HUT77042A

HUT77042A - Eljárás béta-laktám antibiotikumok előállítására fokozott ligázaktivitású mikroorganizmusokkal

Info

Publication number: HUT77042A
Application number: HU9701925A
Authority: HU
Inventors: Svend Kaasgaard; Claus Nyegaard Kristiansen; Henrik Molgaard
Original assignee: Gist-Brocades B.V.
Priority date: 1994-09-28
Filing date: 1995-09-27
Publication date: 1998-03-02
Also published as: WO1996010085A1; EP0783582B1; MX9702270A; ES2236714T3; DE69534041T2; EP0783582A1; US6180360B1; DE69534041D1; AU701665B2; AU3744095A; KR970706393A; CA2201485A1; CN1162337A; JPH10506287A; CN1271208C; US5942411A; ATE290084T1

Description

A találmány béta-laktám antibiotikumok bioszintézisére vonatkozik. Pontosabban, a találmány béta-laktám antibiotikumo in vivő és in vitro termelési eljárásaira vonatkozik.

A találmány további tárgyát képezi egy új enzim, amely előnyösen használható béta-laktám antibiotikumok bioszintézisében. A találmány egy olyan DNS szerkezetre is vonatkozik, amely az emített új enzimet kódolja, továbbá egy rekombináns vektorra vagy transzformációs plazmidra, amely az említett DNS szerkezetet tartalmazza, és végül egy sejtre, amely az említett DNS szerkezetet vagy rekombináns vektort tartalmazza.

A penicillin bioszintézisének folyamata.

A penicillin bioszintézisének első lépését a δ- (L-ce-amino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin (ACV) tripeptid L-α-amino-adipinsavból, L-ciszteinből és L-valinból való képződése alkotja. [Fawcett et al., Biochem.J., 157, 651-660 (1976)]. A reakciót egy multifunkcionális enzim, a δ-(L-a-araino-adipil)-L-ciszteinil-D-valin szintetáz (ACV) szintetáz) katalizálja ATP és Mg²⁺ionok, mint kofaktorok jelenlétében [Bankó et al., J.Am. Chem. Soc., 109, 2858-2860 (1987)].

Az ACV szintetázt Aspergillus nidulans-ból [Van Liempt et al., J.Bioi.Chem., 264, 3680-3684 (1989)], Cephalosporium acremonium-ból [Baldwin et al. , J.Antibiot. , 43 , 1055-1057 (1990)] és Streptomyces elavuligerus-bői [Jensen et al., J. Bacteriol., 172, 7269-7271 (1990), Zhang et al., Biotechnoi. Lett., 12., 649-654 (1990)] tisztították. Az ACV szintetáz Penicillium chrysogenumból való tisztítását eddig nem publikálták. A P.chrysogenumból származó ACV szintetázt azonban Diez r

>

és munkatársai klónozták [Diez et. al., J. Bioi. Chem., 265, 16358-16365 (1990) ] .

Az ACV lineáris tripeptid izopenicillin N-né (IPN) alakul át izopenicillin N szintetáz [cikiáznak vagy izopenicillin N szintetáznak (IPNS) is nevezik], vas ionok, oxigén és egy elektrondonor (például aszkorbát) jelenlétében. Izopenicillin N szintetázt először Ramos és munkatársai [Ramos et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 27, 380-387 (1985)] izoláltak

P.chrysogenumból, és a P.chrysogenumból származó izopenicillin N szintetáz strukturális gént Carr és munkatársai [Carr et al., Gene, 48, 257-266 (1986)] klónozták.

A penicillint és cefalosporint termelő gombákban és baktériumokban a penicillinek bioszintézisének ez a két első lépése közös.

Bizonyos gombákban, például a P.chrysogenumban és az A.nidulansban az izopenicillin N a-amino-adipil oldallánca intracelluláris eredetű vagy kívülről bevitt más oldalláncokkal helyettesíthető. A cserét egy aciltranszferáz enzim (további elnevezése: acil-koenzim A:izopenicilillin N aciltranszferáz vagy acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz) katalizálja. Ma még nem világos, hogy vajon ez a konverzió in vivő két lépésben zajlik-e, amikoris először az L-a-amino-adipil oldallánc hasad le 6-amino-penicillinsav (6-APA) keletkezése mellett, amelyet az acilező lépés követ, vagy pedig a konverzió az oldalláncok közvetlen kicserélődéséből áll. A

P.chrysogenum-ból tisztított aciltranszferáznak izopenicillin-N-amidohidroláz aktivitása és acil-koenzim A:6-amino-penicil• · • · • · linsav aciltranszferáz aktivitása is van [Alvarez et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987)].

Az ACV szintetázt (pcbAB), izopenicillin N szintetázt (pcbC) és acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt (penDE) kódoló gének a P.chrysogenum-ban és az A.nidulansban ugyanabban a csoportban (cluster) helyezkednek el [Diez et al., J.Bioi.Chem., 265, 16358-16365 (1990); Smith et al.,

Bio/Technology, 8., 39-41(1990)].

