KR20040011882A - 아시네토박토 종 ｓｙ－０１의 리파제 코딩 유전자 및이로부터 발현되는 리파제 - Google Patents

아시네토박토 종 ｓｙ－０１의 리파제 코딩 유전자 및이로부터 발현되는 리파제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제 및 리프를 코딩하는 유전자 서열 및 이로부터 발현되는 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 활성이 우수하기 때문에 상기 리파제 코딩 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 생체 촉매로서 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸 합성에 이용할 수 있다.

Description

아시네토박토 종 ＳＹ－０１의 리파제 코딩 유전자 및 이로부터 발현되는 리파제{Gene Coding for Lipase of Acinetobacter Species SY-01 and Protein Expressed Therefrom}
본 발명은 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제 및 리프를 코딩하는 유전자 서열 및 이로부터 발현되는 단백질에 관한 것이다.
상기 아시네토박토 종 SY-01의 리파제는 항진균제의 원료로 사용되는 이트라코나졸의 중간체로서 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸 아세테이트를 입체 선택적으로 가수분해한다.
선택적 유기합성법의 한 분야로 생체 촉매를 이용하는 연구가 활발히 진행되고 있는데 이러한 연구는 주로 선진국에서 진행되고 있고 국내 연구는 미미한 상태이다.
리파제는 췌장에서 처음 발견된 후, 아밀라제 및 프로타제와 함께 3대 소화효소로 널리 사용되어 왔으며, 의학, 생리학 및 효소 생화학 등의 분야에서 폭넓게 연구되어 왔다. 리파제(EC 3.1.1.3, 트리아실글리세롤 아실히드롤라제)의 생체내 주기능은 여러 가지 지방질의 가수분해이지만, 반응기에서의 효소반응 조건에 따라 그 역반응인 에스터 합성반응과 트랜스에스터화 반응 등을 촉매하는 특성을 갖고 있다.
이를 이용한 라세미체 카르복실산과 알콜의 입체선택적 분할 방법은 가수분해, 에스테르화, 트랜스에스테르화 반응으로 나눌 수 있다. 가수분해 반응은 완충용액에서 진행되므로 용해 상태의 효소를 사용할 수 있고, 효소반응의 자연환경에 이어서 반응속도가 빠른 반면, 에스테르 기질을 사용하므로 기질의 용해도가 떨어지는 경우도 생긴다. 에스테르화 반응은 일반적으로 유기용매에서 효소반응이 일어나므로 기질의 용해도를 높일 수 있으나, 반응속도가 느리고 유기용매내 수분함량에 따라 반응속도 및 수율에 민감한 반응 특성을 보여 조업상 어려운 단점이 있다. 트랜스에스테르화 반응은 생성물의 분리가 어려운 점이 있으나 에스테르화 반응의 단점들을 많이 보완할 수 있어서 최근에 활발한 연구가 진척되었으며, 주로 키랄 알콜의 분할에 이용될 것이라 기대된다.
그동안 리파제를 이용하여 비스테로이드계 소염 진통제, 기타 다른 약품등 많은 의약품들이 성공적으로 합성되었으며, 현재까지 많은 종류의 리파제가 동물, 식물, 곰팡이 및 세균으로부터 발견되었는데, 그 중에서도 미생물(곰팡이 및 세균)이 생산하는 리파제가 다양한 기질특이성, 내열성, 내알칼리성, 유기용매성 및 입체특이성 등의 특성을 갖고 있는 것으로 밝혀져 산업적으로 널리 이용되고 있다 [Ruben G. et al. Mol. Microbiol. 15(5): 803-818, (1995) 참조].
이트라코나졸은 잘 알려진 항진균제(antifungal agent)로서 시스 형태의 이성질체를 상업적으로 이용할 수 있으나, 라세미체 혼합물 형태로 판매되고 있다. 그러나 이러한 라세미체 형태의 이트라코나졸은 간에 독성이 있고, 부정맥, 메스꺼움, 구토, 과민증, 두드러기, 복통, 두통, 현기증 등의 부작용을 유발할 수 있으므로 현재 화학적 합성법을 사용하여 광학적으로 순수한 이성질체를 제조하려는 연구가 시도되고 있는 실정이지만 생체 촉매를 이용하는 방법은 전무한 실정이다(미국특허 제5,952,502호 및 미국 특허 제5,474,997호).
