KR19990028533A

KR19990028533A - 페니실륨 크리소제눔 유래의 페닐아세틸-ＣｏＡ 리가제

Info

Publication number: KR19990028533A
Application number: KR1019970709851A
Authority: KR
Inventors: 린덴 글레드힐; 필립 앤드류 그리브즈; 존 패트릭 그리핀
Original assignee: 데이비드 로버츠; 스미스클라인비이참피이엘시이
Priority date: 1995-06-30
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1999-04-15
Also published as: EP0835316A1; KR100455054B1; US6245524B1; SI0835316T1; DK0835316T3; ATE239081T1; WO1997002349A1; EP0835316B1; JP3819429B2; AU6417396A; CN1145699C; PL186765B1; PT835316E; HK1010213A1; ES2198493T3; CN1194002A; DE69627856T2; PL324225A1; MX9800212A; JPH11508450A

Abstract

본 발명은 페닐아세테이트-조효소 A 활성을 갖는 페니실륨 크리소제눔으로부터의 효소의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 상기 효소를 코딩하는 DNA를 제공하며 변경시킨 주의 생산에서의 그의 용도를 제공한다.

Description

페니실륨 크리소제눔 유래의 페닐아세틸-ＣｏＡ 리가제

본 발명은 페니실린 생합성에 관계하는 중간 물질로부터 페니실린을 합성하는 데 유용한 효소에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 효소 및 이 효소를 코딩하는 DNA의 제조 방법에 관한 것이다.

페니실린 G의 생화학적 경로가 문헌 [Queener (1990) Antimicrobial Agents and Chemotherapy34(6), 943-948; Martin (1992) J. Industrial Microbiol9, 73-90; Luengo (1995) J. Antibiotics48(11), 1195-1212]에 기술되어 있다. 상기 경로는 발효 공정에서의 수율 (역가)을 증가시키기 위하여 중요한 연구 주제가 되어 왔다.

페닐아세테이트 (PAA) 및 페녹시아세테이트 (POA)는 페니실륨 크리소제눔 (Penicillium chrysogenum)에서 리가제 효소 (예를 들어 PAA-CoA 리가제)에 의해 상응하는 CoA 티오에스테르로 활성화된다. 이어서 이들 티오에스테르는 PAA의 경우 페니실린 G의 생합성에 그리고 POA의 경우 페니실린 V의 생합성에 사용된다. 따라서 PAA-CoA 리가제는 상기 상업적으로 중요한 치료적 항생제의 생합성에 필수적인 것으로 생각된다.

PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 슈도모나스 푸티다 (Pseudomonas putida)의 효소가 황산 암모늄 침전 및 DEAE-세파셀 (Sephacel) 컬럼으로부터의 염화 칼륨 용출을 포함하는 정제 과정에서 단리되었다 [J. Biol. Chem.267(12), 7084-7090 (1990) 참조]. 효소는 분자량이 48 kDa ＋/－ 1 kD이고, 최적 pH가 8.2이며 PAA 이화 작용에 연관되어 있다.

페니실륨 크리소제눔의 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소를 히드록시메이트법 (페닐아세틸-히드록사메이트 또는 페녹시아세틸-히드록사메이트를 540 nm에서 검출하는 비색 분석법)으로 분석하려는 시도가 문헌 [Kogekar & Deshpande (1983) Ind. J. Biochem. Biophys20, 208-212 및 Brunner & Rohr (1975) Methods Enzymol43, 476-481]에 보고되었지만, 다른 연구자들의 견해는 단백질이 정제되지 않았거나 활성의 특성이 상세하게 밝혀지지 않았다는 것이다 [Martinez-Blanco 등 (1992) J. Biol. Chem.267(8), 5474-5481]. 또한 후기 저자들은 보고된 과정으로 효소를 찾지 못하였다.

국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호 (Gist Brocades, 1996년 4월 4일에 공표됨)에 페니실린 경로에서 작용하는 PAA CoA 리가제를 단리시키려는 상기와 같은 그리고 다른 시도가 개설되어 있다. 국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호에 PanLabs (미국)이 보유하고 있는 페니실륨 크리소제눔 B10의 균주로부터 아실-CoA 효소 합성 효소가 수득되는 것으로 기술되어 있다. 이 효소에 존재한다고 생각되는 특정 특성으로는 분자량이 약 50 kDa (겔 투과법으로 측정)이고, 최적 pH가 8 내지 8.5 (pH 7 이하에서는 저활성)이며, 최적 온도가 40℃이고, pI가 7.25 초과이다. 중요하게는 이 효소는 황산 암모늄 침전법으로 정제시킬 수 있다. 이 효소는 꽤 광범위한 특이성을 갖지만 (즉 이 효소는 Mg2＋, ATP, CoASH와, 각각 페녹시아세트산, 페닐아세트산, 아디프산 또는 헥산산으로부터의 페녹시아세틸-조효소 A, 페닐아세틸-조효소 A, 아디필-조효소 A 및 헥사노일 조효소 A의 형성을 촉매할 수 있음), 아세트산에 대해 현저한 활성은 전혀 나타내지 않는다. 또한 이 효소는 환원제에 의해 안정화된다고 한다. 황산 암모늄 또는 글리세롤이 고농도일 때 이 효소를 또한 안정화시킨다. 발표된 방법으로 수득된 효소 활성에 대해 순도에 대한 표시가 부여되어 있지 않으며 이 효소에 대한 서열 또는 N-말단 서열이 부여되어 있지 않고 상응하는 DNA의 특성이 나타나 있지 않으며 DNA의 서열이 부여되어 있지 않다.

상기와 같은 모든 노력에도 불구하고 페니실륨 종의 생체내에서 작용하는 진정한 PAA-CoA 리가제 효소에 관하여 공지된 것이 거의 없다. 책임있는 상기 효소가 일차 대사에 관계될 수 있으리라 예상되었다 [Smith 등 (1990) Biotechnology8, 39-41]. 상기 Martinez-Blanco 등의 문헌 (1992)에서는 한 가지 가능한 후보 효소인 아세틸 CoA 합성효소를 선발하였으며, 아세틸 CoA 합성효소 활성에 기초하여 페니실륨 크리소제눔으로부터 상기 효소를 정제하였다. 그들은 아세틸 CoA 합성효소가 아세테이트의 CoA 유도체를 형성할 뿐만 아니라, 여러 지방산 (C2-C8) 및 몇몇 방향족 분자 (PAA 포함)를 시험관내에서 활성화시킬 수 있음을 예시할 수 있었다.

아세틸 CoA 합성효소 유전자는 서열이 결정되었으며 [국제 특허 출원 공개 제WO92/07079, Gouka 등 (1993) Appl. Microbiol. Biotechnol.38, 514-519, Martinez-Blanco 등 (1993) Gene130, 265-270 참조] 진균류로부터의 다른 아세틸 CoA 합성효소와 상동관계에 있음이 나타났다. 그러나 플루오로아세트산에 의해 선발된 상기 유전자에서의 돌연변이체는 페니실린 생산 수준을 변경시키지 않는 것으로 나타났는데 (국제 특허 출원 공개 제WO 92/07079호) 이는 생체내에서 PAA의 활성화에 실제로 다른 효소가 책임있다는 것을 제시한다.

본 발명에서 PAA-CoA 리가제 활성의 직접적 분석은 특정 정제 프로토콜과 함께 개발되었으며 이것은 진정한 PAA-CoA 리가제일 것이라 생각되는 것의 정제 및 그 이후의 클로닝을 가능하게 하였다. 본 발명에 의해 단리된 효소는 상기에 기술된 아세틸 CoA 합성효소에 대하여 상이한 N-말단 아미노산 서열을 가지며 많은 상이한 특성 (예를 들어 분자량)을 갖는데 이는 지금까지 상기 역할을 하는 모든 효소들과는 상이한 효소가 단리되었음을 나타낸다. 상기 Kogekar & Deshpande의 문헌 (1983)에 의해 단리된 효소가 CoASH가 없는 조건에서 분석된 반면 본 발명에서 단리된 효소의 특징적인 특성은 기질로서의 CoASH에 절대적으로 의존적이라는 것이다. 단리된 단백질 사이의 상기 상이점 및 다른 상이점 (예를 들어 하기 실시예에 나타낸 최적 pH 및 다른 특성)에서 본 발명의 효소가 종래 기술에 기술되어 있는 임의의 효소와 상이함을 나타낸다. 본 발명이 페니실륨 종으로부터의 효소 PAA CoA 리가제의 순수 형태를 처음으로 단리시켰음을 나타내는 것이라 생각된다. 특히 SKI C-말단 펩티드의 존재는 페니실린 생합성에서 상기 효소가 실제 역할을 한다는 것과 일치한다. 본 발명의 효소는 상기에 기술된 국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호의 효소와 분자량이 다르고 본 발명의 효소가 국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호의 효소와는 달리 황산 암모늄 침전 및 염화물 염에 민감하다는 면에서 서로 다르다.