A P.chrysogenum pcbC-penDE géncsoport (cluster) — amely az izopenicillin N szintázt (IPNS), illetve aciltranszferázt (AT) kódolja — sokszorozása (amplifikációja) a termelés kihozatalában mintegy 40 %-os javulást eredményezett [Veenstra et al. , J.Biotechnoi. , 17. 81-90 (1991)]. Ugyancsak közölték, hogy azokban a transzformált A.nidulans sejtekben, amelyek a PcbAB gén [ACV szintetáz (ACVS) kódoló gén] és a pcbC gén [izopenicillin N szintetáz (IPNS) kódoló gén] többszörös másolatát tartalmazzák, megnövekedett az antibiotikum kihozatal [McCabe et al. , J.Biotechnoi. , 17, 91-97 (1991)].

Az EP 200 425 számú európai szabadalmi leírás (Eli Lilly) izopenicillin N szintetázt (IPNS) kódoló vektorokat ismertet.

A vektorok C.acremonium-ban és E.coli-ban az IPNS magas szintű expressziójára képesek. A leírás szerint a Cephalosporium vektorok jól használhatók a törzsek javítására, abból a célból, hogy a penicillin és cefalosporin antibiotikumok termelésére végzett fermentációk hatékonysága és kitermelése megnövekedjék. A vektorokat módosíthatjuk is, hogy olyan vektorokhoz jussunk, amelyek a P.chrysogenum, Streptomyces elavuligerus, stb. fermentációja esetén növelik a termelés kihozatalát és eredményességét.

Az EP 357 119 számú európai szabadalmi leírás (Gist Brocades) az IPNS-t, AT-t és ACVS-t kódoló antibiotikus bioszintetikus géncsoportot ismerteti, amelyet eredményesen használtak az antibiotikumok mikroorganizmusokban való termelésének a javítására és más olyan gének izolálására, amelyek résztvesznek az antibiotikum bioszintézisben. A találmány a penicillin P.chrysogenum-ban elért eredményesebb termelését, egy másik bioszintetikus géncsoport izolálását és a penicillin bioszintetikus géncsoport Acremonium ahrysogenum-ban való expresszióját írja le.

Az oldallánc aktiválása.

Annak érdekében, hogy az aciltranszferázzal katalizált reakcióban az α-amino-adipinsav oldallánc kicserélődjék, az új oldallánc karbonsav csoportjának aktiválódnia kell. Ez az aktiválás a penicillinek bioszintézisének egyik legkevésbé érthető része. Két elmélet van forgalomban:

A legszélesebb körben elfogadott elmélet szerint az enzim a karbonsavak koenzim A tioészterekké való észtereződését katalizálja egy két-lépéses mechanizmus révén, amely az ATP (adenozin-trifoszfát) pirofoszforolízisén keresztül megy végbe magnézium ionok jelenlétében. Először a karbonsav (az új oldallánc), az ATP és az enzim komplexet alkot, amely egy acil-AMP-enzim komplex. Másodszor, ez a komplex a koenzim Aval reagál, és így felszabadul az acil-koenzim A és az AMP (adenozin-monofoszfát) .

·· · · • · f I

A másik elmélet egy acil-S-glutation köztitermék képződését veszi alapul, amely a megfelelő acil-koenzim A-észterré transzformálható [Ferrero et al. , J.Antibiot., 43., 684-691 (1990)].

Egy P.chrysogenum-ból származó fenacil:koenzim A ligáz képes katalizálni a fenoxi-acetil-koenzim A és fenil-acetil-koenzim A szintézisét ATP, magnézium ion, koenzim A és fenoxi-ecetsav vagy fenil-ecetsav jelenlétében [lásd: Brunner, Röhr, Zinner, Hoppé-Seyler¹s Z.Physiol.Chem., 349, 95-103 (1968); Brunner, Röhr, Methods Enzymol., 43, 476-481 (1975);

Kogekar, Deshpande, Ind. J. Biochem. Biophys., .19, 257-261 (1982); Kurzatkowski, Med. Dosw.Mikrobiol, 33., 15-29 (1981)].

Brunner és munkatársai szerint a ligáz hasonló erősségű aktivitást mutat a fenil-ecetsawal, a fenoxi-ecetsavval és az ecetsawal szemben. Az enzimet azonban soha nem tisztították homogenitásig.

Martinez-Blanco és munkatársai [J.Bioi.Chem., 267, 5474-5481 (1992)] leírtak egy P.chrysogenum Wis 54-1255 törzsből származó olyan acetil-koenzim A szintetázt, amely nemcsak az ecetsavat, hanem a fenil-ecetsavat is elfogadja szubsztrátumként a megfelelő acil-koenzim A észterek szintézisében, éppen úgy, mint a Brunner és munkatársai által leírt ligáz. Martinez-Blanco és munkatársai azonban nem írtak a fenoxi-ecetsavval szembeni aktivitásról. Martinez-Blanco és munkatársai szerint az acetil-koenzim A szintetáz egy homo-dimer («2), amelynek a molekulatömege gélszűréssel meghatározva 139 000 dalton, SDS-PAGE (nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis) módszerrel meghatározva 70 000 dalton, izoelektromos pontja pH 5,6 és 6,0 közé esik.

A Martinez-Blanco és munkatársai féle acetil-koenzim A szintetázt kódoló gént Martinez-Blanco és munkatársai vizsgálták [Martinez-Blanco et al., Gene, 130, 265-270 (1993)]. Ez a gén, amelynek acuA elnevezést adtak, öt intront tartalmaz, és egy 669 aminosavból álló polipeptidet kódol. A polipeptid molekulatömege 74 287.

