HUT77042A - Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal - Google Patents
Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal Download PDFInfo
- Publication number
- HUT77042A HUT77042A HU9701925A HU9701925A HUT77042A HU T77042 A HUT77042 A HU T77042A HU 9701925 A HU9701925 A HU 9701925A HU 9701925 A HU9701925 A HU 9701925A HU T77042 A HUT77042 A HU T77042A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- acid
- enzyme
- coenzyme
- ligase activity
- beta
- Prior art date
Links
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 title claims description 128
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 title claims description 124
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims description 103
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 68
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title claims description 39
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 title claims description 30
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 title claims description 30
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 title claims description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 26
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 92
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 92
- LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N phenoxyacetic acid Chemical compound OC(=O)COC1=CC=CC=C1 LCPDWSOZIOUXRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 77
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 72
- 241000228150 Penicillium chrysogenum Species 0.000 claims description 65
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 63
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 51
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 49
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 44
- 239000005516 coenzyme A Substances 0.000 claims description 44
- 229940093530 coenzyme a Drugs 0.000 claims description 44
- RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N coenzime A Natural products OC1C(OP(O)(O)=O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 41
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 39
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 36
- -1 adipoyl 7-ACA Chemical compound 0.000 claims description 35
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 35
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 34
- KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N dephosphocoenzyme A Natural products OC1C(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)OC1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 KDTSHFARGAKYJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 34
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims description 33
- 229960003424 phenylacetic acid Drugs 0.000 claims description 28
- 239000003279 phenylacetic acid Substances 0.000 claims description 28
- 108700016155 Acyl transferases Proteins 0.000 claims description 27
- 102000057234 Acyl transferases Human genes 0.000 claims description 27
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 claims description 27
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 claims description 26
- RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N CoASH Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 RGJOEKWQDUBAIZ-IBOSZNHHSA-N 0.000 claims description 24
- 229930195708 Penicillin V Natural products 0.000 claims description 23
- 229940056367 penicillin v Drugs 0.000 claims description 23
- BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N phenoxymethylpenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)COC1=CC=CC=C1 BPLBGHOLXOTWMN-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 20
- WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N adipic acid Chemical compound OC(=O)CCCCC(O)=O WNLRTRBMVRJNCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims description 20
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 18
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 claims description 15
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 15
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 15
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 claims description 15
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 claims description 15
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims description 15
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 14
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 14
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 claims description 13
- 241000228417 Sarocladium strictum Species 0.000 claims description 12
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 claims description 11
- 230000008685 targeting Effects 0.000 claims description 11
- 239000001361 adipic acid Substances 0.000 claims description 10
- 235000011037 adipic acid Nutrition 0.000 claims description 10
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 9
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 claims description 9
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 claims description 9
- 238000007792 addition Methods 0.000 claims description 9
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 9
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 9
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N Caprylic acid Natural products CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000228143 Penicillium Species 0.000 claims description 8
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 8
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 8
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 8
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N n-hexanoic acid Natural products CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 8
- 241001619326 Cephalosporium Species 0.000 claims description 7
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N benzyl(trichloro)silane Chemical compound Cl[Si](Cl)(Cl)CC1=CC=CC=C1 GONOPSZTUGRENK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 6
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 claims description 6
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 claims description 6
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 2-phenylacetic acid Chemical compound O[14C](=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-PPJXEINESA-N 0.000 claims description 5
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 claims description 5
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 claims description 5
- 229930191709 Isopenicillin Natural products 0.000 claims description 5
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 claims description 5
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 claims description 5
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 claims description 4
- HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 7beta-aminocephalosporanic acid Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C([O-])=O)N2C(=O)[C@@H]([NH3+])[C@@H]12 HSHGZXNAXBPPDL-HZGVNTEJSA-N 0.000 claims description 4
- CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N adipyl-7-aminodesacetoxycephalosporanic acid Natural products CC1=C(N2[C@H](SC1)[C@H](NC(=O)CCCCC(O)=O)C2=O)C(O)=O CSGFFYNMTALICU-ZWNOBZJWSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 101150074325 pcbC gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 3
- 101100462961 Fischerella muscicola pcb gene Proteins 0.000 claims description 3
- 241000187433 Streptomyces clavuligerus Species 0.000 claims description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 3
- 101150118709 pcbAB gene Proteins 0.000 claims description 3
- 101150022041 penDE gene Proteins 0.000 claims description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 3
- SMJRBWINMFUUDS-UHFFFAOYSA-N 2-thienylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CS1 SMJRBWINMFUUDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- RCNOGGGBSSVMAS-UHFFFAOYSA-N 2-thiophen-3-ylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC=1C=CSC=1 RCNOGGGBSSVMAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000187390 Amycolatopsis lactamdurans Species 0.000 claims description 2
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 claims description 2
- 241000243190 Microsporidia Species 0.000 claims description 2
- 241000187654 Nocardia Species 0.000 claims description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940041009 monobactams Drugs 0.000 claims description 2
- 229930189801 nocardicin Natural products 0.000 claims description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 claims description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 claims description 2
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims 2
- BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N (6r,7r)-7-amino-3-(hydroxymethyl)-8-oxo-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylic acid Chemical compound S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@H]21 BQIMPGFMMOZASS-CLZZGJSISA-N 0.000 claims 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 claims 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims 1
- BQIMPGFMMOZASS-UHFFFAOYSA-N beta-amino-3-hydroxymethyl-3-cefem-4-carboxylic acid Natural products S1CC(CO)=C(C(O)=O)N2C(=O)C(N)C21 BQIMPGFMMOZASS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 claims 1
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 claims 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 79
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 69
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 33
- 102000005870 Coenzyme A Ligases Human genes 0.000 description 32
- 108010011449 Long-chain-fatty-acid-CoA ligase Proteins 0.000 description 32
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 24
- SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N phenoxyacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)COC1=CC=CC=C1 SBPBPUFWNOBPMN-CECATXLMSA-N 0.000 description 24
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 description 22
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 17
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 16
- ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N Phenylacetyl coenzyme A Natural products S(C(=O)Cc1ccccc1)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C ZIGIFDRJFZYEEQ-ZBWAGTGGSA-N 0.000 description 15
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 15
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 14
- 108010012172 isopenicillin N synthetase Proteins 0.000 description 14
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 14
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BYEIJZFKOAXBBV-ATZCPNFKSA-N N-[(5S)-5-amino-5-carboxypentanoyl]-L-cysteinyl-D-valine Chemical compound CC(C)[C@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O BYEIJZFKOAXBBV-ATZCPNFKSA-N 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 12
- ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N phenylacetyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC1=CC=CC=C1 ZIGIFDRJFZYEEQ-CECATXLMSA-N 0.000 description 12
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 11
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 11
- 108010049926 Acetate-CoA ligase Proteins 0.000 description 10
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 10
- 102000008146 Acetate-CoA ligase Human genes 0.000 description 9
- 229940100228 acetyl coenzyme a Drugs 0.000 description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 9
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 9
- 241000228245 Aspergillus niger Species 0.000 description 8
- MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N Isopenicillin N Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(NC(=O)CCCC(N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N isopenicillin N Chemical compound OC(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H](NC(=O)CCC[C@H](N)C(O)=O)C(=O)N21 MIFYHUACUWQUKT-GTQWGBSQSA-N 0.000 description 8
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 6
- 240000006439 Aspergillus oryzae Species 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 5
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010073178 Glucan 1,4-alpha-Glucosidase Proteins 0.000 description 5
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 5
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 2-[2-[2-[[2-[[4-[[2-[[6-amino-2-[3-amino-1-[(2,3-diamino-3-oxopropyl)amino]-3-oxopropyl]-5-methylpyrimidine-4-carbonyl]amino]-3-[(2r,3s,4s,5s,6s)-3-[(2s,3r,4r,5s)-4-carbamoyl-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)- Chemical compound N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(C)=O)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(O[C@H]1[C@@]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)(C)O[C@H]1[C@@H]([C@](O)([C@@H](O)C(CO)O1)C(N)=O)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C QRBLKGHRWFGINE-UGWAGOLRSA-N 0.000 description 4
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 4
- LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N Phleomycin Natural products N=1C(C=2SC=C(N=2)C(N)=O)CSC=1CCNC(=O)C(C(O)C)NC(=O)C(C)C(O)C(C)NC(=O)C(C(OC1C(C(O)C(O)C(CO)O1)OC1C(C(OC(N)=O)C(O)C(CO)O1)O)C=1NC=NC=1)NC(=O)C1=NC(C(CC(N)=O)NCC(N)C(N)=O)=NC(N)=C1C LTQCLFMNABRKSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010035235 Phleomycins Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108010049411 alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase Proteins 0.000 description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 4
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N cephalosporin C Chemical compound S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCC[C@@H](N)C(O)=O)[C@@H]12 HOKIDJSKDBPKTQ-GLXFQSAKSA-N 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 4
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 4
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 4
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 101710104123 Deacetoxycephalosporin C synthase Proteins 0.000 description 3
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102100022624 Glucoamylase Human genes 0.000 description 3
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 3
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 3
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 3
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 3
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N cibacron blue Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S(O)(=O)=O YKCWQPZFAFZLBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 125000003651 hexanedioyl group Chemical group C(CCCCC(=O)*)(=O)* 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 3
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 3
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 3
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 3
- 229910052727 yttrium Inorganic materials 0.000 description 3
- VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N yttrium atom Chemical compound [Y] VWQVUPCCIRVNHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ACAZKHULUUVWCY-JFGNBEQYSA-N (2s,5r,6r)-6-(hexanoylamino)-3,3-dimethyl-7-oxo-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptane-2-carboxylic acid Chemical compound S1C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC)[C@H]21 ACAZKHULUUVWCY-JFGNBEQYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical group OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PKGWLCZTTHWKIZ-UHFFFAOYSA-N 4-Hydroxypheoxyacetate Chemical compound OC(=O)COC1=CC=C(O)C=C1 PKGWLCZTTHWKIZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000193744 Bacillus amyloliquefaciens Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 108091005658 Basic proteases Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001137251 Corvidae Species 0.000 description 2
- 241000193385 Geobacillus stearothermophilus Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 2
- 241000207439 Myra Species 0.000 description 2
- 101710197954 N-(5-amino-5-carboxypentanoyl)-L-cysteinyl-D-valine synthase Proteins 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 108010085186 Peroxisomal Targeting Signals Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 101000968489 Rhizomucor miehei Lipase Proteins 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 2
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N adenosine monophosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(CO)C(OP(O)(O)=O)C1O LNQVTSROQXJCDD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N adipoyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 SPNAEHGLBRRCGL-BIEWRJSYSA-N 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 101150097026 facA gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 101150021650 gluA gene Proteins 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N hexanoyl-coenzyme a Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@@](O)(=O)OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CCCCC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 OEXFMSFODMQEPE-CGSNXLPNSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 2
- 210000002500 microbody Anatomy 0.000 description 2
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical class CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000019525 primary metabolic process Effects 0.000 description 2
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 2
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 229960004295 valine Drugs 0.000 description 2
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000001602 (E)-hex-3-enoic acid Substances 0.000 description 1
- LCPDWSOZIOUXRV-WGGUOBTBSA-N 2-((114C)cyclohexatrienyloxy)acetic acid Chemical compound O([14C]1=CC=CC=C1)CC(=O)O LCPDWSOZIOUXRV-WGGUOBTBSA-N 0.000 description 1
- UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 5,8-dihydroxy-2-methoxy-6-methyl-7-(2-oxopropyl)naphthalene-1,4-dione Chemical compound CC1=C(CC(C)=O)C(O)=C2C(=O)C(OC)=CC(=O)C2=C1O UHPMCKVQTMMPCG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001019659 Acremonium <Plectosphaerellaceae> Species 0.000 description 1
- 241000186046 Actinomyces Species 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 102100034042 Alcohol dehydrogenase 1C Human genes 0.000 description 1
- WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N Alpha-lactose monohydrate Chemical compound O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O WSVLPVUVIUVCRA-KPKNDVKVSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241001513093 Aspergillus awamori Species 0.000 description 1
- 235000002247 Aspergillus oryzae Nutrition 0.000 description 1
- 241000193752 Bacillus circulans Species 0.000 description 1
- 241000193749 Bacillus coagulans Species 0.000 description 1
- 241000193422 Bacillus lentus Species 0.000 description 1
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 1
- 108010029675 Bacillus licheniformis alpha-amylase Proteins 0.000 description 1
- 241000194107 Bacillus megaterium Species 0.000 description 1
- 241000194103 Bacillus pumilus Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000193388 Bacillus thuringiensis Species 0.000 description 1
- 241000149420 Bothrometopus brevis Species 0.000 description 1
- 101100280051 Brucella abortus biovar 1 (strain 9-941) eryH gene Proteins 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- XXHDAWYDNSXJQM-UHFFFAOYSA-N Chloride-3-Hexenoic acid Natural products CCC=CCC(O)=O XXHDAWYDNSXJQM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- 101000796894 Coturnix japonica Alcohol dehydrogenase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101710095468 Cyclase Proteins 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-SCSAIBSYSA-N D-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- LJCWONGJFPCTTL-SSDOTTSWSA-N D-4-hydroxyphenylglycine Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]([NH3+])C1=CC=C(O)C=C1 LJCWONGJFPCTTL-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- 102100037458 Dephospho-CoA kinase Human genes 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010268 HPLC based assay Methods 0.000 description 1
- 101100295959 Halobacterium salinarum (strain ATCC 700922 / JCM 11081 / NRC-1) arcB gene Proteins 0.000 description 1
- 101000780463 Homo sapiens Alcohol dehydrogenase 1C Proteins 0.000 description 1
- 101000952691 Homo sapiens Dephospho-CoA kinase Proteins 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 108030003691 Isopenicillin-N synthases Proteins 0.000 description 1
- OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N L-2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N L-cysteinylglycine Chemical compound SC[C@H]([NH3+])C(=O)NCC([O-])=O ZUKPVRWZDMRIEO-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 108010047290 Multifunctional Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000006833 Multifunctional Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101100235161 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) lerI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 description 1
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000194109 Paenibacillus lautus Species 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 1
- QRLCJUNAKLMRGP-ZTWGYATJSA-N Penicillin F Chemical compound S1C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)C/C=C/CC)[C@H]21 QRLCJUNAKLMRGP-ZTWGYATJSA-N 0.000 description 1
- QRLCJUNAKLMRGP-UHFFFAOYSA-N Penicillin F Natural products S1C(C)(C)C(C(O)=O)N2C(=O)C(NC(=O)CC=CCC)C21 QRLCJUNAKLMRGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XVASOOUVMJAZNJ-MBNYWOFBSA-N Penicillin K Chemical compound S1C(C)(C)[C@H](C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCCCC)[C@H]21 XVASOOUVMJAZNJ-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920001030 Polyethylene Glycol 4000 Polymers 0.000 description 1
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 241000235403 Rhizomucor miehei Species 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 241001468239 Streptomyces murinus Species 0.000 description 1
- 101150033985 TPI gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 Chemical group [CH2]C(=O)C1=CC=CC=C1 XAKBSHICSHRJCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LUCKFPBUROIZRT-BLPRJPCASA-N [Na].CC(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1OP(O)(O)=O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS Chemical compound [Na].CC(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@H]1O[C@H]([C@H](O)[C@@H]1OP(O)(O)=O)n1cnc2c(N)ncnc12)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCS LUCKFPBUROIZRT-BLPRJPCASA-N 0.000 description 1
- 108010048241 acetamidase Proteins 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 101150050414 acuA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010013491 acyl-CoA-6-aminopenicillanic acid acyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L adenosine triphosphate disodium Chemical compound [Na+].[Na+].C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O TTWYZDPBDWHJOR-IDIVVRGQSA-L 0.000 description 1
- PWAXUOGZOSVGBO-UHFFFAOYSA-N adipoyl chloride Chemical compound ClC(=O)CCCCC(Cl)=O PWAXUOGZOSVGBO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150069003 amdS gene Proteins 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 101150008194 argB gene Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940072107 ascorbate Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VEVJTUNLALKRNO-TYHXJLICSA-N benzoyl-CoA Chemical compound O=C([C@H](O)C(C)(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O1)N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1)OP(O)(O)=O)C)NCCC(=O)NCCSC(=O)C1=CC=CC=C1 VEVJTUNLALKRNO-TYHXJLICSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000001311 chemical methods and process Methods 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 1
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 108010061330 glucan 1,4-alpha-maltohydrolase Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N heptanoic acid group Chemical group C(CCCCCC)(=O)O MNWFXJYAOYHMED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000710 homodimer Substances 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000000760 immunoelectrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 229960001021 lactose monohydrate Drugs 0.000 description 1
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 101150039489 lysZ gene Proteins 0.000 description 1
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 1
- WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L magnesium sulfate heptahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[O-]S([O-])(=O)=O WRUGWIBCXHJTDG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 150000004667 medium chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 description 1
- 108010090409 novozym 234 Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940124588 oral cephalosporin Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I pentasodium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O HWGNBUXHKFFFIH-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005222 photoaffinity labeling Methods 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 235000015497 potassium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000028 potassium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011736 potassium bicarbonate Substances 0.000 description 1
- TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M potassium hydrogencarbonate Chemical compound [K+].OC([O-])=O TYJJADVDDVDEDZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N propionyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 QAQREVBBADEHPA-IEXPHMLFSA-N 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 description 1
- 230000012846 protein folding Effects 0.000 description 1
- 101150054232 pyrG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000018406 regulation of metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000016515 regulation of signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000009938 salting Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000019832 sodium triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 101150080369 tpiA gene Proteins 0.000 description 1
- XXHDAWYDNSXJQM-ONEGZZNKSA-N trans-hex-3-enoic acid Chemical compound CC\C=C\CC(O)=O XXHDAWYDNSXJQM-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- VITRLXDSBBVNCZ-UHFFFAOYSA-K trichloroiron;hydrate Chemical compound O.Cl[Fe](Cl)Cl VITRLXDSBBVNCZ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- KIRKGWILHWJIMS-UHFFFAOYSA-K trisodium;1-amino-4-[4-[[4-chloro-6-(2-sulfonatoanilino)-1,3,5-triazin-2-yl]amino]-3-sulfonatoanilino]-9,10-dioxoanthracene-2-sulfonate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S([O-])(=O)=O)C=C1NC(C=C1S([O-])(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC=C1S([O-])(=O)=O KIRKGWILHWJIMS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 150000004669 very long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P35/00—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin
- C12P35/04—Preparation of compounds having a 5-thia-1-azabicyclo [4.2.0] octane ring system, e.g. cephalosporin by acylation of the substituent in the 7 position
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P37/00—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin
- C12P37/04—Preparation of compounds having a 4-thia-1-azabicyclo [3.2.0] heptane ring system, e.g. penicillin by acylation of the substituent in the 6 position
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
A találmány béta-laktám antibiotikumok bioszintézisére vonatkozik. Pontosabban, a találmány béta-laktám antibiotikumo in vivő és in vitro termelési eljárásaira vonatkozik.
