JP2001069983A - アルコール脱水素酵素遺伝子、それを含有する組換えベクター、その組換えベクターを含有する形質転換体及びその形質転換体を用いたアルコール脱水素酵素の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 スフィンゴバクテリウム・スピリヒボラム由
来のアルコール脱水素酵素の効率よい生産に有用な、遺
伝子、組換えベクター、形質転換体及びこれを用いたア
ルコール脱水素酵素の製造方法を提供する。 【解決手段】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列からなるアルコール脱水素酵素をコードする遺伝
子。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はアルコール脱水素酵
素遺伝子と、この遺伝子を含有する組換えベクター、組
換えベクターによる形質転換体、並びにこの形質転換体
によるアルコール脱水素酵素の製造方法に関するもので
ある。

【０００２】

【従来の技術】アルコール脱水素酵素は、動植物界に広
く分布し、動物組織では肝臓等に、また微生物では酵母
等にその存在が知られおり、該酵素は、上記肝臓、酵母
等より精製等して製造されている（「酵素ハンドブッ
ク」、丸尾文治、田宮信雄監修、朝倉書店、１９８２年
１２月１日）。これらのアルコール脱水素酵素は、例え
ば、アルコールやアルデヒドの定量、医薬品等の合成中
間体として有用なアルデヒドの製造等に極めて有用な酵
素である。しかし、ＮＡＤ⁺を補酵素とするアルコール
脱水素酵素では基質特異性が広く、かつ安定な酵素が求
められていた。

【０００３】このような状況の下、本発明者らは好冷性
微生物であるスフィンゴバクテリウム（Sphingobacteri
um）属の微生物が広い基質特異性を有し、かつ高い熱安
定性を有するアルコール脱水素酵素を生産することを見
出し、このアルコール脱水素酵素及びその製造方法につ
いて既に特許を出願している（特願平１０−２５０９３
１号）。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】上記の発明により、広
い基質特異性を有し、かつ高い熱安定性を有するアルコ
ール脱水素酵素を入手することが可能となった。しかし
ながら、上記の発明においてアルコール脱水素酵素を製
造するには、１５℃という極めて低い温度で微生物を培
養することが必要であるため、強力な冷却設備が必要と
なる。また、培養時間も４８〜７２時間の長時間を要す
るために、このアルコール脱水素酵素の工業レベルでの
供給にはなお課題が残されていた。

【０００５】本発明は、以上のとおりの事情に鑑みてな
されたものであり、スフィンゴバクテリウム・スピリチ
ボラム（Sphingobacterium spiritivorum）由来のアル
コール脱水素酵素を遺伝子工学的に大量製造するための
遺伝子操作材料と、この材料を用いたアルコール脱水素
酵素の製造方法を提供することを目的としている。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者等は、このよう
な課題を解決するために鋭意研究を行なった結果、スフ
ィンゴバクテリウム・スピリチボラムが産生するアルコ
ール脱水素酵素遺伝子を単離及び構造決定することに成
功し、さらに、アルコール脱水素酵素をコードする遺伝
子をベクターＤＮＡに挿入した組み換え体ＤＮＡを得、
この組み換え体をエッシェリシア（Escherichia）属に
属する菌株に含ませた該アルコール脱水素酵素生産能を
有する菌株を培地で培養すると、効率よく該アルコール
脱水素酵素が生産されること等を見出し、本発明を完成
した。

【０００７】すなわち、第１の発明は、配列番号１で示
されるアミノ酸配列又は配列番号１で示されるアミノ酸
配列において１もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換も
しくは付加されたアミノ酸配列からなるアルコール脱水
素酵素をコードする遺伝子を要旨とするものである。ま
た、第２の発明は、配列番号２で示される塩基配列又は
配列番号２で示される塩基配列において１もしくは数個
の塩基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からな
るＤＮＡを有し、かつアルコール脱水素酵素をコードす
る遺伝子を要旨とするものである。さらに、第３の発明
は、上記の遺伝子を含有する組換えベクターを要旨とす
るものである。第４の発明は、上記の組換えベクターを
含む形質転換体を要旨とするものである。第５の発明
は、この形質転換体を培地中で培養し、培養物からアル
コール脱水素酵素を採取することを特徴とするアルコー
ル脱水素酵素の製造方法を要旨とするものであり、第６
の発明は、形質転換体の培養温度が２０〜２８℃である
アルコール脱水素酵素の製造方法を要旨とするものであ
る。