따라서, 본 발명은 페니실륨 크리소제눔을 배양하고, 균사체를 수확하고 초음파처리하며, 세포 파편을 제거하고 음이온 교환 크로마토그래피, 이어서 소수 작용 크로마토그래피, 기질로 용출시키는 친화 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피로 초음파 처리물을 분획화시키고 크로마토그래피 활성 분획을 PAA 및 조효소 A 의존적 분석을 사용하여 검출함으로써 페니실륨 크리소제눔으로부터 수득가능한 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소를 제공한다.

본 발명의 효소는 바람직하게는 정제 형태, 유리하게는 실질적으로 정제 형태이다. 본 발명의 효소의 외견상 분자량은 63 kDa이다 (SDS PAGE로). 바람직하게는 본 발명의 효소는 VFLPPKESGQLDP의 N-말단 아미노산 서열을 포함한다.

특히, 본 발명의 효소는 도 1의 서열 번호 1의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 PAA 및 조효소 A 의존적 분석을 사용하여 활성 분획을 검출하는 것인, 페니실륨 종을 배양하고, 이어서 추출 및 정제시키는 것에 의한 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소의 제조 방법을 제공한다. 특히 페니실륨 종은 페니실륨 크리소제눔이며 균사체를 초음파 처리, 이어서 음이온 교환, 소수 작용, 친화 및 겔 여과 크로마토그래피로 분획화하여 순도에서 대략 1000배 증가한 것을 제공한다.

본 발명의 효소는 시험관내 생형질변환에 사용될 수 있다. 예를 들어 CoA 에스테르 합성 또는 페니실린 합성을 위하여 아실-CoA:6-APA 아실트랜스퍼라제와 혼합시켜 사용될 수 있다. 시험관내 생형질변환은 전체 세포, 세포 유리 추출물, 투과성화 세포 또는 미생물로부터 단리시킨 효소, 또는 이의 고정된 형태 중 어느 하나를 사용하여 실시할 수 있다.

전체 세포를 사용하여 생형질변환을 실시할 때, 미생물은 성장 배양균, 휴면 배양균, 세척된 균사체, 고정화된 세포 또는 원형질체의 형태일 수 있다.

세포 유리 추출물을 사용할 때 이것은 전단 및(또는) 화학적 파쇄 또는 효소적 파쇄 또는 다른 파열 방법, 바람직하게는 초음파로 처리하고, 임의로 그 후 세포 파편을 제거하고, 용액에 효소 활성을 남겨둠으로써 적당히 제조된다.

야생형 NRRL1951을 포함하는 시판되는 페니실륨 크리소제눔 균주를 사용하여 하기 실시예에 따라 본 발명의 효소를 적절히 제조한다. 다른 적당한 페니실륨 크리소제눔 균주로는 고페니실린 생산주, 예를 들어 BW1901 균주가 있다 [EMBO J.9(3), 741-747 (1990) D.J. Smith 등].

종래의 방식, 특히 적당한 액체 또는 반고체 배지에서 호기성 조건 하에서 미생물을 배양시킴으로써 본 발명의 효소를 제조할 수 있다. 배양 조건의 온도는 5 내지 50℃ 범위, 바람직하게는 25 내지 30℃일 수 있으며 pH는 3 내지 9 범위, 바람직하게는 6 내지 8, 가장 바람직하게는 7.2일 수 있다.

본 발명의 효소는 정제된 형태, 부분적으로 정제된 형태, 불순한 상태로 수득되는 것, 파열된 세포 제조물로부터의 여과액, 조세포균질물 등으로 단리시킬 수 있고 사용될 수 있다. 가장 적당하게는 효소를 예를 들어 적어도 정제하여 출발 물질 또는 본 발명 효소의 파괴를 또한 촉매할 수 있는 다른 효소를 제거한다.

가장 적당하게는 본 발명의 효소를 예를 들어 Powell의 문헌 [Microbial Enzymes and Biotechnology ed. Fogarty & Kelly p369-394 (1990)]에 기술되어 있는 방법과 같이 불용성 지지 물질에 고정시킨다. 이는 수율 및 처리량을 증가시키는 잇점을 제공한다.

전체 세포를 사용하여 생형질변환을 실시할 때, 적당한 배양용 배지는 pH가 6.5인 탈이온수 또는 pH가 조정된 수 시스템 1 리터 중에 KH₂PO₄2 g, K₂HPO₄1.5 g, KCl 0.2 g, MgCl₂·6H₂O 0.2 g, Na₂SO₄·10H₂O 0.22 g, 포도당 1.0 g의 배지를 포함한다.

세포 유리 추출물을 사용하여 생형질변환을 실시할 때 배양용 배지는 적당한 완충제를 함유한다. 효소 반응 혼합물은 기질 및 1종 이상의 다른 조인자, 예를 들어 금속 이온 또는 안정화제, 예를 들어 티올을 함유할 수 있다.

생형질변환은 반응 혼합물의 pH를 적당하게는 4 내지 10의 범위, 더 적당하게는 6 내지 10, 바람직하게는 약 9.0에서 적당하게 유지시킨, 수성 배지에서 적당하게 실시할 수 있다. pH는 완충제를 사용하여 또는 바람직하게는 산 또는 염기 적정제를 첨가하여 적당하게 조절한다. 반응물의 온도는 일반적으로 5 내지 50℃, 바람직하게는 22 내지 45℃, 가장 바람직하게는 30 내지 37℃ 범위여야 한다. 별법으로 유기 용매에서 또는 유기 용매의 존재 하에서 (예를 들어 아세톤, 메틸 이소부틸 케톤 (MIBK)) 반응을 수행할 수 있다.

반응 시간은 반응물과 조인자의 농도, 온도 및 pH와 같은 인자에 의존적이다. 반응이 완료된 후, 종래의 방법으로 생성물을 단리시킬 수 있다. 편리하게는 초기 정제에 크로마토그래프 단계를 포함시킨다.

또한, 본 발명은 본 발명의 PAA-CoA 리가제를 코딩하는 DNA를 또한 제공한다. 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 도 2에 예시되어 있는 DNA 프래그먼트 내에 위치한다. 특히 상기 DNA는 도 3/서열 번호 2의 DNA 서열을 실질적으로 포함한다.

아가로스 겔 전기 영동으로 수행되는 크기 결정 실험으로 측정된 바와 같이 상기 DNA의 대략적인 킬로베이스 (kb) 길이를 도 2에 나타낸다. DNA 상에 존재하는 모든 제한 효소 위치를 도에서 예시하려는 의도는 없다는 것을 이해해야 한다.

본 발명의 DNA는 자연적으로 발생하는 것과 같은 자연 상태가 아니고 단리된 형태 또는 실질적으로 순수 형태라는 것이 이해될 것이다. 상기 DNA가 뉴클레오티드 삭제, 치환, 첨가 또는 전위를 포함하는 표준 기술에 의해 상기에 기술된 본 발명의 임의의 실시 형태에 따른 DNA로부터 유래되었다면 본 발명은 예시된 정확한 배열의 제한 효소 위치를 갖지 않을 수 있는 DNA를 포함한다는 것이 이해될 것이다.

바람직하게는 본 발명의 DNA는 페니실륨 크리소제눔으로부터 유래한다. 그러나 본 발명은 예시된 배열의 제한 효소 위치를 갖지 않지만 바람직하게는 고도의 엄격한 조건 하에서 도 2에 예시된 DNA 또는 그의 서브프래그먼트와 혼성화하고 PAA-CoA 리가제 또는 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소를 코딩하는, 다른 적당한 유기체, 특히 페니실륨 크리소제눔 외의 생산 유기체로부터 유래되는 DNA 서열을 또한 포함한다 (고도의 엄격한 조건은 예를 들어 실시예 18에 나타내는 것과 같음).

또한 본 발명은 적당한 숙주 유기체에서 PAA-CoA 리가제를 발현시키는 DNA와 같은 것을 포함하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터를 제공한다. 그와 같은 발현 벡터의 특정 예로는 pBK-CMV (스트라타진 (Stratagene)사로부터 구매)가 있으며 상기 발현 벡터는 본 발명에서 대장균에서의 발현용으로 사용된다. 본 발명에서 PAA-CoA 리가제의 cDNA 인서트 (=pPEN09, 도 2)는 대장균에서의 발현용 벡터로 바람직하다.