따라서, 본 발명의 목적은 본 발명은 화학적 합성법이 아니라 생체 촉매인 미생물을 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸을 합성하기 위해 미생물로부터 생산되는 리파제의 유전자 서열을 밝히고, 이를 숙주 세포에서 대량 발현시켜 리파제를하는 것이다.
도 1은 본 발명에서 사용한 전체적인 구성도.
도 2는 다양한 제한효소를 이용해 제작한 유전자 지도.
도 3a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 유전자 및 아미노산 서열.
도 3b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 (Lif) 단백질의 유전자 및 아미노산 서열.
도 4a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 리파제 아미노산 서열의 상동성 비교도.
도 4b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스 리파제 B 아미노산 서열의 상동성 비교도.
도 5는 아시네토박토 종 SY-01로부터 얻은 리파제가 삽입된 재조합 플라스미드를 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis)168로 발현한 단백질의 전기영동 사진.
도 6a는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 바실러스 섭틸리스 168의 활성도 측정 사진.
도 6b는 아시네토 종 SY-01로부터 얻은 리파제가 삽입된 재조합 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 활성도 측정 사진.
도 7은 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 여러 기질에 대한 활성도를 보여주는 그래프.
도 8a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트의 전환율 및 에난티오머 과량(enantiomeric excess) 측정치를 보여주는 그래프.
도 8b는 바실러스 섭틸리스 168 세포 추출물에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트 전환율 및 에난티오머 과량 측정치를 보여주는 그래프.
도 8c는 아시네토박토 종 SY-01의 리프가 동시에 발현되었을 때 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트의 전환율 및 에난티오머 과량 측정치를 보여주는 그래프.
도 9는 아시네토박토 종 SY-01의 입체선택적 기질특이성을 갖는 리파제를 코딩하는 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pSYLipSM(1)의 모식도.
도 10은 본 발명의 리프(Lif) 단백질 코딩 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pSYLipSM(1)의 모식도.
본 발명자들은 상기 목적을 달성하고자 심도있게 연구한 결과, 아시네토박토 종 SY-01이 생산하는 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제 및 리프를 아시네토박토 종 SY-01으로부터 분리 및 정제하여 그 유전자 서열을 분석함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
즉, 본 발명은 아시네토박토 종 SY-01로부터 유래된 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현되는 아미노산 서열을 갖는 단백질에 관한 것이다.
보다 구체적으로는, 본 발명은 서열 2의 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리파제에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 서열 4의 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리프 단백질을 코딩하는 유전자 및 이로부터 발현된 아미노산 서열을 갖는 아시네토박토 종 SY-01 리프 단백질에 관한 것이다.
리파제 발현의 직접적인 조절작용을 수행하는 리프 (Lif) 단백질에 대한 연구는 슈도모나스 세파시아 (Pseudomonas cepacia), 슈도모나스 에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 글루매 (Pseudomonas glumae), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus) 리파제를 중심으로 이루어져 왔다. 이들 종들의 리파제 단백질의 발현이 리프 단백질에 의해 조절되며, 그 유전자 (lif)가 리파제 유전자의 3'쪽에 위치하고 있으면서, 리파제의 발현에 직접적인 조절작용을 수행한다.
아일랜드 트리니티 대학의 홉슨 (Hobson)은 lif가 없는 경우에도 슈도모나스 세파시아 리파제 mRNA의 번역이 정상적으로 진행되지만, 활성이 없는 리파제가 합성되는 것을 밝혔다. [참조 : Hobson, A. H. et al. Proc. Natil. Acad. Sci. U. S. A. 90: 5682-5686, (1993)]. 또한 홉슨은 Lif 단백질이 리파제에 특이적으로 샤페론(chaperone)으로 작용하고 리파제와 Lif의 단백질이 복합체를 형성한다는 것을 리파제와 Lif의 항체를 이용한 면역학적 실험을 통해서 밝혔다.
지금까지 연구되어 온 Lif 단백질은 i) 리파제 단백질이 번역 과정이나 번역 직후에 작용하며, ii) 비공유결합적으로 작용하며, iii) 리파제의 구조적 폴딩에 관여하며, iv) 리파제 단백질의 화학적 변성 후 활성화시킬 수 있는 능력을 갖고 있다. 이상에서 언급한 사실들을 근거로 해서 네덜란드의 Slater 연구소의 헬링베르프 (Hellingwerf)는 아시네토박터 칼코아세쿠스 리파제의 2단계 분비과정의 모델을 제시한 바 있다.
