CN103842505B - 新型酰胺酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种用于制造作为医药品等的合成原料及中间体有用的化合物即光学活性托品酸的方法。本发明提供一种具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的新型的多肽、编码该多肽的DNA、含有该DNA的载体、利用该载体转化的转化体、以及利用它们的光学活性羧酸酰胺及光学活性羧酸的制造方法。

Description

新型酰胺酶
技术领域
本发明涉及一种具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的新型的多肽、编码该多肽的DNA、含有该DNA的载体、利用该载体转化的转化体、以及利用它们的光学活性羧酸酰胺及光学活性羧酸的制造方法。
背景技术
光学活性托品酸为作为具有生理活性的生物碱或医药品等的合成原料及中间体有用的化合物。以往，关于获得光学活性托品酸的方法，已知有使外消旋体托品酸与荧光素酶、ATP、2价金属离子及CoA反应进行光学拆分的方法(专利文献1)、使用南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶B(CAL-B)将外消旋体托品酸丁酯光学拆分的方法(非专利文献1)、使用源自产酸克雷伯式菌(Klebsiella oxytoca)的酯酶将外消旋体托品酸酯光学拆分的方法(非专利文献2)，未知通过将外消旋体托品酸酰胺不对称水解来获得光学活性托品酸的方法。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开第2007-29017
非专利文献
非专利文献1：Tetrahedron：Asymmetry16：2005，3892-3896
非专利文献2：Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic57，158-163(2009)
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于提供一种用于制造作为医药品等的合成原料及中间体有用的化合物即光学活性托品酸的方法。
用于解决问题的方法
本发明人等为了解决上述课题进行了潜心研究，结果，通过本发明人等从土壤中分离的KNK AM38株中分离精制能够将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)的酰胺酶，获得编码其的DNA。另外，由使用获得的DNA制造的富含酰胺酶的转化体确认了进行高立体选择性的托品酸酰胺的水解反应。进而，使用基于上述的源自KNK AM38株的DNA的碱基序列及与该碱基序列同一性高的已知的碱基序列设计的引物，以其它的土壤分离菌3株(KNKAM40株、KNK AM1011株、KNK AM250株)的染色体DNA作为模板进行PCR，结果，可以获得编码具有与KNK AM38株所具有的水解活性同等活性的酰胺酶的DNA。获得的4个DNA的碱基序列未在以DDBJ为代表的DNA数据库中登录，确认为新序列。本发明是基于这种见解而完成的。
本发明包含以下的发明。
[1]一种多肽，其为以下(a)～(c)中的任一种：
(a)由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列构成的多肽；
(b)由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列中缺失、插入、置换和/或附加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽；
(c)由与序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列构成，且具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽。
[2]一种DNA，其编码[1]所述的多肽。
[3]一种DNA，其为以下(d)～(g)中的任一种：
(d)由序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列构成的DNA；
(e)由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列具有80%以上的序列同一性的碱基序列构成，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA；
(f)与由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严谨的条件下杂交，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA；