본 발명의 DNA 및 이것을 포함하는 벡터는 많은 분야의 산업 활동에서 사용될 수 있다. 또한 상기 벡터 및 이들이 발현하는 효소로 형질변환시킨 숙주 미생물에 적용된다. 예를 들어 혼성화 프로브로 상기 DNA를 사용하여 페니실륨 크리소제눔 (NRRL 1951) 및 유사한 구조 및 특이성의 효소를 생산하는 다른 미생물의 전체 세포 DNA 상에 존재하는 관련된 또는 일부분이 일치하는 유전자를 동정 및 단리시킬 수 있다.

상기 DNA를 포함하는 재조합 벡터로 적당한 숙주를 형질변환시키면 페니실린 합성량이 증가된 유전적으로 변형된 미생물의 생산에 가치있을 수 있다.

적당한 유기체에서 PAA-CoA 리가제의 활성량을 증가시키는 것이 매우 이로울 것이다. 재조합 벡터는 유전자 이전 방법에 의한 신규 또는 혼성 항생제의 생산에 또한 사용될 수 있다 [예를 들어 D.A. Hopwood 등, Nature, 1985, 314, 642-644 참조]. 본 발명의 DNA에 의해 코딩되는 효소는 특히 적당한 고체 지지체 상에 고정시킨 경우 예를 들어 세포 유리 시스템에서 사용되어 자연 전구체로부터의 공지된 항생제 또는 예를 들어 화학적 합성에 의해 수득되는 '비자연' 전구체로부터의 신규 항생제를 제조할 수 있다.

본 발명의 DNA 또는 그의 프래그먼트 (완전한 유전자를 가질 필요는 없음)는 재조합 DNA 기술 또는 자연적 재조합 방법 중의 하나로 생합성에 관련된 유전자의 프래그먼트와 조합시켜 혼성 효소를 합성하게 할 수 있는 혼성 유전자를 생성시킬 수 있다. 상기와 같은 효소는 하기에 기술되는 것과 같은 유사한 방법으로 신규 항생제의 생산에 사용될 수 있다.

본 발명의 DNA는 또한 예를 들어 문헌 [G. Winter 등, Nature, 1982, 299, 756-758, 또는 Zoller 및 Smith, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6487-6500]에 기술되어 있는 방법과 유사한 방식으로 공지되어 있는 위치-지시 돌연변이화 (site-directed mutagenesis) 기술로 변경시켜 특정 돌연변이 및(또는) 삭제가 달성된 DNA를 수득할 수 있다. 돌연변이시킨 DNA는 적당한 숙주 미생물로부터 증가된 수율 (또는 역가)의 페니실린을 수득하는 데 사용될 수 있다.

또한 돌연변이시킨 DNA는 유전자 이전법으로 신규 또는 혼성 항생제를 수득하는 데 사용될 수 있거나, 또는 상기에 기술된 방법과 유사하게 신규 항생제를 생산하는 데 사용될 수 있는 돌연변이 효소 (뮤테인 (mutein))를 생산하는 데 사용될 수 있다. 돌연변이시킨 DNA는 또한 적당한 유기체의 다른 발효 특성, 예를 들어 변경된 기질인 PAA에 대한 내성을 변경시키는 데 사용될 수 있다.

하기 실시예로 본 발명을 예시한다.

실시예 1-페니실륨 크리소제눔 발효

페니실륨 크리소제눔 (스미쓰클라인 비참 (SmithKline Beecham) 사의 BW1901 균주)의 포자를 100 ml의 진탕 플라스크에 존재하는 15 ml의 PVS 배지 (35 g/l 옥수수 침지액 (corn steep liquor), 15 g/l의 포도당, 5 g/l의 CaCO₃, 8 ml/l의 평지씨 오일, NaOH로 pH를 5.9로 조정)에 접종하였다. 궤도 진탕 (230 rpm)시키면서 배양물을 26℃에서 48시간 동안 성장시킨 후 전체 브로쓰 중의 1ml을 취하여 100 ml의 진탕 플라스크에 존재하는 10 ml의 C5 배지 (35 g/l 옥수수 침지액, 85 g/l의 유당, 10 g/l의 CaCO₃, 10 g/l의 NaH₂PO₄, 8 g/l의 (NH₄)₂SO₄, 4 g/l의 MgSO₄·7H₂O, 4 g/l의 Na₂SO₄, 6 ml/l의 평지씨 오일, 6 g/l의 페녹시아세트산, NaOH로 pH를 6.0으로 조정)로 이전시켰다. 이어서 궤도 진탕시키면서 (230 rpm) 상기 배양물을 26℃에서 55시간 동안 성장시킨 후 균사체를 수득하였다.

실시예 2- PAA-CoA 리가제를 분석, 정제 및 웨스턴 블롯팅 (Western blotting) 하기 위한 페니실륨 크리소제눔으로부터의 단백질 추출물 제조.

실시예 1에 기술된 바와 같이 55시간 동안 배양한 C5 진탕 플라스크로부터의 균사체를 미세섬유 유리 필터 (와트만 (Whatman) GF/A)를 통하여 여과시킴으로써 수집하였다. 균사체 매트를 0.9% (중량/부피) 염화 나트륨 (4℃) 300 ml로 세척시켰으며 이어서 필터로부터 긁어모았으며 10 ml의 리가제 분석용 완충제 (pH가 9.0인 30 mM 트리스-HCl, 1 mM 디티오트레이톨, 50% 글리세롤에 존재하는 100 μg/ml의 페파블로크 (Pefabloc, 등록상표))에 넣었다. 이어서 균사체를 얼음 상에서 초음파 처리하였으며 (울트라소닉스 (Ultrasonics) 모델 W-385 초음파 처리기를 사용하여, 파워를 5로 세팅하고, 사이클 속도를 5초로 하며, 50% 효율 사이클로 15초 동안의 파열을 3회 실시), 이어서 균사체 파편을 원심분리 (18000xg, 4℃, 30분)하여 펠렛화시켰다. 상청액을 -70℃에서 냉동 보관하거나 또는 PAA-CoA 리가제 분석, 정제 또는 웨스턴 블롯팅을 위하여 즉시 사용하였다 (실시예 7).

실시예 3-PAA-CoA 리가제의 시험관내 분석

추출물 또는 컬럼 분획물에 PAA-CoA 리가제 활성이 존재하는지 증명하기 위하여, 플라스틱 에펜도르프 튜브에서 20 μl를 pH가 7.5인 50 mM 트리스-HCl에 존재하는 0.1 M 페닐아세트산 (20 μl), 0.1 M 나트륨 ATP (10 μl), 0.2 M 염화 마그네슘 (10 μl), 0.02 M 나트륨 조효소 A (10 μl) 및 0.015 M 디티오트레이톨 (10 μl)와 혼합시켰다. 튜브를 5초 동안 와동 (渦動) 혼합시켰으며 이어서 30℃에서 15분 동안 수조에 방치하였다. 이어서 메탄올 (100 μl)을 혼합물에 첨가하였으며 튜브를 원심분리시켜 (14 K, 1분) 단백질을 침전시켰다. HPLC를 사용하여 PAA-CoA의 존재에 대해 상청 분획물을 분석하였다 (실시예 4). 각각의 분석 세트에서 페니실륨 크리소제눔 진탕 플라스크 발효 (실시예 1)로부터 제조된 단백질 추출물을 PAA-CoA 표준물과 함께 양성 대조로 분석하였다.

실시예 4-분석용 상청액의 HPLC 분석

PAA-CoA 리가제 분석 (실시예 3)으로부터의 상청 시료에 워터스 (Waters) LCM1 HPLC 시스템을 사용하여 PAA-CoA가 존재하는지를 분석하였다. 0 내지 4분까지 동등하게 pH가 5.4인 0.2 M 인산 나트륨 (완충제 A)의 이동상을 사용하여 유속 2.5 ml/분으로 실온에서 라디알 팩 (Radial Pak) C18 압축 컬럼상에 시료 (100 μl)를 주입시켰다. 이어서 40% 아세토니트릴에서 pH가 5.4인 0.16 M 인산 나트륨을 포함하는 100% 완충제 B까지 선형 농도구배를 실시하였다 (4 내지 10분). 완충제 B를 2분 동안 더 100%에서 유지시켰으며 이어서 100% A까지의 선형 농도구배를 다시 사용하여 다음에 주입시키기 위한 준비로 시스템을 재평형화시켰다 (12 내지 13분). 260 nm에서 피크를 검출하였으며 PAA-CoA의 체류 시간은 12분이었다. 양성 시료는 PAA-CoA 표준물과 공용출되는 피크를 가지며 포토다이오드 배열 분광계로 측정하였을 때 표준물과 동일한 UV 흡수 스펙트럼을 나타내는 것이었다.