A találmány további tárgyát képezi egy új enzim, amely előnyösen használható béta-laktám antibiotikumok bioszintézisében. A találmány egy olyan DNS szerkezetre is vonatkozik, amely az emített új enzimet kódolja, továbbá egy rekombináns vektorra vagy transzformációs plazmidra, amely az említett DNS szerkezetet tartalmazza, és végül egy sejtre, amely az említett DNS szerkezetet vagy rekombináns vektort tartalmazza.
A penicillin bioszintézisének folyamata.
A penicillin bioszintézisének első lépését a δ- (L-ce-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin (ACV) tripeptid L-α-amino-adipinsavból, L-ciszteinből és L-valinból való képződése alkotja. [Fawcett et al., Biochem.J., 157, 651-660 (1976)]. A reakciót egy multifunkcionális enzim, a δ-(L-a-araino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin szintetáz (ACV) szintetáz) katalizálja ATP és Mg2+ ionok, mint kofaktorok jelenlétében [Bankó et al., J.Am. Chem. Soc., 109, 2858-2860 (1987)].
Az ACV szintetázt Aspergillus nidulans-ból [Van Liempt et al., J.Bioi.Chem., 264, 3680-3684 (1989)], Cephalosporium acremonium-ból [Baldwin et al. , J.Antibiot. , 43 , 1055-1057 (1990)] és Streptomyces elavuligerus-bői [Jensen et al., J. Bacteriol., 172, 7269-7271 (1990), Zhang et al., Biotechnoi. Lett., 12., 649-654 (1990)] tisztították. Az ACV szintetáz Penicillium chrysogenumból való tisztítását eddig nem publikálták. A P.chrysogenumból származó ACV szintetázt azonban Diez r
>
és munkatársai klónozták [Diez et. al., J. Bioi. Chem., 265, 16358-16365 (1990) ] .
Az ACV lineáris tripeptid izopenicillin N-né (IPN) alakul át izopenicillin N szintetáz [cikiáznak vagy izopenicillin N szintetáznak (IPNS) is nevezik], vas ionok, oxigén és egy elektrondonor (például aszkorbát) jelenlétében. Izopenicillin N szintetázt először Ramos és munkatársai [Ramos et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 27, 380-387 (1985)] izoláltak
P.chrysogenumból, és a P.chrysogenumból származó izopenicillin N szintetáz strukturális gént Carr és munkatársai [Carr et al., Gene, 48, 257-266 (1986)] klónozták.
A penicillint és cefalosporint termelő gombákban és baktériumokban a penicillinek bioszintézisének ez a két első lépése közös.
Bizonyos gombákban, például a P.chrysogenumban és az A.nidulansban az izopenicillin N a-amino-adipil oldallánca intracelluláris eredetű vagy kívülről bevitt más oldalláncokkal helyettesíthető. A cserét egy aciltranszferáz enzim (további elnevezése: acil-koenzim A:izopenicilillin N aciltranszferáz vagy acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz) katalizálja. Ma még nem világos, hogy vajon ez a konverzió in vivő két lépésben zajlik-e, amikoris először az L-a-amino-adipil oldallánc hasad le 6-amino-penicillinsav (6-APA) keletkezése mellett, amelyet az acilező lépés követ, vagy pedig a konverzió az oldalláncok közvetlen kicserélődéséből áll. A
P.chrysogenum-ból tisztított aciltranszferáznak izopenicillin-N-amidohidroláz aktivitása és acil-koenzim A:6-amino-penicil• · • · • · linsav aciltranszferáz aktivitása is van [Alvarez et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987)].
Az ACV szintetázt (pcbAB), izopenicillin N szintetázt (pcbC) és acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt (penDE) kódoló gének a P.chrysogenum-ban és az A.nidulansban ugyanabban a csoportban (cluster) helyezkednek el [Diez et al., J.Bioi.Chem., 265, 16358-16365 (1990); Smith et al.,
Bio/Technology, 8., 39-41(1990)].
A P.chrysogenum pcbC-penDE géncsoport (cluster) — amely az izopenicillin N szintázt (IPNS), illetve aciltranszferázt (AT) kódolja — sokszorozása (amplifikációja) a termelés kihozatalában mintegy 40 %-os javulást eredményezett [Veenstra et al. , J.Biotechnoi. , 17. 81-90 (1991)]. Ugyancsak közölték, hogy azokban a transzformált A.nidulans sejtekben, amelyek a PcbAB gén [ACV szintetáz (ACVS) kódoló gén] és a pcbC gén [izopenicillin N szintetáz (IPNS) kódoló gén] többszörös másolatát tartalmazzák, megnövekedett az antibiotikum kihozatal [McCabe et al. , J.Biotechnoi. , 17, 91-97 (1991)].
Az EP 200 425 számú európai szabadalmi leírás (Eli Lilly) izopenicillin N szintetázt (IPNS) kódoló vektorokat ismertet.
A vektorok C.acremonium-ban és E.coli-ban az IPNS magas szintű expressziójára képesek. A leírás szerint a Cephalosporium vektorok jól használhatók a törzsek javítására, abból a célból, hogy a penicillin és cefalosporin antibiotikumok termelésére végzett fermentációk hatékonysága és kitermelése megnövekedjék. A vektorokat módosíthatjuk is, hogy olyan vektorokhoz jussunk, amelyek a P.chrysogenum, Streptomyces elavuligerus, stb. fermentációja esetén növelik a termelés kihozatalát és eredményességét.
Az EP 357 119 számú európai szabadalmi leírás (Gist Brocades) az IPNS-t, AT-t és ACVS-t kódoló antibiotikus bioszintetikus géncsoportot ismerteti, amelyet eredményesen használtak az antibiotikumok mikroorganizmusokban való termelésének a javítására és más olyan gének izolálására, amelyek résztvesznek az antibiotikum bioszintézisben. A találmány a penicillin P.chrysogenum-ban elért eredményesebb termelését, egy másik bioszintetikus géncsoport izolálását és a penicillin bioszintetikus géncsoport Acremonium ahrysogenum-ban való expresszióját írja le.
Az oldallánc aktiválása.
Annak érdekében, hogy az aciltranszferázzal katalizált reakcióban az α-amino-adipinsav oldallánc kicserélődjék, az új oldallánc karbonsav csoportjának aktiválódnia kell. Ez az aktiválás a penicillinek bioszintézisének egyik legkevésbé érthető része. Két elmélet van forgalomban:
A legszélesebb körben elfogadott elmélet szerint az enzim a karbonsavak koenzim A tioészterekké való észtereződését katalizálja egy két-lépéses mechanizmus révén, amely az ATP (adenozin-trifoszfát) pirofoszforolízisén keresztül megy végbe magnézium ionok jelenlétében. Először a karbonsav (az új oldallánc), az ATP és az enzim komplexet alkot, amely egy acil-AMP-enzim komplex. Másodszor, ez a komplex a koenzim Aval reagál, és így felszabadul az acil-koenzim A és az AMP (adenozin-monofoszfát) .
·· · · • · f I
A másik elmélet egy acil-S-glutation köztitermék képződését veszi alapul, amely a megfelelő acil-koenzim A-észterré transzformálható [Ferrero et al. , J.Antibiot., 43., 684-691 (1990)].
Egy P.chrysogenum-ból származó fenacil:koenzim A ligáz képes katalizálni a fenoxi-acetil-koenzim A és fenil-acetil-koenzim A szintézisét ATP, magnézium ion, koenzim A és fenoxi-ecetsav vagy fenil-ecetsav jelenlétében [lásd: Brunner, Röhr, Zinner, Hoppé-Seyler1s Z.Physiol.Chem., 349, 95-103 (1968); Brunner, Röhr, Methods Enzymol., 43, 476-481 (1975);
Kogekar, Deshpande, Ind. J. Biochem. Biophys., .19, 257-261 (1982); Kurzatkowski, Med. Dosw.Mikrobiol, 33., 15-29 (1981)].
Brunner és munkatársai szerint a ligáz hasonló erősségű aktivitást mutat a fenil-ecetsawal, a fenoxi-ecetsavval és az ecetsawal szemben. Az enzimet azonban soha nem tisztították homogenitásig.
Martinez-Blanco és munkatársai [J.Bioi.Chem., 267, 5474-5481 (1992)] leírtak egy P.chrysogenum Wis 54-1255 törzsből származó olyan acetil-koenzim A szintetázt, amely nemcsak az ecetsavat, hanem a fenil-ecetsavat is elfogadja szubsztrátumként a megfelelő acil-koenzim A észterek szintézisében, éppen úgy, mint a Brunner és munkatársai által leírt ligáz. Martinez-Blanco és munkatársai azonban nem írtak a fenoxi-ecetsavval szembeni aktivitásról. Martinez-Blanco és munkatársai szerint az acetil-koenzim A szintetáz egy homo-dimer («2), amelynek a molekulatömege gélszűréssel meghatározva 139 000 dalton, SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis) módszerrel meghatározva 70 000 dalton, izoelektromos pontja pH 5,6 és 6,0 közé esik.
A Martinez-Blanco és munkatársai féle acetil-koenzim A szintetázt kódoló gént Martinez-Blanco és munkatársai vizsgálták [Martinez-Blanco et al., Gene, 130, 265-270 (1993)]. Ez a gén, amelynek acuA elnevezést adtak, öt intront tartalmaz, és egy 669 aminosavból álló polipeptidet kódol. A polipeptid molekulatömege 74 287.
Gouka és munkatársai [Gouka et al., Appl.Microbiol.Biotechnol. , 38., 514-519 (1993)] és Van Hartingsveldt és munkatársai (WO 92/070709) leírták, hogy egy P.chrysogenum-ból származó acetil-koenzim A szintetáz gént (facA) izoláltak, amelynek meghatározták a szekvenciáját, és megállapították, hogy ez egy 669 aminosavból álló proteint kódol, amely körülbelül 74 000 dalton molekulatömegnek felel meg (az egyes aminosavakra 110 g/M átlag molekulatömeget számítva). A Gouka és munkatársai féle facA gén és a Martinez-Blanco és munkatársai féle acuA gén génszekvenciái nem mutattak különbségeket.
Brunner és munkatársai és Kogekar és Deshpande az általuk leírt fenil-acetil-koenzim A ligázok részletes vizsgálatát nem közölték.
Az új oldallánc — aktivált formában — amely az a-amino-adipinsav oldalláncot fogja helyettesíteni az acil-transzferáz által katalizált reakcióban, koenzim A tioészter formában vagy más tioészter-formában lehet, minthogy más tioészterekről leírtak (mint például az acil-S-ciszteinil-glicinről és az acil-S-glutationról), hogy ezek aciltranszferáz szubsztrátumok.
További lehetőség, hogy a dipeptidet (ciszteinil-glicin) egy nem-enzimes reakcióban CoASH-val szubsztituálják, mielőtt ez belépne az aciltranszferáz reakcióba. [Ferrero et al., J.Biol. Chem., 265, 7084-7090 (1990)].
A tioészterek tionilcsoportja, mihely kialakult, gyorsan kicserélhető más tiolokra (ilyenek például a merkapto-etanol, az 1,4-ditio-treitol, ACV és koenzim A) egy nem-enzimes reakcióban .
A liqázokról általában.
A ligázok, azaz a 6.2.1. enzim alcsoportba tartozó sav-tiol-ligázok (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., 1992) — egyéb elnevezésük: acil-koenzim A szintetázok vagy acil-koenzim A tiokinázok — ATP és magnézium ionok jelenlétében egy karbonsavból és a koenzim A-ból acil-koenzim A tioészterek képződését katalizálják.
Különböző forrásokból számos ligázt vagy acil-koenzim A szintetázt azonosítottak. Ilyenek például az acetil-koenzim A szintetáz; propionil-koenzim A szintetáz [Groot, Biochim.Biophys.Acta, 441, 260-267 (1976)]; lutiril-koenzim A szintetáz [Wanders et al., J.Bioi.Chem., 240. 29-33 (1965)]; közepes-láncú és nagyon hosszú-láncú zsírsav-acil-koenzim A szintetázok [Waku, Biochim.Biophys Acta, 1124, 101-111 (1992) összefoglalás] ; benzoil-koenzim A ligáz Pseudomonas fajokból [Auburger, Appl.Microbiol.Biotechnoi., 37, 789-795 (1992)] és fenil -acetil -koenzim A ligázok[Martinez-Blanco et. al., J.Biol. Chem., 265, 7084-7090 (1990); Vitovski, FEMS Microbiol.Letters, 108, 1-6 (1993)]. A legtöbbjük széles szubsztrátum specifitás• · , t sál rendelkezik.
Az acil-koenzim A szintetázok (ligázok) a zsírsavak és az ecetsav primer métábólizmusának és az aromás savak lebomlásának első lépéseiben általában a kulcsenzimek szerepét töltik be, amikoris energiában gazdag tioészter kötés képzése révén aktiválják a karbonsav acilcsoportját.
Béta-laktámok in vivő termelése.
A legtöbb úgynevezett természetes béta-laktám (például penicillin DF, izopenicillin Ν, 6-APA, cefalosporin C, stb.) nem stabil, fermentléből nehezen tisztítható, antibiotikus hatása csak korlátozott, és/vagy alacsony kihozatallal termelheto.
A természetes béta-laktámok oldalláncainak például fenoxi -ecetsawal vagy fenil-ecetsavval való helyettesítése olyan penicillinek (penicillin V, illetve penicillin G) képződését eredményezi, amelyek stabilabbak, könnyebben izolálhatok, és magasabb az antibiotikus aktivitásuk.
A közvetlenül fermentált penicillinek közül ipari jelentősége csak a penicillin V-nek és a penicillin G-nek van, ezeket úgy állítják elő, hogy a fermentorba fenoxi-ecetsavat, illetve fenil-ecetsavat adagolnak. Amennyiben a P.chrysogenum fermentálása folyamán más prekurzorokat, például 2-tiofén-ecetsavat vagy 3-tiofén-ecetsavat adagolunk, más penicillinek képződnek. Bizonyos adagolt rekurzorok, például az 1-fenil-alkánok vagy az 1-fenoxi-n-alkánok részben metabolizálódhatnak a P.chrysogenum sejtekben, mielőtt a penicillin termelésben az aciltranszferáz szubsztárumaiként lennének használhatók [Szarka « ·
et al. , Advances in Biotechnology, 3., 167-173 (1980); Szarka et. al., US 4,250,258; Szarka et al., US 4,208,481]. Az úgynevezett természetes penicillinek, például a penicillin DF, penicillin K, penicillin F és penicillin H bioszintézisében a hexánsav (kapronsav), oktánsav, a 3-hexénsav, illetve a heptánsav oldalláncok feltehetően a primer métábólizmusból származnak.