【０００８】

【発明の実施の形態】本発明に係るアルコール脱水素酵
素は、配列番号１で示されるアミノ酸配列、あるいは、
配列番号１で示されるアミノ酸配列における１もしくは
数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
酸配列を有するタンパク質である。従って、本発明の遺
伝子は上記アミノ酸配列をコードする遺伝子であって、
具体的には、配列番号２に示される塩基配列からなるＤ
ＮＡに代表される遺伝子である。

【０００９】このような遺伝子の単離及びこの遺伝子を
含有する組換えベクターの作成、組換えベクターによる
形質転換体の作成、並びに形質転換体の培養等は公知の
方法、例えばモレキュラー・クローニング（コールドス
プリングハーバー出版社、１９８９年）、カレント・プ
ロトコールス・イン・モレキュラー・バイオロジー（ウ
ィリー・インターサイエンス出版社、１９８９年）等に
記載されている方法を組み合わせて行なうことができ
る。例えば遺伝子は、配列番号２で示される塩基配列の
一部配列を合成し、この合成ＤＮＡをプローブとしてＤ
ＮＡライブラリーから単離する方法、配列番号２で示さ
れる塩基配列の両端部分の合成ＤＮＡをプライマーと
し、染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法によって目的遺
伝子を増幅する方法等によって取得することができる。

【００１０】本発明の組換えベクターは、このようにし
て得られたアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を
含有するものであり、ベクターにこのようにして得られ
たアルコール脱水素酵素をコードする遺伝子を連結する
ことにより得ることができる。ベクターとしては、特に
限定されるものではなく、例えばpET-3b（ノバジェン社
製）、pKK223-3（ファルマシア社製）、pUC19（宝酒造
社製）、pBluescriptKS(+)（ストラタジーン社製）、pB
R322（東洋紡社製）等のプラスミドＤＮＡがあげられ
る。また、このようにして得られた組換えベクターを形
質転換法により例えば大腸菌、枯草菌、酵母等に導入す
ることにより、アルコール脱水素酵素の発現能を有する
形質転換体を得ることができる。

【００１１】このようにして製造した形質転換体を用い
てアルコール脱水素酵素を製造する方法としては、ま
ず、形質転換体をアルコール脱水素酵素の生産に適しか
つそれぞれの宿主微生物の生育に適した培地で、培養、
集菌する。形質転換体の培養温度としては、１５〜３２
℃が好ましく、さらに好ましくは２０〜２８℃であり、
特に好ましい温度は２２〜２６℃である。次に、得られ
た形質転換体の菌体を超音波で破砕或いはリゾチーム等
で溶菌し、遠心分離することによってアルコール脱水素
酵素を製造することができる。さらに、遠心上清から市
販のイオン交換樹脂、疎水クロマト樹脂、アフィニティ
ー樹脂等を用いてアルコール脱水素酵素を精製すること
ができる。

【００１２】

【実施例】次に、本発明を実施例によって具体的に説明
する。 実施例１：アルコール脱水素酵素遺伝子の配列決定 （１）アルコール脱水素酵素アミノ酸配列の解析 スフィンゴバクテリウム・スピリチボラムＰ１株（ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６９７４）より精製したアルコール脱水素
酵素１５０μｇを気相ペプチドシーケンサー４７７Ａ
（パーキンエルマー社製）に供し、Ｎ末端アミノ酸配列
を測定した結果、配列番号３に示す配列を得た。また、
スフィンゴバクテリウム・スピリチボラムＰ１株より精
製したアルコール脱水素酵素１６０μｇをリジルエンド
ペプチダーゼ（和光純薬工業製）を用いて消化後、ＨＰ
ＬＣで分離して１０番目のペプチドを分取し、これを気
相ペプチドシーケンサー４７７Ａ（パーキンエルマー社
製）に供した結果、配列番号４に示す内部アミノ酸配列
を得た。これらの情報により配列番号５及び６に示した
ＤＮＡプライマーをアマシャムファルマシア社にて作製
した。