실시예 5-PAA-CoA 리가제의 정제

효소 활성이 매우 불안정하다는 것이 밝혀졌기 때문에 주의가 요구되었다. 황산 암모늄으로 효소를 침전시키려는 시도는 성공적이지 못하였는데 이는 수득된 물질에서 활성을 찾을 수 없었기 때문이었다. 이것 자체에서 본 효소와 국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호 (Gist-Brocades)에 기술되어 있는 효소와는 구별된다. 다른 언급이 없는 한 하기 과정은 4℃에서 30 mM 트리스-HCl, 4 mM DTT, 4 mM EDTA, 5 mM MgCl₂및 20% 글리세롤 (부피/부피)을 포함하는 pH 9.0의 완충제 C를 사용하여 수행하였다. 파마시아 하이-로드 (Hi-Load, 등록상표) 시스템을 사용하여 분리를 성취하였다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이 제조된 세포 유리 추출물 (500 ml)을 4℃에서 서서히 녹였다. 이어서 얼음 상에서 교반시키면서 5 M NaOH를 사용하여 추출물의 pH를 9.0으로 조절하였다. 3 L의 물, 이어서 1 L의 완충제 C로 이전에 세척시킨 큐-세파로스 파스트 플로우 (Q-Sepharose Fast Flow, 파마시아사) 이온 교환 매질 275 g을 상기 교반시키고 있는 추출물에 첨가하였다. 이 혼합물을 얼음 상에서 1.5 시간 동안 교반시켰다. 이어서 감압을 사용하여 유리 소결물 상에서 세척시킨 큐-세파로스 수지 50 g을 더 통과시킴으로써 슬러리를 여과시켰다. 이어서 완충제 C 100 ml로 수지를 더 세척시켰으며 이어서 건조시켜 PAA-CoA 리가제를 포함하는 투명한 추출물 600 ml을 수득하였다. 이어서 황산 암모늄 (92.4 g, 즉 부분침전 수준)을 첨가하였으며 용액을 얼음 상에서 1시간 동안 교반시켰고 이어서 여과시켰다 (0.45 μm 필터, 밀리포어 (Milipore) 사, HA 형).

이어서 1 L의 완충제 D (140 g/l의 황산 암모늄을 함유하는 완충제 C)로 이전에 상태조절한, 저치환 컬럼 (파마시아사, 12 cm x 2.6 cm 직경) 페닐-세파로스 6 파스트 플로우 상에 PAA-CoA 리가제 추출물 (700 ml)을 1 ml/분으로 로딩하였다. 이어서 로딩된 컬럼을 완충제 D 230 ml로 0.8 ml/분으로 세척시켰으며 이어서 238 ml의 100% 완충제 D 내지 100% 완충제 C의 선형 농도구배로 0.8 ml/분으로 용출시켰다. 5.5 ml의 분획을 수집하였으며 실시예 3에 나타낸 바와 같이 PAA-CoA 리가제 활성을 시험하였다. 활성 분획 41 내지 49를 합하여 50 ml 수득하였으며 50 ml의 완충제 C로 이전에 세척시킨 5 ml 하이트랩 (HiTrap, 등록상표) 블루 (Blue) 친화 컬럼 (파마시아사) 상에 이것을 0.5 ml/분으로 로딩하였다. 로딩된 컬럼을 15 ml의 완충제 C로 세척시켰으며 이어서 25 ml의 100% 완충제 C 내지 100% 완충제 E의 선형 농도구배를 사용하여 0.5 ml/분으로 용리시켰다. 완충제 E는 완충제 C에 페닐아세트산을 첨가하여 최종 농도가 0.5 M이 되게 하고 고체 NaOH를 사용하여 pH 9.0으로 재조정한 것이었다. 자연 기질을 사용하여 친화 컬럼으로부터 용출시켜 정제 선택성을 증가시켰으며 결과물인 분획에서 효소 활성이 측정될 수 있게 하였다. NaCl 염이 효소 활성을 억제하기 때문에 NaCl 용출은 성공적이지 못한 것으로 판명되었다. 반대로 국제 특허 출원 공개 제WO 96/10085호에 기술되어 있는 효소는 KCl로 용출시킬 때 안정한 것처럼 보인다.

활성 분획 21, 22 및 23을 합하여 6 ml을 수득하였으며, 이어서 완충제 F (완충제 C를 5 M HCl로 pH 7.5로 조정한 것)로 이전에 평형시킨 세파크릴 S-200 하이 퍼포먼스 크기별 제외 컬럼 (High Performance size exclusion column, 파마시아사, 64 cm x 2.6 cm 직경) 상에 이것을 0.25 ml/분으로 분리시켰다. 활성 분획 54 내지 65를 합하여 11 ml을 수득하였으며 원심분리성 한외여과 (분자량 10,000 컷-오프의 센트리콘 (Centricon), 아미콘 인크.사 (Amicon Inc.))로 60 μl까지 농축시켰다. 크기별 제외 컬럼으로부터의 분획물을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기 영동으로 분석했을 때 (실시예 6), PAA-CoA 리가제 활성과 서로 관련된 강도의 63 kDa의 단백질이 나타났다. 웨스턴 블롯팅 (실시예 6)을 사용하여 정제를 완료하고 PAA-CoA 리가제의 N-말단 아미노산 서열 결정을 가능하게 하였다.

실시예 6-PAA-CoA 리가제 단백질의 웨스턴 블롯팅.

N-말단 아미노산 서열 결정을 위한 물질을 제공하기 위하여 정제 단백질 (60 μl, 실시예 5)을 pH가 6.8인 0.5 M 트리스-HCl (10 ml), 소듐 도데실 설페이트 (2 g, 초고순도), 2-메르캅토에탄올 (1 ml), 글리세롤 (10 ml), 탈이온 증류수 (7 ml) 및 0.1% 브로모클로로페놀 블루 (2 ml)를 함유하는 동일 부피의 SDS-PAGE 시료용 완충제와 혼합시켰다. 이 혼합물을 10분 동안 끓였으며 실온으로 냉각되게 하였다. 제조 업자의 프로토콜을 사용하여 제조한 바이오-라드 미니 프로테안 II (Bio-Rad Mini Protean II) 전기 영동 셀 내로 주조된 10% 폴리아크릴아미드 겔 (4% 적층 겔) 상에 분취물 (5, 15 및 20 μl)을 로딩하였다. 0.025 M 트리스, 0.192 M 글리신 및 0.1% (중량/부피) 소듐 도데실 설페이트 (초고순도)를 함유하는 전극용 완충제에서 200 V에서 45분 동안 전기 영동을 실시하였으며 그 후 폴리아크릴아미드 겔을 전기적 블롯팅용 완충제 (10% 메탄올에 존재하는 10 mM 3-[시클로헥실아미노]-1-프로판술폰산, pH 11)에서 5분 동안 방치하였다. 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems) 사의 프로토콜에 따라 바이오-라드 미니 트란스-블롯 (Mini Trans-Blot) 전기 영동적 이전용 셀을 사용하여 어플라이드 바이오시스템스 프로블롯 (ProBlott, 등록상표) 고정화 막 위로 폴리아크릴아미드 겔 내의 단백질을 이전시켰다. 블롯팅이 완료되면 어플라이드 바이오시스템스사의 프로토콜에 있는 염색 방법을 사용하여 쿠마지 블루 (Coomassie Blur) R-250으로 막을 염색시켰다. 63 kDa에서의 단백질 밴드를 막으로부터 오려내어 이 물질을 N-말단 아미노산 서열 결정용으로 사용하였다 (실시예 7).

실시예 7-N-말단 아미노산 서열 결정

어플라이드 바이오시스템스 (ABI) 477A 펄스트 리퀴드 시퀀서 (Pulsed Liquid Sequencer)를 사용하여 블롯팅된 단백질 (실시예 6)로부터 N-말단 아미노산 서열을 획득하였다. ABI 120Å 협공 (狹孔) 크로마토그래피를 사용하여 방출되는 PTH-표지 아미노산을 동정하는 표준 에드만 화학 (Edman Chemistry)을 사용하여 서열을 획득하였다. 정제된 PAA-CoA 리가제 단백질을 분석해 본 결과 서열이

이었다.