Bizonyos esetekben a fenoxi-acetil vagy a fenil-acetil oldallánc védőcsoportként szerepel a fermentáció és a béta-laktam izolálása folyamán, ugyanis az izolált penicillin V-t vagy G-t szerves kémiai vagy enzimes eljárással hidrolizálják, hogy 6-APA képződjék, amely ezután alap építőként szolgál az olyan új félszintetikus penicillinek számára, amelyek a természetes penicillinekkel, valamint a penicillin V-vel vagy G-vel összehasonlítva jobb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.
Hasonló a helyzet a cefalosporinok termelésénél. A természetes cefalosporinok gyógyászati értéke korlátozott, mivel ezeket is nehéz izolálni, és csak alacsony antibiotikus hatást fejtenek ki. Továbbá nehéz ezeket magasabb gyógyászati értékű új cefalosporinokká módosítani.
Számos lépést kell tenni annak érdekében, hogy a fermentált cafalosporint a kívánt antibiotikummá módosítsák, például az orális cefalosporinok — például ilyen a cefalexin és cefadroxil — termelésében a kiindulási pont a penicillin V vagy G, amelyet azután cefalosporinná módosítanak egy sor kémiai reakció segítségével, megtartva a fenoxi-acetil vagy fenil-acetil oldalláncot védőcsoportként. A gyűrű expanzió után V11
-DCA, illetve G-DCA (V/G-dezacetoxi-cefalosporánsav) keletkezik, majd az oldalláncot hidrolízissel távolítják el egy olyan eljárással, amely hasonló a penicillin V vagy G hidrolíziséhez. Végül új oldalláncot (például: D-fenil-glicin vagy D-p-hidroxi-fenil-glicin) adnak hozzá egy szerveskémiai eljárás segítségével .
A cefalosporinok cefalosporin C-ből való előállításánál a D-a-amino-adipinsav vagy kémiai hidrolízissel vagy két lépésben, szerves kémiai és enzimes eljárással távolítható el. A kapott 7-ACA-ból (7-amino-cefalosporánsav) ezután acilezéssel állítják elő a kívánt terméket.
Mind a V-DCA és G-DCA képződéséhez vezető reakciót, mind a cefalosporin C 7-ACA termékké való hidrolízisét ipari méretekben végzik. Ezek a reakciók azonban nehezen szabályozhatók, költségesek, és a kitermelések általában alacsonyak.
E probléma áthidalása érdekében számos alternatív megoldást javasoltak, amelyek közül néhány magába foglalta a P.chrysogenum transzformálását, például a Streptomyces-ből származó epimerázzal és expandázzal, mint ahogyan ezt C.Cantwell és munkatársai [C.Cantwell et al., 248, 283-289 (1992)] leírták. Kimutatták, hogy a transzformált P.chrysogenum képes dezacetoxi-cefalosporánsav termelésére. Azonban nem találtak V-DCA-t. Cantwell javasolta, hogy az expandázt géntechnológiai eljárással úgy módosítsák, hogy megváltozzon szubsztrátum specifitása, és fogadja el a penicillin V-t vagy G-t szubsztrátumként. Ezután a V/G-DCA közvetlenül, fermentációval termelhető .
··
- 12 S.Gutierrez és munkatársai [Mól.Gén.Génét., 225. 56-64 (1991)] a P.chrysogenum-ból származó aciltranszferázzal transzformálták a C.acremonium-ot, és ki tudták mutatni, hogy a transzfromáit C.acremonium penicillin G-t termel, de nem tudták bizonyítani a G-DCA jelenlétét.
Az EP 532341 számú európai szabadalmi leírás (Merck and Co., Inc.) ismerteti az adipoil-7-ADCA (adipoil-7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav) fermentációval való előállítását Streptomyces clavuligerus-ból származó expandázzal transzformáit P.chrysogenum használatával. Az adipoil-7-ADCA a fermentléből extrahálható, majd például egy Pseudomonas eredetű adipoil-acilázzal hidrolizálható.
Az ES 2,016,476 számú spanyolországi szabadalmi leírás a fenil-acetil-koenzim A és a benzil-penicillin (penicillin G) in vitro biokémiai előállítását tárgyalja. A fenil-acetil-koenzim A-t úgy állítják elő, hogy a Pseudomonas putida-ból származó fenil-acetil-koenzim A ligázt ATP-vel, koenzim A-val, fenil-ecetsavval, és magnézium-kloriddal inkubálják 10-45 °C és pH 5-10 között 10-180 percig. A benzil-penicillint úgy állítják elő, hogy a fenil-acetil-koenzim A ligázt és a Penicillium chrysogenum eredetű acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt 6-amino-penicillinsawal, fenil-ecetsavval, ATP-vel, koenzim A-val és magnézium-kloriddal inkubálják
10-40 °C és pH 5,5 - 9 között 30-180 percig.
Az ES 2,033,590 számú spanyolországi szabadalmi leírás benzil-penicillinből (penicillin G) származó különböző penicillinek in vitro termelését írja le. A termelést úgy végzik, ···· ··
- 13 hogy egy enzimrendszert — amely Pseudomonoas putida eredetű fenil-acetil-koenzim A ligázt és Penicillium chrysogenum eredetű acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt tartalmaz —, szuszbsztrátumokat — ilyenek a 6-amino-penicillinsav, ATP, koenzim A —, magnézium-kloridot, ditiotreitolt (DTT) és penicillin prekurzorokat inkubálnak.
A jelenlegi technika olyan eljárásokat alkalmaz bizonyos penicillinek és cefalosporinok termeléséhez, amelyek in vitro lépéseket tartalmaznak. A legtöbb eljárást nehéz ellenőrizni, ezek az eljárások nehézkesek és/vagy költségesek.
A találmány tárgyát néhány fent leírt probléma megoldása képezi. A feladatot úgy teljesítjük, hogy a béta-laktám antibiotikumok termelésére javított eljárásokat bocsátunk rendelkezésre. Ezeket az eljárásokat fokozott ligáz aktivitás jelenléte jellemzi, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amely akkor van jelen, amikor csak az említett eredeti mikroorganizmussal végezzük a fermentálást az eredeti fermentációs feltételek mellett.
A találmány egy ligáz aktivitást kifejtő olyan űj enzimre is vonatkozik, amely erősen specifikus a fontos béta-laktám prekurzorokra, mint a fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav és adipinsav, de kevéssé specifikus az ecetsavra.
A találmány szerint ez az enzim a Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans vagy Cephalosporium acremonium fonalas gombákból nyerhető.
Az új enzim különböző béta-laktám antibiotikumok bioszintézisével kapcsolatosan használható.
- 14 A találmány további tárgyát egy olyan eljárás képezi, amely béta-laktám antibiotikumok in vitro termelésére szolgál.
Közreadunk egy olyan DNS szerkezetet is, amely az említett, ligáz aktivitást kifejtő új enzimet kódolja.
A találmány további tárgyát egy olyan rekombináns vektor vagy transzformáció hordozó képezi, amely az említett DNS szerkezetet tartalmazza.
A találmány egy olyan sejtre is vonatkozik, amely az említett DNS szerkezetet vagy az említett rekombináns vektort tartalmazza.
Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.
Az 1. ábra az ACV és izopenicillin Ν (IPN) koncentrációit ábrázolja a fermentáció időtartamának függvényében.
A 2. ábra a ligáz aktivitás pH optimumát mutatja be.
A 3. ábra a ligáz aktivitás hőmérséklet optimumát mutatja be.
Minthogy a béta-laktámok termelésénél a termelés gazdaságossága fontos tényező, igény merült fel olyan javított eljárások iránt, amelyek nagyobb fermentációs kitermelést biztosítanak, amelyeket könnyebb ellenőrizni, kevésbé nehézkesek, és ennek következtében kevésbé költségesek.
A találmány tárgyát képezi tehát, hogy a béta-laktám antibiotikumok termelésére ilyen javított eljárásokat bocsássunk rendelkezésre.
Ugyanakkor meglepő módon azt találtuk, hogy akkor juthatunk ilyen javított eljárásokhoz, ha a szóbanforgó béta-laktám antibiotikumok termelése fokozott ligáz aktivitás jelenlétében megy végbe.
• · ··» 9
- 15 A találmány szerint a béta-laktám antibiotikum termelést szolgáló javított eljárás a következő lépéseket tartalmazza:
i) olyan mikroorganizmust fermentálunk, amely képes az említett béta-laktám antibiotikum termelésére; és ii) az említett béta-laktám antibiotikumot lényegében tiszta formában izoláljuk, amennyiben az említett fermentáció fokozott ligáz aktivitás jelenlétében történik, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amelyet akkor kapunk, ha csak az eredeti mikroorganizmust fermentáljuk az eredeti fermentációs feltételek mellett.
A fokozott ligáz aktivitás azt jelenti, hogy a szóbanforgó karbonsav konverziója a megfelelő acil-koenzim A észterré fokozottabb, mint a módosítatlan, eredeti mikroorganizmus használata esetén és/vagy az eredeti fermentációs feltételek esetén .
A talámány egyik kiviteli alakja szerint az említett eredeti mikroorganizmus, amely képes béta-laktámok termelésére, nem, vagy csak igen alacsony ligáz aktivitást fejt ki.
A ligáz aktivitás okozott expressziója bármilyen alkalmas módon megvalósítható.
Egy találmány szerinti kiviteli alakban például a ligáz aktivitást úgy növelhetjük, hogy a fermentációs eljárás fizikai körülményeit — ilyen a hőmérséklet és a pH — moduláljuk. Egy másik lehetőség szerint a mikroorganizmust olyan vegyületek vagy szerek hatásának tesszük ki, amelyek fokozott ligáz expressziót eredményeznek. Az említett vegyületek vagy szerek jellege például a ligáz expressziójának megindításához hasz·· .··. ···:
·· . ·. ···· ·, nált promotertől függ. Ezenkívül a ligáz expressziót szabályozó sejtes szabályozó mechanizmusokba való beavatkozás révén érhetjük el a ligáz aktivitás expressziójának fokozását.
A találmány egy kiviteli formája szerint az említett ligáz aktivitáshoz vagy a fokozott ligáz aktivitáshoz az említett mikroorganizmus módosítása révén jutunk.
A módosítást jól ismert eljárásokkal végezhetjük, például úgy, hogy a fermentálandó, említett eredeti mikroorganizmusba egy olyan DNS szerkezet legalább egy másolatát vezetjük be, vagy egy olyan rekombináns vektort vezetünk be, amelyek ligáz aktivitású enzimet kódoló gént tartalmaznak.
Az egyik kiviteli alakban a ligáz aktivitást vagy fokozott ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus random vagy hely-specifikus mutagenezisével kapjuk meg.
A fokozott ligáz aktivitást eredményező említett módosítást ezenkívül a ligáz enzimben végrehajtott aminosav szubsztitúciókkal, deléciókkal vagy addiciókkal érhetjük el, mint alább leírjuk.
Az említett ligáz aktivitáshoz vagy fokozott ligáz aktivitáshoz másképpen úgy jutunk, hogy a béta-laktám antibiotikum termelés folyamán ligáz aktivitású enzimet adagolunk.
Egy alternatív kiviteli alakban az említett DNS szerkezet nem abból a mikroorganizmusból származik, amibe azt bevezetjük.
A DNS szerkezet vagy a transzformáció hordozó bevezetését jól ismert módszerekkel végezhetjük, mint alább leírjuk.
Bizonyos esetekben megkívánt, hogy egy béta-laktám teljes ·« ·
- 17 bioszintézisét, beleértve a ligáz aktivitású enzim expresszióját, más olyan mikroorganizmusba vigyük át, amely saját maga nem képes az említett béta-laktám termelésére. Ezt olyan esetben valósítjuk meg, amikor a recipiens (gazda) mikroorganizmus például 1) könnyebben transzformálható, 2) magas szinten képes kifejezni bioszintetikus enzimeket, 3) jobbak a növekedés jellemzői, vagy 4) kevesebb olyan szennyező anyagot termel, amely zavarná az izolálást. Ilyen esetben általában magasabb kitermelést kaphatunk egy béta-laktámból.
Kívánatos lehet, hogy egy mikroorganizmus új, alternatív bioszintetikus utakkal rendelkezzen.
A találmány szerint a fent említett recipiens vagy gazda mikroorganizmusokat a következő csoportból választjuk ki: Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, különböző Eubacteriumok, különböző Actinomycesek vagy fonalas gombák.
Az előnyös kiviteli alakban az említett mikroorganizmus a következő csoportból választott fajhoz tartozik: Penicillium chrysogenum, Pencillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans és Straptomyces clavuligerus.
A találmány egyik megvalósítási formájában az említett ligáz aktivitás expresszióját a béta-laktám bioszintetikus folyamat más génjeinek expressziójával szinkronzáltuk. Az említett gének például a pcbAB, pcbC és/vagy a penDE gének lehetnek .
A fent említett béta-laktám antibiotikumokat a penicil··>· «V ··»·
- 18 űriekből, cefalosporinokból, cefamicinekből, mono-baktámokból és nokardicinekből álló csoportból választjuk.
Az említett antibiotikum előnyösen egy cefalosporin vagy egy penicillin, például penicillin V, penicillin G, V-DCA, G-DCA, 7-(L-a-5-amino-karboxi-valeramido)-cefalosporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA, vagy adipoil-7-ACA.
A találmány egy kiviteli alakjában az említett mikroorganizmust az említett DNS szekvencia expressziójának indukálásához szükséges feltételek mellett tenyésztjük, amikoris aktivált koenzim A tioészter oldallánc termelődik, majd ezután egy aciltranszferáz (AT) enzim jelenlétében az említett oldalláncot tartalmazó béta-laktám képződik.
Az említett módosított mikroorganizmus tenyésztését előnyösen olyan feltételek mellett végezzük, amelyek az említett DNS szerkezet vagy rekombináns vektor kifejeződését indukálják, ennek eredményeként a kívánt béta-laktám antibiotikum oldalláncának megfelelő sav koenzim A-val alkotott tioésztere fokozott mértékben termelődik, ami viszont megnövelt átalakulási sebességet tesz lehetővé a béta-laktám bioszintézisének abban a lépésében, amelyben a béta-laktám oldallánc beépül a béta-laktám magba.
A mikroorganizmus tenyésztését még olyan körülmények között is végezhetjük, amelyek az említett ligáz expresszióját indukáló promotertől függenek.
A penicillin V vagy penicillin G termelés speciális eseteiben, ha a ligáz aktivitást például géntechnológia segítségével fokozzuk, ez intenzív metabolikus folyamathoz vezet a »·«* közé ···*
- 19 bioszintézis utolsó lépése folyamán.
A találmány szerint megjavított eljárások előnyei tartozik — először — egy olyan találmány szerinti eljárás, amely a szóbanforgó béta-laktám antibiotikum össz-kihozatalának lényeges megnövekedését eredményezi.
Másodszor, annak következtében, hogy kevesebb melléktermék képződik, a béta-laktám antibiotikumok lényegében tiszta formában való kinyerése és tisztítása könnyebbé válik.
Harmadszor, a találmány úgy teszi lehetővé a szóbanforgó béta-laktám antibiotikumok termelését, hogy nem képződik jelentős mennyiségű hulladék. Ennek következtében az eljárások sokkal hatékonyabbak, mivel több energia áll rendelkezésre a lényeges termékek szintetizálásához. A hulladék-termékek károsan befolyásolhatják a bioszintetikus folyamatot.
Negyedszer, a szóbanforgó béta-laktám antibiotikum kihozatala a fermentációs eljárás bármely időpontjában jelentősen nagyobb, mint az olyan mikroroganizmusokkal végzett fermentációs eljárásokban, amelyekből hiányzik az említett ligáz aktivitás, vagy amelyekben az említett ligáz aktivitás alacsony. Ebben az összefüggésben a kihozatal vagy össz-kihozatal lehet, vagy pedig egy bizonyos időtartam alatt elért kihozatal.
A fent említett előnyök az iparilag fontos béta-laktám antibiotikumok termelési eljárásait kevésbé költségessé teszik .
A penicillin V és penicillin G termelés eseteiben, ahol a fermentáció folyamán az ACV és izopenicillin N felszaporodása figyelhető meg, a ligáz aktivitás találmány szerinti fokozása az említett intermedier metabolitok felszaporodását, azaz amikor az izopenicillin N átalakulása (konverziója) penicillin V-vé szűk keresztmetszet, csökkenti.
Olyan mikroorganizmusokban, amelyekben alacsony vagy nincs ligáz aktivitás, a ligáz aktivitás találmány szerinti expressziójával vagy az említett ligáz aktivitás csekély fokozásával, például a penicillinek és cefalosporinok termelésekor keletkező felesleges béta-laktám antibiotikum intermedier oldalláncok nem-enzimes eltávolítása oldható meg.