본 발명자들은 아시네토박토 종 SY-01이 생산하는 기질에 대한 입체선택적 특이성을 갖는 리파제를 얻기 위해 우선 그 유전자를 찾고 클로닝하여 그 염기서열을 결정한 후 염기서열을 바탕으로 단백질을 발현시켜 기질 특이성 및 입체특이성을 갖는 효소인 리파제를 얻고자 하였다.
이를 위해 도 1에 도시된 바와 같은 유전자 클로닝 계통도를 설계하였다. 도 1을 참고로 하여 본 발명을 상세히 설명한다.
먼저, 아시네토박토 종 SY-01는 한국과학기술연구원 수질환경연구센터로부터 입수한 것이며, 상기 균주는 전국 각지의 토양, 폐수, 하천 슬러지 샘플로부터 상기 기질에 활성이 높고 입체선택성이 우수한 리파제 효소를 생산하는 균주를 분리하여 한국종균협회에 기탁한 것이다 (기탁번호: FCC-11111).
상기 균주는 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란 -4-메틸 아세테이트로 명명된 라세미체 기질에 대한 높은 입체선택성을 나타내면서 라세미체 혼합물을 단일 이성질체로 분할할 수 있는 리파제 생산 균주이다.
본 발명자들은 상기 아시네토박토 종 SY-01로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 본 균주가 속하는 종의 특성상 서로간의 아미노산 서열 상동성이 매우 높은 것을 이용하여 이들간의 아미노산 서열 상동성을 분석한 후, 리파제만이 갖는 특유의 활성화 아미노산 서열 부분(활성 부위)과 아미노산의 C-말단의 상동성이 높은 부위의 아미노산 서열을 이용하여 프라이머를 제작하였으며, 프라이머의 염기서열은 다음과 같다.
SY-01 N' : 5'-TAYCCNATHATHCTNGTNCAY-3'
SY-01 C' : 5'-NARNGCNGCNARNGCRTCYTG-3'
이를 사용하여 게놈 DNA를 주형으로 하여 PCR(polymerase chain reaction)을 수행하였고 이로부터 6개의 PCR 산물을 얻었으며, 이들 전부를 pGEM T easy 벡터에클로닝한 후, 사슬 종결 방법으로 유전자 서열을 결정한 후 유사성을 찾기 위해 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 프로그램을 사용하였다. 그 중 하나의 클론이 리파제와 아주 높은 유사성(유전자 서열 동일성 : 88%)을 보여, 이 클론을 사용해 중합효소 연쇄반응을 실시하여 리파제 전체 유전자를 얻기 위한 플라스미드 라이브러리(plasmid library)의 유전자 탐색 프로브(probe)로 사용하였다.
플라스미드 라이브러리를 제작하기에 앞서 다양한 제한효소를 사용하여 게놈 DNA를 절단하여 전반적인 유전자 지도를 제작하였으며 (도 2 참조), 이 유전자 지도를 바탕으로 플라스미드 라이브러리를 제작하여 콜로니 혼성화(colony hybridization)와 서던 블로팅(Southern blotting)을 이용하여 전체 리파제 유전자 및 리프 유전자를 찾아내었다.
아시네토박토 종 SY-01 리파제 단백질을 얻기 위해, 상기 리파제 유전자를 함유하는 클론을 2개의 합성 올리고뉴클레오티드를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응시킨 후 아가로스 겔 상에서 분리하여 유전자 절편을 수득하고, 이 절편을 제한효소 BamHI과 SalI으로 처리한 후, 동일한 제한효소로 처리된 pLIPSM(1)에 결합시켜 플라스미드 pSYLipSM(1)를 제조하였다..
상기 사용된 합성 올리고뉴클레오티드는 상기 사용한 제한효소의 절단 부위를 포함하며, 단백질 번역 개시 부위에 정확히 결합될 수 있도록 설계하고, 그 서열은 다음과 같다.
LP-N: 5'-AACTGTAACGTAAGCAGTTG-3'
LP-C: 5'-CTTTAGTTGGACCACCAACA-3'
상기 플라스미드 pSYLipSM(1)을 발현 숙주인 바실러스 섭틸리스 168에 형질전환시킨 후, 배지에 접종하여 진탕배양한 후 세포를 원심 분리한 다음 상등액을 분리하였다. 얻어진 상등액을 크로마토그래피 등으로 분리하여 전기영동시켜 단백질 밴드를 확인할 수 있다.
pSYLipSM(1)를 포함하는 바실러스 섭틸리스 168 균주(Bacillus subtilis 168/pSYLipSM(1))는 2002년 6월 5일자로 한국 생명공학 연구원 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁되었으며, 기탁 기관에 의해 부여된 수탁 번호는 KCTC 10267BP이다.