실시예 8-PAA-CoA 리가제 N-말단 펩티드의 합성

63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질로부터 결정된 N-말단 아미노산 서열 (실시예 7)을 사용하여 펩티드를 합성하였다. 이것은 펩티드 앤드 프로틴 리서치 컨설턴츠 (Peptide and Protein Research Consultants, 영국 데본 EX4 4QG 엑세터 페리 로드 소재의 University of Exeter, Washington Singer Laboratories)를 사용하여 유리 펩티드 50 mg으로 합성시켰다. SMCC (숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트)를 사용하여 12 mg을 말레이미드 활성화 BSA (소 림프액 알부민, Bovine Serum Albumin)에 결합시켰으며 MBS (m-말레이미도벤조일-N-히드록시숙신이미드 에스테르)를 사용하여 2.5 mg을 말레이미드 활성화 OVA (난 알부민)에 결합시켰다.

실시예 9-63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질의 N-말단으로부터 유래된 펩티드에 대한 폴리클로날 항체의 제조

BSA에 결합시킨 펩티드 (실시예 8)를 사용하여 63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질에 특이적인 토끼 폴리클로날 항체를 제조하였다. 펩티드-BSA 콘쥬게이트 (375 μg/ml)를 여과시켜 멸균하였으며 (0.2 μm 필터) 1 ml의 멸균 용액을 2 ml의 비궤양성의 완전한 프레운츠 (Freunds) 보조제 (영국 길드포드 소재의 브라이언 모리스 인터내셔날 (Brian Morris International))와 완전히 혼합시켰다. 뉴질랜드 백색 토끼 (대략 10주령)의 서로 다른 네 군데 주사 위치에 전체 0.8 ml의 상기 혼합물 (100 μg의 펩티드-BSA 콘쥬게이트)을 피하 투여하였다. 비궤양성의 불완전한 프레운츠 보조제를 사용하는 것을 제외하고 상기에 기술된 바와 같이 초기 면역화 후 28일 및 58일에 면역화물을 더 투여하였다. 초기 면역화 후 42일 및 72일에 변두리 귀 정맥으로부터 시험용 혈액 시료를 채취하여 효소 결합 면역흡착 분석 (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) (실시예 10)을 사용하여 항체 역가 및 특이성을 평가하였다.

실시예 10-63 kDa PAA-CoA 리가제에 대한 항체 역가 및 특이성을 결정하기 위한 효소 결합 면역흡착 분석 (ELISA).

항체 역가 측정

pH가 7.2인 인산염 완충 염수 (8 g/l의 염화 나트륨, 0.2 g/l의 염화 칼륨, 1.44 g/l의 오르토인산 이수소 나트륨, 0.24 g/l의 오르토인산 이수소 칼륨, pH 7.2)에 존재하는 PAA-CoA 리가제 펩티드-OVA 콘쥬게이트 (200 μl/웰, 0-10 μg/ml)로 평평한 바닥의 96 웰 마이크로타이터 플레이트 (넝크 맥시소르프 (Nunc MaxiSorp), 등록상표)를 코팅하였다. 코팅시킨 마이크로타이터 플레이트를 4℃에서 약 18시간 동안 두었으며 그 후 플레이트를 디나테크 (Dynatech) MRW 플레이트 세척기를 사용하여 세척용 완충제 (10 mM 트리스, 0.15 M 염화 나트륨, 0.02% 소듐 아지드, 0.05% 트윈 (Tween) 20, pH 7.2)로 4회 세척시켰다. 다른 언급이 없는 한 상기 세척 방법을 모든 나머지 시행에서 사용하였다. 블로킹용 완충제 (1.56 g/l의 오르토인산 이수소 나트륨, 8.8 g/l의 염화 나트륨, 0.2 g/l의 피콜 400, 0.2 g/l의 폴리비닐-피롤리돈, 시그마 (Sigma)의 0.5% 소 감마 글로불린, pH 7.4, 200 μl/웰)를 플레이트에 첨가하였으며 디나테크의 바리쉐이커 인큐베이터 (Varishaker Incubator)에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 그 이후의 모든 인큐베이션은 상기 방법을 사용하여 37℃에서 수행하였다. 플레이트를 4회 세척시켰으며 이어서 분석용 완충제 (50 mM 트리스, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM 염화 마그네슘, 0.5% BSA, 0.25% 소 감마 글로불린, 0.02% 소듐 아지드, pH 7.4)에 희석시킨 토끼 폴리클로날 항체 (100 μl/웰, 0-1:500000 희석)를 플레이트에 첨가하였으며 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척시킨 후 아머샴 (Amersham)으로부터의 항-토끼 IgG 바이오티닐화 항체 (100 μl/웰, 분석용 완충제에 1:5000 희석)를 플레이트에 첨가하였으며 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척시켰으며 아머샴의 스트렙타비딘 알칼린 포스파타제 콘쥬게이트 (100 μl/웰, 분석용 완충제에 1:2000 희석)를 플레이트에 첨가하여 37℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척시킨 후 0.1 M 글리신 완충제 (7.51 g/l 글리신, 203 mg/l의 염화 마그네슘, 136 mg/l의 염화 아연, pH 10.4)에 용해되어 있는 p-니트로페닐 포스페이트 (시그마, 1 mg/ml)를 플레이트에 첨가하였으며 (100 μl/웰) 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서 수산화 나트륨 (2 M, 50 μl/웰)을 플레이트에 첨가하였고 안토스 랩테크 플레이트 판독기 (Anthos Labtec plate reader)를 사용하여 각 웰의 흡광도를 405 nm에서 측정하였다. 1:500000와 1:1000000 사이의 항체 역가가 수득되었다.

항체 특이성 측정

토끼 폴리클로날 항체가 콘쥬게이션되지 않은 PAA-CoA 리가제 펩티드와 반응하는지를 증명하기 위하여 토끼 폴리클로날 항체를 사용하는 인큐베이션 단계를 변경시켜 상기에 기술한 바와 같이 ELISA를 수행하였다. 분석용 완충제에 항체를 1:100000-1:400000으로 희석시켰으며 2-메르캅토에탄올 (0.01 부피/부피%)을 함유하는 분석용 완충제에 제조시킨 콘쥬게이션시키지 않은 펩티드 (0-20 μg/ml) 50 μl를 포함하는 웰에 희석시킨 항체 50 μl를 첨가하였다. 대략 2 μg/ml의 콘쥬게이션시키지 않은 펩티드 농도에서 OVA-펩티드 콘쥬게이트와의 항체 반응성이 50% 억제되는 것으로 나타났다.

실시예 11-페니실륨 크리소제눔, 대장균 추출물에서의 PAA-CoA 리가제 및 정제 단백질 시료에 대한 웨스턴 블롯에서의 항체 특이성 측정.

쿠마지 블루로 막을 염색시키지 않는 것을 제외하고 실시예 6에 기술된 바와 같이 페니실륨 크리소제눔 진탕 플라스크 배양물 (BW1901 및 BW1900A-무작위 돌연변이 프로그램으로부터 유래된 균주), 대장균 JM109로부터 제조된 추출물 및 정제 PAA-CoA 리가제 단백질 시료를 웨스턴 블롯팅하였다. 블롯팅된 막을 블로킹용 완충제 (1.56 g/l의 오르토인산 이수소 나트륨, 8.8 g/l의 염화 나트륨, 0.2 g/l의 피콜 400, 0.2 g/l의 폴리비닐 피롤리돈, 0.5% 소 감마 글로불린, pH 7.4)에 방치하였으며 4℃에서 대략 18시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서 막을 세척용 완충제 (10 mM 트리스, 0.15 M 염화 나트륨, 0.05% 트윈 20, pH 7.2)로 4회 세척시킨 후 실시예 9에 나타낸 것과 같이 제조되고 이전에 분석용 완충제 (50 mM 트리스, 150 mM 염화 나트륨, 1 mM 염화 마그네슘, 0.5% BSA, 0.25% 소 감마 글로불린, pH 7.4)에서 1:100으로 희석시킨 토끼 폴리클로날 항체와 함께 인큐베이션시켰다 (실온, 60분). 세척용 완충제로 4회 더 세척시킨 후 막을 당나귀 항-토끼 IgG 양고추냉이 페록시다제 콘쥬게이트와 함께 인큐베이션시켰으며 (바이오-라드, 분석용 완충제에서 1:2000, 60분, 실온) 이어서 세척용 완충제로 4회 더 세척시켰다. 이어서 막을 페록시다제 기질 (바이오-라드 양고추냉이 페록시다제 콘쥬게이트 기질 키트)과 함께 실온에서 10분 동안 인큐베이션한 후 탈이온 증류수로 5회 바꿔주면서 블롯을 세척시킴으로써 반응을 중지시켰다. 양성 PAA-CoA 리가제 단백질 시료는 정제 PAA-CoA 리가제 밴드와 함께 이동한 대략 63 kDa에서의 밴드였다. 대장균 JM109 단백질 추출물에서는 63 kDa에서의 양성 밴드가 전혀 검출되지 않았다.