A fermentált béta-laktámok kinyerését és az ezt követő enzimes hidrolízist megkönnyíthetjük, ha az úgynevezett természetes béta-laktámok oldalláncait hidrofób oldalláncokkal — ilyenek például a fenoxi-ecetsav vagy fenil-exetsav — helyettesítjük, amelyek enzimes hidrolízissel könnyen eltávolíthatók penicillin V acilázok vagy penicillin G acilázok használatával. Ezek az enzimek jól ismertek a béta-laktám iparban, a 6-APA termelésénél.
Ez tehát lehetőséget teremt bizonyos iparilag fontos béta-laktám intermedierek, mint a V-DCA és G-DCA in vivő termelésére .
A találmány szerint megállapítottuk, hogy bizonyos béta-laktám antibiotikumok termelését meg lehet oldani kizárólag enzimesen katalizált eljárásokkal, azaz kémiai eljárások használata nélkül.
A találmány egyik megvalósítási alakjában a V-DCA-t vagy G-DCA-t teljes egészében enzimes eljárással, in vivő termeljük úgy, hogy a gazda mikroorganizmust fokozott ligáz aktivitás expressziójára késztetjük a találmány szerint. Jelen vannak továbbá: egy aciltranszferáz (AT) (például a P.chrysogenum eredetű, acil-koenzim A:izopenicillin N aciltranszferáz) és olyan enzimek, amelyek a penicillineket át tudják alakítani cefalosporinokká (például az S.elavuligerus eredetű expandáz).
A találmány egy új enzimre is vonatkozik, amely a találmánynak megfelelően használható.
Nemrég egy ligáz aktivitású megfelelő új enzimet izoláltunk és jellemeztünk.
Ez az új, találmány szerinti enzim egy olyan acil-koenzim A szintetáz (ligáz), amely béta-laktám antibiotikumok termelése esetén a főtermék felé tolja el a reakció irányát.
A találmány szerinti enzim egyik jellemzője, hogy bizonyos iparilag fontos béta-laktám prekurzorokra erősen specifikus .
Minthogy a találmány szerinti ligáznak az ecetsavval szemben nincs nyilvánvaló aktivitása, nem valószínű, hogy a ligáz aktivitás fokozott expressziója az acetil-koenzim A — amely a primer metabolizmus egyik kulcsmetabolitja — intracelluláris hozzáférhetőségét zavarná. Tehát a primer metabolizmus káros befolyásolásának kockázata csökken, összehasonlítva az olyan manipulációkkal (például genetikai vagy kémiai manipulációkkal), amelyek egy olyan ligáz fokozott expressziójához vezetnek, amely mind az ecetsavval, mind a fenil-ecetsawal és/vagy a fenoxi-ecetsavval és/vagy adipinsawal szemben aktivitást fejt ki.
Pontosabban a találmány szerinti új enzim legalább 10-10022 szór, előnyösen 103-szor és előnyösebben 104-105-ször aktívabb a fenoxi-ecetsawal szemben, mint az ecetsavval szemben.
A találmány szerinti enzimnek a szubsztrát specifitása 10-100-szor, előnyösebben 103-szor és előnyösebben 104-105-ször erősebb a fenil-ecetsavra, mint az ecetsavra.
A találmány szerinti enzim — mint fentebb említettük — egy acil-koenzim A szintetáz, pontosabban egy fenoxi-acetil-koenczim A szintetáz, amelyet a következőkben ligáz-nak fogunk nevezni.
A ligáz katalitikusán aktív formájának a valószínű molekulatömege 40 000 és 60 000 dalton tartomány közt van, pontosabban körülbelül 50 000 dalton, gélszűréssel meghatározva.
A ligáz valószínű aktivitási optimuma pH 7,0 - 9,0 tartományban van, pontosabban pH 8,0 - 8,5 között. Az enzim in vitro csak alacsony aktivitást fejt ki pH 7 mellett vagy ez alatt, ami feltehetően annak tudható be, hogy a pH 7,5 alatt tartott ligáz stabilitása alacsony.
A ligáz aktivitás optimális hőmérséklete 35 °C és 45 °C közé esik, a legmagasabb aktivitást körülbelül 40 °C-nál fejti ki.
Úgy tűnik, a ligáz izoelektromos pontja (pl) magasabb, mint pH 7,25, valószínűleg pH 9 felett és körülbelül pH 12 alatt van.
Az enzim P.chrysogenum sejtkivonatokból tisztítható, például ammónium-szülfátos kicsapással és különböző géleket (például Phenylsepharose, Cibacron blue és Sephacryl S-200) tartalmazó oszlopokból való elucióval. A ligáz tisztítására alább ismertetünk egy példát. Azonban a proteinek tisztítására használt más, jól ismert eljárások szintén alkalmazhatók, például más oszlop-töltetek is használhatók, ilyenek a Reactiv Red, Sepharose Q FF és Sepharose S FF.
Kimutatták a találmány szerint, hogy az említett ligáz a fenoxi-acetil-koenzim A, fenil-acetil-koenzim A, adipoil-koenzim A és hexanoil-koenzim A képződését képes katalizálni magnézium ionok, ATP, CoASH és fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav, adipinsav, illetve hexánsav elegyéből. Ugyanilyen rendszerekben vizsgálva (például ahogyan alább a példákban leírjuk), a ligáz egyáltalán nem mutat szignifikáns aktivitást az ecetsawal szemben.
Az enzim in vitro nem stabil, de ATP, Mg+2 és merkapto-etanol, ditiotreitol (DTT), aszkorbinsav vagy más redukáló szerek hozzáadása jelentékenyen stabilizálja az aktivitást a tisztítás és tárolás alatt. Ammónium-szulfát magas koncentrációjának vagy a glicerinnek a jelenléte szintén stabilizálja az enzimet.
A CoASH fogyáson alapuló vizsgálatban a fenil-ecetsawal szembeni aktivitás megközelítőleg 80 %-a a fenoxi-ecetsawal szembeni aktivitásnak, a 6. példában alább leírt teszt feltételek mellett.
Csak akkor figyeltünk meg direkt fenoxi-acetil-koenzim A szintetikus aktivitást, ha más tiolok (például merkapto-etanol, ditiotreitol) nélkül végeztük a vizsgálatot. Viszont, ha a ligázt ATP, Mg2+, CoASH, fenoxi-ecetsav és például merkapto-etanol elegyével inkubáltuk, egy olyan vegyület keletkezett, ·· ···· ·· · · · · · • · ····· ·
amelynek ugyanolyan UV spektruma volt, mint a fenoxi-ecetsav és a merkapto-etanoltio észterének —fenoxi-acetil-S-CH2-CH3— és ez szintén úgy viselkedhet, mint egy acil-transzferáz (AT) szubsztrátum.
A találmány egy kiviteli alakjában az említett enzim immunreakciót ad egy Penicillium chrysogenum BIO törzsből származó, találmány szerint tisztított ligázzal szemben termelt antitesttel.
Az enzim immunkémiai tulajdonságait immunológiai keresztaktív azonossági vizsgálatokkal határozhatjuk meg. Az azonossági vizsgálatokat a jól ismert Ouchterlony féle kettős immundiffúziós eljárással vagy a tandem keresztezett immunelektroforézissel végezhetjük el [Lásd: N.H.Axelsen, Handbook of Immunoprecipitationin-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publication, 5. és 14. fejezet (1983)]. Az antigén azonosság (antigenic identity) és részleges antigén azonosság (partial antigenic identity) kifejezések értelmezése ugyanebben a kiadványban, az 5., 19. és 20.fejezetben található.
A találmány szerinti enzim egy polipeptid.
A találmány szerinti megfogalmazásban a találmány szerinti enzimek közé érett proteinek, ezek prekurzor formái és olyan működőképes fragmentumai tartoznak, amelyeknek az aktivitása lényegében megegyezik a teljes hosszúságú polipeptidekével.
Megfelelnek a találmánynak az említett enzimek homológjai is. Az ilyen homológok olyan aminosavszekvenciát tartalmaznak, amelynek az azonossági foka a találmány szerinti enzim amino• · ···· ·· · ···· ·· ····· · • · · · · · • · · « ·· ·· ·· ·· savszekvenciájához képest legalább 50-70 %-os, előnyösebben 70-80 %-os, még előnyösebben 100 %-os.
Az azonossági fok hagyományos módszerekkel határozható meg [lásd például: Altshul et al. , Bull .Math.Bio. , 48., 603-616 (1986); Henikoff and Henikoff, Proc . Natl .Acad. Sci . , .89, 10915-10919 (1992)]. Röviden: két aminosavszekvenciát úgy igazítunk egymás mellé, hogy 10-es gab opening penalty, 1-es gap extension penalty értéket és a Henikoff and Henikoff féle blosum 62 számító mátrixot használva az igazodási optimálisak legyenek.
A találmány szerinti enzimnek egy olyan polipeptid is lehet a homológja, amelyet az említett, ligáz aktivitású enzim nukleotid szekvenciájának alapján készített oligonukleotid szondával hibridizáló nukleotid szekvencia kódol.
Azokat a molekulákat, amelyekhez ilyen körülmények között hibridizál az oligonukleotid szonda, standard eljárásokkal (például Southern blotting) mutatjuk ki.
A találmány szerinti polipeptid homológjai egy vagy több aminosavra kiterjedő szubsztitúciókat, deléciókat vagy addíciókat tartalmazhatnak. Előnyös, ha ezek a változások csak kisebb mértékűek, azaz olyan konzervatív aminosav szubsztitúciók, amelyeknek nincs káros hatása a protein felgombolyodottságára vagy aktivitására; olyan kis deléciók, amelyek általában körülbelül 1-30 aminosavat érintenek; az amino- vagy karboxi-terminális végeken csekély mértékű meghosszabbítások, ilyen egy amino-terminális metionincsoport, egy kis linker peptid, amely körülbelül 20-25 csoportból áll, vagy egy kis meghosz• · ···· ·· « ···· ·· ····· · • * · · · · ···· · · ·· ·· · · szabbítás, amely megkönnyíti a tisztítást; ilyen egy polihisztin szakasz, egy antigén epitóp vagy egy kötő dómén. Lásd általánosságban: Ford et al., Protein Expression and Purification, 2, 95-107 (1991). A konzervatív szubsztitúciókat például a bázikus aminosavak (arginin, hisztidin, lizin), savas jellegű aminosavak (glutaminsav, aszparaginsav), poláris aminosavak (glutamin, aszparagin), hidrofób aminosavak (leucin, izoleucin, valin), aromás aminosavak (fenilalanin, triptofán, tirozin) és a rövid láncú aminosavak (glicin, alanin, szerin, treonin, metionin) csoportjain belül végezzük.
A szakmában járatos szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az ilyen szubsztitúciókat a molekula funkciója szempontjából kritikus területeken kívül lehet csak végrehajtani, amelyek még aktív enzimet eredményeznek. A találmány szerinti enzim aktivitása szempontjából esszenciális aminosavak, amelyek nem képezhetik szubsztitúció tárgyát, a szakterület ismert eljárásai szerint azonosíthatók, ilyen például a helyre irányuló mutagenezis vagy az alanine-scanning mutagenezis [Cunningham and Wells, Science, 244, 1081-1085 (1989)]. Ez utóbbi technika szerint a molekula minden csoportjánál mutatációkat visznek be, és a kapott mutáns molekulát biológiai aktivitásra tesztelik (például ligáz aktivitásra), hogy meghatározzák azokat az aminosav csoportokat, amelyek a molekula aktivitására nézve kritikusak. A ligandum - receporo kölcsönhatás helyeit is meg lehet határozni kristályszerkezet analízissel, ilyen technika a magmágneses rezonancia, krisztallográfia vagy a fotoaffinitás jelzés [lásd például: De Vos et al., Science, 255, 306-312
(1992); Smith et al., J.Mól.Bioi., 224, 899-940 (1992); Wlodaver et al., FEBS Lett., 309, 59-64 (1992)].
A homológ lehet egy alléi változat, azaz egy olyan gén alternatív formája, amely mutáció révén jött létre, vagy egy mutált gén által kódolt módosult enzim, de lényegében ugyanolyan aktivitású, mint a találmány szerinti enzim. A mutációk tehát vagy csendesek (nincs változás a kódolt enzimben), vagy pedig olyan enzimeket kódolhatnak, amelyekben módosult az aminosavszekvencia.
A találmány szerinti enzim homológja species homológ is lehet, azaz egy más fajból származó, hasonló aktivitású enzim.
Az enzim egy homológját úgy izolálhatjuk, hogy a kérdéses faj egy sejtjéből genomiális vagy cDNS tárat készítünk, és olyan DNS szekvenciákra szúrjuk, amelyek az egész homológot vagy egy részét kódolják. A szűrést szintetikus oligonukleotid szondák használatával, standard technikákkal végezzük, például ahogyan Sambrook és munkatársai leírták [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)], vagy polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, specifikus primereket használva, Sambrook és munkatársai (lásd fentebb) szerint.
A találmány szerinti enzim további homológjainak tekinthetők azok, amelyek immunológiai keresztreakciót adnak a találmány szerinti enzim ellen termelt antitestekkel.
A találmány feladatát képezi továbbá, hogy olyan DNS szerkezetet állítsunk elő, amely az említett ligáz aktivitású enzimet kódolja.
A leírásban használt DNS szerkezet kifejezés alatt minden cDNS, genomiális DNS, szintetikus DNS vagy RNS eredetű nukleinsav molekulát értünk. A szerkezet kifejezéssel egy olyan nukleinsav szegmentumra kívánunk utalni, amely egyszálú vagy kétszálű lehet, és amely egy szóbanforgó polipeptidet kódoló teljes vagy részleges, természetben előforduló nukleotid szekvencián alapulhat. A szerkezet adott esetben más nukleinsav szegmentumokat is tartalmazhat.
A találmány szerinti DNS szerkezet, amely a találmány szerinti polipeptidet kódolja, genomiális vagy cDNS eredetű lehet, és például úgy állítjuk elő, hogy készítünk egy genomiális vagy cDNS tárat, amelyet olyan DNS szekvenciákra szúrunk, amelyek a teljes polipeptidet vagy ennek részét kódolják. A szűrést szintetikus oligonukleotid szondákkal való hibridizációval végezzük, standard technikákat haználva [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] A találmány szerinti célnak megfelelő polipeptidet kódoló DNS szekvencia előnyösen fonalas gomba vagy bakteriális eredetű.
A polipeptidet kódoló találmány szerinti DNS szekvenciát szintetikus úton is előállíthatjuk eddig már kidolgozott standard módszerek segítségével, például a Beaucage és Cardthers által leírt [Tetrahedron Letters, 22 , 1859-1869)] foszforamidit módszerrel, vagy a Matthes és munkatársai által leírt [EMBO Journal, 3., 801-805 (1984)] módszerrel. A foszforamidit módszer szerint az oligonukleotidokat például automata DNS szintetizátorban szintetizálják, majd tisztítják, anellálják, » · · · · « ligáiják és megfelelő vektorokba klónozzák. A DNS szerkezet ezenkívül szintetikus és genomiális eredetű szekvenciák keverékéből is állhat, továbbá szintetikus és cDNS eredetű vagy genomiális és cDNS eredetű keverékből. Ezeket úgy állítjuk elő, hogy a szintetikus, genomiális vagy cDNS eredetű fragmentumokat (az adott esetnek megfelelően) — azaz a teljes nukleinsav szerkezet különböző részeinek megfelelő fragmentumokat — standard technikák szerint ligáljuk.
A DNS szerkezet polimeráz láncreakcióval is előállítható, specifikus primerek használatával [lásd: US 4,683,202 vagy Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988)]. A találmány egy előnyös kiviteli alakjában a DNS szekvencia Aspergillus, Penicillium, vagy Cephalosporium nemzetséghez tartozó fonalas gombából, előnyösen P.chrysogenum, C.acremonium vagy A.nidulans törzsből, elsősorban a P.chrysogenum BIO törzséből származik.
A találmány a továbbiakban az említett, ligáz aktivitású enzimet kódoló találmány szerinti DNS szerkezetet tartalmazó rekombináns vektorra vagy transzformáció hordozóra vonatkozik.
A rekombináns vektor, amelybe a találmány szerinti DNS szerkezetet beépítjük, minden olyan vektor lehet, amelyet nehézség nélkül kezelhetünk rekombináns DNS eljárásokban. A vektor kiválasztása gyakran attól a gazdasejttől függ, amibe be fogjuk vezetni. Ennélfogva a vektor vagy autonóm módon replikálódó vektor lehet, azaz egy olyan vektor, amely kromoszómán kívüli entitásként létezik, és replikációja független a kromoszóma replikációjától, például ilyen egy plazmid, vagy használhatunk olyan vektort is, amelyet ha beviszünk a gazdasejtbe, a gazda30 sejt genomjába integrálódik, és azzal a kromoszómával (azokkal a kromoszómákkal) együtt replikálódik, amelybe integrálódott.