본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로 페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸아세테이트 전환율 및 에난티오머 과량 측정을 통해 입체선택적 기질특이성을 갖고 높은 활성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.
또한, 본 발명에서 규명한 Lif 유전자의 서열은 아시네토박터 칼코세티쿠스 RAG-1의 Lif 유전자 서열과 매우 높은 뉴클레오티드 서열 상동성(80% 이상)을 가지고 있음을 밝혔으며, 이들이 지금까지 연구되어온 Lif 단백질의 역할과 매우 유사한 기능을 가졌음을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 다음의 실시예에 의해 더 구체적으로 설명하나, 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
<실시예 1> 리파제 유전자의 클로닝
게놈 DNA를 적당한 크기로 자르는 제한효소인EcoRI과HindIII로 게놈 DNA를 완전히 절단한 후, 같은 제한효소로 절단한 pBluescruipt II KS(+)에 삽입한 후, 상기 플라스미드로 에피쿠리안 콜라이(Epicurian Coli) XL2-블루 초수용성(supercompetent) 세포를 형질전환시켜 적어도 콜로니수가 20,000 내지 30,000개가 되도록 라이브러리를 제조하였다. 스크리닝 혼성화 과정은 이들 라이브러리의 콜로니들을 양성 전하를 갖도록 제조된 나일록 멤브레인에 옮긴 후 변성(denaturalization) 용액(0.5 M NaOH, 1.5M NaCl)에서 5분간 변성시키고, 중화 용액(0.5 M Tris-Cl(pH 7.4), 1.5 M NaCl)에서 5분간 중화시킨 후 멤브레인을 완전히 건조시켜 UV 가교결합시켰다. 이들 나일론 멤브레인을 방사능으로 표지된 프로브와 함께 65℃에서 Modifed Church 완충액 (0.25 M Na2HPO4, 1% 카사미노산, 7% SDS, 1 mM EDTA)에서 12시간 동안 혼성화시켰다. 프로브는 랜덤 프라이밍 (random priming) 방법을 통해32P-dCTP로 표지하였다. 혼성화를 마친 멤브레인은 세척 용액 I (2xSSC, 0.1% SDS)과 세척 용액 II (1xSSC, 0.1% SDS)로 세척하여 배경(background) 신호를 제거한 후 X-선 필름에 24시간 노출시켰다.
먼저 1차 스크리닝에서는 5개의 양성 신호를 얻은 후, 이 양성 신호를 나타내는 콜로니를 사용하여 2차 스크리닝을 실시한 결과, 20여 개의 강한 양성 신호를 보이는 클론을 얻었다. 양성 신호를 나타내는 클론 20개 중 6개를 선택하여 플라스미드를 분리하였다. 분리한 플라스미드를EcoRI과HindIII로 절단하여 나일론 멤브레인으로 옮긴 후 콜로니 라이브러리에서 사용한 프로브를 사용하여 서던 블로팅을실시한 결과 찾고자 하는 유전자가 있는 것을 다시 확인할 수 있었다. 이 중 1개의 클론을 디데옥시뉴클레오티드 사슬종결법을 이용하여 유전자의 염기서열을 결정하였다 (도 3 참조). 염기서열의 분석결과, 리파제 유전자의 3'쪽의 말단 서열에 바로 뒤이어 리프 유전자도 함께 존재함이 밝혀졌다. 도 3a는 리파제 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타내고, 여기서 이중선은 시그날 서열 영역을 의미하고, 점선은 활성 부위를 의미한다. 도 3b는 리프 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
이들 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열들을 기존에 밝혀진 아시네토박터 칼코아세티쿠스의 리파제 및 리프의 아미노산과 서열 상동성을 비교한 결과, 매우 가까운 상동성을 가지고 있음을 보였다(도 4 참조). 도 4a는 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스(Acinetobacter calcoaceticus) 리파제 아미노산 서열의 상동성 비교도이고, 도 4b는 아시네토박토 종 SY-01의 리프 아미노산과 아시네토박터 칼코아세티쿠스 RAG-1의 리프 아미노산 서열의 상동성 비교도이다.
