JPWO2013047767A1 - 新規アミダーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
[1] 以下の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチド。
(a)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
(c)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
[2] [1]に記載のポリペプチドをコードするDNA。
(d)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列からなるDNA
(e)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(f)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(g)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/又は付加された塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
[4] [2]又は[3]に記載のDNAを含むベクター。
[5] [4]に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
[6] 前記宿主細胞が大腸菌である[5]に記載の形質転換体。
[7] [5]又は[6]に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から発現させたポリペプチドを採取することを特徴とする、[1]に記載のポリペプチドの製造方法。
本発明のアミダーゼは、ラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドであって、配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列からなる。配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、KNK AM 38株より単離されたポリペプチドであり、配列番号3、5、7に示すアミノ酸配列からなるポリペプチドは、それぞれKNK AM 40株、KNK AM 1011株、KNK AM 250株より単離された上記活性と実質的に同等の活性を有するポリペプチドである。「実質的に同等」とは、例えば、配列番号1のアミノ酸配列からなるポリペプチドの上記活性に対して90%以上、好ましくは95%以上、より好ましくは98%以上の活性をいう。
本発明のDNAは、ラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNAであり、後述する方法に従って導入された宿主細胞内で1.のポリペプチドを発現し得るものであればいかなるものでもよく、任意の非翻訳領域を含んでいてもよい。具体的には、本発明のDNAとして、配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列からなるDNAが挙げられる。
本発明のベクターは、適当な宿主細胞内で前記DNAによりコードされるポリペプチドを発現できるものであれば、特に限定されない。このようなベクターとしては、例えば、プラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベクターなどが挙げられ、さらに、他の宿主株との間での遺伝子交換が可能なシャトルベクターも使用できる。
DNAを含むベクターは、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、DEAEデキストラン法など公知の方法により宿主細胞に導入できる。宿主細胞として大腸菌を用いる場合、例えば、市販のEscherichia coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を用いることにより、当該ベクターを宿主細胞に導入できる。
本発明の「形質転換体」は、本発明のポリペプチドをコードするDNAを、前記ベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入することにより得られる。なお、本発明の「形質転換体」には、培養菌体は言うまでもなく、その処理物も含まれる。ここでいう処理物とは、例えば、界面活性剤や有機溶媒で処理した細胞、乾燥細胞、破砕処理した細胞、細胞の粗抽出液等のほか、公知の手段でそれらを固定化したものを意味する。ラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性が残存する限りにおいては、これら処理物を本発明の反応に使用できる。
本発明によれば、上記ポリペプチドまたは形質転換体を下記式(I):
ラセミ体トロパ酸(49.85g、300mmol)をメタノール(250ml)と濃硫酸(0.5g)中で80℃、20時間攪拌した後、減圧下にて溶媒を留去することにより、トロパ酸メチルの油状物(9.3g、45.9mmol)を得た。
(1)KNK AM38株由来のアミダーゼの単離・精製
土壌分離菌KNK AM38株を、試験管内で滅菌した60mlの培地A(グリセロール20g、肉エキス10g、イーストエキス5g、ポリペプトン10g、塩化ナトリウム3g、脱イオン水にて1Lにメスアップ、滅菌前pH7.0)に植菌して30℃で12時間、好気的に振とう培養した。この培養液15mlをフラスコ内で滅菌した3Lの培地Aに植菌して30℃で24時間、好気的に振とう培養した。培養終了後、遠心分離で菌体を集菌して、100mM リン酸緩衝液(pH7.0)に菌体を懸濁後、超音波により菌体を破砕し、これを遠心分離した。上清に0.5%終濃度となるよう硫酸プロタミンを添加し、生じた沈殿を遠心分離で除去した。この上清液に10%終濃度となるようグリセリンを添加し、これをDEAE−TOYOPEARL650M(東ソー社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、10%濃度のグリセリンを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄後、同緩衝液で0Mから0.3Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出し、活性のあるフラクションを集めた。この活性画分に終濃度0.5Mとなるように硫酸アンモニウムを溶解した後、Butyl−TOYOPEARL(東ソー社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、10%濃度のグリセリンを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)で0.5Mから0Mの硫酸アンモニウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分を、10%濃度のグリセリンを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)で透析後、Resource Q(アマシャムファルマシアバイオテック社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、10%濃度グリセリンを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)で洗浄後、同緩衝液で0Mから0.3Mの塩化ナトリウムの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分をSuperdex 200 HR 10/30(アマシャムファルマシアバイオテック社製)にアプライしてゲルろ過を行い、10%濃度のグリセリン及び0.15Mの塩化ナトリウムを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.0)で溶出した。