Előnyös, ha a vektor egy olyan expressziós vektor, amelyben a találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvenica működőképesen kapcsolódik a DNS transzkripciójához szükséges további szegmentumokhoz. Az expressziós vektor — általánosságban — plazmid vagy vírus DNS-ből származik, de tartalmazhatja mindkét elemet. A működőképesen kapcsolódik kifejezés azt jelenti, hogy a szegmentumok elrendezése olyan, hogy a szándékolt célok érdekében összhangban működnek, például a transzkripció egy promoterben indul meg, és a polipeptidet kódoló DNS szekvencia mentén halad előre.
Promoter lehet minden olyan DNS szekvencia, amely a kiválasztott gazdasejtben transzkripciós aktivitást mutat, és olyan génekből származhat, amelyek a gazdasejthez képest vagy homológok vagy heterológok.
Fonalas gomba gazdasejtekben való felhasználásra alkalmas promoter például az ADH3 promoter [McKnight et al., The EMBO J.,4, 2093-2099 (1985)] vagy a tpiA promoter. További hasznos promoterek például azok, amelyek az A.oryzae TAKA amilázt, a Rhizomucor miehei aszparagin proteinázt, az A.niger semleges alfa-amilázt, az A.niger sav-stabil alfa-amilázt, az A.niger vagy A.awamori glükoamilázt (gluA), Rhizomucor miehei lipázt,
A.oryzae alkalikus proteázt, A.oryzae trióz-foszfát izomerázt vagy az An.nidulans acetamidázt kódoló génből származnak. Előnyösek a TAKA amiláz és gluA promoterek.
Két vagy több bioszintetikus gén szabályozására gyakran előnyös az azonos vagy hasonló promoterek használata amiatt, hogy a béta-laktám antibiotikum szintézisben szereplő köztitermékek szinronizált termelése valósuljon meg. Ha a köztitermékek termelése nem szinkronizált, a köztitermékek felszaporodhatnak (szűk keresztmetszet). Ennek következtében a béta-laktám antibiotikum termelés visszamarad.
A találmány egy megvalósítása során az említett ligáz gén promoterét egy másik olyan gén promoterével cseréltük ki, amely béta-laktámok bioszintézisében vesz részt.
Egy megfelelő promoterre jellemző példa az 1118/94 számú nem közzétett dániai szabadalmi bejelentésben leírt AT promoter .
Bakteriális gazdasejtekben való felhasználásra alkalmas promoter például a Bacillus stearothermophilus maltogén amiláz gén, a Bacillus licheniformis alfa-amiláz gén, a Bacillus amyloliquefaciens BÁN amiláz gén, a Bacillus subtilis alkalikus proteáz gén vagy a Bacillus pumilus xilozidáz gén promotere, vagy a lambda fág PR vagy Pl promoterei vagy az E.coli lac, trp vagy tac promoterei.
A találmány szerinti enzimet kódoló DNS szekvencia szükség esetén működőképesen kapcsolódhat egy megfelelő terminátorhoz is.
Előnyös lehet, ha a találmány szerinti rekombináns vektor olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a vektor a szóbanforgó gazdasejtben replikálódjék.
A rekombináns vektor szelekciós markert is tartalmazhat, például egy olyan gént, amelynek a terméke kijavít egy hibát a • · · · · * ·« ·· ·· gazdasejtben, ilyen a dihidrofolát reduktázt (DHFR) kódoló gén vagy a Schizosaccharomyces pombe TPI gén [P.R.Russel, Gene, 40, 125-130 (1985)], vagy egy olyan gént, amely rezisztenciát ad egy gyógyszerrel szemben, például az ampicillinnel, kanamicinnel, tetraciklinnel, fleomicinnel, kloramfenikollal, neomicinnel, higromicinnel, vagy metotrexáttal szemben. Fonalas gombáknál használt szelekciósmarker például az amdS, pyrG, argB, niaD és sC.
Annak érdekében, hogy a találmány szerinti ligáz enzimet a gazdasejten belül a kívánt helyre vagy a fermentációs táptalajba irányítsuk, targeting szignállal, illetve szekréciós szignálszekvenciával (vezérszekvencia, prepro-szekvencia vagy pre-szekvencia néven is ismert) láthatjuk el a rekombináns vektort. A targeting szignálok vagy a szekréciós szignálszekvenciák az enzimet kódoló DNS szekvenciához a helyes leolvasási keretben kapcsolódnak. A szekréciós szekvenciák rendszerint az enzimet kódolóDNS szekvenciától 5' felé helyezkednek el, míg a targeting szignálszekvenciák helye rendszerint a DNS szekvenciától 3' felé esik. Használható olyan targeting szignál, vagy használhatók olyan szekréciós szignálszekvenciák, amelyek természetszerűen társulnak az enzimhez, vagy származhatnak egy más proteint kódoló olyan génből, amely a kívánt szignálszekvenciát tartalmazza.
Fonalas gombákban való használathoz megfelel, ha a szignálpeptid egy Aspergillus faj eredetű amilázt vagy glükoamilázt kódoló génből, a Rhizomucor miehei lipázt vagy proteázt vagy a Humicolal anuginosa lipázt, stb. kódoló génből szárma»··· ·· zik. Előnyös, ha a szignálpeptid az A.oryzae TAKA amilázt, az A.niger neutrális alfa-amilázt, az A.niger sav-stabil amilázt, vagy az A.niger glükoamilázt kódoló génből származik.
A találmány szerinti targeting szekvencia előnyösen egy olyan targeting szignál, amely a ligáz aktivitást a kívánt helyre képes irányítani a sejten belül (például a mikrotestekhez). Gyakran megkívánt, hogy fenntartsunk potenciális targeting szignálokat. Azonban a targeting szignált más olyan szignálokra cserélhetjük, amelyeknek azonos a funkciójuk. Ezenkívül, ha egy mikroorganizmusba egy olyan ligáz kódoló szekvenciát építünk be, amelynek nincs alkalmas ligáz targeting szignálja, akkor ezt hozzá is adhatjuk, hogy a ligáz expreszsziója a gazdasejten belül a kívánt helyen menjen végbe.
Fonalas gombákban való használatra például egy olyan peroxiszómális targeting szignál (PTS) felel meg, amely képes a citoszol utazó (passenger) proteinjeit a peroxiszómákhoz (mikrotestekhez) áthelyezni, mint például a Neurospora crassa-ban [lásd: Keller et al., J.Cell.Biol., 114, 893-904 (1991)].
A találmány szerinti enzimet kódoló DNS szekvenciák ligálásához, a promoter és adott esetben a terminátor és/vagy szekréciós szignálszekvencia, illetve targeting szignál szekvencia ligálásához használt eljárások, valamint ezeknek a replikációhoz szükséges információt tartalmazó megfelelő vektorokba való beépítéséhez használt eljárások, jól ismertek azok számára, akik ezen a szakterületen gyakorlattal rendelkeznek [lásd: Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor, New York (1989)].
A találmány további tárgyát egy találmány szerinti DNS szerkezetet vagy rekombináns vektrot tartalmazó sejt képezi.
A gazdasejtbe bevezetett találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvencia a szóbanforgó gazdasejtre nézve homológ vagy heterológ lehet. Amennyiben ez a DNS szekvencia homológ a gazdasejttel, azaz a természetben a gazdasejt termeli, mesterségesen hozzáköthetjük más olyan promoter szekvenciához vagy — amennyiben alkalmazható — más olyan szekréciós szignálszekvenciához és/vagy terminátorszekvenciához, amelyek természetes környezetében nem fordulnak elő. A homológ kifejezést olyan DNS-re, fél-szintetikus vagy szintetikus úton előállított DNS szekvenciára vonatkoztatjuk, amely a szóbanforgó gazdaszervezet szempontjából természetes polipeptidet kódol. A DNS szekvencia tehát származhat más mikroorganizmusból is, vagy lehet szintetikus szekvencia is.
Egy gazdasejt, amelybe a találmány szerinti DNS szerkezetet vagy rekombináns vektort bevisszük, minden olyan sejt lehet, amelyet képessé tehetünk a találmány szerinti polipeptid (enzim) termelésére, és amelyek előnyösen fonalas gombák és baktérium sejtek.
Az alábbiakban példaként felsorolunk olyan bakteriális gazdasejteket, amelyek — tenyésztésük folyamán — képesek a találmány szerinti enzim termelésére. Ilyenek a Gram-pozitív baktériumok, mint a Bacillus törzsek, például a B.subtilis,
B.licheniformis, B.lentus, B.brevis, B.stearothermophilus, B.alkalophilus, B.amyloliquefaciens, B.coagulans, B.circulans,
B.lautus, B.megaterium vagy B.thuringiensis, vagy a Streptomyces törzsek, mint a S.lividans, S.murinus vagy S.clavuligerus, vagy a Gram-negatív baktériumok, mint az Escherichia coli. A baktériumok transzformálását vagy protoplaszt transzformációval vagy önmagában ismert módon, kompetens sejtek használatával végezhetjük (Sambrook et al., lásd előbb).
Amennyiben az enzimet baktériumokban, például E.coli-bán fejezzük ki, az enzim vagy a citoplazmában marad, általában oldhatatlan szemcsék (zárványtestek) alakjában, vagy pedig bakteriális szekréciós szekvencia segítségével kijut a periplazmatikus térbe. Az előbbi esetben a sejteket lizáljuk, a szemcséket kinyerjük és denaturáljuk, majd ezután a polipeptidet újra felgombolyítjuk a denaturáló szer felhígítása révén. Az utóbbi esetben az enzimet a periplazmatikus térből izoláljuk a sejt feltárásával, amelyet például ultrahanggal vagy ozmotikus sokk segítségével végezhetünk, amikoris a periplazmatikus tér tartalma kiszabadul, és az enzimet izoláljuk.
Fonalas gomba sejtek például a következők: Penicillium, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Trichoderma vagy Cephalosporium fajok, főképpen a P.chrysogenum, P.notatum, A.oryzae, A.nidulans, A.niger vagy C.acremonium törzsek. A gombasejteket olyan eljárással transzformálhatjuk, amely magába foglalja a protoplaszt képzést, a protoplasztok transzformációját, amely után a sejtfal regenerálása következik önmagában ismert módon. Az Aspergillus fajok használatát proteinek expressziójához például az EP 272 277, EP 238 023 és EP 184 438 európai szabadalmi leírások írják le. A F.oxysporum transzformálását példá-
ul Malardier és munkatársai [Gene, 78, 147-156 (1989)] szerint végezhetjük.
Amikor fonalas gombát használunk gazdasejt gyanánt, a sejtet megfelelő módon úgy transzformálhatjuk a találmány szerinti DNS szerkezettel, hogy a DNS szerkezetet a gazda kromoszómájába integráljuk, és így rekombináns gazdasejtet kapunk. Az integrálás általában előnyösnek tekinthető, ugyanis így valószínűbb, hogy a DNS szekvencia stabilan a sejtben marad. A DNS szerkezeteknek a gazda kromoszómájába való integrálását a szokásos módszerekkel végezzük, például homológ vagy heterológ rekombinációval.
A fentiek szerint transzformált vagy transzfektált gazdasejtet megfelelő táptalajban, olyan feltételek mellett tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a találmány szerinti enzim expresszióját. Ezután a kapott enzimet a tenyészetből izolálhatjuk.
A sejtek tenyésztéséhez használt táptalaj bármilyen, a gazdasejtek növekedéséhez alkalmas, szokásos táptalaj lehet. Ilyenek a minimál táptalajok, vagy a megfelelő kiegészítőket tartalmazó komplex táptalajok. A megfelelő táptalajokat vagy kereskedelmi cégektől szerezzük be, vagy pedig elkészítjük leközölt receptek szerint (lásd például az American Type Culture Collection katalógusait) .
A sejtek által termelt enzimet ezután hagyományos módszerekkel nyerjük ki a táptalajból, például úgy, hogy a gazdasejteket centrifugálással vagy szűréssel választjuk el a táptalajtól, a felül úszóból vagy a szűrletből kisózással — példá«« ···· • · · · • · * • · * · »· ·· ·· ul ammónium-szulfáttal — csapjuk ki a protein komponenseket, a tisztítást különböző kromatográfiás és/vagy elektroforetikus eljárásokkal végezzük, például ioncserés kromatográfiával, gélszűréses kromatográfiával, izoelektromos fokuszálással, affinitás -kromatográf iával vagy hasonlókkal, a szóbanforgó polipeptid típusától függően.
Abban az esetben, ha az enzim intracellulárisan van jelen a gazdasejtben, a sejteket először centrifugálással vagy szűréssel nyerjük ki a fermentléből. A sejteket ezután homogenizátorban tárjuk fel, majd a felül úszó vagy szürlet protein komponenseit kisózással csapjuk ki, mint fent említettük. Végül az enzimet a fent leírtak szerint tisztítjuk.
A találmány egy kiviteli alakjában a gazdasejt vagy bakteriális sejt, mégpedig Gram-pozitív baktérium sejt, például Bacillus vagy Streptomyces'nemhez tartozó sejt, vagy Gram-negatív baktérium sejt, például Escherichia nembéli sejt vagy fonalas gomba, például Aspergillus, Cephalosporoium vagy Penicillium nembéli sejt.
Egy előnyös kiviteli alakban a gazdasejt P.chrysogenum és
C.acremonium.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Törzsek.
BIO: P.chrysogenum törzs (beszerezhető: Panlabs, 11804 North
Creek Parkway South, Bothell WA 98011-8805, USA) .
P8: P.chrysogenum törzs (a Panlabs-tól beszerezhető).
Anyagok.
LCS Agar táptalaj: [Z.Vanek, Z.Hostálek (szerk.) Overpro·*♦ • ·
- 38 duction of microbial metabolites, strain improvement and process control strategies (Butterworth, Boston, 1986) című kiadványban J.Lein, The Panlabs penicillin strain improvement program 105-139 old.].
LCS táptalaj: laktóz monohidrát 1,5 %, kukoricalekvár 0,5 %, pepton 0,5 %, nátrium-klorid 0,4 %, magnézium-szulfát—víz (1/7) 0,05 %, kálium-dihidrogén-foszfát 0,06 %, vas(III)-klorid—víz (1/6) 0,0005 %. Tween-80: Merck, kat-szám: 822187.
P-l inokulum táptalaj: [J.Lein, lásd előbb (1986)].
P-2 fermentációs táptalaj: [J.Lein, lásd előbb (1986)].
Vektor.
pUC19: 2,6 kb méretű Asp719-Sall fragmentum.
Transzformáció szelekciós marker.
Aspergillus oryzae által kifejezett E.coli Tn5 fleomicin rezisztencia gén, TPI (trióz-foszfát-izomeráz) promoter és Aspergillus niger AMG (amiloglükozidáz) terminátor.
Készülékek.
Sepharose S FF oszlop (Pharmacia Biotech),
Phenyl-Sepharose CL 4B oszlop (150 ml) (Pharmacia Biotech),
PdlO oszlop (Pharmacia Biotech),
Supelcosil RP C-18 DB oszlop (250x4,6 mm) Supelguard (Supelco), Flow-one/Beta serie 100 radioaktivitás detektor (Radiomatic), Yttrium-szilikát cella (Radiomatic),
Sephacryl S-200 oszlop (181 ml) (Pharmacia Biotech),
Cromatofocussing PBE 94 oszlop (20 ml) (Pharmacia Biotech), Pharmacia LKB PhastSystem (Pharmacia Biotech),
Cibacron Blue 3GA oszlop (Sigma), |«· <« * * • · *>··>·
- 39 ABI 1000S fotodióda sor HPLC detektor (Applied Biosystem) ,
HPLC (Waters),
Applied Biosystems 394 DNA/RNA szintetizátor,
Applied Biosystems 473 Amino Acid szekvenátor,
Waters 991 Pohotiode Array Detector.
Referencia enzimek és vegyületek.