<실시예 2> 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 단백질의 과잉발현
아시네토박토 종 SY-01의 리파제로부터 단백질을 과잉발현하기 위하여 대전 바이오리더스(주)에서 입수한 pLIPSM(1) 벡터에 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 전체 유전자를 삽입한 후, 이를 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법을 이용하여 유전자의 염기서열을 확인하였다. 상기 재조합 플라스미드로 바실러스 섭틸리스 168을 형질전환시킨 후, 상기 리파제 유전자가 배지내로 분비됨을 확인하였다(도 5 참조). 도 5에서, M은 표준 분자량 마커, 레인 1은 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 음성 대조군의 펠렛, 레인 2는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 음성 대조군의 상등액, 레인 3은 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배지, 레인 4는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배양 펠렛, 레인 5는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 배양 상등액을 나타낸다.
이들이 리파제 활성을 갖는지를 확인하기 위하여 로다민 (Rhodamin) B 안료 및 리파제 기질인 올리브유가 들어있는 로다민 B 플레이트에서 재조합된 플라스미드가 삽입된 바실러스 섭틸리스 168을 배양한 후, UV에서 형광을 이용하여 이들의 활성을 확인하였다(도 6참조). 도 6a는 pLIPSM(1) 벡터만 삽입된 바실러스 섭틸리스 168에 대해 시험한 결과를 나타내고, 도 6b는 리파제 유전자를 포함하는 pLIPSM(1) 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168의 활성 측정 결과이다.
<실시예 3> 아시네토박토 종 SY-01의 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 활성도 측정
아시네토박토 종 SY-01의 리파제 유전자로부터 발현된 리파제의 활성도는 다음과 같은 방법으로 측정하였다.
리파제의 활성도를 측정하기 위한 기질로는p-NP(니트로페닐)-아세테이트,p-NP-부티레이트,p-NP-카프로에이트,p-NP-카프릴레이트,p-NP-카프레이트,p-NP-라우레이트,p-NP-미리스테이트,p-NP-팔미테이트,p-NP-스테아레이트 등을 n-헥산에 녹여서 사용하였다. 96웰 마이크로플레이트에서, 200 ㎕의 반응용액 (10 mMCaCl2함유 20 mM Tris-HCl (pH 10),3 mM 기질)에 정제된 리파제 단백질 10 ㎍을 첨가한 후, 반응 혼합액을 50 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 진행된 후, 반응액과 동량의 아세톤을 첨가하여 반응을 정지시키고, 405 nm에서 방출된p-니트로페놀의 흡광도를 측정하였다. 이때 대조군으로서 단백질이 첨가되지 않은 반응물에 대해서도 동일한 시험을 수행하였다 (도 7 참조).
도 7에서 활성도 수치는 가장 좋은 활성도를 100으로 설정하고, 이에 대한 상대적인 백분율로 환산하여 나타낸 것이다. 도 7에 도시된 바와 같이, 본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 대조군에 비해 상이한 기질에 대하여 약 50% 이상의 우수한 활성을 보임을 알 수 있다.
<실시예 4> 아시네토박토 종 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질의 이성질체 반응 측정
바실러스 섭틸리스 168로부터 SY-01의 리파제가 과잉 발현된 배양 세포의 상등액 1 ml (약 5 ㎎ 리파제/1 ℓ 세포 상등액)을 20 mM Tris-HCl 완충액 (pH 8) 9 ml에 혼합한 후, n-헥산 중에 10 g/ℓ의 농도로 용해되어 있는 라세미체 혼합물인 시스-2-브로모메틸-2-(2,4-디클로로페닐)-13-디옥솔란-4-메틸 아세테이트 (cis-BDDM) 용액 200 ㎕를 첨가하였다. 반응은 50 ℃에서 250 rpm으로 2시간 이상 반응시키면서 시간별로 활성도를 측정하였으며, 반응이 끝난 후 n-헥산 200 ㎕를 첨가하여 SY-01 리파제 단백질에 의해 분해된 시스-BDDM의 전환율과 에난티오머 과량(ee)을 HPLC를 이용하여 측정하였다 (도 8 참조). HPLC 분석은 키랄 컬럼(Diacel Chiralcel OD, 용출액: 부피비 95:5의 n-헥산/이소프로판올; 유속 1.0 ml/min) 에 의해 이루어졌으며, 도 8에 표시된 기질의 전환율(반응물에서 생성물로의 전환율) 및 ee값 (생성된 생성물 중에서 원하는 생성물 형태로 전환된 반응비율)의 측정식은 다음과 같다.