【００１３】（２）ＰＣＲによるアルコール脱水素酵素
遺伝子の部分増幅とＤＮＡ配列の決定 スフィンゴバクテリウム・スピリチボラムＰ１株の菌体
３ｇを公知の方法（Saito & Miura, Biochim.Biophys.,
Acta, vol.72, p619, 1963）に従いリゾチーム（生化
学工業社製）により溶菌後、ＳＤＳ含有アルカリ性緩衝
液とフェノールでＤＮＡを抽出した。さらに、ＲＮＡを
ＲＮアーゼで分解して染色体ＤＮＡを２ｍｇ精製した。
公知の方法 (Simpson et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun., vol.151. p487, 1988) に従って、得られた
染色体ＤＮＡのうち１μｇをテンプレートとし、上述の
プライマーおよびサーマスアクアティカス由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを、９４℃
２０秒、４５℃３０秒、６８℃１２０秒の条件で３０サ
イクル行った。増幅したＤＮＡ断片（約６５０ｂｐ）
は、アガロースゲルで分離した後、そのバンドを切り出
し、GENECLEAN II（フナコシ社製）を用いて抽出精製し
た。

【００１４】得られたＤＮＡ断片はプラスミドベクター
pT7Blue T-Vector（ノバジェン社製）にLigation Kit
(宝酒造製)を用いライゲーションし、組み換えＤＮＡを
得た。得られた組み換えＤＮＡをNovaBlueコンピテント
セル（ノバジェン社製）５０μｌと混合し、０℃下で３
０分間静置した後、４２℃で４５秒間加温して形質転換
を行なった。得られた形質変換体を、アンピシリン、Ｘ
−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢ寒天培地上で培養し、ブ
ルー・ホワイトスクリーニングを行い５８株の陽性クロ
ーンを得た。このうち５株をアンピシリンを含むＬＢ培
地５ｍｌに植菌し、３７℃で一晩培養後、アルカリ−Ｓ
ＤＳ法によりプラスミドを調製し、ポリエチレングリコ
ール６０００（和光純薬製）でさらに精製した。このプ
ラスミド各４００ｎｇを、公知の方法に従い、ダイデオ
キシチェーンターミネーション反応での塩基配列解析に
供した。反応にはBig Dye Terminator Cycle Sequencin
g Ready Reaction Kit（パーキンエルマー社製）を用
い、ＤＮＡシーケンサー３７７Ａ（パーキンエルマー社
製）を用いて分析した。ＰＣＲでは１万分の１から１０
万分の１の確率で変異が入ることがあるので、結果が異
なる箇所は５株のシークエンス結果を比較して多い方
（５つのうち４つ同じもの）を正しい配列とした。その
結果、配列番号５に示した６１７塩基対の塩基配列を得
た。得られた塩基配列より予想されるアミノ酸配列のＮ
末端が配列番号３で示されるＮ末端アミノ酸配列の後部
分（１０〜２０アミノ酸残基）であること及びＣ末端が
配列番号４で示される内部アミノ酸配列の始まりの２ア
ミノ酸残基と一致することが確認された。このことよ
り、上記のＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片にはアルコール
脱水素酵素遺伝子の一部の配列であることが判明した。

【００１５】（３）アルコール脱水素酵素遺伝子の塩基
配列の決定 配列番号１で示される塩基配列を元に配列８〜１１で示
したＤＮＡを合成し、これをプライマーとし、LA PCR i
n vitro Cloning Kit(宝酒造製)を用いてgenome walkin
g PCRを行った。上記の方法で得た染色体ＤＮＡのうち
１μｇを制限酵素HindIII（宝酒造社製）を用いて完全
に分解後、ライゲーション反応によりHindIIIカセット
をつないだ。次に、カセットプライマーＣ１（キットに
付属）と配列番号８に示すＤＮＡプライマーを用いて１
回目のＰＣＲを上述のサイクルで行った。さらに、この
反応液の一部を用いて、内側のプライマーであるカセッ
トプライマーＣ２（キットに付属）と配列番号９に示す
ＤＮＡプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行った。そ
の結果、約０．８ｋｂのＤＮＡ断片を増幅できた。増幅
したＤＮＡ断片は、前項と同様に抽出精製後、プラスミ
ドベクターpT7Blue T-Vectorに組み込み、NovaBlueコン
ピテントセルを用いて形質転換した。得られた形質変換
体を、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢ
寒天培地上で培養し、ブルー・ホワイトスクリーニング
を行い約５０株の陽性クローンを得た。このうち５株を
アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃で
一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によりプラスミドを調
製し、ポリエチレングリコール６０００（和光純薬製）
でさらに精製した。このプラスミド各５００ｎｇを用い
て前項と同様に塩基配列を解析した。結果が異なる箇所
は、前項と同様にして正しい配列を得た。

