掬の酵母の発酵によるその単離および相当するＬ
−α−アミノ酸またはそれらの銹導体からのα−ケト酸
、それらのエステルおヨヒエーテルの調製への前記Ｌ−
アミノ酸オキシダーゼの使用に関する。

Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（以下ＬＡＯと略記する）は
クリプトコツカス属の酵母中に訪尋し５る酵素である。

それゆえその調製には誘導物質（Ｉｎｄｕｃｅｒ）とし
てアミノ酸またはアミノ酸を放出する物質を添加して酵
母を発酵させる。本発明の好ましい態様を以下に詳細に
説明する。

クリプトコツカス属のうちではクリプトコツカス、ジウ
レンテイ（０，，１ａｕｒｅｎｔｉｉ）例えはクリプト
コツカス・ラウレンテイ変種マグヌス　（ｍａｇｎｕｓ
）ＣＢＳ５６９菌株、ならびにクリプトコツカス・アル
ビドウス（０，ａｌｂｉｄｕｓ）種が好ましい。

特に好ましいのはクリブトコツカスラウレンテイＤＳＭ
　２７６２　Ｎ４株である。この菌株の出発物質は唯一
の窒素源としてＤ−グルタミン酸を含有するミネラル培
地中２８℃で数回の工程にわたりそれぞれ２〜３日間保
湿培養されたボボジオブラシオ（Ｂｏｂｏｄｉｏｖｌａ
ｓｓｉｏ）（Ｕｐｐｅｒ　Ｖｏｌｔａ）地方からの土壌
試料であった。これらの液体培養物をＤ−α−アミノア
ジピン酸エチルアミドを唯一の窒素源として含有する培
地上で培養した。

さらに接種したのちなかんず（ＤＳＭ２７６２菌株を純
粋な培養物として単離した。

この菌株は菌糸体も偽菌糸も形成しない単細胞の卵形酵
母である。増殖は種々の発芽により行われる。子のう胞
子またはバリスト胞子の存在は検出され得なかった。凸
状の帯白色コロニーは租（てそして平滑な縁辺を有する
。カロチノイドの形態をした顔料形成は起らない。酵母
殿粉の検出は沃素−沃化カリウムを用いて行われ、コロ
ニーにおいてもまた液体培養物中にお〜１ても検出され
た。生理学的なＩｆ究では葡萄糖。

蔗糖、マルトース、ラフィノース、ガラクトース、乳糖
、殿粉、ラムノース、メリビオース、デキストリンおよ
びイノシトールが炭素源として吸収されることが示され
た。糖の発酵は起らなかった。硫酸アンモニウム、α−
アミノアジピン酸、グルタミン酸、アラニン、ロイシン
。

セリン、トリプトファン、チロシンおよびフェニルアラ
ニンの窒素源としての利用は示され得なかった。これに
対し硝酸ナトリウムでの生育は観察されなかった。

ＬＡＯが生育に平行して形成されそして対数相の終りに
向ってその最大活性に達することが見出された。好まし
い誘４９勿賀はＤ−アミノ酸特にＤ−Ｌ＋ｅｕ、　Ｄ−
α−アミノアジピンぶ（以下Ｄα患と略記する）ならび
にＤ−Ａｌａである。見出されたＬＡＯｌ’古（（ｉ：
　ＫついてのイへＦ各ン第１表に示ず。

第１表 株々のアミノらｔてよるＬ−アミノ酸オキシダーゼの誘
専ＮＨ４Ｏβ　９．５　０ Ｄ−Ａｌａ　１．９　１．２２ ＤＬ−Ａ’ｌａ　１１．８　（Ｊ、９３ＤＬ−αＡＡＡ
　８．９　１．７６ ＤＬ−Ｌｅｕ　４．２　１．６０ Ｌ−Ｍθｔ３．１　［１，７０ ＤＬ−Ｐｈｅ　３．６　０．７４ Ｌ−Ｔｒｙ　３．９　０．５Ｏ Ｌ−ｓｅｒ　１３．３　０．３０ Ｄ−Ｇｌｕ　１０．２　０ ＤＬ−Ｇｌｕ　１５．７　０ （ＬａＡＡＡ） 好ましいＣ−源は溶性殿粉および特に乳糖および蔗糖で
ある。