A →C (1)
B →D (2)
여기서, A와 B는 라세미체 반응전 기질을 의미하며, C 와 D는 라세미체 반응물을 의미한다. 이때 전환율(c)은 ([C]+[D])/([A]+[B]+[C]+[D])이다. 또한 기질의 에난티오머 과량은 ([B]-[A])/([A]+[B])이며, B는 A에 비해 반응비율이 더 낮다. 생성물의 에난티오머 과량 (eep)는 ([C]-[D])/([C]+[D])이다.
도 8a는 Tris-HCl 완충액 (pH 8)에서 본 발명의 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168 배양 상등액과 기질을 9시간 동안 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이고, 도 8b는 Tris-HCl 완충액 (pH 8)에서 본 발명의 SY-01 리파제 코딩 유전자로 형질전환되지 않은 바실러스 섭틸리스 168 세포 배양액을 기질과 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이고, 도 8c는 상기한 바와 유사하게, 본 발명의 SY-01 리파제 코딩 유전자와 리프 유전자를 포함하는 도 10에 도시한 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168 배양 상등액과 기질을 9시간 동안 반응시킨 후 HPLC를 이용하여 측정한 아시네토박토 종 SY-01의 리프가 동시에 발현될 때 SY-01 리파제 코딩 유전자로부터 발현된 단백질에 의한 에난티오머 선택도를 보여주는 그래프이다.
상기 반응에 의해 측정한, SY-01 리파제 단독에 의한 기질의 전환율 및 ee값과 리프(Lif) 동시 발현시의 SY-01 리파제에 의한 기질의 전환율 및 ee값은 각각 하기 표 1 및 2에 나타낸 바와 같다.
반응시간 %ee 전환율(%)
바실러스 섭틸리스168 배양 상등액(음성 대조군) SY-01 리파제함유 배양 상등액 바실러스 섭틸리스168 배양 상등액(음성 대조군) SY-01 리파제함유 배양 상등액
5h 3.32 16.2 - 4.9
7h 3.91 19.49 - 33.12
9h 6.34 28.36 - 50.12
반응시간 %ee 전환율(%)
SY-01 리파제만발현된 배양 상등액 SY-01 리파제/Lif 동시 발현된배양 상등액 SY-01 리파제만 발현된 배양상등액 SY-01 리파제/Lif동시 발현된배양 상등액
7h 20.22 15 44.68 67
상기 표에서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 리파제 코딩 유전자를 포함하는 플라스미드로 형질전환된 바실러스 섭틸리스 168은 대조군에 비해 우수한 전환율과 ee값을 갖는 것으로 입증되었고, 이것은 본 발명의 리파제가 이트라코나졸의 중간체로서 라세미체 혼합물인 시스-2-(브로모메틸)-2-(2,4-디클로로페닐)-1,3-디옥솔란-4-메틸 아세테이트를 입체 선택적으로 가수분해한다는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 리프 단백질이 본 발명의 리파제와 동시에 발현될 경우 리파제만 발현된 경우보다 우수한 전환율을 보인다는 것이 입증되었다.
본 발명의 아시네토박토 종 SY-01 리파제는 활성이 우수하기 때문에 상기 리파제 코딩 유전자를 포함하는 형질전환된 미생물을 생체 촉매로서 이용하여 광학적으로 순수한 이트라코나졸 합성에 이용할 수 있다.

Claims (10)

  1. 서열 2에 기재된 아시네토박토종 SY-01 리파제 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
  2. 서열 2에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아시네토박토종 SY-01 리파제.
  3. 제1항 기재의 아시네토박토종 SY-01 리파제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 재조합 벡터가 플라스미드 pSYLipSM(1)인 벡터.
  5. 제3항 기재의 재조합 벡터로 형질전환된 바실러스 섭틸리스.
  6. 제5항에 있어서, 수탁 번호 KCTC 10267BP의 바실러스 섭틸리스 168/pSYLipSM(1)인 바실러스 섭틸리스.
  7. 제5항 기재의 바실러스 섭틸리스를 배양하는 단계 및
    배양된 세포에서 발현된 아시네토박토 종 SY-01 리파제를 회수하여 정제하는 단계
    를 포함하는, 아시네토박토 종 SY-01 리파제의 제조 방법.
  8. 서열 5 또는 서열 6의 염기 서열을 포함하는 합성 프로브.
  9. 서열 4에 기재된 아시네토박토종 SY-01 리프 단백질 아미노산 서열을 코딩하는 유전자.
  10. 서열 4에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 아시네토박토종 SY-01 리프 단백질.
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