Gouka és munkatársai [Gouka et al., Appl.Microbiol.Biotechnol. , 38., 514-519 (1993)] és Van Hartingsveldt és munkatársai (WO 92/070709) leírták, hogy egy P.chrysogenum-ból származó acetil-koenzim A szintetáz gént (facA) izoláltak, amelynek meghatározták a szekvenciáját, és megállapították, hogy ez egy 669 aminosavból álló proteint kódol, amely körülbelül 74 000 dalton molekulatömegnek felel meg (az egyes aminosavakra 110 g/M átlag molekulatömeget számítva). A Gouka és munkatársai féle facA gén és a Martinez-Blanco és munkatársai féle acuA gén génszekvenciái nem mutattak különbségeket.

Brunner és munkatársai és Kogekar és Deshpande az általuk leírt fenil-acetil-koenzim A ligázok részletes vizsgálatát nem közölték.

Az új oldallánc — aktivált formában — amely az a-amino-adipinsav oldalláncot fogja helyettesíteni az acil-transzferáz által katalizált reakcióban, koenzim A tioészter formában vagy más tioészter-formában lehet, minthogy más tioészterekről leírtak (mint például az acil-S-ciszteinil-glicinről és az acil-S-glutationról), hogy ezek aciltranszferáz szubsztrátumok.

További lehetőség, hogy a dipeptidet (ciszteinil-glicin) egy nem-enzimes reakcióban CoASH-val szubsztituálják, mielőtt ez belépne az aciltranszferáz reakcióba. [Ferrero et al., J.Biol. Chem., 265, 7084-7090 (1990)].

A tioészterek tionilcsoportja, mihely kialakult, gyorsan kicserélhető más tiolokra (ilyenek például a merkapto-etanol, az 1,4-ditio-treitol, ACV és koenzim A) egy nem-enzimes reakcióban .

A liqázokról általában.

A ligázok, azaz a 6.2.1. enzim alcsoportba tartozó sav-tiol-ligázok (Enzyme Nomenclature, Academic Press, Inc., 1992) — egyéb elnevezésük: acil-koenzim A szintetázok vagy acil-koenzim A tiokinázok — ATP és magnézium ionok jelenlétében egy karbonsavból és a koenzim A-ból acil-koenzim A tioészterek képződését katalizálják.

Különböző forrásokból számos ligázt vagy acil-koenzim A szintetázt azonosítottak. Ilyenek például az acetil-koenzim A szintetáz; propionil-koenzim A szintetáz [Groot, Biochim.Biophys.Acta, 441, 260-267 (1976)]; lutiril-koenzim A szintetáz [Wanders et al., J.Bioi.Chem., 240. 29-33 (1965)]; közepes-láncú és nagyon hosszú-láncú zsírsav-acil-koenzim A szintetázok [Waku, Biochim.Biophys Acta, 1124, 101-111 (1992) összefoglalás] ; benzoil-koenzim A ligáz Pseudomonas fajokból [Auburger, Appl.Microbiol.Biotechnoi., 37, 789-795 (1992)] és fenil -acetil -koenzim A ligázok[Martinez-Blanco et. al., J.Biol. Chem., 265, 7084-7090 (1990); Vitovski, FEMS Microbiol.Letters, 108, 1-6 (1993)]. A legtöbbjük széles szubsztrátum specifitás• · , t sál rendelkezik.

Az acil-koenzim A szintetázok (ligázok) a zsírsavak és az ecetsav primer métábólizmusának és az aromás savak lebomlásának első lépéseiben általában a kulcsenzimek szerepét töltik be, amikoris energiában gazdag tioészter kötés képzése révén aktiválják a karbonsav acilcsoportját.

Béta-laktámok in vivő termelése.

A legtöbb úgynevezett természetes béta-laktám (például penicillin DF, izopenicillin Ν, 6-APA, cefalosporin C, stb.) nem stabil, fermentléből nehezen tisztítható, antibiotikus hatása csak korlátozott, és/vagy alacsony kihozatallal termelheto.

A természetes béta-laktámok oldalláncainak például fenoxi -ecetsawal vagy fenil-ecetsavval való helyettesítése olyan penicillinek (penicillin V, illetve penicillin G) képződését eredményezi, amelyek stabilabbak, könnyebben izolálhatok, és magasabb az antibiotikus aktivitásuk.

A közvetlenül fermentált penicillinek közül ipari jelentősége csak a penicillin V-nek és a penicillin G-nek van, ezeket úgy állítják elő, hogy a fermentorba fenoxi-ecetsavat, illetve fenil-ecetsavat adagolnak. Amennyiben a P.chrysogenum fermentálása folyamán más prekurzorokat, például 2-tiofén-ecetsavat vagy 3-tiofén-ecetsavat adagolunk, más penicillinek képződnek. Bizonyos adagolt rekurzorok, például az 1-fenil-alkánok vagy az 1-fenoxi-n-alkánok részben metabolizálódhatnak a P.chrysogenum sejtekben, mielőtt a penicillin termelésben az aciltranszferáz szubsztárumaiként lennének használhatók [Szarka « ·

et al. , Advances in Biotechnology, 3., 167-173 (1980); Szarka et. al., US 4,250,258; Szarka et al., US 4,208,481]. Az úgynevezett természetes penicillinek, például a penicillin DF, penicillin K, penicillin F és penicillin H bioszintézisében a hexánsav (kapronsav), oktánsav, a 3-hexénsav, illetve a heptánsav oldalláncok feltehetően a primer métábólizmusból származnak.