知られた微生物性Ｌ−アミノ酸オキシグーゼと対照的に
本発明によるＬＡＯは巾広い基質範囲を有ゴる。大抵の
天然のアミノ酸と並んでＬ−α−アミノアジピン酸およ
びＬ−七ンアロスポリンＣのような他のアミノ酸も相当
するα−ケト酸に変換される。しかしながらそれらと並
んでアミノ酸の訪尋体１丁なわちそれらのエステル特に
低級アルキルエステルおよびベンジルエステル、ならび
にエーテルしかもセリンのアルコール基のエーテルのみ
ならずチロシンのフェノール性ヒドロキシ基のエーテル
、およびシスティンのチオエーテルも変換される。ここ
でもまた低級アルキルおよびベンジルーエーテルマタハ
ーチオエーテルが好ましい。天然のチオエーテルＬ−メ
チオニンも同様に変換される。

すべての反応は厳密に立体特異的である。Ｌ−形が相当
するケ）Ｍまたはケト酸カ；尋体に変換される。従って
本発明によりラセミ化合物も分割でき、その場合り一形
がケト訪導体に変換され一方り一形は未変化のまま残る
。

Ｌ−アミノ酸の反応は好ましくはｐＨ６，５〜８．５好
ましくは７〜８特にＺ５で遂行される。それゆえ適当な
緩衝剤は燐酸カリウム緩衝液およびトリス−Ｈｅｎ緩衝
液である。

好ましい反応流度は約３０〜６０１：、好都合には４０
〜５５℃％に５０℃である。

ＬＡＯはＬ−α−ＡＡＡＫ対しＫｍ値０．２５ｍＭおよ
びＶｎａａｘ加Ｍを冶する。

本発明によるＬＡＯは高い保存安定性により優れている
。これは４℃で数日間そして一１８℃で数カ月間活性の
低下を伴うことなく使用されうる。

本発明によるＬＡＯは外側の細胞質膜に局在する。それ
ゆえ透通性となされてない、完全な細胞中における酵素
活性はセチル−トリメチル−アンモニウムブロマイドで
処理された細胞中におけると正しく同じ高さである。細
胞を謔結しそして解凍すると３０〜４０％の活性増大が
ひき起される。

本発明によるＬＡＯは細胞質膜からの濃縮物として使用
されうる。しかしながら特に好ましいのは固定された細
胞の形態における使用である。

前記したように酢索は外側の細胞質膜上に局在するので
、細胞を固定する場合無毒性条件下に保持する必要はな
い。

より高い安定性および改良された取扱い容易性なる知ら
れた１素固定のオリ点と並んで、全細胞の埋め込みにお
いては酵素の単離および鞘層が不快である。

画素または細胞の固定は知られた方法で天然または合成
の重合体を用いて遂行される（Ｎａｃｈｒ。

Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、Ｌａｂ、第２９巻第８５０頁（１
９８１年）％西ドイツ特許公開公報第２，２５２，８１
５号、同第２，３４５，６３３号、同Ｍ　２，４１４，
１２８号、同第２，４２０，１０２号および同第２，８
０５，６０７号参照）。

以下の実施例において本発明の％に好ましい態体・を詳
細に説明する。

実施例　１　・ 酵母クリプトコツカス・アルビドゥス（０，ａｌｂｌｕ
ｓ）を下記固形栄養培地上に保持する。

「栄養肉汁」８９ 寒　天　１５９ 蒸　留　水　１１ 培地を試馳管に分配しそして１２１℃で３０分間滅菌し
１次に冷却し、培養物を接種しそして２５℃で３〜４日
間日間保養培養。生育した培養物を滅菌食塩溶液１０ｍ
Ｎで洗い流しそして下記組成の培地に加える。