【００１６】また、上記と同様にして得た染色体ＤＮＡ
のうち１μｇを制限酵素SalI（宝酒造社製）を用いて完
全に分解後、ライゲーション反応によりSalIカセットを
つないだ。次に、カセットプライマーＣ１（キットに付
属）と配列番号１０に示すＤＮＡプライマーを用いて１
回目のＰＣＲを上述のサイクルで行った。さらに、この
反応液の一部を用いて、内側のプライマーであるカセッ
トプライマーＣ２（キットに付属）と配列番号１１に示
すＤＮＡプライマーを用いて２回目のＰＣＲを行った。
その結果、約０．５ｋｂのＤＮＡ断片を増幅できた。増
幅したＤＮＡ断片は、前項と同様に抽出精製後、プラス
ミドベクターpT7Blue T-Vectorに組み込み、NovaBlueコ
ンピテントセルを用い形質転換した。得られた形質変換
体を、アンピシリン、Ｘ−ｇａｌ、ＩＰＴＧを含むＬＢ
寒天培地上で培養し、ブルー・ホワイトスクリーニング
を行い約６０株の陽性クローンを得た。このうち５株を
アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌに植菌し、３７℃で
一晩培養後、アルカリ-ＳＤＳ法によりプラスミドを調
製し、ポリエチレングリコール６０００（和光純薬製）
でさらに精製した。このプラスミド各４００ｎｇを用い
て前項と同様に塩基配列を解析した。結果が異なる箇所
は、前項と同様にして正しい配列を得た。以上の結果、
スフィンゴバクテリウム・スピリチボラムＰ１株から精
製したアルコール脱水素酵素の遺伝子配列は配列番号２
に示す１０３５塩基対の塩基配列であった。

【００１７】実施例２：アルコール脱水素酵素発現プラ
スミドの構築 アルコール脱水素酵素遺伝子の１塩基から２０塩基目ま
での配列の5’末端にNdeI認識配列及びgccの配列を付加
した配列番号１２で示したＤＮＡプライマーをアマシャ
ムファルマシア社で合成した。また、アルコール脱水素
酵素遺伝子の１０１６塩基から１０３５塩基目までのア
ンチセンス配列の5’末端にBamHI認識配列及びgccの配
列を付加した配列番号１３で示したＤＮＡプライマーも
アマシャムファルマシア社で合成した。

【００１８】スフィンゴバクテリウム・スピリチボラム
Ｐ１の染色体ＤＮＡ１μｇをテンプレートとし、上述の
プライマーおよびサーマスアクアティカス由来のＤＮＡ
ポリメラーゼ（宝酒造社製）を用いたＰＣＲを、９４℃
２０分、６０℃３０秒、７２℃１２０秒の条件で３０サ
イクル行った。増幅したＤＮＡ断片（約１．１ｋｂｐ）
を、アガロースゲルで分離した後、GENECLEAN II（フナ
コシ社製）を用いて抽出精製した。このＤＮＡ断片とpT
7Blue T-vector（ノバジェン社製）１００ｎｇを混合
し、DNA Ligation Kit Ver.2（宝酒造社製）を用い１６
℃で３０分間ライゲーションした。得られたプラスミド
を、NovaBlueコンピテントセル（ノバジェン社製）５０
μｌに混合し、０℃下で３０分間静置した後、４２℃で
４５秒間加温することにより、形質転換を行なった。得
られた形質変換体を、アンピシリンを含むＬＢ寒天培地
上で培養し陽性クローンを約８０得た。陽性クローンの
うち１株を選び、アンピシリンを含むＬＢ培地５ｍｌに
植菌し、３７℃で一晩培養後、アルカリ−ＳＤＳ法によ
りプラスミドを精製した。得られたプラスミドを制限酵
素NdeI（宝酒造社製）およびBamHI（宝酒造社製）で切
断し、アガロースゲルで分離した後、アルコール脱水素
酵素遺伝子を含む断片をGENECLEAN II（フナコシ社製）
を用いて抽出精製した。一方、pET 3bベクター（ノバジ
ェン社製）を、NdeI（宝酒造社製）およびBamHI（宝酒
造社製）認識部位で切断し、アガロースゲルで分離した
後、断片をGENECLEAN II（フナコシ社製）を用いてベク
ターＤＮＡ断片を抽出精製した。