Bizonyos esetekben a fenoxi-acetil vagy a fenil-acetil oldallánc védőcsoportként szerepel a fermentáció és a béta-laktam izolálása folyamán, ugyanis az izolált penicillin V-t vagy G-t szerves kémiai vagy enzimes eljárással hidrolizálják, hogy 6-APA képződjék, amely ezután alap építőként szolgál az olyan új félszintetikus penicillinek számára, amelyek a természetes penicillinekkel, valamint a penicillin V-vel vagy G-vel összehasonlítva jobb farmakológiai tulajdonságokkal rendelkeznek.

Hasonló a helyzet a cefalosporinok termelésénél. A természetes cefalosporinok gyógyászati értéke korlátozott, mivel ezeket is nehéz izolálni, és csak alacsony antibiotikus hatást fejtenek ki. Továbbá nehéz ezeket magasabb gyógyászati értékű új cefalosporinokká módosítani.

Számos lépést kell tenni annak érdekében, hogy a fermentált cafalosporint a kívánt antibiotikummá módosítsák, például az orális cefalosporinok — például ilyen a cefalexin és cefadroxil — termelésében a kiindulási pont a penicillin V vagy G, amelyet azután cefalosporinná módosítanak egy sor kémiai reakció segítségével, megtartva a fenoxi-acetil vagy fenil-acetil oldalláncot védőcsoportként. A gyűrű expanzió után V11

-DCA, illetve G-DCA (V/G-dezacetoxi-cefalosporánsav) keletkezik, majd az oldalláncot hidrolízissel távolítják el egy olyan eljárással, amely hasonló a penicillin V vagy G hidrolíziséhez. Végül új oldalláncot (például: D-fenil-glicin vagy D-p-hidroxi-fenil-glicin) adnak hozzá egy szerveskémiai eljárás segítségével .

A cefalosporinok cefalosporin C-ből való előállításánál a D-a-amino-adipinsav vagy kémiai hidrolízissel vagy két lépésben, szerves kémiai és enzimes eljárással távolítható el. A kapott 7-ACA-ból (7-amino-cefalosporánsav) ezután acilezéssel állítják elő a kívánt terméket.

Mind a V-DCA és G-DCA képződéséhez vezető reakciót, mind a cefalosporin C 7-ACA termékké való hidrolízisét ipari méretekben végzik. Ezek a reakciók azonban nehezen szabályozhatók, költségesek, és a kitermelések általában alacsonyak.

E probléma áthidalása érdekében számos alternatív megoldást javasoltak, amelyek közül néhány magába foglalta a P.chrysogenum transzformálását, például a Streptomyces-ből származó epimerázzal és expandázzal, mint ahogyan ezt C.Cantwell és munkatársai [C.Cantwell et al., 248, 283-289 (1992)] leírták. Kimutatták, hogy a transzformált P.chrysogenum képes dezacetoxi-cefalosporánsav termelésére. Azonban nem találtak V-DCA-t. Cantwell javasolta, hogy az expandázt géntechnológiai eljárással úgy módosítsák, hogy megváltozzon szubsztrátum specifitása, és fogadja el a penicillin V-t vagy G-t szubsztrátumként. Ezután a V/G-DCA közvetlenül, fermentációval termelhető .

··

- 12 S.Gutierrez és munkatársai [Mól.Gén.Génét., 225. 56-64 (1991)] a P.chrysogenum-ból származó aciltranszferázzal transzformálták a C.acremonium-ot, és ki tudták mutatni, hogy a transzfromáit C.acremonium penicillin G-t termel, de nem tudták bizonyítani a G-DCA jelenlétét.

Az EP 532341 számú európai szabadalmi leírás (Merck and Co., Inc.) ismerteti az adipoil-7-ADCA (adipoil-7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav) fermentációval való előállítását Streptomyces clavuligerus-ból származó expandázzal transzformáit P.chrysogenum használatával. Az adipoil-7-ADCA a fermentléből extrahálható, majd például egy Pseudomonas eredetű adipoil-acilázzal hidrolizálható.

Az ES 2,016,476 számú spanyolországi szabadalmi leírás a fenil-acetil-koenzim A és a benzil-penicillin (penicillin G) in vitro biokémiai előállítását tárgyalja. A fenil-acetil-koenzim A-t úgy állítják elő, hogy a Pseudomonas putida-ból származó fenil-acetil-koenzim A ligázt ATP-vel, koenzim A-val, fenil-ecetsavval, és magnézium-kloriddal inkubálják 10-45 °C és pH 5-10 között 10-180 percig. A benzil-penicillint úgy állítják elő, hogy a fenil-acetil-koenzim A ligázt és a Penicillium chrysogenum eredetű acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt 6-amino-penicillinsawal, fenil-ecetsavval, ATP-vel, koenzim A-val és magnézium-kloriddal inkubálják

10-40 °C és pH 5,5 - 9 között 30-180 percig.