실시예 12-페니실륨 크리소제눔 cDNA 뱅크의 작제.

페니실륨 크리소제눔 (스미쓰클라인 비참사의 BW1901 균주)의 cDNA 뱅크를 스트라타진의 잽 익스프레스 (ZAP Express, 등록상표) cDNA 합성 키트의 지시 안내서에 따라 작제하였다. 하기와 같이 BW1901 균주로부터 RNA를 단리시켰다. 실시예 1에 나타낸 바와 같이 40시간 동안 BW1901 균주를 성장시킨 후, 두 개의 와트만 GF/A 9.0 cm 미세섬유 유리 필터를 통하여 여과시킴으로써 균사체를 수집하였다. 균사체를 DEPC (디에틸피로카르바네이트) 처리 증류수 100 ml로 세척시켰다. 이어서 DEPC 처리 모터 및 막자를 사용하여 액체 질소에서 균사체를 미분화시켰다. 10 ml의 용액 G (4 M 구아니디늄 티오시아네이트, pH가 7.5인 50 mM 트리스·HCl, 25 mM EDTA)를 포함하는 50 ml 원심 분리용 튜브로 냉동 균사체 분말을 이전시켰다. 용액 G에 분말을 재현탁시켜 얼음에 15분 동안 방치하였다. 균사체 파편을 17500xg에서 4℃에서 20분 동안 펠렛화하였다. 상청액을 다른 50 ml 원심분리용 튜브에 수집하였으며, Chomczynski 및 Sacchi의 문헌 [Analytical Biochemistry162, 156-159 (1987)]에 기술되어 있는 바와 같이 RNA를 추출하였다. 제조업자의 지시대로 씨피 래버러토리즈 미니-올리고 (CP Laboratories Mini-Oligo) (dT) 셀룰로스 스핀 컬럼 키트를 사용하여 전체 RNA로부터 폴리A^＋RNA를 단리시켰다. Sambrook 등의 문헌 [Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2판, 1989)]에서와 같이 겔 전기영동으로 폴리A^＋RNA를 분석하였다. 폴리A^＋RNA 분취물 (5 μg)을 취하여 스트라타진 잽 익스프레스 (등록상표) cDNA 합성 프로토콜에 따라 cDNA의 5' 말단에 EcoRI 제한 효소 위치 및 3' 말단에 XhoI 제한 효소 위치가 측면에 위치한 이중 가닥 cDNA를 합성시키는 데 사용하였다. 이어서 상기와 같이 합성시킨 cDNA를 제조업자의 지시에 따라 cDNA 합성 키트와 함께 공급된 스트라타진의 세파크릴 S-400 스핀 컬럼을 통과시킴으로써 크기별로 분획시켰다. 크기별로 분획시킨 cDNA를 스트라타진의 지시 안내서에서와 같이 λ잽 익스프레스의 XhoI과 EcoRI 암에 라이게이션시켰다. 이어서 라이게이션시킨 λDNA를 지시된 프로토콜대로 스트라타진의 기가팩 II 골드 패키징 키트 (Gigapack II Gold Packaging kit)를 사용하여 패키징시켰다. 이어서 그 결과물인 cDNA 파지를 도말하여 8시간 동안 인큐베이션시킴으로써 증폭시켰다. 250,000개 초과의 독립적인 클론을 획득하였으며 상기 Sambrook 등의 문헌 (1989)에서와 같이 넝크 플레이트 당 20 ml의 SM 배지 (0.1 M NaCl, 0.01 M MgSO₄, pH가 7.5인 0.05 M 트리스-HCl, 0.01% 겔라틴)로 용출시켰고 분취시켰으며 보관하였다.

실시예 13-cDNA 뱅크의 면역선별

실시예 9에 나타낸 바와 같이 제조한 항체를 사용하여 실시예 12로부터의 λ잽 익스프레스 cDNA 뱅크에서 63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질을 발현하는 클론을 선별하였다. Sambrook 등의 문헌 (1989)에서와 같이 cDNA 뱅크를 선별하였다. λ잽 익스프레스 뱅크를 적당히 희석시켜 대장균 XL1 블루 MRF' 균주 내로 감염시켰다. 10 mM MgSO₄, 0.2% 맥아당 및 5 mM IPTG (cDNA 인서트의 발현을 유도하기 위한 것임)를 함유하는 루리아 (Luria) 아가로스 상에서 감염시킨 세균을 4시간 동안 성장시킨 후 니트로셀룰로스 (하이본드 (Hybond)-C 슈퍼, 아머샴)를 덮고 37℃에서 철야 인큐베이션시켰다. 이어서 토끼 1차 항체 (실시예 9)를 1/1000으로 희석시키는 반면, 2차 항체인 염소 항-토끼 IgG 알칼린 포스파타제 콘쥬게이트 항체 (시그마 제품 A-8025)는 1/2000으로 희석시켜 사용하여 필터를 면역선별하였다. 제조 업자의 지시에 따라 사용된, 시그마로부터 구매한 BCIP/NBT 정제 (5 브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트/니트로블루테트라졸륨) (제품 B-5655)을 사용하여 양성 클론의 위치화를 수행하였다. 24개의 양성 클론을 동정하였으며 이것을 꺼내어 SM 완충제 (5.8 g/l NaCl, 2 g/l의 MgSO₄·7H₂O, pH가 7.5인 50 mM 트리스-HCl, 0.01% 겔라틴)에 재현탁시켰고 단일 플라크에 대하여 양성 신호가 동정될 수 있을 때까지 저밀도의 플라크에서 재선별하였다.

실시예 14-양성 클론의 서브클로닝

이어서 스트라타진에 의해 제공되는 엑스어시스트 (ExAssist) 헬퍼 파지 및 절제 프로토콜을 사용하여 면역선별로부터 동정된 양성 λ잽 익스프레스 cDNA 클론 (실시예 13)을 플라스미드 pBKCMV 유도체로서 절제하였다. 이어서 Sambrook 등의 문헌 (1989)에 나타낸 바와 같이 플라스미드 클론을 배양하여 (카나마이신 선별) "미니-프렙"하였다. 이어서 획득된 플라스미드를 XbaI/SstI 이중 절단으로 분석하여 클론의 cDNA 인서트 크기를 특성화하였다. 가장 큰 군 (12개의 클론)의 인서트 크기가 2.0 kb였으며 cDNA 인서트 크기는 700 bp 내지 2.8 kb 범위였다. 플라스미드를 Sau3A (4 염기쌍을 절단함)로 또한 절단시켜 유사한 제한 효소 양식에 기초한 클론의 분류를 확인하였다. 이런 방법으로 공통의 제한 효소 절단 양식에 기초하여 클론을 6개의 군으로 나누었다. 이어서 웨스턴 분석으로 각 군으로부터의 대표적인 클론에서의 63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질의 생산 및 효소 활성을 또한 시험하였다.

실시예 15-웨스턴 블롯팅을 사용한 양성 cDNA 클론의 증명

실시예 6과 같이 카나마이신 (50 μg/ml), IPTG (5 mM)가 첨가된 루리아 브로쓰에서 철야 배양시킨 대장균 클론의 배양물을 취하여 동일 부피의 SDS-PAGE 시료용 완충제를 첨가하고 이어서 끓여 전기영동함으로써 절제시킨 대표적인 면역선별 양성 클론으로부터의 단백질 추출물을 제조하였다. 이어서 단백질을 웨스턴 블로팅시키고 63 kDa PAA-CoA 리가제 단백질의 존재를 측정하였다 (실시예 11). 항-토끼 IgG 알칼린 포스파타제 콘쥬게이트를 사용하였으며 (분석용 완충제에서 1:2000으로 희석시킴) 포스파타제 기질이 정제 형태로 공급되는 BCIP/NBT (시그마)였으며 제조 업자의 지시대로 사용되었다는 것을 제외하고 실시예 11에 기술된 바와 동일하게 막의 면역염색을 수행하였다. 한 군의 클론 (cDNA 인서트 크기 2.0 kb)이 63 kDa 단백질을 갖는 것으로 동정되었다 (BW1901 대조와 함께 이동함).

실시예 16-대장균 클론의 리가제 활성 분석.