Acetyl-coenzyme A (Sigma), (acetil-koenzim A)
Acetyl-coenzyme A synthetase (Sigma), (acetil-koenzim A szintetáz)
Bovine serum albumin (BSA) (Sigma A7638); (marha szérum albumin)
Gelfiltration Calibration Kit (Pharmacia Biotech), (gélszüréshez kalibrációs készlet)
Fenoxi-ecetsav koenzim A észter [M.J.Alonso et al., J.Antibiot. , 41, 1074-1084 (1988)],
Fenil-ecetsav koenzim A észter (Sigma) (Phenyl acetic acid coenzyme A ester)
Adipinsav koenzim A észter. A következőképpen készült: koenzim A nátrium sójának (400 mg; 5,152 χ 10“4 mM, Sigma) vizet (0,6 ml) és 0,2M kálium-hidrogén-karbonátot (a pH 7 fölé való állításához) tartalmazó acetonos (60 ml; Merck PA) szuszpenziójához erős keverés és jeges vízzel való hűtés közben, nitrogén atmoszféra alatt, hozzáadunk adipoil-kloridot (0,14 ml; Aldrich). A reakcióelegy pH-ját 7,7-re emeljük, majd tovább keverjük 60 percig ugyanezen a hőmérsékleten. Ezután az acetont alacsony nyomáson részben eltávolítjuk, a kapott terméket hideg vízben oldjuk és Iofilizáljuk. A kitermelés 0,0890 g. Vé4« ·»
- 40 ·· ·ν«· »·
9 4 · » · ♦ «44 • · 4 4 4 ···« ·· ·€ gül a terméket ultraszűrjük.
Pufferek.
Puffer A
Puffer B
Puffer C mM trisz.HCl, pH 8,5, 1,36 M ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorinsav, 1 mM PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid);
mM trisz.HCl, pH 8,5, 0,68 M ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF;
mM trisz.HCl, pH 8,5, 20 % glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF;
Puffer D: puffer C + 150 mM kálium-klorid;
Puffer E: 10 mM trisz.HCl, 20% glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF, pH 8,2;
Puffer F: 50 mM trisz.HCl, 20 % glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, pH 7,5.
Oldatok.
A oldat: 50 mM trisz.HCl, pH 8,5, 35 % ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 1 mM PMSF, 5 mM merkapto-etanol;
B oldat: 10 μΐ 0,25 M magnézium-klorid, 50 μΐ 0,1 M ATP 50 mM trisz.CHl-ben, pH 8,0, 50 μΐ 20 mM CoASH 50 mM triszHCl-ben, pH 8,0 és 30 μΐ 0,2 M fenoxi-ecetsav vagy fenil-ecetsav vagy adipinsav vagy hexánsav 50 mM trisz.HCl-ben, pH 8,0, keverve és egyensúlyba hozva 25 °C-on 5 percen át;
C oldat: 50 mM trisz.HCl, pH 8,5, ammónium-szulfát (20 %-os telítés), 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF, 4 mM magnézium-klorid;
···« »· ····
- 41 D oldat: 5 ml a kővetkezőket tartalmazza: 1,2 M magnézium-szulfát, 10 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, pH 5,8, 150 mg Novozym 234 (sarzs szám: 1199), 100 μΐ kitináz (Sigma, 4 U/ml);
E oldat: 0,6 M szorbit, 100 mM trisz.HCl, pH 7,0;
F oldat: 1,2 M szorbit, 10 mM trisz.HCl, pH 7,5, 10 mM kalcium-klorid;
G oldat: 60 % PEG 4000 (EDH 29576), 10 mM trisz.HCl, pH 7,5, 10 mM kalcium-klorid;
Oldószer H: 20 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5;
Oldószer I: 13 % metanol 20 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 2,5;
Szubsztrát oldat A: 100 μΐ 0,25 M magnézium-klorid, 500 μΐ 0,1 Μ ATP 50 mM trisz.HCl-ben, 500 μΐ 20 mM CoASH 50 mM trisz.HCl-ben és 300 μΐ 0,067 m kálium-acetát 50 mM trisz.HCl-ben;
Oldószer A: 15 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5;
Oldószer B: 5 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5.
··· ·
- 42 MÓDSZEREK
A) Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz klónozása P.chrysogenumból.
Genomiális DNS-t izoláltunk P.chrysogenum-ból Schwarz-Sommer és munkatársai szerint [EMBO J. , 3., 1021-1028 (1984)], majd részlegesen emésztettük Sau3A-val. Ezután a 15-23 kb méretű fragmentumokat izoláltuk, és lambda EMBL3 BamHI karokhoz (Promega) ligáltuk.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz egy részleges aminosavszekvenciáját — amennyiben homogenitásig tisztított — úgy határozhatjuk meg, hogy Edman degradációt alkalmazunk a ligázra vagy egy fragmentumára, majd egy Applied Biosystems 473 aminosav szekvenátort használunk. Az aminosavszekvenciából származtatott primereket a Beaucage és Caruthers által leirt [Tetrahedron Letters, 22. 1859-1869 (1981) ] foszforamidit módszerrel állíthatjuk elő, például az Applied Biosystems féle 394 DNA/RNA szintetizátor használatával.
A lambda EMBL3-ban létrehozott P.chrysogenum DNS genomiális tár plakk hibridizációs módszerrel végzett szűrésével [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] egy olyan klón izolálható, amely a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz génre specifikus primerrel hibridizál.
A működőképes fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz gént tartalmazó lambda klón szakaszt pUC19 vektorba szubklónoztuk Tn5 fleomicin rezisztencia génnel együtt, és a kapott plazmidot például a P.chrysogenum transzformálására használhatjuk.
• ·
- 43 Β) A Ρ.chrysogenum transzformálása.
A Penicillium chrysogenum BIO törzset (nagy hozamú törzs) db, 100-100 ml LCS táptalajt tartalmazó palackban tenyésztettük 36 órán át 26 °C-on. A micéliumokat Myra-szöveten gyűjtöttük össze, majd 500 ml 0,6 M magnézium-szulfát oldattal alaposan átmostuk. A micéliumokat ezután műanyag csőbe helyeztük, ml D oldatban szuszpendáltuk, és 5 percig jégre tettük. A micélium szuszpenzióhoz 750 μΐ BSA-t (12 mg/ml) adtunk, és tovább inkubáltuk 30 °C-on 1-2 órán át, óvatosan rázogatva. A protoplaszt képződést fény-mikroszkóppal ellenőriztük.
A protoplasztokat Myra-szöveten gyűjtöttük össze, majd óvatosan 5 ml E oldatra rétegeztük. Lassú, 2000 ford/perc-nél nem gyorsabb centrifugálás után az E oldat és D oldat közötti fázisban elhelyezkedő protoplasztokat kipipettáztuk, és 2 térfogat F oldat hozzáadásával felhígítottuk. Ezután 5 percig újból centrifugáltuk 2500 ford/perc mellett. A protoplaszt üledéket kétszer mostuk F oldattal, majd az izolált protoplasztokat F oldat hozzáadásával úgy hígítottuk, hogy ml-énként 1-2 x 107 sejtet kapjunk. A transzformáláshoz 100 μΐ protoplasztot használtunk.
Cézium-klorid sürüség-grádiens centrifugálással (Maniatis et al., 1982, lásd előbb) készített 10 ^g DNS-t adtunk a protoplasztokhoz, és 20 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. Ezután 200 μΐ G oldatot adtunk hozzá, 20 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd 3 térfogat 1,2 M szorbit oldatot adtunk hozzá. A protoplaszt — DNS aggregátumot 2500 ford/perc mellett 10 percig centrifugáltuk. Az üledéket 300 μΐ 1,2 M szorbit-oldat hozzáadásával reszuszpendáltuk, majd 3 szelektív lemezre vittük (mindegyikre 100 μΙ-t). A lemezeken lévő LCS agar 50 μ/ml fleomicint tartalmazott. A lemezeket 26 °C-on inkubáltuk addig, amíg a transzformált sejtek meg nem jelentek.
Ezután a transzformált sejteket izolálhatjuk, és rázott palackokban való fermentálással ellenőrizhetjük penicillin termelő képességüket.
C) A P. chrysogenum fermentálása*.
Penicillin chrysogenum BIO vagy P8 (Panlabs) törzs liofilizált spóráit 0,1 % (térf/térf) Tween 80 tartalmú desztillált vízben szuszpendáltuk, majd 10 ml LCS Agar (ferde) táptalajokra oltottuk. Az agart 25 °C-on 10 napig inkubáltuk, majd az egyes ferde agarok felületéről 10 ml 0,1 %-os Tween 80-ban szuszpendáltuk a spórákat. E szuszpenzió 5 ml-ét használtuk 50 ml P-l inokulum táptalajt tartalmazó 300 ml-es Erlenmeyer lombikok beoltására. Az inokulum tenyészeteket 25 °C-on inkubáltuk körforgó rázógépen (290 ford/perc), és 48 óra múlva az inokulum tenyészet 2 ml-es részleteit használtuk a P-2 fermentációs táptalaj — 35 ml 300 ml-es Erlenmeyer lombikokban (a sertés zsírt olívaolajjal helyettesítettük) — beoltásához. A tenyészeteket 25 °C-on inkubáltuk — 250 ford per perc mellett — az aratásig.
D) Aratás, extrahálás és kicsapás.
A P.chrysogenum 3 napos tenyészetéből szűréssel izoláltuk a sejteket, és azonnal mostuk 5 térfogat 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal. A sejteket folyékony nitrogénben fagyasztottuk, és mozsárban homogenizáltuk. Az enzimet A oldatban való szusz45 pendálással extraháltuk. A sejttörmelékeket centrifugálással távolítottuk el. A kivonatot 50 %-ig telítettük ammónium-szulfáttal, és a csapadékot centrifugálással távolítottuk el. Ezután az enzimet úgy csaptuk ki, hogy 70 % telítésig adtunk hozzá ammónium-szulfátot. Centrifugálás után az üledéket a C oldatban oldottuk fel.
E) Phenyl-Sepharose CL 4B oszlopkromatográfia.
Az előző fejezet szerint kapott 2280 mg proteint (95 ml) Phenyl-Sepharose CL 48 oszlopra (150 ml) vittük fel, amelyet Puffer A-val — 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett — hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 500 ml Puffer A-val mostuk, majd grádiens elució következett 100 % Puffer C-ig; összmennyiség:
1800 ml. A frakciószedés 8 ml-enként történt.
Minden frakciót fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitásra és acetil-koenzim A szintetáz aktivitásra analizáltunk.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 115-277 számú frakció között oldódott ki, az aktivitás csúcsa a 175-ös frakcióban mutatkozott. Az acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a
108-157 számú frakció között oldódott ki, az aktivitás csúcsa a 118-as frakcióban mutatkozott.
F) Cibacron Blue oszlop-kromatográfia.
A Phenyl-Sepharose kromatografálással kapott 143-225 frakciókat egyesítettük, és a proteint 65 %-os telítéssel, ammónium-szülfáttál csaptuk ki. A csapadékot 10 ml Puffer C-ben szuszpendáltuk, és PD10 oszlopon sótlanítottuk. A minta végső mennyisége 16 ml volt.
Ezt a mintát Puffer C-vel kiegyensúlyozott 20 ml Cibacron *♦
- 46 Blue-val töltött oszlopra vittük. Az oszlopot 10-szeres oszloptérfogat Puffer C-vel mostuk, és kálium-klorid gradienssel (0 - 0,25 M KCl) eluáltuk, 25 ml/óra átfolyási sebesség használatával. Az eluátumot 8,3 ml-es frakciókként gyűjtöttük. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 36. - 65. számú frakciók között oldódott ki, a 45. számú frakcióban lévő maximummal .
G) Gélszúrés S-200 (Super fine) oszlopon.
A Cibacron Blue kromatográfiával kapott 36-56. számú frakciókat egyesítettük és ultraszűréssel (kizárási molekulatömeg határ = cut off : 10 000) koncentráltuk, PD10 oszlopon sótlanitottuk Puffer D-vel. Ezután 7 mg proteint (3,3 ml) vittünk egy Sephacryl S-200 oszlopra (181 ml), amelyet ugyenezen pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot Puffer D-vel eluál tűk (átfolyási sebesség: 10 ml/óra), a frakciókat 1 ml-enként szedtük és vizsgáltuk. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitása a 72 - 118. számú frakciók között oldódott ki, az aktivitás a 87. frakcióban mutatott csúcsot.
H) Kromatofókuszálás PBE 94 oszlopon.
A 79-101. számú frakciókat egyesítettük, ultraszűréssel koncentráltuk (cut off 10 000), és PD10 oszlopon sótlanitottuk Puffer E hasznlatával. A minta végső mennyisége 30 ml.
A mintát Puffer E-vel kiegyensúlyozott 20 ml PBE 94 oszlopra vittük, és az oszlopot Puffer E-vel eluáltuk, 30 ml/óra átfolyási sebesség mellett. A frakciókat 1,5 ml-enként gyűjtöttük. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 11-40.
számú frakciókban oldódott ki, a maximális aktivitást a 17.
számú frakcióban kaptuk.
I) Sepharose S FF oszlopkromatográfia.
A Phenyl-Sepharose kromatográfiával (lásd fent) kapott 143-225. számú frakciók pooljából egy részletet (protein tartalom: 149 mg) 65 % telítésig hozzáadott ammónium-szulfáttal csaptuk ki. A csapadékot Puffer F-ben reszuszpendáltuk, és PD10 oszlopon sótlanítottuk. A végső minta mennyisége 28 ml volt.
A mintát egy előzőleg Puffer F-fel kiegyensúlyozott 50 ml-es Sepharose S FF oszlopra vittük fel. A minta felvitele után az oszlopot 150 ml Puffer F-fel mostuk, majd kálium-klorid grádiensben (0 — 0,3 M KCl) eluáltuk. Minden lépésben 5 ml/óra átfolyási sebességet használtunk, és 5 ml-énként szedtük a frakciókat. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást a 45 - 120. számú frakciók között eluálódott, a maximális aktivitást a 48. frakció tartalmazta, míg a fő protein csúcs a 16. frakcióban jelent meg.
J) Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.
A reakciót úgy indítjuk, hogy 100 μΐ enzim oldatot adunk a fenoxi-ecetsavat (vagy fenil-ecetsavat) és CoASH-t tartalmazó B oldathoz, majd 30 perces 25 °C-on való inkubálás után a reakciót 240 μΐ 0,5 %-os trifluor-ecetsav hozzáadásával állítjuk le. A kapott csapadékot centrifugálással távolítjuk el, és a képződött fenoxi-ecetsav koenzim A észtert (vagy fenil-ecetsav koenzim A észtert) HPLC-vel analizáljuk.
Fenoxi-ecetsav koenzim A észter vagy fenil-ecetsav koen48 zim A észter kimutatása HPLC-vel.
Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB Supelguard-dal.
Észlelés: UV fényben, 260 nm-en.
Oldószer A: 15 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.
Átfolyás: 1 ml/perc.
A fenoxi-ecetsav koenzim A észter retenciós ideje 9,7 perc és a fenil-ecetsav koenzim A észteré 9,0 perc. A fenoxi-ecetsav koenzim A észter és a fenil-ecetsav koenzim A észter mennyiségi meghatározását standardhoz viszonyítva végeztük.
K) Adipoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.
A reakciót úgy indítjuk, hogy 1 térfogat enzimet adunk 1,4 térfogat, pH 8,5-re beállított, adipinsavat tartalmazó B oldathoz. A szokásos inkubációs elegy 250 μΐ enzimet és 350 μΐ B oldatot tartalmaz. Az inkubációt 30 °C-on végezzük. Szabályos időközönként mintát veszünk az inkubációs elegyből, és azonos mennyiségű 0,5 %-os trif luor-ecetsawal keverjük össze.
A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el. A képződött adipoil-koenzim A észtert HPLC-vel analizáljuk.
Adipoil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel.
Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB.
Észlelés: UV fényben, 257 nm-en.
Oldószer B: 5 % acetonitril 25 mM nátrifum-foszfát pufferben; pH: 6,5.
Átfolyás: 1 ml/perc.
Az adipoil-koenzim A észter retenciós ideje 11,4 perc. Referencia gyanánt adipoil-koenzim A észtert használtunk.
L) Hexanoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.
A reakciót úgy indítjuk, hogy 1 térfogat enzimet adunk 1,4 térfogat, pH 8,5-re beállított, hexánsavat tartalmazó B oldathoz. A szokásos inkubációs elegy 250 μ és 350 μ B oldatot tartalmaz. Az inkubálást 30 °C-on végezzük. Szabályos időközönként mintát veszünk az elegyből, és azonos mennyiségű 0,5 %-os trifluor-ecetsawal keverjük össze. A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el. A képződött hexanoil-koenzim A észtert HPLC-vel analizáljuk.
Hexanoil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel:
Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB.
Észlelés: UV fényben, 257 nm-en.
Oldószer A: 15 % acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.
Átfolyás: 1 ml/perc.
A hexanoil-koenzim A észter retenciós ideje 20,4 perc.
M) Acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.
Az A szubsztrát oldatot elkészítjük, pH-ját 4 M kálium-hidroxid oldattal 8,0-ra állítjuk be. Hozzáadunk 40 μΐ ecetsav-l-l4C nátrium sóit (41,8 mCi/mM; 1 mCi/ml), és az elegyet 35 °C-on egyensúlyba hozzuk.