Az ES 2,033,590 számú spanyolországi szabadalmi leírás benzil-penicillinből (penicillin G) származó különböző penicillinek in vitro termelését írja le. A termelést úgy végzik, ···· ··

- 13 hogy egy enzimrendszert — amely Pseudomonoas putida eredetű fenil-acetil-koenzim A ligázt és Penicillium chrysogenum eredetű acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferázt tartalmaz —, szuszbsztrátumokat — ilyenek a 6-amino-penicillinsav, ATP, koenzim A —, magnézium-kloridot, ditiotreitolt (DTT) és penicillin prekurzorokat inkubálnak.

A jelenlegi technika olyan eljárásokat alkalmaz bizonyos penicillinek és cefalosporinok termeléséhez, amelyek in vitro lépéseket tartalmaznak. A legtöbb eljárást nehéz ellenőrizni, ezek az eljárások nehézkesek és/vagy költségesek.

A találmány tárgyát néhány fent leírt probléma megoldása képezi. A feladatot úgy teljesítjük, hogy a béta-laktám antibiotikumok termelésére javított eljárásokat bocsátunk rendelkezésre. Ezeket az eljárásokat fokozott ligáz aktivitás jelenléte jellemzi, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amely akkor van jelen, amikor csak az említett eredeti mikroorganizmussal végezzük a fermentálást az eredeti fermentációs feltételek mellett.

A találmány egy ligáz aktivitást kifejtő olyan űj enzimre is vonatkozik, amely erősen specifikus a fontos béta-laktám prekurzorokra, mint a fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav és adipinsav, de kevéssé specifikus az ecetsavra.

A találmány szerint ez az enzim a Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans vagy Cephalosporium acremonium fonalas gombákból nyerhető.

Az új enzim különböző béta-laktám antibiotikumok bioszintézisével kapcsolatosan használható.

- 14 A találmány további tárgyát egy olyan eljárás képezi, amely béta-laktám antibiotikumok in vitro termelésére szolgál.

Közreadunk egy olyan DNS szerkezetet is, amely az említett, ligáz aktivitást kifejtő új enzimet kódolja.

A találmány további tárgyát egy olyan rekombináns vektor vagy transzformáció hordozó képezi, amely az említett DNS szerkezetet tartalmazza.

A találmány egy olyan sejtre is vonatkozik, amely az említett DNS szerkezetet vagy az említett rekombináns vektort tartalmazza.

Az alábbiakban az ábrák rövid leírása következik.

Az 1. ábra az ACV és izopenicillin Ν (IPN) koncentrációit ábrázolja a fermentáció időtartamának függvényében.

A 2. ábra a ligáz aktivitás pH optimumát mutatja be.

A 3. ábra a ligáz aktivitás hőmérséklet optimumát mutatja be.

Minthogy a béta-laktámok termelésénél a termelés gazdaságossága fontos tényező, igény merült fel olyan javított eljárások iránt, amelyek nagyobb fermentációs kitermelést biztosítanak, amelyeket könnyebb ellenőrizni, kevésbé nehézkesek, és ennek következtében kevésbé költségesek.

A találmány tárgyát képezi tehát, hogy a béta-laktám antibiotikumok termelésére ilyen javított eljárásokat bocsássunk rendelkezésre.

Ugyanakkor meglepő módon azt találtuk, hogy akkor juthatunk ilyen javított eljárásokhoz, ha a szóbanforgó béta-laktám antibiotikumok termelése fokozott ligáz aktivitás jelenlétében megy végbe.

• · ··» 9

- 15 A találmány szerint a béta-laktám antibiotikum termelést szolgáló javított eljárás a következő lépéseket tartalmazza:

i) olyan mikroorganizmust fermentálunk, amely képes az említett béta-laktám antibiotikum termelésére; és ii) az említett béta-laktám antibiotikumot lényegében tiszta formában izoláljuk, amennyiben az említett fermentáció fokozott ligáz aktivitás jelenlétében történik, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amelyet akkor kapunk, ha csak az eredeti mikroorganizmust fermentáljuk az eredeti fermentációs feltételek mellett.

A fokozott ligáz aktivitás azt jelenti, hogy a szóbanforgó karbonsav konverziója a megfelelő acil-koenzim A észterré fokozottabb, mint a módosítatlan, eredeti mikroorganizmus használata esetén és/vagy az eredeti fermentációs feltételek esetén .

A talámány egyik kiviteli alakja szerint az említett eredeti mikroorganizmus, amely képes béta-laktámok termelésére, nem, vagy csak igen alacsony ligáz aktivitást fejt ki.

A ligáz aktivitás okozott expressziója bármilyen alkalmas módon megvalósítható.

Egy találmány szerinti kiviteli alakban például a ligáz aktivitást úgy növelhetjük, hogy a fermentációs eljárás fizikai körülményeit — ilyen a hőmérséklet és a pH — moduláljuk. Egy másik lehetőség szerint a mikroorganizmust olyan vegyületek vagy szerek hatásának tesszük ki, amelyek fokozott ligáz expressziót eredményeznek. Az említett vegyületek vagy szerek jellege például a ligáz expressziójának megindításához hasz·· .··. ···:

·· . ·. ···· ·, nált promotertől függ. Ezenkívül a ligáz expressziót szabályozó sejtes szabályozó mechanizmusokba való beavatkozás révén érhetjük el a ligáz aktivitás expressziójának fokozását.

A találmány egy kiviteli formája szerint az említett ligáz aktivitáshoz vagy a fokozott ligáz aktivitáshoz az említett mikroorganizmus módosítása révén jutunk.