대장균 세포를 포함하는 브로쓰 (실시예 15에서와 동일하게 배양)를 냉각 덴레이 (Denley) 원심 분리기에서 4000xg에서 4℃에서 7분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하였다. 상청액을 따라버렸으며 원래 브로쓰 부피의 절반의 리가제 분석용 완충제에 세포를 재현탁시켰다 (실시예 2). 이어서 세포를 얼음에서 냉각시킨 후 초음파 처리하여 세포를 파열시켰다. 얼음 상에서 7분에 걸쳐 30초 파열을 실시하기 위한 아폴로 일렉트로닉스 (Apollo Electronics) 초음파 처리기에서 초음파 처리를 위한 조건은 출력 5, 50% 효율 사이클이었다. 추출물은 즉시 사용하거나 또는 사용할 때까지 -80℃에 보관하였다. 40 μl의 추출물을 사용하고 반응 혼합물을 30℃에서 60분 동안 인큐베이션시키는 것을 제외하고 실시예 3에 기술되어 있는 분석 방법을 사용하여 PAA-CoA 리가제 활성을 증명하였다. 스펙트럼 분석용의 워터스 (Waters) 996 포토다이오드 배열 검출기가 첨가된 실시예 4에 기술된 것과 같은 HPLC를 사용하여 분석용 상청액에서의 PAA-CoA의 존재를 증명하였다. PAA-CoA 리가제 활성은 클론 6.6에서 검출되었으며 (cDNA 인서트 크기가 2.0 kb인 군의 대표) PAA-CoA 표준물에 대한 다이오드 배열 분석으로 생성되는 PAA-CoA를 확인하였다.

실시예 17-PAA-CoA 리가제 클론의 5'DNA 서열.

Sambrook 등의 문헌 (1989)에서와 같이 클론 6.6 (pPEN09)을 "맥시-프렙"하였으며 DNA를 CsCl 구배로 정제하였다. 단일 및 이중 효소 절단으로 pPEN09의 제한 효소 지도를 만들었다 (도 2). 이어서 크루아켐 (Cruachem)으로부터 구매한 프라이머 (5'-ACAGGAAACAGCTATGACCTTG-3')를 사용하고 파마시아의 T7 서열 결정 키트를 사용하며 제공된 제조 업자의 지시에 따라 상기 클론을 서열 결정하였다. 출발 메티오닌을 제외하고 (펩티드 서열에는 없음), cDNA의 N-말단에서의 번역 아미노산 서열이 이전에 획득된 펩티드 서열의 그것 (실시예 6)과 일치된다는 것으로 하기에 예시된 cDNA 인서터의 5' 말단 서열을 증명하였다.

7-데아자 dGTP를 포함하는 표준 디데옥시뉴클레오티드 종결 반응을 사용하여 나머지 pPEN09 서열을 결정하였다. [³⁵S]dATP를 표지로 사용하였다. 8 M 우레아를 포함하는 6% 폴리아크릴아미드 웨지 (wedge) 겔 상에서 서열 반응물을 분석하였다 [Sanger 등 (1977) PNAS74, 5463-5467; Chen 및 Seeburg (1985) DNA4, 165-170]. ExoIII 및 S1 뉴클레아제를 사용함으로써 T7 및 T3 말단 모두로부터 네스티드 (nested) 삭제가 일어났다 [Henikoff (1984) Gene24, 351-359]. DNA 서열 결정을 위하여 삭제 클론을 아가로스 겔 상에서 전기영동함으로써 크기별로 선발하였다. 선발된 클론은 pPEN09로 서열 결정되었다. 필요한 경우 서열 결정용 내부 프라이머를 합성하였다. cDNA 인서트의 완전한 서열을 도 3에 나타낸다. 번역된 단백질 서열을 도 1에 나타낸다.

DNASTAR 소프트웨어상의 국제 생의학 연구 재단 단백질 서열 결정 데이타베이스 (National Biomedical Research Foundation Protein sequence database, NBRF-PIR) 및 SWISS-PROT 단백질 서열 결정 데이타 뱅크 (Protein Sequence Data Bank, SWISS-PROT)로 PAA-CoA 리가제 단백질의 유추 아미노산 서열을 비교했을 때 감자로부터의 4-쿠마레이트-CoA 리가제와 가장 잘 일치하였다. DNASTAR 메갈린 (megalign) 프로그램 (집단적 방법)을 사용하여 PAA-CoA 리가제 단백질 및 감자 4-쿠마레이트-CoA 리가제를 정렬시켰다. 서열 거리 분석에서 두 단백질 사이에 아미노산 유사성이 25%임이 나타났다. 진균류 (페니실륨, 아스페르길루스, 뉴로스포라 및 효모)로부터의 아세틸 CoA 합성 효소를 유사하게 비교해 보면 유사성이 단지 15%였다.

PAA-CoA 리가제 단백질의 마지막 세 아미노산은 세린-리신-이소류신이다. 이 아미노산 서열은 C-말단 미소체 표적화 신호 (CMTS)의 콘센서스 (consensus) 서열과 일치하며 동일한 아미노산이 한세눌라 (Hansenula) 다형체 카탈라제 단백질을 미소체로 표적화하는 데 필수적이라 생각되었다 [Didion&Roggenkamp (1992) FEBS Lett.303(2-3), 113-116]. SKI C-말단 트리펩티드도 또한 뉴로스포라 크라싸 (Neurospora crassa)에서 단백질을 미소체에 표적화할 수 있다 [de Zoysa&Connerton (1994) Curr. Genet.26, 430-437]. ACTF 단백질에 의해 수행되는 페니실린 생합성의 최종 단계 (PAA-CoA 리가제의 생성물인 PAA-CoA를 이용)는 페니실륨 크리소제눔에서 미소체에 편중되어 있다 [Muller 등 (1991) EMBO J.10(2) 489-495]. ACTF 단백질은 또한 미소체로의 표적화에 필요한 CMTS를 갖고 있다 (유럽 특허 제0488 180 A2호). PAA-CoA 리가제 단백질이 CMTS를 갖는다는 것은 페니실린 생합성에서의 그의 역할과 일치한다.

실시예 18-게놈 DNA와 PAA-CoA 리가제 cDNA 프로브와의 혼성화

페니실륨 크리소제눔 야생형 NRRL1951, BW1900A, BW1901을 포함하는 많은 균주로부터 하기와 같이 게놈 DNA를 단리시켰다. 실시예 1과 같이 균주를 배양하였으며, 40시간 후에 와트만 GF/A 미세섬유 유리 필터를 통하여 여과시킴으로써 수집하였다. 균사체를 0.9 M NaCl로 헹군 후 액체 질소에서 동결시켰다. 액체 질소에서 균사체를 미세한 분말로 미분화시켰으며 얼음에 15분 동안 둔 용액 G에 분말을 재현탁시켰다 (실시예 12). 4℃에서 17500xg에서 20분동안 균사체 파편을 펠렛화하였다. Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 다른 50 ml 원심분리용 튜브에 상청액을 수집하였으며 pH 8.0의 페놀/클로로포름으로 DNA를 추출하였으며 클로로포름으로 추출하였고 에탄올로 침전시켰다. Sambrook 등 (1987)의 동일 문헌에서와 같이 pH 8.0의 10 mM 트리스·HCl, 1 mM EDTA에 핵산을 재현탁시켰으며 알엔아제 (RNase)로 처리하여 RNA를 제거하였다. Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 게놈 DNA를 BamHI으로 절단하였으며 절단물을 전기영동하였고, 하이본드 엔 (Hybond N) 막 (아머샴)으로 블롯팅시켰다. 하기와 같이 막을 pPEN09로부터의 cDNA 인서트와 혼성화시켰다: 6xSSC, 1% SDS, 6% PEG6000, 100 μg/ml의 프래그먼트화된 변성 청어 정액 DNA에서 60℃에서 6시간 동안 막을 예비혼성화하였다. 그 후, 표지된 변성 cDNA 프래그먼트 (아머샴의 메가프라임 (Megaprime) 키트 및³²P-dCTP를 사용하여 제조 업자의 지시대로)를 혼성화 용액에 첨가하였으며 60℃에서 철야로 혼성화를 계속하였다. 이어서 2xSSC, 0.1% SDS에서 65℃에서 30분 동안 막을 2회 세척하였다. Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 막을 방사능사진화하였다. 모든 페니실륨 주 (야생형 NRRL1951 포함)로부터 cDNA 프로브에 혼성화된 단일한 공통의 8 kb BamHI 프래그먼트가 결과에서 나타났다.