(g)由序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列中缺失、插入、置换和/或附加了1个或者多个碱基的碱基序列构成，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA；
[4]一种载体，其含有[2]或[3]所述的DNA。
[5]一种转化体，其通过[4]所述的载体转化宿主细胞而得到。
[6]根据[5]所述的转化体，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
[7]一种[1]所述的多肽的制造方法，其特征在于，在培养基中培养[5]或[6]所述的转化体，从得到的培养物中收集已表达的多肽。
[8]一种光学活性羧酸和/或光学活性羧酸酰胺的制造方法，其包含使[1]所述的多肽、或[5]或者[6]所述的转化体与下述式(I)所示的羧酸酰胺的对映体混合物作用，生成下述式(II)所示的(R)体或(S)体的羧酸和/或下述式(III)所示的(S)体或(R)体的羧酸酰胺。
[化学式1]
(式中，X表示羟基或酰胺基，R表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的烯基、任选具有取代基的炔基、任选具有取代基的芳基、或任选具有取代基的芳烷基。)
[化学式2]
(式中，X、R与上述的X、R意义相同。)
[化学式3]
(式中，X、R与上述的X、R意义相同。)
本申请要求在2011年9月29日申请的日本专利申请2011-214381号的优先权，包含该专利申请的说明书中所记载的内容。
发明效果
根据本发明，可提供一种具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的新的多肽。如果利用本发明的多肽，则可以以高光学纯度且高收率制造作为医药品等的合成原料及中间体有用的光学活性托品酸等光学活性羧酸或光学活性羧酸酰胺。
具体实施方式
1、新型酰胺酶及多肽
本发明的酰胺酶为具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽，由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列构成。由序列编号1的氨基酸序列构成的多肽为从KNK AM38株中分离的多肽，由序列编号3、5、7所示的氨基酸序列构成的多肽分别为从KNK AM40株、KNK AM1011株、KNK AM250株分离的具有与上述活性实质上同等的活性的多肽。“实质上同等”是指例如相对于由序列编号1的氨基酸序列构成的多肽的上述活性为90%以上、优选为95%以上、更优选为98%以上的活性。
另外，本发明的酰胺酶只要具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性，则也包含由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列构成的多肽的同源的多肽。作为同源的多肽，例如可以举出：由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列中缺失、插入、置换和/或附加了1个或者多个氨基酸的氨基酸序列构成，且具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽。在此，作为“多个氨基酸”的个数，是指能够通过定点突变诱发法等公知的突变蛋白质制作法来缺失、插入、置换和/或附加程度的个数，只要保持上述的活性，则其个数没有限制，是指例如30个以下、优选20个以下、更优选10个以下、进一步优选7个以下、特别优选5个以下。
上述氨基酸的缺失、插入、置换和/或附加可通过定点突变导入法(Nucleic AcidsRes(1982)10：6487；Methods in Enzymol(1983)100：448；Molecular Cloning2nd Edt.，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)；PCR A Practical Approach，IRLP ress(1991)pp.200)等公知手法或依据其的方法导入到序列编号1、3、5、7所示的氨基酸序列中。
另外，作为同源的多肽，还可以举出由与序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列具有80%以上的序列同一性的氨基酸序列构成，且具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽。在此，“80%以上的序列同一性”是指优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的序列同一性。序列同一性例如在使用同源性检索程序BLAST(W.R.Pearson&D.J.Lipman P.N.A.S.(1988)85：2444-2448)比较分析2个氨基酸序列时，用相对于序列整体的同一性(Identity)值表示。
本发明的多肽可以通过如下方法来获得：通过基于其氨基酸序列进行化学合成的方法、自表达载体的体外转录、作为利用表达载体得到的转化细胞的表达产物分离精制的方法等。