【００１９】このようにして得たアルコール脱水素酵素
遺伝子を含むＤＮＡ断片とベクターＤＮＡ断片を、DNA
Ligation Kit Ver.2（宝酒造社製品）を用いて１６℃で
３０分間連結反応を行い、アルコール脱水素酵素遺伝子
を含有する組換えプラスミドベクターpETadhを得た。次
いで、pETadhを大腸菌BL21(DE3)コンピテントセル５０
μｌ（ノバジェン社製）に混合し、０℃下で３０分間静
置後、４２℃で４５秒間加温し、形質転換を行なった。
得られた形質転換体をアンピシリンを５０μｇ／ｍｌ含
むＬＢ寒天平板に塗抹したところ、約１２０株の形質転
換株を得た。このうち１６株からプラスミドＤＮＡを調
製し、その０．５μｇを制限酵素NdeIとBamHIで切断
し、アガロース電気泳動により検定した結果、全て約
１．１ｋｂｐの断片が確認された。このうちの１株を大
腸菌（エシェリチア・コリ）BL21(DE3)/pETadhとした。

【００２０】実施例３：大腸菌でのアルコール脱水素酵
素の製造 実施例２で作成した形質転換大腸菌BL21(DE3)/pETadhを
アンピシリン５０μｇ／ｍｌを含むＬ培地３０ｍｌ（５
ｍｌ×６本）に植菌後、３７℃にて一晩（１６時間）前
培養を行なった。前培養液をアンピシリン５０μｇ／ｍ
ｌ及び塩化亜鉛１００μＭを含むＬ培地１Ｌを入れた２
Ｌ容坂口フラスコに植菌し、２５℃にて１８時間培養
後、イソプロピルβチオガラクトピラノシドを０．２ｍ
Ｍ加え、さらに６時間培養した後集菌した。得られた菌
体（１ｇ）は、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ
７．０）２ｍｌに懸濁後、Insonator210M（KUBOTA社
製）を用いて超音波処理した。菌体破砕物を除いた上澄
中のアルコール脱水素酵素活性は、３８９．６ユニッ
ト、蛋白質量は６９．５６ｍｇであり、比活性５．６ユ
ニット/ｍｇ蛋白質であった。得られた酵素の性質を調
べたところ、サブユニット分子量約４２ｋＤａ、反応至
適温度６０℃以上であり、スフィンゴバクテリウム・ス
ピリチボラムＰ１株由来酵素と同じ性質を有するもので
あることが確認された。

【００２１】なお、本発明においてアルコール脱水素酵
素の活性測定は、エタノールを基質とし、１５℃で反応
を行い、生成するＮＡＤＨに由来する３４０ｎｍの吸光
度の上昇により測定した。具体的には、反応液を最終組
成が、１００ｍＭＣＨＥＳ（ｐＨ９．０）、１ｍＭＮＡ
Ｄ⁺、１０ｍＭエタノールとなるように調製した。この
反応液２．９５ｍｌを、キュベットに入れて5分間保温
し、５０ｍｌの粗酵素抽出液を添加することによって反
応を開始させ、増加する３４０ｎｍの吸光度を測定し
た。また、酵素活性は、上記条件下で、１分間に１μモ
ルのＮＡＤＨを生成しうる酵素量を１単位（ユニット）
と定義した。