葡＠糖　１ｏｐ Ｄ−α−ＡＡＡ　０．５９ ｘｎ２ｐ０４　０．８７５１ に２ＨＰＯ４０，１２５９ Ｈａｂｉｔ　Ｏ，１９ Ｍｇ（Ｍｔ２・７Ｈ２００，５９ ０ａＯＡ　２　・７Ｊ（２００，１９ 痕跡元素溶液　１ｍＱ ビタミン溶液　１ｏ峨 蒸留水（ｐＨ７，２）　１１゜ 痕跡充水溶液：　ビタミン溶液： ＣｏＣｎ２　＋　６Ｈ２００，２５５１ヒオチｙ　［］
、［ｌ０１ｊｌＮｉＯ１２・６Ｈ２００，０１９ビタミ
ンＢ　１２　０．００５ＦＯｕＯＪ２２・２Ｈ２０ｏ、
ｏ’＋９　チアミンＨＯｊｌ！　０．０５ＺｎＯＪ！２
　０．１９　＝　”チン酸　０．［ｌ３５ｓ５ｓｏ３　
０５９　ｐ−アミノ安息香酸０．Ｏ２Ｎａ２Ｍ０Ｏ４・
２Ｈ２００，５９ピリドキサール−ＨＯ犯０．０１Ｎａ
Ｓｅ０３　・６ｆ（２００，１５１／’：／　）テン酸
カルシウム　０．０１Ｆθ８０４・７Ｈ２００，２９５
０饅エタノール　１℃蒸留水　１１ （ＨＣｌを用いてｐＨ２〜乙に調整） この培地５００峨を２Ｉ！、のエレンマイヤーフラスコ
中に入れそして１２１℃で３０分間滅菌する。

１０ｍ１！の接種物を接種したフラスコを次に２８℃お
よび１９０　ｒｐｍで回転振盪語中で保温培養する。７
２時間後生育した培養物を収穫し、洗浄しそして燐酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７，５，５０ｍＭ）中にとる。完全
な細胞のＬＡＯ活性を基質としてのＬ−α−ＡＡＡ　ヲ
ＪｆＪい０−フェニレンジアミン−ペルオキシダーゼ依
存性試験において測定すると細胞１ｇ当り１．５４であ
った。

実施例　２ クリプトコツカス・ラウレンティ（０，ｌａｕｒｅｎｔ
ｉｉ）ＤＳＭ２７６２株を実施例１の記載に従い栄養溶
液５００緘中で生育させそして３日後に、同じ培地９℃
を有するがしかしＤ−α−〃咳の代りにＤ−ロイシンを
含有する１２２の発師器中に移しそして２８℃、４００
　ｒｐｍおよび通気率毎時４００１で保温培養する。

４日後に細胞１９箔りＬＡ○活性３．５Ｕが測定された
。

実施例　３ χ−カラゲエニン（Ｍａｒｉｎｅ　Ｃｏ１１ｏｉｄｓ社
製、Ｒｏｃｋｌａｎｄ、Ｍａｉｎｅ、ＵＳＡ）の６％溶
液を７５℃で酵解させ、４０℃に冷却しそして生理食塩
溶液中のクリプトコツカス糸１月民の４％細ＩＩ包屁よ
ン蜀敲と１：１の割合で混合する。この腟濁液をカニユ
ーレから沈殿床（０ａ０１２１　Ｄ　ｍＭ、　ＫＯＪＩ
　３　Ｄ　０１ＵＭ　）中に注射するとビードが形成さ
れる。１時間投拌後０□３　Ｍ　ＫＯｎで６回洗う。カ
ラゲエニンビードを０．０２％のナトリウムアジドを含
有するＬｌ、１３Ｍ燐酸カリウムに、ｆｉＩ液（ｐＨ７
，５）中４℃で仇存する。ビードの活性は触媒の湿った
塊１ｇ当り約８０ｍＵであった。

実施例　４ ０、１　Ｍ燐酸カリウム緩＠液（ｐＨ８，０）中に溶解
シた１０ｍＭのＬ−フェニルアラニン１０ｍ１を実力ｍ
例３記載の操作により固定されたクリプトコツカス・ラ
ウレンテイＤＳＭ　２７１１５２ｆｍ刀ｃ１４９と６７
℃で通気しながら反応させる。工業上のカタラーゼ（Ｂ
ｏｅｈｒｉｎｇｓｒ社製、　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）　Ｉ　
Ｑ、Ｊを添加すると生成した過酸化水素が分解されそし
て生成物の品質が損なわれるのを阻止する。基質の消失
および生成物の形成は薄層クロマドグ２フイーにより追
跡されうる。生成物の検出は薄Ｍｆ　クロマトクラフィ
ーに２，４−ジニトロフェニルヒドシジンを噴霧するこ
とにより遂行される。