在化学合成多肽的情况下，可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁基氧基羰基法)等公知的化学合成法来进行。
在通过体外翻译表达多肽的情况下，若将具有RNA聚合酶启动子的表达载体添加于含有对应于启动子的RNA聚合酶的兔网织红细胞裂解物、小麦胚芽提取物等体外翻译体系，则能够在体外生产多肽。作为RNA聚合酶启动子，可以举出：T7、T3、SP6等。另外，作为含有这些RNA聚合酶启动子的载体，可以举出：pKA1、pCDM8、pT3/T718、pT7/319、pBluescriptII等。
另外，在作为利用表达载体得到的转化细胞的表达产物进行分离精制的情况下，在后述的转化体的项目中也进行描述，概要如下所述。首先，基于上述各氨基酸序列确定编码多肽的碱基序列，得到由该碱基序列构成的DNA片段。接着，在例如用大肠杆菌使多肽表达的情况下，在能够在大肠杆菌中复制的具有起始点、启动子、核糖体结合位点、DNA克隆位点、终止子等的表达载体上重组上述DNA片段，制作表达载体。通过用该表达载体转化宿主细胞，能够得到表达多肽的转化体细胞，通过培养该转化体，能够得到该培养物中所生产的目标多肽。
2、DNA
本发明的DNA为编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA，只要为能够根据后述的方法在所导入的宿主细胞内表达1中的多肽的DNA就可以为任意DNA，也可以含有任意的非翻译区域。具体而言，作为本发明的DNA，可以举出由序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列构成的DNA。
本发明的编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA例如可通过如下所述的方法获得。首先，用气相蛋白测序仪确定从具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的微生物、例如上述KNK AM38株中所精制的多肽的N末端的氨基酸序列。另外，使所精制的多肽与赖氨酰肽链内切酶(Lysylendopeptidase)等蛋白酶作用而消化成适当大小的多肽，然后，使用HPLC等精制得到的多肽，根据与上述同样的方法确定内部氨基酸序列。合成基于如上得到的N末端氨基酸序列及内部氨基酸序列设计的DNA引物。接着，从作为多肽的起源的微生物中分离染色体DNA。染色体DNA可以通过如下操作得到：将所培养的细胞用表面活性剂、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯仿、苯酚等裂解、处理后，用异丙醇使所提取的DNA析出，用乙醇清洗通过离心分离得到的沉淀(例如参照Current Protocols in Molecular Biology(Greene Publishing Associates andWiley-Interscience))。将该染色体DNA作为模板，使用上述的DNA引物进行PCR，由此可以得到目标DNA的一部分。接着，可以通过反向PCR法获得编码已获得的部分基因的进一步N末侧和C末侧的DNA片段(例如参照Nucleic Acids Res.16，8186(1988))。确定该DNA片段的碱基序列后，基于推定比多肽的N末端更靠上游的部分、及推定比C末端更靠下游的部分的各自的碱基序列制作DNA引物。以之前得到的染色体DNA作为模板，使用该DNA引物进一步进行PCR，由此可以获得编码目标多肽的DNA。
本发明的DNA只要具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的水解的活性，则也包含由序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列构成的DNA的同源的DNA。
例如，作为同源的DNA，可以举出：由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列具有80%以上的序列同一性的碱基序列构成，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA；与由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严谨的条件下杂交，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA；由在序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列中缺失、插入、置换和/或附加了1个或者多个碱基的碱基序列构成，且编码具有将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性的多肽的DNA。