【００２２】比較例１：スフィンゴバクテリウム・スピ
リチボラムＰ１株からのアルコール脱水素酵素の製造 スフィンゴバクテリウム・スピリチボラムＰ１の寒天斜
面培養物を、２００ｍｌ（５ｍｌ×４０本）の栄養培地
（１．０％酵母エキス、２．０％ポリペプトン：ｐＨ
７．０）に植菌し、１５℃で二昼夜振盪培養した。本培
養菌体を７Ｌの培地を含む１０Ｌのジャーファーメンタ
ーに植え継ぎ、さらに４８時間攪拌培養した後集菌し
た。得られた菌体（２０ｇ）は、１０ｍＭリン酸カリウ
ム緩衝液（ｐＨ７．０）１００ｍｌに懸濁後、Insonato
r210M（KUBOTA社製）を用いて超音波処理した。菌体破
砕物を除いた上澄中のアルコール脱水素酵素活性は７４
５ユニット、蛋白質量は５５９ｍｇでり、比活性は１．
３３ユニット/ｍｇ蛋白質であった。

【００２３】以上の結果から、本発明の形質転換体を用
いると（実施例３）、スフィンゴバクテリウム・スピリ
チボラムＰ１を用いた場合（比較例１）に比べて、比活
性が４倍以上向上しており、本発明においてより効率的
にアルコール脱水素酵素が生産されていることがわか
る。また、比活性が高いことは、アルコール脱水素酵素
以外の夾雑蛋白質が少ないことであり、精製工程の簡略
化、収率の向上が予想される。また、スフィンゴバクテ
リウム・スピリチボラムＰ１株からアルコール脱水素酵
素を製造する場合は、培養工程に４昼夜（９６時間）を
要しているが、本発明を用いた場合は半分以下の４０時
間で終了できる。また、培養液１Ｌ当たりの酵素製造量
が従来法では１０６．４ユニットであるのに対して本発
明では３倍以上の３８９．６ユニットを得ることができ
た。すなわち、本発明を用いれば生産性を従来より６倍
以上改善することができた。さらに、培養工程において
従来は１５℃という低温で培養するため、強力な冷凍設
備が必要であったが、本発明を用いると前培養は一般的
な培養温度である３７℃で培養することができ、本培養
においても常温である２５℃付近で培養できる利点があ
る。