A módosítást jól ismert eljárásokkal végezhetjük, például úgy, hogy a fermentálandó, említett eredeti mikroorganizmusba egy olyan DNS szerkezet legalább egy másolatát vezetjük be, vagy egy olyan rekombináns vektort vezetünk be, amelyek ligáz aktivitású enzimet kódoló gént tartalmaznak.

Az egyik kiviteli alakban a ligáz aktivitást vagy fokozott ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus random vagy hely-specifikus mutagenezisével kapjuk meg.

A fokozott ligáz aktivitást eredményező említett módosítást ezenkívül a ligáz enzimben végrehajtott aminosav szubsztitúciókkal, deléciókkal vagy addiciókkal érhetjük el, mint alább leírjuk.

Az említett ligáz aktivitáshoz vagy fokozott ligáz aktivitáshoz másképpen úgy jutunk, hogy a béta-laktám antibiotikum termelés folyamán ligáz aktivitású enzimet adagolunk.

Egy alternatív kiviteli alakban az említett DNS szerkezet nem abból a mikroorganizmusból származik, amibe azt bevezetjük.

A DNS szerkezet vagy a transzformáció hordozó bevezetését jól ismert módszerekkel végezhetjük, mint alább leírjuk.

Bizonyos esetekben megkívánt, hogy egy béta-laktám teljes ·« ·

- 17 bioszintézisét, beleértve a ligáz aktivitású enzim expresszióját, más olyan mikroorganizmusba vigyük át, amely saját maga nem képes az említett béta-laktám termelésére. Ezt olyan esetben valósítjuk meg, amikor a recipiens (gazda) mikroorganizmus például 1) könnyebben transzformálható, 2) magas szinten képes kifejezni bioszintetikus enzimeket, 3) jobbak a növekedés jellemzői, vagy 4) kevesebb olyan szennyező anyagot termel, amely zavarná az izolálást. Ilyen esetben általában magasabb kitermelést kaphatunk egy béta-laktámból.

Kívánatos lehet, hogy egy mikroorganizmus új, alternatív bioszintetikus utakkal rendelkezzen.

A találmány szerint a fent említett recipiens vagy gazda mikroorganizmusokat a következő csoportból választjuk ki: Penicillium, Cephalosporium, Aspergillus, Nocardia, Streptomyces, Bacillus, Cerospora, Microspora, különböző Eubacteriumok, különböző Actinomycesek vagy fonalas gombák.

Az előnyös kiviteli alakban az említett mikroorganizmus a következő csoportból választott fajhoz tartozik: Penicillium chrysogenum, Pencillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans és Straptomyces clavuligerus.

A találmány egyik megvalósítási formájában az említett ligáz aktivitás expresszióját a béta-laktám bioszintetikus folyamat más génjeinek expressziójával szinkronzáltuk. Az említett gének például a pcbAB, pcbC és/vagy a penDE gének lehetnek .

A fent említett béta-laktám antibiotikumokat a penicil··>· «V ··»·

- 18 űriekből, cefalosporinokból, cefamicinekből, mono-baktámokból és nokardicinekből álló csoportból választjuk.

Az említett antibiotikum előnyösen egy cefalosporin vagy egy penicillin, például penicillin V, penicillin G, V-DCA, G-DCA, 7-(L-a-5-amino-karboxi-valeramido)-cefalosporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA, vagy adipoil-7-ACA.

A találmány egy kiviteli alakjában az említett mikroorganizmust az említett DNS szekvencia expressziójának indukálásához szükséges feltételek mellett tenyésztjük, amikoris aktivált koenzim A tioészter oldallánc termelődik, majd ezután egy aciltranszferáz (AT) enzim jelenlétében az említett oldalláncot tartalmazó béta-laktám képződik.

Az említett módosított mikroorganizmus tenyésztését előnyösen olyan feltételek mellett végezzük, amelyek az említett DNS szerkezet vagy rekombináns vektor kifejeződését indukálják, ennek eredményeként a kívánt béta-laktám antibiotikum oldalláncának megfelelő sav koenzim A-val alkotott tioésztere fokozott mértékben termelődik, ami viszont megnövelt átalakulási sebességet tesz lehetővé a béta-laktám bioszintézisének abban a lépésében, amelyben a béta-laktám oldallánc beépül a béta-laktám magba.

A mikroorganizmus tenyésztését még olyan körülmények között is végezhetjük, amelyek az említett ligáz expresszióját indukáló promotertől függenek.

A penicillin V vagy penicillin G termelés speciális eseteiben, ha a ligáz aktivitást például géntechnológia segítségével fokozzuk, ez intenzív metabolikus folyamathoz vezet a »·«* közé ···*

- 19 bioszintézis utolsó lépése folyamán.

A találmány szerint megjavított eljárások előnyei tartozik — először — egy olyan találmány szerinti eljárás, amely a szóbanforgó béta-laktám antibiotikum össz-kihozatalának lényeges megnövekedését eredményezi.

Másodszor, annak következtében, hogy kevesebb melléktermék képződik, a béta-laktám antibiotikumok lényegében tiszta formában való kinyerése és tisztítása könnyebbé válik.