上述的“80%以上的序列同一性”是指优选85%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上、最优选98%以上的序列同一性。
另外，与由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA在严谨的条件下杂交的DNA是指通过以由与序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列互补的碱基序列构成的DNA作为探针，在严谨的条件下使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法、或者印迹杂交法（サザンハイブリダイゼーション法）等而得到的DNA。
上述的“严谨的条件”是指形成所谓的特异性杂种且未形成非特异性杂种的条件。例如可以举出：相对于序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列，由如上所述的具有高序列同一性的碱基序列构成的DNA的互补链杂交，同源性比其低的核酸的互补链不会杂交的条件。如果为本领域从业人员，则上述的严谨的杂交条件可以参考Sambrook等、MolecularCloning，A Laboratory Manual，3rd Ed，Cold Spring Harbor Laboratory(2001)来适当选择。如果示出一个例子，则在含有25%甲酰胺、在更严谨的条件下为50%甲酰胺、4×SSC、50mM HEPES(pH7.0)、10×Denhardt's溶液、20μg/ml改性鲑鱼精子DNA的杂交溶液中在42℃下预杂交一晚后，添加标记的探针，在42℃下保温一晚，由此进行杂交。之后的清洗中的清洗液及温度条件为“1xSSC、0.1%SDS、37℃”左右，作为更严谨的条件为“0.5xSSC、0.1%SDS、42℃”左右，作为进一步严谨的条件为“0.2xSSC、0.1%SDS、65℃”左右。在此，1倍浓度的SSC溶液(1xSSC)的组成由150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠构成。温度越高，盐浓度越低，严谨度变得更高，能够分离同一性更高的基因。
但是，上述SSC、SDS及温度的条件的组合为例示，如果为本领域从业人员，则可以通过适宜组合确定杂交的严谨度的上述或者其它的要素(例如探针浓度、探针的长度、杂交反应时间等)来实现与上述同样的严谨度。
另外，关于上述的“缺失、插入、置换和/或附加了1个或者多个碱基的碱基序列”，作为可以缺失、插入、置换和/或附加的碱基的个数，只要通过该DNA所编码的多肽不丧失上述活性，则其个数没有限制，但优选为200个碱基以下，更优选为150个碱基以下，进一步优选为100个碱基以下，最优选为50个碱基以下。
上述的同源DNA可以通过相对于序列编号2、4、6、8所示的碱基序列，利用定点突变导入法(Nucleic Acids Res(1982)10：6487；Methods in Enzymol(1983)100：448；Molecular Cloning2nd Edt.，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989)；PCR APractical Approach，IRLP ress(1991)pp.200)等公知手法或依据其的方法导入突变来得到，例如可以利用使用了定点突变诱发法的突变导入用试剂盒(例如Mutant-K(TAKARA公司制)或Mutant-G(TAKARA公司制))、TAKARA公司的LA PCR in vitro Mutagenesis系列试剂盒。
在本说明书中所记述的上述DNA的分离、及后述的载体的制备、转化等的基因操作只要没有特别说明，则可以通过Molecular Cloning2nd Edition(Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)、Current Protocols in Molecular Biology(GrenePublishing Asscociates and Wiley-Interscience)等成书中所记载的方法来实施。
3、载体
本发明的载体只要能够在适当的宿主细胞内表达通过所述DNA所编码的多肽就没有特别限定。作为这样的载体，例如可以举出：质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体等，进而，也可以使用能够在与其它的宿主株之间进行基因交换的穿梭载体。
这样的载体通常含有lacUV5启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、lpp启动子、tufB启动子、recA启动子、pL启动子等控制因子，可优选用作包含与本发明的DNA可操作连接的表达单元的表达载体。例如，可优选使用pUCN18。质粒pUCN18为通过PCR法将pUC18(Takara-bio公司制、GenBank Accession No.L09136)的第185个T变为A并破坏NdeI位点，进而，将第471-472个GC变为TG来重新导入NdeI位点的质粒。