Vizsgálat: 25 μΐ enzimet és 35 μΐ A szubsztrát oldatot elegyítünk, és az elegyet 35 °C-on 30 percig inkubáljuk. A reakciót 60 μΐ 0,5 %-os trifluor-ecetsav hozzáadásával állítjuk le. A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el, és a kapott acetil-koenzim A észtert radioaktivitás detektorral ellátott HPLC-vel analizáljuk. A nem-radioaktív vegyületeket
UV fényben, 210 nm-en mutatjuk ki, a Radiomatic detektorral egy sorozatban.
Acetil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel:
Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB oszlop Supelguard-dal.
Észlelés: a radioaktív vegyületeket Flow-one/Beta serie 100 radioaktivitás detektorral (Radiomatic) mértük, amely egy 250 μΙ-es yttrium-szilikát mérőcellával volt felszerelve.
UV észlelés 210 nm-en.
Oldószer B: 5 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.
Átfolyás: 1 ml/perc.
Az acetil-koenzim A észter retenciós ideje: 6,9 perc.
Standardként a Sigma cégtől származó acetil-koenzim A-t használtuk, és az A szubsztrát keveréket is a Sigma féle acetil-koenzim A szintetázzal inkubáltuk, ezután a képződött 14C-acetil-koenzim A-t HPLC-vel analizáltuk.
N) Penicillin V és penicillin G kimutatása HPLC-vel.
Inkubálás után a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel analizáltuk penicillin V-re vagy penicillin G-re a következő feltételek mellett.
Oszlop: Supelcosil LC C-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelguard-dal,
Észlelés: UV fényben, 215 nm-en.
Oldószer: Oldószer H.
Átfolyás: 1 ml/perc.
Retenciós idők: penicillin V-nél 13,3 perc, penicillin Gnél 8,7 perc.
···· ·· • · • ·· ·
- 51 O) Minta készítés az ACV és IPNS HPLC-vel való meghatározáshoz .
Rázott lombikból 2 ml mintát veszünk, és gyorsan 0-4 °C-ra hütjük, 25-szörösére hígítjuk 25 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,5) és ultraszürjük (out off 10 000). A szűrlethez ditiotreitol-t adunk 5 mM végső koncentrációig, és a mintákat HPLC-vel analizáljuk.
Oszlop: Supelcosil LC-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelgurad-dal.
Észlelés: UV fényben, 210 nm-en.
Oldószer: Oldószer I.
Átfolyás: 2 ml/perc.
Hőmérséklet: 35 ’C.
Injektált térfogat: 10 μΐ
Retenciós idők (RT): izopenicillin N-nél 5,7 perc, ACVnél 17 perc.
P) Acil-koenzim A extrakciója P.chrvsogenum-ból.
Az acil-koenzim A vegyületeket P.chrysogenumból Barbera E. Gorkey és Jude T. Deeney [Acyl CoA regulation of metabolism and signal transduction Progress in Clinica] and Biological Research, 321, 217-232 (1990)] módszere szerint extraháljuk.
A P.chrysogenum törzset (B10 vagy P8) rázott lombikokban tenyésztjük a c) fejezetben — A P.chrysogenum fermentálása — leírtak szerint. A tenyésztést P-2 táptalajban (pH 6,1) végezzük. Négy nap múlva a sejteket só-jég fürdőben gyorsan lehűtjük, és 30 másodpercig 22 000 g mellett centrifugáljuk. Az üledéket folyékony nitrogénben fagyasztjuk le a sejtek le• ·
- 52 aratás után. A sejteket két térfogat 0,6 M triklór-ecetsav oldat hozzáadása után felolvasztjuk. Harminc perces ultrahangos kezelés után a sejtkivonatokat centrífugálással (12 000 g; 30 másodperc) izoláljuk. A triklór-ecetsavat dietil-éteres extrahálással — amíg a vizes fázis pH-ja 6-ra áll be — távolítjuk el. A vizes fázist (ez tartalmazza az acil-koenzim A vegyületeket) liofilizáljuk, majd a mintát végül 25 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 6,5) oldjuk fel, és HPLC-vel analizáljuk a Fenoxi-ecetsav koenzim A észter kimutatása című bekezdésben megadott feltételek mellett.
Q) Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrvsogenum-ban.
P.chrysogenum sejteket (B10 vagy P8) tenyésztünk rázott lombikokban A P.chrysogenum fermentálása című fejezetben leírtak szerint P-2 táptalajban (pH 6,1). Négy napos tenyésztés után 10 ml sejtet átviszünk egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 250 μΐ [1-14C]-fenoxi-ecetsavat (72 gCi/ml; 9,7 gCi/uM) tartalmaz. A lombikot ezután 26 °C-on, rázás közben inkubáljuk.
Ezután 1, 15, 30, 60, 120, 240 és 360 perc múlva 1-1 ml sejtet kiveszünk a lombikból, azonnal 0 °C-ra hűtjük, és 1 percig 22 000 g mellett centrifugáljuk. Az üledéket 500 μΐ 5 %-os foszforsav és 500 μΐ metanol elegyében szuszpendáljuk, és az elegyet 1 percen át ultrahangozzuk. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel analizáljuk, amikoris a radioaktivitás mérésére detektort használunk a jelzett metabolitok azonosítása végett.
HPLC feltételek.
• ·
- 53 Oszlop: Supelcosil LC-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelguard-dal.
Észlelés:Radiometric A-140 yttrium-szilikát cellával.
Oldószer 1: 25 mM nátrium-foszfát; pH 6,5.
Oldószer 2: acetonitril.
Grádiens:
idő | oldószer 1 | oldószer 2 |
(perc) | (%) | (%) |
0 | 100 | 0 |
40 | 70 | 30 |
45 | 70 | 30 |
46 | 100 | 0 |
60 | 100 | 0 |
Átfolyás: 1 ml/perc.
A kromatogrammon csak a következő vegyületeknek megfelelő csúcsok jelentek meg: fenoxi-ecetsav (RT: 14,5 perc), p-hidroxi-fenoxi-ecetsav (RT: 8,4 perc) és penicillin V (RT: 34 perc). A p-hidroxi-fenoxi-ecetsav-nak és a penicillin V-nek megfelelő csúcsok csak 60 perces inkubálás után voltak detektálhatok.
Az alábbi példák a találmány szemléltetését szolgálják, de nem korlátozzák annak oltalmi körét.
1. példa:
Ligáz aktivitás egy magas és egy alacsony hozamú P.chrysoqenum törzsben.
Penicillium hozamok szempontjából a P.chrysogenum P8 • · · ·
- 54 törzs fermentációját általában alacsony hozamúnak tartjuk intermedier tekintetében, míg a P.chrysogenum BIO törzset magas hozamú törzsnek tartjuk.
P.chrysogenum törzseket (BIO és P8) fermentálunk a P. chrysogenum fermentálása fejezetben leírtak szerint. A sejteket learatjuk és a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt úgy extraháljuk, ahogyan a D) fejezetben — Aratás, extrahálás és kicsapás — leírtuk, majd a két kivonatban meghatározzuk a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt (ligáz) a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata címú fejezetben leírtak szerint.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás meghatározások eredményét az alábbi táblázatban utatjuk be.
1. táblázat
P.chrysogenum törzs
Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás (relatív érték) (%)
Képződött penicillin V (relatív érték) (%)
P8 27,5 40
BIO 100 100
A példa világosan mutatja, hogy a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a törzs penicillin termelésével korrelál.
2. példa:
Intermedier metabolitok felszaporodása.
P.chrysogenum (B10) sejteket tenyészünk rázott lombikok·»*· ····
- 55 bán, ahogyan ezt a P.chrysogenum fermentálása című fejezetben [C) fejezet] leírtuk. A P-2 fermentációs táptalaj beoltása után 7 napon át minden nap meghatároztuk a fermentlében az ACV és izopenicillin N koncentrációját. A vizsgálatot HPLC-vel, a fent leírt eljárás szerint végeztük.
Az 1. ábrán az ACV és izopenicillin N koncentrációkat adjukmeg a fermentációs idő függvényében.
Az ábra világosan mutatja, hogy a P.chrysogenum fermentálásakor a tenyészetben ACV és izopenicillin N szaporodik fel.
3. példa:
Penicillin V és penicillin G in vitro szintézise.
μΐ 60 mM fenoxi-ecetsav, 25 μΐ 40 mM ATP, 25 μ 6 mM koenzim A és 10 μΐ 6 mM 6-amino-penicillinsav elegyét (az egyes komponenseket 50 mM trisz.HCl, pH 7,8, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM aszkorbinsav tartalmú oldatban oldottuk fel) 30 °C-on 10 μΐ fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz [a kromatofókuszálás (PBE 94 oszlopon) 11-40. számú frakcióinak pooljából (lásd fent) származik] és 10 μΐ acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz (P.chrysogenum-ból tisztítva Emilio Alvarez és munkatársa szerint) [A.Alvarez et al., Pufification to Homogeneity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-aminopenicillianic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum című közlemény az Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987) folyóiratban] jelenlétében inkubáltuk .
A penicillin G in vitro szintézisénél a fenoxi-ecetsavat
- 56 25 μΐ 60 mM fenil-ecetsawal helyettesítettük.
Az inkubálást 15 perc múlva 100 μΐ metanol hozzáadásával állítottuk le, és a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel penicillin V-re vagy penicillin G-re analizáltuk, mint fent leírtuk.
A penicillin V vagy penicillin G azonosítása.
A kromatogrammon a penicillin V vagy penicillin G csúcsok azonosításának ellenőrzésére standard penicillin V, illetve penicillin G oldatokat használtunk. A csúcs-inflexiós pontoknál és a csúcs-pontoknál összehasonlítottuk az UV spektrumot a két penicillin standard spektrumával egy ABI 1000S fotodióda sor (photodiode array) HPLC-detektor használatával, mint fent leírtuk.
Amikor a reacióelegyből akár a koenzim A-t vagy a 6-amino-penicillinsavat vagy az ATP-t vagy a fenoxi-ecetsavat vagy a fenil-ecetsavat kihagytuk, nem szintetizálódott penicillin V vagy G.
Ez a kísérlet igazolta, hogy az izolált enzim fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást és fenil-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást (ligáz aktivitást) fejt ki.
4. példa:
V-DCA in vitro szintézise.
μΐ 60 mM fenoxi-ecetsav, 25 μΐ 40 mM ATP, 25 μΐ 6 mM koenzim A és 10 μΐ 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) elegyét (az egyes komponenseket 50 mM trisz.HCI, pH 7,8, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM aszkorbinsav tartalmú oldatban oldot- 57 tűk fel) 30 °C-on 10 μΐ fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz [ a kromafókuszálás (PBE 94 oszlopon) 11-40. frakcióinak pooljából (lásd fent) származik] és 10 μΐ acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz (P.chrysogenum-ból tisztítva Emilio Alvarez és munkatársai szerint) [E.Alvarez et. al., Purification to Homogenity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium chrysogenum című közlemény, lásd: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987)] jelenlétében inkubáltuk.
A penicillin G in vitro szintézisénél a fenoxi-ecetsavat 25 μΐ 60 mM fenil-ecetsawal helyettesítettük.
Az inkubálást 15 perc múlva 100 μΐ metanol hozzáadásával állítottuk le, és a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel V-DCA-ra analizáltuk a Q) fejezetben (Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrysogenumban) leírtak szerint. A V-DCA retenciós ideje 32 perc.
A V-DCA azonosítása.
A kromatogrammon a V-DCA csúcs azonosítását úgy ellenőriztük, hogy standard V-DCA oldatokat használtunk, és a csúcs inflexiós pontoknál és a csúcspontoknál Waters 991 Photodiode Array Detector használatával összehasonlítottuk az UV spektrumot a V-DCA standard specktrumával.
5. példa:
Molekulatömeg meghatározás gélszűréssel.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) molekulatömegének meghatározását úgy végeztük, hogy összehasonlítottuk a »*··
- 58 gélszűrésnél [lásd a gélszűrés S-200 (super fine) oszlopon című fejezetet] kapott eluciós térogatot a standard Calibration Kit-tel (ribonukleáz A: 13 700 dalton, kimotripszinogén A: 25 000 dalton, ovalbumin: 43 000 dalton, marha szérum albumin: 67 000 dalton és aldoláz: 158 000 dalton) ugyanezen az oszlopon, azonos feltételek mellett végzett gélszűrésnél kapott aluciós térfogatokkal. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz valószínű molekulatömege körülbelül .50 000 dalton.
6. példa:
Izoelektromos pont (pl).
Az izoelektromos pont meghatározásánál úgy járjunk el, hogy a Sepharose S FF oszlopkromatográfiánál (leírását lásd előbb) használt F pufferben (pH 7,5) a pH-t 8,5-re változattuk. A többi paramétert konstansnak tartva, azt találtuk, hogy fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) nem maradt vissza az oszlopon az F pufferrel (pH 8,5) való elució folyamán.
A kísérlet azt mutatta, hogy ahol az enzim töltése zéró (azaz az izoelektromos pont), a pH 7,25 felett van.
7. példa:
Fenoxi-acetil-koenzim A a kivonatokban.
Annak érdekében, hogy bizonyítékot kapjunk a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) aktivitás jelenlétéről, acil-koenzim A-t extraháltunk, ahogyan ezt az Acil-koenzim A extrakciója P.chrysogenumból című fejezetben leírtuk, és HPLCvel analizáltuk.
Bár a HPLC vizsgálat kimutatási határa 50 pM alatt van, a sejtkivonatokban nem tudtunk azonosítani fenoxi-ecetsav-koenzim A-t. Jelzett fenoxi-ecetsav metabolitok extrakciója sem mutatott észlelhető fenoxi-ecetsav-koenzim A-t a sejtkivonatokban, ahogyan a Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrysogenumban című fejezetben leírtuk.
8. példa:
VIZSGÁLAT
Az alábbiakban leírt tisztítással kapott fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt (ligázt) használtuk az enzim további vizsgálatához.
Hőmérséklet és pH optimum.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz meghatározása című fejezetben leírt módon vizsgáltuk 15 - 50 °C hőmérsékletet használva, és a vizsgálati pH értékek 6,5-től 9,0ig való változatásával.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás pH 8 - 8,5 körül érte el maximumát, mint ezt a 2. ábra mutatja. A 3. ábra 40 °C körül mutatja a hőmérséklet optimumát.
Szubsztrátspecifitás.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt fenoxi-ecetsavval, fenil-ecetsavval, adipinsawal, hexánsavval és ecetsavval inkubáltuk a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben, az Acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című feje60 zetben, az Adipoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben és a Hexanoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben megadott feltételek mellett, és a következő eredményeket kaptuk:
Szubsztrát_Relatív aktivitás
Fenoxi-ecetsav | 100 |
Fenil-ecetsav | 80 |
Adipinsav | 19 |
Hexánsav | 320 |
Ecetsav | 1 |
A Km konstans meghatározása ATP-re, fenoxi-ecetsavra, koenzim A-ra és macrnézium-kloridra.
A fenoxi-acetil-koenzim a szintetáz aktivitását a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk különböző koncentrációjú szubsztrátumok jelenlétében, egyidőben egy szubsztrátumot véve. A Kpj értékeket (az ebben a vizsgálatban használt feltételek mellett) az Eadie-Hofstee, Hanes és Lineweaver-Burk féle görbék alapján határoztuk meg, ahogyan Nicholas C. Price és Lewis Stenens leírták a Fundamentals of Enzymology (Oxford University Press, 1982) című kiadvány 123. oldalán. A görbék világosan mutatták, hogy a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz a Míchaelis-Menten kinetikát követi az egyes szubsztrátumok vonatkozásában.
Az eredményeket az alábbi, 2. táblázatban foglaljuk öszsze.
- 61 2. táblázat
Koncentrációk (mM) Kjq (mM)
Fenoxi-ecetsav | 0 | - 40 | 3,2 |
ATP | 0 | - 10 | 0,22 |
Koenzim A | 0 | - 4,0 | 0,57 |
MgCl2 | 0 | - 15 | 1,6 |
Kjvj: Michaelis konstans
Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz fenil-ecetsav és ecetsav eredetű gátlása.
A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk, vagy fenil-ecetsav vagy ecetsav változó koncentrációi jelenlétében a fenoxi-ecetsav különböző koncentrációi mellett.
A vizsgálatban a következő fenoxi-ecetsav koncentrációkat használtuk: 1,7; 3,3; 6,6; 20 és 42 mM. A fenil-ecetsav és ecetsav koncentrációk a következők voltak: 0; 1,0; 5,0; 10, illetve 25 mM.
A Lineweaver-Burk görbék azt mutatták, hogy a fenil-ecetsav kompetitív inhibitorként viselkedik a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázzal szemben, míg az ecetsav nem hatott kompetitív inhibitorként a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázra a használt vizsgálati feltételek mellett.