Harmadszor, a találmány úgy teszi lehetővé a szóbanforgó béta-laktám antibiotikumok termelését, hogy nem képződik jelentős mennyiségű hulladék. Ennek következtében az eljárások sokkal hatékonyabbak, mivel több energia áll rendelkezésre a lényeges termékek szintetizálásához. A hulladék-termékek károsan befolyásolhatják a bioszintetikus folyamatot.

Negyedszer, a szóbanforgó béta-laktám antibiotikum kihozatala a fermentációs eljárás bármely időpontjában jelentősen nagyobb, mint az olyan mikroroganizmusokkal végzett fermentációs eljárásokban, amelyekből hiányzik az említett ligáz aktivitás, vagy amelyekben az említett ligáz aktivitás alacsony. Ebben az összefüggésben a kihozatal vagy össz-kihozatal lehet, vagy pedig egy bizonyos időtartam alatt elért kihozatal.

A fent említett előnyök az iparilag fontos béta-laktám antibiotikumok termelési eljárásait kevésbé költségessé teszik .

A penicillin V és penicillin G termelés eseteiben, ahol a fermentáció folyamán az ACV és izopenicillin N felszaporodása figyelhető meg, a ligáz aktivitás találmány szerinti fokozása az említett intermedier metabolitok felszaporodását, azaz amikor az izopenicillin N átalakulása (konverziója) penicillin V-vé szűk keresztmetszet, csökkenti.

Olyan mikroorganizmusokban, amelyekben alacsony vagy nincs ligáz aktivitás, a ligáz aktivitás találmány szerinti expressziójával vagy az említett ligáz aktivitás csekély fokozásával, például a penicillinek és cefalosporinok termelésekor keletkező felesleges béta-laktám antibiotikum intermedier oldalláncok nem-enzimes eltávolítása oldható meg.

A fermentált béta-laktámok kinyerését és az ezt követő enzimes hidrolízist megkönnyíthetjük, ha az úgynevezett természetes béta-laktámok oldalláncait hidrofób oldalláncokkal — ilyenek például a fenoxi-ecetsav vagy fenil-exetsav — helyettesítjük, amelyek enzimes hidrolízissel könnyen eltávolíthatók penicillin V acilázok vagy penicillin G acilázok használatával. Ezek az enzimek jól ismertek a béta-laktám iparban, a 6-APA termelésénél.

Ez tehát lehetőséget teremt bizonyos iparilag fontos béta-laktám intermedierek, mint a V-DCA és G-DCA in vivő termelésére .

A találmány szerint megállapítottuk, hogy bizonyos béta-laktám antibiotikumok termelését meg lehet oldani kizárólag enzimesen katalizált eljárásokkal, azaz kémiai eljárások használata nélkül.

A találmány egyik megvalósítási alakjában a V-DCA-t vagy G-DCA-t teljes egészében enzimes eljárással, in vivő termeljük úgy, hogy a gazda mikroorganizmust fokozott ligáz aktivitás expressziójára késztetjük a találmány szerint. Jelen vannak továbbá: egy aciltranszferáz (AT) (például a P.chrysogenum eredetű, acil-koenzim A:izopenicillin N aciltranszferáz) és olyan enzimek, amelyek a penicillineket át tudják alakítani cefalosporinokká (például az S.elavuligerus eredetű expandáz).

A találmány egy új enzimre is vonatkozik, amely a találmánynak megfelelően használható.

Nemrég egy ligáz aktivitású megfelelő új enzimet izoláltunk és jellemeztünk.

Ez az új, találmány szerinti enzim egy olyan acil-koenzim A szintetáz (ligáz), amely béta-laktám antibiotikumok termelése esetén a főtermék felé tolja el a reakció irányát.

A találmány szerinti enzim egyik jellemzője, hogy bizonyos iparilag fontos béta-laktám prekurzorokra erősen specifikus .

Minthogy a találmány szerinti ligáznak az ecetsavval szemben nincs nyilvánvaló aktivitása, nem valószínű, hogy a ligáz aktivitás fokozott expressziója az acetil-koenzim A — amely a primer metabolizmus egyik kulcsmetabolitja — intracelluláris hozzáférhetőségét zavarná. Tehát a primer metabolizmus káros befolyásolásának kockázata csökken, összehasonlítva az olyan manipulációkkal (például genetikai vagy kémiai manipulációkkal), amelyek egy olyan ligáz fokozott expressziójához vezetnek, amely mind az ecetsavval, mind a fenil-ecetsawal és/vagy a fenoxi-ecetsavval és/vagy adipinsawal szemben aktivitást fejt ki.

Pontosabban a találmány szerinti új enzim legalább 10-10022 szór, előnyösen 10³-szor és előnyösebben 10⁴-10⁵-ször aktívabb a fenoxi-ecetsawal szemben, mint az ecetsavval szemben.

A találmány szerinti enzimnek a szubsztrát specifitása 10-100-szor, előnyösebben 10³-szor és előnyösebben 10⁴-10⁵-ször erősebb a fenil-ecetsavra, mint az ecetsavra.

A találmány szerinti enzim — mint fentebb említettük — egy acil-koenzim A szintetáz, pontosabban egy fenoxi-acetil-koenczim A szintetáz, amelyet a következőkben ligáz-nak fogunk nevezni.

A ligáz katalitikusán aktív formájának a valószínű molekulatömege 40 000 és 60 000 dalton tartomány közt van, pontosabban körülbelül 50 000 dalton, gélszűréssel meghatározva.