上述控制因子是指具有功能性启动子及任意的相关联的转录要素(例如增强子、CCAAT盒、TATA盒、SPI部位等)的碱基序列。上述的“可操作连接”这样的术语是指调节基因的表达的启动子、增强子等各种调节元件和基因在宿主细胞中在可操作的状态下连接。控制因子的类型及种类可根据宿主发生变化是对于本领域从业人员总所公知的事项。
作为本说明书内所记载的宿主细胞，可以举出：细菌、酵母、丝状菌、植物细胞、动物细胞等，从导入及表达效率的方面考虑，优选细菌，特别优选大肠杆菌。
含有DNA的载体可通过电穿孔法、磷酸钙法、核糖体法、DEAE葡聚糖法等公知的方法导入宿主细胞。在使用大肠杆菌作为宿主细胞的情况下，例如可通过使用市售的Escherichia coli HB101感受态细胞(Takara-bio公司制)来将该载体导入宿主细胞。
4、转化体
本发明的“转化体”可通过将编码本发明的多肽的DNA导入所述载体并将其导入宿主细胞来得到。另外，本发明的“转化体”不仅包含培养菌体，还包含其处理物。在此所谓的处理物是指例如用表面活性剂或有机溶剂进行了处理的细胞、干燥细胞、进行了破碎处理的细胞、细胞的粗提取液等，以及除此之外，通过公知的方法将它们固定化的物质。只要残留将外消旋体托品酸酰胺选择性地水解为(R)体的活性，则可以将这些处理物用于本发明的反应。
本发明的转化体的培养只要用于转化的宿主细胞增殖、且可生成本发明的多肽，则可使用含有通常的碳源、氮源、无机盐类、有机营养素等的液体营养培养基来实施。
为了分离精制转化体中所表达的多肽，可以组合公知的分离操作来进行。例如可以举出：利用尿素等改性剂或表面活性剂的处理、超声波处理、酶消化、盐析或溶剂沉淀法、透析、离心分离、超滤、凝胶过滤、SDS-PAGE、等电点电泳、离子交换色谱法、疏水性色谱法、亲和色谱法、反相色谱法等。
5、光学活性羧酸酰胺及光学活性羧酸的制造方法
根据本发明，可提供一种光学活性羧酸和/或光学活性羧酸酰胺的制造方法，其包含：使上述多肽或转化体与下述式(I)所示的羧酸酰胺的对映体混合物作用，生成下述式(II)所示的(R)体或(S)体的羧酸和/或下述式(III)所示的(S)体或(R)体的羧酸酰胺。
[化学式4]
(式中，X表示羟基或酰胺基，R表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的烯基、任选具有取代基的炔基、任选具有取代基的芳基、或任选具有取代基的芳烷基)
[化学式5]
(式中，X、R与上述的X、R意义相同)
[化学式6]
(式中，X、R与上述的X、R意义相同)
上述式(I)的R所示的烷基通常是指碳原子数1～8的烷基，例如可以举出：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、正己基、正庚基、正辛基等。
上述式(I)的R所示的烯基通常是指碳原子数2～8的烯基，例如可以举出：乙烯基、丙烯基、正丁烯基、异丁烯基、仲丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基等。
上述式(I)的R所示的炔基通常是指碳原子数2～8的炔基，例如可以举出：乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基等。
上述式(I)的R所示的芳基通常是指碳原子数6～14的芳基，例如可以举出：苯基、萘基、蒽基、菲基、联苯基等。
作为上述R基的芳烷基，通常是指碳原子数6～8的芳烷基，具体而言，可以举出：苄基、苯乙基、萘基甲基等。
上述烷基、烯基、炔基、芳基及芳烷基任选具有取代基，作为取代基，可以举出：卤素原子、羟基、氨基、硝基等。
作为上述式(I)所示的作为基质的羧酸酰胺，具体而言，可以举出：托品酸酰胺、3-羟基异丁酸酰胺、2-羟基甲基戊酸酰胺、2-羟基甲基己酸酰胺、2-苄基-3-羟基丙酸酰胺、2-环己基-3-羟基丙酸酰胺、3-苄基-2-羟基丙酸酰胺等，并不限于外消旋体，可以使用对映体混合物。
反应中可以使用水系溶剂，也可以混合使用水系的溶剂和有机系的溶剂。作为有机系溶剂，例如可以举出：甲苯、醋酸乙酯、醋酸正丁酯、己烷、异丙醇、二异丙醚、甲醇、丙酮、二甲基亚砜等。反应例如在10℃～70℃的温度下进行，反应液的pH维持为例如4～10。反应可以以分批方式或者连续方式实施。在分批方式的情况下，反应基质例如以0.1%～70%(w/v)的进料浓度添加。
在上述的反应条件中，在以外消旋体托品酸酰胺作为基质的情况下，可得到(R)-托品酸和(S)-托品酸酰胺。
反应中生成的光学活性羧酸和/或光学活性羧酸酰胺、例如光学活性托品酸和光学活性托品酸酰胺可通过常法分别分离、精制。例如可以通过将含有水解反应中生成的光学活性托品酸的反应液用醋酸乙酯、甲苯等有机溶剂萃取，在减压下蒸馏除去有机溶剂后，进行蒸馏、重结晶、或色谱法等处理来分离、精制。另外，可以将从反应液中除去微生物菌体而得到的滤液使用硫酸等进行中和晶析，过滤出析出的目标物，由此也可以分离、精制。
实施例