실시예 19-λEMBL3 뱅크의 작제

50 ml의 ACM 배지 (20 g/l의 맥아 추출물, 1 g/l의 박토-펩톤, 20 g/l의 포도당)에 스미쓰클라인 비참사의 페니실륨 크리소제눔 BW1900A 균주의 포자를 루프 가득 접종하고 25℃에서 진탕배양시킴으로써 상기 균주의 진탕플라스크 배양물을 제조하였다. 40시간의 배양 후 와트만 GF/A 미세섬유 유리 필터를 통하여 여과시킴으로써 균사체를 수집하였으며 0.9 M NaCl에 헹구었다. 이어서 10 mg/ml의 노보자임 (Novozym, 덴마크 Novo Biolabs, Novo Industri.)을 함유하는 0.9 M NaCl에 균사체를 재현탁시켰으며 25℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 코튼 울 필터를 통과시킴으로써 균사체 파편으로부터 원형질체를 정제한 후 4000xg에서 10분 동안 원심분리하여 원형질체를 펠렛화하였다. 0.9 M NaCl에서 원형질체를 2회 헹군 후 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, pH 7.5의 50 mM 트리스·HCl, 25 mM EDTA를 첨가하여 원형질체를 파쇄시켰다. 원심분리하여 파편을 제거하였으며 염색체 DNA를 포함하는 상청액을 동일 부피의 8 LiCl에 첨가하여 서서히 혼합시켰으며 -20℃에서 30분 동안 보관하였다. 이어서 원심분리 (10000xg, 4℃, 10분)하여 단백질 및 약간의 RNA를 펠렛화하였으며 염색체 DNA를 포함하는 상청액을 에탄올 침전시켰다. Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 염색체 DNA를 Sau3A로 부분 절단시켰으며 수크로스 밀도구배로 프래그먼트화된 DNA를 크기별로 분획화시켰다. 10 kb 초과의 Sau3A 프래그먼트를 포함하는 분획을 합하였으며 λEMBL3 뱅크의 작제에 사용하였다. 프로메가로부터 수득한 λEMBL3 BamHI 암에 게놈 Sau3A 프래그먼트를 라이게이션시켰다. 이어서 프로메가의 패카진 (Packagene) 키트를 사용하여 라이게이션된 λDNA를 패키징시켰다. 이어서 Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 패키징된 λDNA를 대장균 주 LE392 세포에 감염시킴으로써 증폭시켰고 플라크를 세균 론 (lawn) 상에 도말시켰고 37℃에서 8시간 동안 인큐베이션하였다. 대략 18000개의 독립적 클론을 획득하였다. 파지를 SM 완충제 내로 용출시켰으며 적당히 보관하였다 (Sambrook 등의 문헌 (1989)에서와 같이).

실시예 20-PAA-CoA 리가제 게놈 DNA의 클로닝

Sambrook 등 (1989)의 동일 문헌에서와 같이 플라크 혼성화로 cDNA 클론 6.6으로부터의 cDNA 인서트를 포함하는 SstI-XbaI 프래그먼트 (도 2)를 사용하여 λEMBL3 뱅크 (실시예 19에서 제조)를 프로브하였다. 1차 선별에서 많은 1차 양성이 동정되었으며 이들을 가려내어 저 희석에서의 2차 선별에 사용하였다. 플라크 혼성화를 반복하였으며 PAA-CoA 리가제 cDNA 프로브에 혼성화시켜 개개의 플라크들을 동정하였다. 이들 λEMBL 클론을 가려내어 증폭시켰다. 주 BW1900A로부터의 게놈 DNA의 단일 절단물과 함께, BamHI, EcoRI 또는 SalI 중의 하나로 그리고 모든 조합쌍의 상기 제한 효소로 λEMBL 클론을 절단하였다. 절단물들을 전기영동하였으며 서턴 혼성화로 블롯팅 및 특성화하였고 전체 PAA-CoA 리가제 유전자를 포함하는 제한 효소 프래그먼트를 동정하였다. 몇몇 λEMBL 클론으로부터 6.5 kb EcoRI 프래그먼트를 취하였으며 (염색체 DNA 절단물로부터 동일 크기의 프래그먼트가 나타남) pIJ2925로 서브클로닝하였다 [G.R. Janssen 및 M.J. Bibb(1993) Gene124(1) 133-134]. 게놈 DNA의 제한 효소 지도를 도 4에 나타낸다.

실시예 21-페니실륨 크리소제눔 BW1901 균주의 PAA-CoA 리가제에 의한 형질 변환

pIJ2925에서의 6.5 kb EcoRI 서브클론 (실시예 20,=pAMX131)을 p3SR2로부터의 선형 amdS 프래그먼트 [Hynes 등 (1983) Mol. Cell. Biol.3, 1430-1439 참조]와 함께 사용하여 페니실륨 크리소제눔 BW1901 균주의 원형질체를 공동형질변환시켰다 (문헌 [Tilburn 등 (1984) Gene 26, 205-221]에서의 방법). 아세트아미드를 사용할 수 있는 능력에 의해 형질변환체를 선발하였다. 이어서 PenV 역가에 대하여 형질변환체를 선별하였다. BW1901 대조와 비교하여 많은 형질변환체들이 더 높은 수준의 PenV를 가졌는데 (재시험시 111%까지), 이는 아마도 두 가지 플라스미드 모두가 인테그레이션되었음을 암시하는 것이다. 상기와 같은 결과는 페니실린 생합성에서의 상기 클론의 역할을 지지한다.

〈서열표〉

(1) 일반적 정보 :

(i) 출원인 :

(A) 이름: 스미쓰클라인 비참 피엘씨

(B) 거리: 뉴 호라이즌스 코트

(C) 도시: 브렌트포드

(D) 주: 미들섹스

(E) 국가: 영국

(F) 우편 번호: TW8 9EP

(G) 전화 번호: 0181 975 3314

(H) 텔레팩스: 0181 975 3688

(ii) 발명의 명칭 : 신규 산물

(iii) 서열수 : 2

(iv) 컴퓨터 판독 형태

(A) 매체 유형: 플로피 디스크

(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형

(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS

(D) 소프트웨어: 퍼텐트인 릴리스 #1.0, 버젼 #1.30 (EPO)

(2) 서열번호 1에 대한 정보:

(i)서열 특징:

(A) 길이: 578 아미노산

(B) 유형: 아미노산

(C) 가닥수: 알 수 없음

(D) 토폴로지: 알 수 없음

(ii) 분자형: 단백질

(iii) 가설: 있음

(iv) 안티-센스: 없음

(vi) 원천

(A) 유기체: 페니실륨 크리소제눔

(B) 균주: BW1901

(xi) 서열 설명: 서열 번호 1:

(2) 서열번호 2에 대한 정보:

(i)서열 특징:

(A) 길이: 1976 염기쌍

(B) 유형: 핵산

(C) 가닥수: 이중

(D) 토폴로지: 알 수 없음

(ii) 분자형: cDNA

(iii) 가설: 없음

(iv) 안티-센스: 없음

(vi) 원천

(A) 유기체: 페니실륨 크리소제눔

(B) 균주: BW1901

(xi) 서열 설명: 서열 번호 2:

Claims

페니실륨 크리소제눔 (Penicillium chrysogenum)을 배양, 균사체를 수집하고 초음파 처리하며, 세포 파편을 제거하고 음이온-교환 크로마토그래피, 이어서 소수 작용 크로마토그래피, 기질로 용출시키는 친화 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피로 초음파 처리물을 분획시키고 PAA 및 조효소 A에 의존적인 분석을 사용하여 크로마토그래프의 활성 분획을 검출하는 것에 의하여 페니실륨 크리소제눔 균주로부터 수득가능한 PAA-CoA 리가제 활성이 있는 효소.
제1항에 있어서, SDS PAGE로 대략 63 kD의 외관상 분자량을 갖는 효소.
제1항 또는 제2항에 있어서,

의 N-말단 서열이 삽입된 효소.
제1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 도 1/서열 번호 1에 나타낸 아미노산 서열을 포함하는 효소.
제1항 내지 4항 중 어느 한 항에서 정의된 효소 유전자를 코딩하는 DNA.
제5항에 있어서, 도 2 또는 도 4에 나타낸 것과 같은 제한 효소 위치 배열을 갖는 DNA.
제6항에 있어서, 실질적으로 도 3/서열 번호 2의 DNA 서열을 포함하는 DNA.
엄격한 혼성화 조건 하에서 제5항, 제6항 또는 제7항에 따른 DNA 또는 이들의 프래그먼트에 혼성화하는 DNA.
제5항 내지 8항 중 어느 한 항에 따른 DNA를 포함하는, 적당한 숙주 유기체에서 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소 발현용 벡터.
제5항 내지 8항 중 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 DNA를 포함하는 형질 변환된 숙주.
페니실린을 생산하거나 또는 페니실린 생산 유기체의 역가를 증가시키기 위한 제9항에 따른 형질 변환된 숙주의 용도.
페니실륨 종을 배양하고, 이어서 추출 및 정제시키고 PAA 및 조효소 A에 의존적인 분석법을 사용하여 활성 분획을 검출하는 것을 포함하는 PAA-CoA 리가제 활성을 갖는 효소의 제조 방법.