【００２４】

【発明の効果】本発明によれば、スフィンゴバクテリウ
ム・スピリチボラム由来のアルコール脱水素酵素を効率
よく生産することができる。

【配列表】 <110> UNITIKA LTD. <120> NUCLEIC ACIDS ENCODING ALCOHOL DEHYDROGENASE, VECTOR AND TRANSFORM ANT THEREOF, AND METHOD FOR PRODUSING ALCOHOL DEHYDROGENASE THEREWITH <130> P0018141 <160> 11 <210> 1 <211> 344 <212> PRT <213> Sphingobacterium spiritivorum P1 <400> 1 Met Leu Pro Lys Thr Met Lys Ala Ala Val Ile Arg Glu Phe Gly Ser 1 5 10 15 Leu Leu Lys Ile Glu Glu Val Glu Val Lys Arg Pro Gly Arg Asn Glu 20 25 30 Ile Leu Val Lys Val Ile Ala Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His 35 40 45 Ala Val Glu Gly Asp Trp Pro Val Lys Pro Lys Met Pro Leu Ile Pro 50 55 60 Gly His Glu Ala Val Gly Tyr Val Val Ala Val Gly Gln Glu Val Lys 65 70 75 80 Asn Val Lys Glu Gly Asp Ala Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala 85 90 95 Cys Gly Gly Cys Asp Gln Cys Ile Thr Gly Trp Glu Thr Leu Cys Asp 100 105 110 Thr Gln Gln Asn Gly Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Phe Ala Glu Tyr 115 120 125 Val Ile Ala Asp Ala Arg Tyr Val Gly Leu Leu Pro Ser Asn Val Asn 130 135 140 Phe Met Glu Met Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys 145 150 155 160 Gly Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Ser 165 170 175 Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met 180 185 190 Gly Met His Val Ala Ala Ile Asp Val Ala Asp Asp Lys Leu Asp Leu 195 200 205 Ala Lys Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Val Asn Ala Lys Asn Gln Asn 210 215 220 Pro Gly Glu Phe Leu Lys Lys Glu Val Gly Gly Met His Gly Ala Leu 225 230 235 240 Ile Thr Ala Val Ser Pro Ile Ala Phe Lys Gln Gly Leu Glu Thr Leu 245 250 255 Arg Arg Lys Gly Thr Met Ala Leu Asn Gly Leu Pro Pro Gly Asn Phe 260 265 270 Asp Leu Ser Ile Phe Asp Thr Val Leu Asn Arg Ile Thr Ile Arg Gly 275 280 285 Ser Ile Val Gly Thr Arg Lys Asp Met Lys Glu Ala Ile Glu Phe Ala 290 295 300 Val Glu Gly Lys Val Lys Ala Thr Val Thr Pro Ala Lys Leu Glu Asn 305 310 315 320 Ile Asn Glu Val Phe Asp Lys Met Lys Lys Gly Gln Ile Glu Gly Arg 325 330 335 Val Val Leu Glu Ile Ala Lys Ala 340 <210> 2 <211> 1035 <212> DNA <213> Sphingobacterium spiritivorum P1 <400> 2 atg cta ccg aaa act atg aaa gcc gcc gtt att aga gaa ttt ggt tct 48 Met Leu Pro Lys Thr Met Lys Ala Ala Val Ile Arg Glu Phe Gly Ser 1 5 10 15 ctt ttg aaa att gaa gaa gtt gaa gtt aaa cgc ccg gga aga aat gaa 96 Leu Leu Lys Ile Glu Glu Val Glu Val Lys Arg Pro Gly Arg Asn Glu 20 25 30 att ctc gta aaa gta att gca agt gga gtt tgt cat act gat tta cac 144 Ile Leu Val Lys Val Ile Ala Ser Gly Val Cys His Thr Asp Leu His 35 40 45 gca gta gaa gga gat tgg cct gta aaa cca aaa atg ccc tta att cct 192 Ala Val Glu Gly Asp Trp Pro Val Lys Pro Lys Met Pro Leu Ile Pro 50 55 60 ggc cat gaa gcc gta gga tat gtg gtt gct gta ggg cag gag gta aaa 240 Gly His Glu Ala Val Gly Tyr Val Val Ala Val Gly Gln Glu Val Lys 65 70 75 80 aat gta aaa gaa ggt gat gca gtt ggt gtg cca tgg ctt tat agt gcg 288 Asn Val Lys Glu Gly Asp Ala Val Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala 85 90 95 tgc ggt ggt tgt gat cag tgc att acc ggt tgg gaa aca tta tgc gat 336 Cys Gly Gly Cys Asp Gln Cys Ile Thr Gly Trp Glu Thr Leu Cys Asp 100 105 110 aca cag caa aat gga ggt tac agt gta gat ggg gga ttt gct gaa tat 384 Thr Gln Gln Asn Gly Gly Tyr Ser Val Asp Gly Gly Phe Ala Glu Tyr 115 120 125 gtg att gca gat gca aga tat gtt ggt ctt ttg cca tca aat gtg aat 432 Val Ile Ala Asp Ala Arg Tyr Val Gly Leu Leu Pro Ser Asn Val Asn 130 135 140 ttt atg gag atg gcg cca atc ctt tgt gcc gga gta aca gtt tat aaa 480 Phe Met Glu Met Ala Pro Ile Leu Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys 145 150 155 160 gga ctt aag gaa acg gaa gtt aaa ccc gga gaa tgg gtt gcg att tca 528 Gly Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Ser 165 170 175 gga atc gga ggt ctt gga cac gtt gcg gta caa tat gcc aaa gca atg 576 Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Val Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met 180 185 190 gga atg cat gtt gcg gca ata gat gta gca gat gat aaa ctg gat cta 624 Gly Met His Val Ala Ala Ile Asp Val Ala Asp Asp Lys Leu Asp Leu 195 200 205 gcc aaa aaa ctt gga gca gat tta gta gta aac gca aaa aat caa aat 672 Ala Lys Lys Leu Gly Ala Asp Leu Val Val Asn Ala Lys Asn Gln Asn 210 215 220 cct gga gaa ttc tta aag 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Asp Trp Pro Val 35 40 45 AAA CCA AAA ATG CCC TTA ATT CCT GGC CAT GAA GCC GTA GGA TAT GTG 193 Lys Pro Lys Met Pro Leu Ile Pro Gly His Glu Ala Val Gly Tyr Val 50 55 60 GTT GCT GTA GGG CAG GAG GTA AAA AAT GTA AAA GAA GGT GAT GCA GTT 241 Val Ala Val Gly Gln Glu Val Lys Asn Val Lys Glu Gly Asp Ala Val 65 70 75 80 GGT GTG CCA TGG CTT TAT AGT GCG TGC GGT GGT TGT GAT CAG TGC ATT 289 Gly Val Pro Trp Leu Tyr Ser Ala Cys Gly Gly Cys Asp Gln Cys Ile 85 90 95 ACC GGT TGG GAA ACA TTA TGC GAT ACA CAG CAA AAT GGA GGT TAC AGT 337 Thr Gly Trp Glu Thr Leu Cys Asp Thr Gln Gln Asn Gly Gly Tyr Ser 100 105 110 GTA GAT GGG GGA TTT GCT GAA TAT GTG ATT GCA GAT GCA AGA TAT GTT 385 Val Asp Gly Gly Phe Ala Glu Tyr Val Ile Ala Asp Ala Arg Tyr Val 115 120 125 GGT CTT TTG CCA TCA AAT GTG AAT TTT ATG GAG ATG GCG CCA ATC CTT 433 Gly Leu Leu Pro Ser Asn Val Asn Phe Met Glu Met Ala Pro Ile Leu 130 135 140 TGT GCC GGA GTA ACA GTT TAT AAA GGA CTT AAG GAA ACG GAA GTT AAA 481 Cys Ala Gly Val Thr Val Tyr Lys Gly Leu Lys Glu Thr Glu Val Lys 145 150 155 160 CCC GGA GAA TGG GTT GCG ATT TCA GGA ATC GGA GGT CTT GGA CAC GTT 529 Pro Gly Glu Trp Val Ala Ile Ser Gly Ile Gly Gly Leu Gly His Val 165 170 175 GCG GTA CAA TAT GCC AAA GCA ATG GGA ATG CAT GTT GCG GCA ATA GAT 577 Ala Val Gln Tyr Ala Lys Ala Met Gly Met His Val Ala Ala Ile Asp 180 185 190 GTA GCA GAT GAT AAA CTG GAT CTA GCC AAA AAA CTT GGA G 617 Val Ala Asp Asp Lys Leu Asp Leu Ala Lys Lys Leu Gly 195 200 205 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 acatatccta cggcttca 18 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 ccaatctcct tctactgcg 19 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 ggtacaatat gccaaagc 18 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ggaatcggag gtcttgg 17 <210> 12 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 gcccatatgc taccgaaaac tatgaa 26 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 gccggatccc tatgcttttg caatttcaa 29