下面，举出实施例对本发明进一步具体地进行说明，但本发明并不仅限定于这些实施例。另外，在以下的记载中，“%”只要没有特别说明，则是指“重量%”。
(参考例1)外消旋体托品酸酰胺的合成
将外消旋体托品酸(49.85g、300mmol)在甲醇(250ml)和浓硫酸(0.5g)中在80℃下搅拌20小时后，在减压下蒸馏除去溶剂，由此得到托品酸甲酯的油状物(9.3g、45.9mmol)。
将上述的托品酸二甲酯的油状物(9.0g、44.5mmol)放入耐压容器，加入氨水溶液(200ml、900mmol)后，在密闭体系中在室温下搅拌20小时，然后过滤出析出的固体。将过滤出的固体在减压下干燥，由此得到托品酸酰胺的固体(29g、176mmol)。
(实施例1)
(1)KNK AM38株来源的酰胺酶的分离、精制
将土壤分离菌KNK AM38株接种于在试验管内灭菌的60ml的培养基A(甘油20g、浓缩肉汁10g、酵母提取物5g、聚胨10g、氯化钠3g、用去离子水定容为1L、灭菌前pH7.0)，在30℃下需氧振荡培养12小时。将该培养液15ml接种于在烧瓶内灭菌的3L的培养基A，在30℃下需氧振荡培养24小时。培养结束后，通过离心分离收集菌体，使菌体悬浮于100mM磷酸缓冲液(pH7.0)后，通过超声波破碎菌体，将其离心分离。在上清液中以成为0.5%终浓度的方式添加硫酸精蛋白，通过离心分离除去产生的沉淀。在该上清液中以成为10%终浓度的方式添加甘油，将其上样至DEAE-TOYOPEARL650M(东曹公司制)进行柱层析，用含有10%浓度的甘油的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗后，用相同缓冲液施加0M～0.3M的氯化钠的浓度梯度进行洗脱，收集具有活性的级分。在该活性级分中以成为终浓度0.5M的方式溶解硫酸铵后，上样至Butyl-TOYOPEARL(东曹公司制)进行柱层析，用含有10%浓度的甘油的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)施加0.5M～0M的硫酸铵的浓度梯度进行洗脱。将得到的活性级分用含有10%浓度的甘油的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)透析后，上样至Resource Q(Amersham Pharmacia Biotech公司制)进行柱层析，用含有10%浓度甘油的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)清洗后，用相同缓冲液施加0M～0.3M的氯化钠的浓度梯度进行洗脱。将得到的活性级分上样至Superdex200HR10/30(Amersham Pharmacia Biotech公司制)进行凝胶过滤，用含有10%浓度的甘油及0.15M的氯化钠的20mM磷酸缓冲液(pH7.0)进行洗脱。将得到的活性级分上样至BIO-Gel HThydroxyapatite(Bio-Rad Laboratories公司制)进行柱层析，用含有10%浓度的甘油的磷酸缓冲液(pH7.0)施加10mM～25mM的浓度梯度进行洗脱。利用SDS-聚丙烯酰胺电泳分析得到的活性级分，结果，以单带的形式检测出酰胺酶，可以确认精制酶的纯粹性。
(2)酰胺酶基因的克隆
首先，将通过与(1)同样的方法培养KNK38株而得到的菌体使用CTAB、氯仿、苯酚溶解、处理后，将所提取的DNA用异丙醇析出，将通过离心分离得到的沉淀用乙醇清洗，由此制备染色体DNA。接着，使用气相蛋白测序仪确定(1)中精制的酰胺酶的氨基末端的氨基酸序列。进而，将使V8蛋白酶在4M的尿素的存在下与(1)中精制的酰胺酶作用而生成的多肽片段使用反相HPLC精制后，通过与上述同样的方法确定酰胺酶的内部氨基酸序列。使用基于N末端氨基酸序列设计的DNA引物(Primer-1：序列编号9和基于内部氨基酸序列设计的DNA引物(Primer-2：序列编号10)，以之前得到的染色体DNA作为模板进行PCR。该结果，获得目标酰胺酶基因的一部分(称为部分基因)。
接着，为了获得目标基因的全长，进行以下的操作。在上述部分基因中，基于与酰胺酶的N末端侧、C末端侧各自的部分相当的碱基序列，合成朝向部分基因的外侧方向的DNA引物(Primer-3：序列编号11、及、Primer-4：序列编号12)。使用该引物，以使用T4DNA连接酶使以限制酶ApaI、ApaLI、BspT104I将之前得到的染色体DNA分解而得到的片段环化而得到的DNA作为模板，进行反向PCR。由此，获得含有已获得的部分基因的进一步外侧的基因部分的DNA片段。确定该DNA片段的碱基序列后，制备具有在推定比酶的N末端更靠上游的部分的碱基序列上结合限制酶EcoRI的切断位点而成的序列的DNA引物(Primer-5：序列编号13)和具有在推定比C末端更靠下游的部分的碱基序列结合制限酶SacI切断部位而成的序列的DNA引物(Primer-6：序列编号14)。使用该DNA引物，通过PCR扩增该序列之间的DNA，由此获得含有酰胺酶基因的全长的DNA片段。对得到的DNA片段的一部分的碱基序列进行分析，确认了含有酰胺酶基因的全长(序列编号2)。