得られた活性画分をBIO−Gel HT hydroxyapatite(バイオ・ラッドラボラトリー社製)にアプライしてカラムクロマトグラフィーを行い、10%濃度のグリセリンを含むリン酸緩衝液(pH7.0)で10mMから25mMの濃度勾配をかけて溶出した。得られた活性画分をSDS−ポリアクリルアミド電気泳動によって分析したところ、アミダーゼは単一バンドとして検出され、精製酵素の純粋性が確認できた。
まず、(1)と同様の方法でKNK 38株を培養して得た菌体を、CTAB、クロロホルム、フェノールを用いて溶解、処理後、抽出されたDNAをイソプロパノールで析出し、遠心分離で得られた沈殿をエタノールで洗浄することにより染色体DNAを調製した。次いで、(1)で精製したアミダーゼのアミノ末端のアミノ酸配列を、気相プロテイン・シークエンサーを用いて決定した。さらに、(1)で精製したアミダーゼにV8プロテアーゼを4Mの尿素の存在下作用させて生成したポリペプチド断片を、逆相HPLCを用いて精製した後、上記と同様の方法でアミダーゼの内部アミノ酸配列を決定した。N末端アミノ酸配列にもとづいて設計したDNAプライマー(Primer−1:配列番号9と、内部アミノ酸配列に基づいて設計したDNAプライマー(Primer−2:配列番号10)を用いて、先に得た染色体DNAを鋳型にPCRを行った。この結果、目的のアミダーゼ遺伝子の一部(部分遺伝子と称す)を取得した。
(1)の配列番号2に示す塩基配列及び配列番号2と相同性の高い既知塩基配列を基に設計したDNAプライマー(Primer−7:配列番号15、Primer−8:配列番号16)を用いて、(1)に記載した方法にて得たKNK AM40株、KNK AM1011株、KNK AM250株それぞれの染色体DNAを鋳型にPCRを行った。この結果、目的のアミダーゼ遺伝子の一部を取得した。(2)に記載した方法と同様の目的遺伝子の全長を取得する操作を行うことで、配列番号4、6、8に示す塩基配列からなるDNAを得た。
実施例1で得られたKNK AM38株、KNK AM1011株、KNK AM250株由来のDNA断片をプラスミドpUCN18(PCR法によりpUC18(タカラバイオ社製、GenBank Accession No.L09136)の185番目のTをAに改変してNdeIサイトを破壊し、更に471−472番目のGCをTGに改変することにより新たにNdeIサイトを導入したプラスミド)のlacプロモーターの下流のEcoRI認識部位とSacI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNAM38、pNAM1011、pNAM250を構築した。また、実施例1で得られたKNK AM40株由来のDNA断片をプラスミドpUCN18のlacプロモーターの下流のEcoRI認識部位とSphI認識部位の間に挿入し、組換えベクターpNAM40を構築した。これらの組換えベクターpNAM38、pNAM40、pNAM1011、pNAM250を用いて、E.coli HB101コンピテントセル(タカラバイオ社製)を形質転換し、E.coli HB101(pNAM38)、E.coli HB101(pNAM40)、E.coli HB101(pNAM1011)、E.coli HB101(pNAM250)を得た。得られた形質転換体を、200μg/mlのアンピシリンを含む2×YT培地(トリプトン1.6%、イーストエキス1.0%、NaCl0.5%、pH7.0)5mlに接種し、37℃で24時間振盪培養した。遠心分離により菌体を集め、5mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.0)に懸濁した。
実施例2で調製した菌体懸濁液1mlと、参考例1に記載した方法で合成した基質トロパ酸アミド20mgを混合し、30℃にて24時間振とうした。反応終了後、遠心分離にて固形物を除去し、反応液中の基質及び生成物を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、下記式により変換率(%)を求めた。さらに、反応液を1N塩酸でpH2に調整し、酢酸エチル抽出で取得したトロパ酸を高速液体クロマトグラフィーにて分析することにより、下記式により光学純度(%ee)を求めた。
・変換率(%)=生成物量/(基質量+生成物量)×100
・光学純度(%ee)=(A−B)/(A+B)×100 (A及びBは対応する鏡像異性体量を表し、A>Bである)
[変換率の分析]
カラム:5C18−ARII(4.6mmφ×250mm、ナカライテスク社製)、溶離液:20mMリン酸水溶液(pH2.5)/アセトニトリル=6/4、流速:0.5ml/分、カラム温度:30℃、測定波長:210nm
[光学純度の分析]
カラム:CHIRALCEL OD−H(4.6mmφ×250mm、ダイセル化学社製)、溶離液:ヘキサン/イソプロピルアルコール/トリフルオロ酢酸=95/5/0.1、流速:0.7ml/分、カラム温度:35℃、測定波長:254nm
得られた結果を表1に示す。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書に組み入れるものとする。
Claims (8)
- 以下の(a)〜(c)のいずれかのポリペプチド。
(a)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列からなるポリペプチド
(b)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列において、1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換及び/又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド
(c)配列番号1、3、5、又は7に示すアミノ酸配列と80%以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチド - 請求項1に記載のポリペプチドをコードするDNA。
- 以下の(d)〜(g)のいずれかのDNA。
(d)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列からなるDNA
(e)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列と80%以上の配列同一性を有する塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(f)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列と相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA
(g)配列番号2、4、6、又は8に示す塩基配列において、1若しくは複数個の塩基が欠失、挿入、置換及び/又は付加された塩基配列からなり、かつラセミ体トロパ酸アミドを(R)体選択的に加水分解する活性を有するポリペプチドをコードするDNA - 請求項2又は3に記載のDNAを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターにより宿主細胞を形質転換して得られる形質転換体。
- 前記宿主細胞が大腸菌である請求項5記載の形質転換体。
- 請求項5又は6に記載の形質転換体を培地に培養し、得られる培養物から発現させたポリペプチドを採取することを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチドの製造方法。
- 請求項1に記載のポリペプチド、または、請求項5若しくは6に記載の形質転換体を下記式(I):
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Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11513255A (ja) * | 1995-10-06 | 1999-11-16 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 立体特異的ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素をコードする核酸断片、ならびにキラルアミドおよび酸の生産に有用なそれら酵素を発現する組換え微生物 |
JP2007029017A (ja) * | 2005-07-28 | 2007-02-08 | Kikkoman Corp | ルシフェラーゼを用いる光学活性なカルボン酸の製造方法 |
WO2008120554A1 (ja) * | 2007-03-22 | 2008-10-09 | Kaneka Corporation | 新規アミダーゼ、その遺伝子、ベクター、形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法 |
WO2010125829A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 三井化学株式会社 | 3-メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE19727517A1 (de) | 1997-06-30 | 1999-01-07 | Basf Ag | Racematspaltung von Aminosäureestern durch Enzym-katalysierte Acylierung |
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH11513255A (ja) * | 1995-10-06 | 1999-11-16 | イー・アイ・デユポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニー | 立体特異的ニトリルヒドラターゼおよびアミダーゼ酵素をコードする核酸断片、ならびにキラルアミドおよび酸の生産に有用なそれら酵素を発現する組換え微生物 |
JP2007029017A (ja) * | 2005-07-28 | 2007-02-08 | Kikkoman Corp | ルシフェラーゼを用いる光学活性なカルボン酸の製造方法 |
WO2008120554A1 (ja) * | 2007-03-22 | 2008-10-09 | Kaneka Corporation | 新規アミダーゼ、その遺伝子、ベクター、形質転換体、及びそれらを利用した光学活性カルボン酸アミド及び光学活性カルボン酸の製造方法 |
WO2010125829A1 (ja) * | 2009-04-30 | 2010-11-04 | 三井化学株式会社 | 3-メルカプトプロピオン酸またはその塩を製造する方法 |
Non-Patent Citations (10)
Title |
---|
JPN6012053801; KLOMP D et al.: 'Enzymatic kinetic resolution of tropic acid' Tetrahedron:Asymmetry Vol.16, Isuue 23, 2005, pp.3892-3896 * |
JPN6012053801; Tetrahedron:Asymmetry Vol.16, Isuue 23, 2005, pp.3892-3896 * |
JPN6012053803; Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic Vol.57, Issue 1-4, 2009, pp.158-163 * |
JPN6012053803; WANG PY et al.: 'Enzymatic hydrolytic resolution of (R,S)-tropic acid esters and (R,S)-ethyl alpha-methoxyphenyl acetate' Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic Vol.57, Issue 1-4, 2009, pp.158-163 * |
JPN6012053804; J. Bacteriol. Vol.173, No.8, 1991, pp.2465-2472 * |
JPN6012053804; NISHIYAMA M et al.: 'Cloning and characterization of genes responsible for metabolism of nitrile compounds from Pseudomon' J. Bacteriol. Vol.173, No.8, 1991, pp.2465-2472 * |
JPN6012053806; J. Bacteriol. Vol.179, No.4, 1997, pp.1044-1050 * |
JPN6012053806; LONG MT et al.: 'Enzymology of oxidation of tropic acid to phenylacetic acid in metabolism of atropine by Pseudomonas' J. Bacteriol. Vol.179, No.4, 1997, pp.1044-1050 * |
JPN6012053807; Journal of Liquid Chromatography Vol.7, No.4, 1984, pp.731-741 * |
JPN6012053807; WAINER IW et al.: 'The application of HPLC chiral stationary phases to pharmaceutical analysis: the resolution of some' Journal of Liquid Chromatography Vol.7, No.4, 1984, pp.731-741 * |
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