A szakterületen gyakorlattal rendelkezők az előzőekben • · · ·
- 62 előadottak alapján nyilvánvalóan megértik, hogy a találmány kivitelében számos változtatást és módosítást végezhetnek anélkül, hogy a találmány szellemétől vagy oltalmi körétől eltérnének. A találmány oltalmi körét ennélfogva a következő igénypontokban meghatározott lényegnek megfelelően kell értelmezni .
Claims (48)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás béta-laktám antibiotikum termelésére, azzal jellemezve, hogyi) olyan mikrooganizmust fermentálunk, amely képes az említett béta-laktám antibiotikum termelésére; és ii) az említett béta-laktám antibiotikumot lényegében tiszta formában izoláljuk, amikoris az említett fermentációt megnövelt ligáz aktivitás jelenlétében végezzük, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amely akkor van jelen, amikor kizárólag az eredeti mikroorganizmussal fermentálunk, az eredeti fermentációs feltételek mellett.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eredeti mikroorganizmusnak nincs ligáz aktivitása, vagy csak alacsony ligáz aktivitása van.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expresszióját a fermentációs eljárás fizikai feltételeinek modulálásával növeljük.
- 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozása érdekében a fermentáció folyamán a hőmérsékletet moduláljuk.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozása érdekében a fermentáció folyamán a pH-t moduláljuk.
- 6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz aktivitás expresszióját úgy fokozzuk, hogy a mikroorganizmust ligáz expresszió indukáló vegyületek vagy szerek hatásának tesszük ki.
- 7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz aktivitást úgy fokozzuk, hogy beavatkozunk a fermentálandó mikroroganizmus sejtes szabályozó mechanizmusába .
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitást vagy fokozott ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus módosítása révén kapjuk meg.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus random vagy hely-specifikus mutagenezisével érjük el.
- 10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a megvalósítását vagy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozását úgy érjük el, hogy egy olyan DNS szerkezet legalább egy másolatát vagy egy olyan rekombináns vektort vezetünk be az említett fermentálandó eredeti mikroorganizmusba, amely ligáz aktivitású enzimet kódoló gént vagy DNS szekvenciát tartalmaz.
- 11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a módosítást aminosav szubsztitúcióval, delécióval vagy addícióval hajtjuk végre.
- 12. A 10. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett DNS szerkezet nem abból a mikroorganizmus fajból származik, amelybe azt bevezetjük.
- 13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eredeti mikroorganizmust a következő csoportból választjuk ki: Penicillium, Aspergillus,Nocardia, Streptomyces, Bacillus Cerospora, Microspora, különböző Eubacterium, különböző Streptomyces fajok és fonalas gombák.
- 14. A 13. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett eredeti mikroorganizmus a következő csoportba tartozó fajokhoz tartozik: Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans és Streptomyces clavuligerus.
- 15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett ligáz aktivitás expresszióját a béta-laktám bioszintetikus folyamathoz tartozó más gének expressziójával szinkronizáljuk.
- 16. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitás expresszióját a pcbAB, pcbC és/vagy a penDE gének expressziójával szinkronizáljuk.
- 17. A 13. vagy a 14. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett eredeti, béta-laktám antibiotikum termelésére képes mikroorganizmust penicillineket, cefalosporinokat, cefamicineket, mono-baktámokat és nokardicineket termelő mikroorganizmusok csoportjából választjuk ki.
- 18. A 17. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett antibiotikum cefalosporin vagy penicillin, előnyösen penicillin V, penicillin G, V-DCA, 7-(L-a-5-amino-5-karboxi-valeramido)-cefalosporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA vagy adipoil-7-ACA.
- 19. A 8-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosított mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek előmozdítják az említett DNS szerkezet expresszióját, ennek eredményeként a kívánt béta-laktám antibiotikum oldalláncának megfelelő karbonsav koenzim A-val alkotott tioésztere nagyobb mennyiségben termelődik.
- 20. A 8-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek előmozdítják az említett DNS szerkezet expresszióját, ez aktivált oldallánc-koenzim A-tioészter termelést eredményez, amely ezután egy aciltranszferáz (AT) jelenlétében az említett oldalláncot tartalmazó béta-laktám képződéséhez vezet.
- 21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz enzimet az jellemzi, hogy legalább tízszer aktívabb a fenoxi-ecetsavval és a fenil-ecetsavval szemben, mint az ecetsavval szemben és valószínű molekulatömege — gélszűréssel meghatározva — körülbelül 50 000 dalton.
- 22. Ligáz aktivitású új enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb fenoxi-ecetsavval szemben, mint ecetsavval szemben.
- 23. A 22. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb fenil-ecetsawal szemben, mint ecetsavval szemben.
- 24. A 22. vagy a 23. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb adipinsawal szemben, mint ecetsawal szemben.
- 25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb hexánsavval szemben, mint ecetsavval szemben.
- 26. A 22-24.igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy valószínű molekulatömege — gélszűréssel meghatározva — 40 000 és 60 000 dalton között van, pontosabban körülbelül 50 000 dalton.
- 27. A 22-26. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy aktivitásának valószínű pH optimuma 7,0 -9,0 közé esik, pontosabban 8,0 - 8,5 tartományban van.
- 28. A 22-27. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy aktivitásának valószínű hőmérséklet optimuma 34-45 °C közötti tartományban van, pontosabban körülbelül40 °C.
- 29. A 22-28. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium nemhez (genus-hoz) tartozó fonalas gomba, előnyösen P. chrysogenum vagy C.acremonium törzs eredetű fonalas gomba termeli, pontosabban a P.chrysogenum B10 törzs termeli.
- 30. A 22-29. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a P.chrysogenum törzsből származó tisztított ligáz ellen termelt antitesttel immunológiai reakciót ad.
- 31. DNS szerkezet, amely a 22-30. igénypontok bármelyike szerinti enzimet kódolja.
- 32. A 31. igénypont szerinti DNS szerkezet, amelyben a DNS szekvencia egy Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium genushoz tartozó fonalas gombából származik, előnyösen egyΡ.chrysogenum vagy C.acremonium törzsből, pontosabban a P.chrysogenum BIO törzsből származik.
- 33. Rekombináns vetor vagy transzformációs plazmid, amely a 31. és 32. igénypont bármelyike szerinti DNS szerkezetet tartalmazza.
- 34. A 33. igénypont szerinti vektor vagy transzformációs plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett DNS szerkezet működőképesen kapcsolódik egy promoter szekvenciához és adott esetben egy terminátor szekvenciához.
- 35. A 33. és 34. igénypont bármelyike szerinti vektor, amelyben az említett ligáz gén promoterét egy, a béta-laktámok bioszintézisében résztvevő másik génből származó promoterrel helyettesítjük.
- 36. A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti vektor vagy transzformációs plazmid, amelyben az említett DNS szerkezet működőképesen kapcsolódik egy targeting szignált vagy szekréciós szignált kódoló szekvenciához.
- 37. Sejt, amely a 31. és a 32. igénypont bármelyike szerinti DNS szerkezetet, vagy a 33-36. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmazza.
- 38. A 37. igénypont szerinti sejt, amely mikrobiális sej t.
- 39. A 38. igénypont szerinti sejt, amely baktérium sejt vagy gomba sejt.
- 40. A 39. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy a baktérium sejt egy Gram-pozitív baktérium sejt, ilyenek például a Bacillus vagy Streptomyces genus-hoz tartozó sejtek, • * ·· • · · ··*· vagy egy Gramnegatív baktérium sejt, ilyen például az Excherichia genus-hoz tartozó sejt, továbbá, hogy a gomba sejt például egy Aspregillus, Cephalosporium vagy Penicillium genus-hoz tartozó fonalas gomba.
- 41. Eljárás béta-laktámok termelésére, azzal jellemezve, hogy egy karbonsavat, koenzim A-t és egy, a 22-30. igénypontok bármelyike szerinti ligáz aktivitású enzimet, aciltranszferázt és egy béta-laktám intermediert inkubálunk.
- 42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett ligáz aktivitáshoz úgy jutunk, hogy a béta-laktámok termelésében ligáz aktivitást kifejtő enzimeket használunk.
- 43. A 41. és 42. igénypont bármelyike szerinti eljárás, amelyben a béta-laktám köztitermékek a következők: izopenicillin Ν (IPN), 6-amino-penicillánsav (6-APA), 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA), 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) és 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav, 7-(L-a-5-amino-5-karboxi-valeramido)-cefalosoporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA vagy adipoil-7-ACA.
- 44. A 41. igénypont szerinti eljárás, amelyben a karbonsav fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav, adipinsav, hexánsav, 2-tiofén-ecetsav vagy 3-tiofén-ecetsav.
- 45. A 41-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást magnézium ionok és ATP jelenlétében végezzük .
- 46. A 41-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást redukáló szer — ilyen a ditiotreitol »···- ΊΟ (DTT), merkapto-etanol, aszkorbinsav vagy glutation — jelenlétében végezzük.
- 47. A 41-46. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást 10 - 60 °C között, előnyösen 15 - 50 °C között és főképpen 20 - 45 °C között végezzük.
- 48. A 41-47. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást pH 5,5 - 9 között, előnyösen körülbelül pH 8 mellett végezzük.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DK111794 | 1994-09-28 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT77042A true HUT77042A (hu) | 1998-03-02 |
Family
ID=8101208
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU9701925A HUT77042A (hu) | 1994-09-28 | 1995-09-27 | Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US5942411A (hu) |
EP (1) | EP0783582B1 (hu) |
JP (1) | JPH10506287A (hu) |
KR (1) | KR970706393A (hu) |
CN (1) | CN1271208C (hu) |
AT (1) | ATE290084T1 (hu) |
AU (1) | AU701665B2 (hu) |
CA (1) | CA2201485A1 (hu) |
DE (1) | DE69534041T2 (hu) |
ES (1) | ES2236714T3 (hu) |
HU (1) | HUT77042A (hu) |
MX (1) | MX9702270A (hu) |
WO (1) | WO1996010085A1 (hu) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE290084T1 (de) * | 1994-09-28 | 2005-03-15 | Dsm Ip Assets Bv | Verfahren zur herstellung von beta lactam antibiotika durch mikroorganismen mit erhoehter ligaseaktivitaet |
GB9513403D0 (en) | 1995-06-30 | 1995-09-06 | Smithkline Beecham Plc | Novel product |
WO1997038107A1 (en) * | 1996-04-04 | 1997-10-16 | Gist-Brocades B.V. | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof |
JP2000514301A (ja) * | 1996-07-16 | 2000-10-31 | ギスト ブロカデス ベスローテン フェンノートシャップ | アクレモニウム・クリソゲヌムを用いたセファロスポリンの新規な調製方法 |
US6133227A (en) * | 1997-06-23 | 2000-10-17 | The Procter & Gamble Company | Enzymatic detergent compositions |
US6284483B1 (en) * | 1999-10-06 | 2001-09-04 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Modified synthetases to produce penicillins and cephalosporins under the control of bicarbonate |
EP1470491A4 (en) * | 2002-01-30 | 2006-06-21 | Larry E Roher | AUDIOVISUAL MULTIPORT CONFERENCE SYSTEM |
WO2003104459A1 (en) * | 2002-06-07 | 2003-12-18 | Arthron Limited | Fcyriia transgenic animal model for autoimmune disease |
CN115337308B (zh) * | 2022-07-15 | 2024-03-22 | 山东省农业科学院家禽研究所(山东省无特定病原鸡研究中心) | Acss2抑制剂在制备抗h1n1亚型猪流感病毒药物中的应用 |
Family Cites Families (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ES2016476A6 (es) * | 1989-07-10 | 1990-11-01 | Antibioticos Sa | Procedimientos para sintetizar fenilacetil-coa y para producir bencilpenicilina. |
KR920703829A (ko) * | 1990-10-15 | 1992-12-18 | 한스 발터 라벤 | 형질전환체 선별 표지 시스템 |
ES2033590A6 (es) * | 1991-04-19 | 1993-03-16 | Antibioticos Sa | Procedimientos para sintetizar fenilacetil-coa y para producir bencilpenicilina |
ATE290084T1 (de) * | 1994-09-28 | 2005-03-15 | Dsm Ip Assets Bv | Verfahren zur herstellung von beta lactam antibiotika durch mikroorganismen mit erhoehter ligaseaktivitaet |
GB9513403D0 (en) * | 1995-06-30 | 1995-09-06 | Smithkline Beecham Plc | Novel product |
-
1995
- 1995-09-27 AT AT95935410T patent/ATE290084T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-09-27 EP EP95935410A patent/EP0783582B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-27 DE DE69534041T patent/DE69534041T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-27 CN CNB951960016A patent/CN1271208C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-09-27 CA CA002201485A patent/CA2201485A1/en not_active Abandoned
- 1995-09-27 KR KR1019970702038A patent/KR970706393A/ko not_active Application Discontinuation
- 1995-09-27 WO PCT/EP1995/003857 patent/WO1996010085A1/en active IP Right Grant
- 1995-09-27 ES ES95935410T patent/ES2236714T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-09-27 JP JP8511394A patent/JPH10506287A/ja active Pending
- 1995-09-27 AU AU37440/95A patent/AU701665B2/en not_active Ceased
- 1995-09-27 HU HU9701925A patent/HUT77042A/hu unknown
- 1995-09-27 MX MX9702270A patent/MX9702270A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-09-27 US US08/817,010 patent/US5942411A/en not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-06-15 US US09/333,645 patent/US6180360B1/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO1996010085A1 (en) | 1996-04-04 |
EP0783582B1 (en) | 2005-03-02 |
MX9702270A (es) | 1997-07-31 |
ES2236714T3 (es) | 2005-07-16 |
DE69534041T2 (de) | 2006-04-13 |
EP0783582A1 (en) | 1997-07-16 |
US6180360B1 (en) | 2001-01-30 |
DE69534041D1 (de) | 2005-04-07 |
AU701665B2 (en) | 1999-02-04 |
AU3744095A (en) | 1996-04-19 |
KR970706393A (ko) | 1997-11-03 |
CA2201485A1 (en) | 1996-04-04 |
CN1162337A (zh) | 1997-10-15 |
JPH10506287A (ja) | 1998-06-23 |
CN1271208C (zh) | 2006-08-23 |
US5942411A (en) | 1999-08-24 |
ATE290084T1 (de) | 2005-03-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU657787B2 (en) | Novel bioprocess for preparing 7-ADCA | |
CN100390285C (zh) | 体内生产头孢菌素的改良 | |
ALVAREZ et al. | The isopenicillin‐N acyltransferase of Penicillium chrysogenum has isopenicillin‐N amidohydrolase, 6‐aminopenicillanic acid acyltransferase and penicillin amidase activities, all of which are encoded by the single penDE gene | |
NO315802B1 (no) | Biologisk fremgangsmåte for fremstilling av 7-ACA og 7-ADAC | |
HUT77042A (hu) | Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal | |
LUENGO | Enzymatic synthesis of hydrophobic penicillins | |
LUENGO et al. | Direct evaluation of phenylacetyl-CoA: 6-aminopenicillanic acid acyltransferase of Penicillium chrysogenum by bioassay | |
KR20070073779A (ko) | 변이주 익스팬다제 | |
Martín et al. | Insights into the structure and molecular mechanisms of β-lactam synthesizing enzymes in fungi | |
Jensen et al. | Beta-lactams | |
JP3764166B2 (ja) | 二次代謝産物を産生するための方法 | |
Gidijala et al. | Biosynthesis of active pharmaceuticals: β-lactam biosynthesis in filamentous fungi | |
EP2084270B1 (en) | Production of beta-lactam antibiotics | |
EP2851423B1 (en) | Mutant type II beta-lactam acylases | |
WO1997038107A1 (en) | An enzyme with high adipoyl-coenzyme a synthetase activity and uses thereof | |
Martín et al. | Insights into the molecular mechanisms of β-lactam antibiotic synthesizing and modifying enzymes in fungi | |
KR20080028924A (ko) | 변이주 익스팬다제 및 베타-락탐 화합물의 생성에 있어서이들의 용도 | |
Martín et al. | Genes Encoding Penicillin and Cephalosporin Biosynthesis in Acremonium chrysogenum: Two Separate Clusters are Required for Cephalosporin | |
EP0444758A1 (en) | Method for modification of ACV synthetase and use of the modified enzyme for production of beta-lactam antibiotics | |
Sklyarenko et al. | Enzymatic transformation and synthesis of beta-lactam antibiotics | |
WO1999001561A1 (en) | IMPROVED PROCESS FOR THE PRODUCTION OF β-LACTAMS | |
PL172155B1 (pl) | Sposób biotechnologiczny wytwarzania pochodnych kwasu cefalosporanowego |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
DFA9 | Temporary protection cancelled due to abandonment |