(3)由KNK AM40株、KNK AM1011株、KNK AM250株的酰胺酶基因克隆
使用基于与(1)的序列编号2所示的碱基序列及与序列编号2同一性高的已知碱基序列设计的DNA引物(Primer-7：序列编号15、Primer-8：序列编号16)，以通过(1)中记载的方法得到的KNK AM40株、KNK AM1011株、KNKAM250株各自的染色体DNA作为模板进行PCR。该结果，获得目标酰胺酶基因的一部分。通过进行获得与(2)中记载的方法同样的目标基因的全长的操作，得到由序列编号4、6、8所示的碱基序列构成的DNA。
(实施例2)酰胺酶的制备
将实施例1中得到的源自KNK AM38株、KNK AM1011株、KNK AM250株的DNA片段插入质粒pUCN18(通过PCR法，将pUC18(Takara-bio公司制、GenBank Accession No.L09136)的第185位的T变为A且破坏NdeI位点，进而进一步将第471-472位的GC变为TG，由此重新导入NdeI位点的质粒)的lac启动子的下游的EcoRI识别位点和SacI识别位点之间，构建重组载体pNAM38、pNAM1011、pNAM250。另外，将实施例1中得到的源自KNK AM40株的DNA片段插入质粒pUCN18的lac启动子的下游的EcoRI识别位点和SphI识别位点之间，构建重组载体pNAM40。使用这些重组载体pNAM38、pNAM40、pNAM1011、pNAM250转化E.coli HB101感受态细胞(Takara-bio公司制)，得到E.coli HB101(pNAM38)、E.coli HB101(pNAM40)、E.coliHB101(pNAM1011)、E.coli HB101(pNAM250)。将得到的转化体接种于含有200μg/ml的氨苄青霉素的2×YT培养基(胰化蛋白胨1.6%、酵母提取物1.0%、NaCl0.5%、pH7.0)5ml，在37℃下振荡培养24小时。通过离心分离收集菌体，悬浮于5ml的100mM磷酸缓冲液(pH7.0)。
(实施例3)外消旋体托品酸酰胺的R体选择性水解
混合实施例2中制备的菌体悬浮液1ml和通过参考例1中记载的方法合成的基质托品酸酰胺20mg，在30℃下振荡24小时。反应结束后，通过离心分离除去固体物质，利用高效液相色谱法分析反应液中的基质及产物，由此利用下述式求出转化率(%)。进而，将反应液用1N盐酸将pH调整为2，利用高效液相色谱法分析通过醋酸乙酯提取而获得的托品酸，由此，利用下述式求出光学纯度(%ee)。
·转化率(%)=产物量/(基质量+产物量)×100
·光学纯度(%ee)=(A-B)/(A+B)×100(A及B表示对应的对映异构体量，A>B)
上述高效液相色谱法的条件如下所述。
[转化率的分析]
柱：5C18-ARII(4.6mmφ×250mm、Nacalai Tesque公司制)，洗脱液：20mM磷酸水溶液(pH2.5)/乙腈=6/4，流速：0.5ml/分钟，柱温：30℃、测定波长：210nm
[光学纯度的分析]
柱：CHIRALCEL OD-H(4.6mmφ×250mm、Daicel化学公司制)，洗脱液：己烷/异丙醇/三氟乙酸=95/5/0.1，流速：0.7ml/分钟，柱温：35℃，测定波长：254nm
将得到的结果示于表1。
[表1]
工业实用性
本发明可用于作为医药品等的合成原料及中间体的光学活性羧酸和/或光学活性酰胺的制造领域。
本说明书中引用的全部发行物、专利及专利申请直接作为参考引入本说明书中。

Claims (8)

1.一种多肽，其为由序列编号1、3、5、或7所示的氨基酸序列构成的多肽。
2.一种DNA，其编码权利要求1所述的多肽。
3.一种DNA，其为由序列编号2、4、6、或8所示的碱基序列构成的DNA。
4.一种载体，其含有权利要求2或3所述的DNA。
5.一种转化体，其通过权利要求4所述的载体转化宿主细胞而得到。
6.根据权利要求5所述的转化体，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌。
7.一种权利要求1所述的多肽的制造方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求5或6所述的转化体，从得到的培养物中收集已表达的多肽。
8.一种光学活性羧酸和/或光学活性羧酸酰胺的制造方法，其包括：
使权利要求1所述的多肽、或权利要求5或者6所述的转化体与下述式(I)所示的羧酸酰胺的对映体混合物作用，生成下述式(II)所示的(R)体或(S)体的羧酸和/或下述式(III)所示的(S)体或(R)体的羧酸酰胺，
式中，X表示羟基或酰胺基，R表示任选具有取代基的烷基、任选具有取代基的烯基、任选具有取代基的炔基、任选具有取代基的芳基、或任选具有取代基的芳烷基，
式中，X、R与上述的X、R意义相同，
式中，X、R与上述的X、R意义相同。
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