同様に、アンモニウムイオンの形成はニトロプルジッド
法により追跡されうる。

５時間後に出発物質は定量的に反応した。

以下の第２表および第６表に示される結果は実施例４に
より得られたものである。基質濃度は別に記載が７Ｌけ
れば４ｍＭである。

比２表 クリプトコツカス・ラウレンテイ ＤＳＭ２７６２株からのＬＡＯの基質範囲り一α−ＡＡ
Ａ　１００　：　Ｄ−Ａｌａ　０Ｌ−Ａｌａ　７２　：
Ｄ−α−ＡＡＡ　０Ｌ−Ｇｌｕ　４９　： Ｌ−Ｐｈｅ　７２　： Ｌ−Ｐｒｏ　Ｏ： Ｌ−Ｔｙｒ　５６　： Ｌ−ＶａｌＯ： 化６表 クリプトコツカス・ラウレンテイ ＤＳＭ２７６２株からのＬＡＯの基質範囲Ｌ−α−ＡＡ
Ａ　ＩＤ。

Ｌ−Ａｌａ−ＯＭｅ　９８ Ｌ−Ａｌａ−ＯＥｔ　４０ Ｌ−Ａｌａ−ＯｔＢｕ　３２ Ｌ−Ａｒｇ−ＯＭｅ　６４ Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＭｅ　１００ Ｌ−Ｌ７θ−ＯＭｅ　１０９ Ｄ、Ｌ−Ｍｅｔ−ＯＭｅ　１１０ ０Ｌ−θｔ−０Ｅｔ　８４ Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ　１１６ Ｌ−Ｐｈｅ−ＯＥｔ　８４ Ｌ−Ｐｈｅ−ＯｔＢｕ　６９ Ｌ−８ｅｒ−ＯＭｅ　５０ Ｌ−８ｅｒ−ＯＢｚ　８２ Ｌ−ＣＢ−Ｂｚ）−０ｙｅ”　７０ Ｌ−（Ｓ−Ｂｓ？）−Ｃｙｓ−ＯＭｏ”　６３Ｌ−Ｔｙ
ｒ−Ｍｅ−エーテル＊＊　７４Ｄ　、Ｌ−Ｖａｌ−ＯＭ
ｅ　０ Ｌ−１−ナフチル−アラニン　６３ Ｌ−２−す７チルーアラニン　１００ ＋　５ｍＭ 骨臀　２ＩｌｎＭ Ｍｅ−メチル Ｅｔ＝　エチル ＆−第三ブチル ＢＺ−ベンジル

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）クリプトコツカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属
   の酵母からのＬ−アミノ酸オキシダーゼ。 ２）クリプトコツカス・ラウレンテイ（０，Ｌａｕｒθ
   ｎｔｉｉ）種の酵母からのＬ−アミノ酸オキシダーゼ。 ３）クリプトコツカス・ラウレンテイＤＳＭ　２７６２
   株からのし一アミノ酸オキシダーゼ。 ４）前記した酵母をアミノ酸またはアミノ酸を放出する
   物質を添力Ｃして発酵させることを特徴とする特許 記載のＬ−アミノ酸オキシダーゼの製法。 ５）　Ｄ−アミノ酸が用いられることを％徴とする前記
   特許請求の範囲第４項記載の方法。 ６）’　Ｄ−Ｌｅｕ，　Ｄ−Ａｌａ，　Ｄ一α−アミノ
   アジビン酸またはＤ一α−アミノアジピン眩−δ−セミ
   エチルアミドが用いられることを特徴とする前記特許請
   求の範囲８５項記載の方法。 ７）炭素源として乳糖または蔗糖が用いられることを特
   徴とする前記特許請求のｆｋ曲第４ないし６項のいずれ
   か１項またはそれ以上の項に記載の方法。 ８）相当ずるＬ−α−アミノ酸またはその訪導体からの
   α〜ケト酸およびそれらのエステルおよびエーテルの調
   製に前記特許請求の範囲第１ないし３項記載のＬ−アミ
   ノ酸メーキシタ゛ーセまたは前記特￥Ｆ諸求の範囲第４
   な（・し第７項記載の方法により得られる生成物を使用
   すること。 ９）　Ｌ−アミノ酸オキシダーゼがａＩＪ泡質膜からの
   濃縮物としてまたは固定された細胞の形態で使用される
   前記特許請求の範囲第８項記載の使用。 １０）クリプトコツカス・ラウレンティＤＳＭ　２７６
   ２゜