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 左右田 健次 京都府宇治市木幡御蔵山45−61 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA11 BA08 CA03 DA06 EA04 GA19 HA03 4B050 CC03 CC04 DD02 LL01 LL03 4B065 AC14 BA02 BC03 CA28 CA44 CA46

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号１で示されるアミノ酸配列又は
   配列番号１で示されるアミノ酸配列において１もしくは
   数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ
   酸配列からなるアルコール脱水素酵素をコードする遺伝
   子。
2. 【請求項２】 配列番号２で示される塩基配列又は配列
   番号２で示される塩基配列において１もしくは数個の塩
   基が欠失、置換もしくは付加された塩基配列からなるＤ
   ＮＡを有し、かつアルコール脱水素酵素をコードする遺
   伝子。
3. 【請求項３】 請求項１ないし２の遺伝子を含有する組
   換えベクター。
4. 【請求項４】 請求項３記載の組換えベクターを含む形
   質転換体。
5. 【請求項５】 請求項４記載の形質転換体を培地中で培
   養し、培養物からアルコール脱水素酵素を採取すること
   を特徴とするアルコール脱水素酵素の製造方法。
6. 【請求項６】 形質転換体の培養温度が２０〜２８℃で
   ある請求項５記載のアルコール脱水素酵素の製造方法。