A ligáz valószínű aktivitási optimuma pH 7,0 - 9,0 tartományban van, pontosabban pH 8,0 - 8,5 között. Az enzim in vitro csak alacsony aktivitást fejt ki pH 7 mellett vagy ez alatt, ami feltehetően annak tudható be, hogy a pH 7,5 alatt tartott ligáz stabilitása alacsony.

A ligáz aktivitás optimális hőmérséklete 35 °C és 45 °C közé esik, a legmagasabb aktivitást körülbelül 40 °C-nál fejti ki.

Úgy tűnik, a ligáz izoelektromos pontja (pl) magasabb, mint pH 7,25, valószínűleg pH 9 felett és körülbelül pH 12 alatt van.

Az enzim P.chrysogenum sejtkivonatokból tisztítható, például ammónium-szülfátos kicsapással és különböző géleket (például Phenylsepharose, Cibacron blue és Sephacryl S-200) tartalmazó oszlopokból való elucióval. A ligáz tisztítására alább ismertetünk egy példát. Azonban a proteinek tisztítására használt más, jól ismert eljárások szintén alkalmazhatók, például más oszlop-töltetek is használhatók, ilyenek a Reactiv Red, Sepharose Q FF és Sepharose S FF.

Kimutatták a találmány szerint, hogy az említett ligáz a fenoxi-acetil-koenzim A, fenil-acetil-koenzim A, adipoil-koenzim A és hexanoil-koenzim A képződését képes katalizálni magnézium ionok, ATP, CoASH és fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav, adipinsav, illetve hexánsav elegyéből. Ugyanilyen rendszerekben vizsgálva (például ahogyan alább a példákban leírjuk), a ligáz egyáltalán nem mutat szignifikáns aktivitást az ecetsawal szemben.

Az enzim in vitro nem stabil, de ATP, Mg⁺² és merkapto-etanol, ditiotreitol (DTT), aszkorbinsav vagy más redukáló szerek hozzáadása jelentékenyen stabilizálja az aktivitást a tisztítás és tárolás alatt. Ammónium-szulfát magas koncentrációjának vagy a glicerinnek a jelenléte szintén stabilizálja az enzimet.

A CoASH fogyáson alapuló vizsgálatban a fenil-ecetsawal szembeni aktivitás megközelítőleg 80 %-a a fenoxi-ecetsawal szembeni aktivitásnak, a 6. példában alább leírt teszt feltételek mellett.

Csak akkor figyeltünk meg direkt fenoxi-acetil-koenzim A szintetikus aktivitást, ha más tiolok (például merkapto-etanol, ditiotreitol) nélkül végeztük a vizsgálatot. Viszont, ha a ligázt ATP, Mg²⁺, CoASH, fenoxi-ecetsav és például merkapto-etanol elegyével inkubáltuk, egy olyan vegyület keletkezett, ·· ···· ·· · · · · · • · ····· ·

amelynek ugyanolyan UV spektruma volt, mint a fenoxi-ecetsav és a merkapto-etanoltio észterének —fenoxi-acetil-S-CH2-CH3— és ez szintén úgy viselkedhet, mint egy acil-transzferáz (AT) szubsztrátum.

A találmány egy kiviteli alakjában az említett enzim immunreakciót ad egy Penicillium chrysogenum BIO törzsből származó, találmány szerint tisztított ligázzal szemben termelt antitesttel.

Az enzim immunkémiai tulajdonságait immunológiai keresztaktív azonossági vizsgálatokkal határozhatjuk meg. Az azonossági vizsgálatokat a jól ismert Ouchterlony féle kettős immundiffúziós eljárással vagy a tandem keresztezett immunelektroforézissel végezhetjük el [Lásd: N.H.Axelsen, Handbook of Immunoprecipitationin-Gel Techniques, Blackwell Scientific Publication, 5. és 14. fejezet (1983)]. Az antigén azonosság (antigenic identity) és részleges antigén azonosság (partial antigenic identity) kifejezések értelmezése ugyanebben a kiadványban, az 5., 19. és 20.fejezetben található.

A találmány szerinti enzim egy polipeptid.

A találmány szerinti megfogalmazásban a találmány szerinti enzimek közé érett proteinek, ezek prekurzor formái és olyan működőképes fragmentumai tartoznak, amelyeknek az aktivitása lényegében megegyezik a teljes hosszúságú polipeptidekével.

Megfelelnek a találmánynak az említett enzimek homológjai is. Az ilyen homológok olyan aminosavszekvenciát tartalmaznak, amelynek az azonossági foka a találmány szerinti enzim amino• · ···· ·· · ···· ·· ····· · • · · · · · • · · « ·· ·· ·· ·· savszekvenciájához képest legalább 50-70 %-os, előnyösebben 70-80 %-os, még előnyösebben 100 %-os.

Az azonossági fok hagyományos módszerekkel határozható meg [lásd például: Altshul et al. , Bull .Math.Bio. , 48., 603-616 (1986); Henikoff and Henikoff, Proc . Natl .Acad. Sci . , .89, 10915-10919 (1992)]. Röviden: két aminosavszekvenciát úgy igazítunk egymás mellé, hogy 10-es gab opening penalty, 1-es gap extension penalty értéket és a Henikoff and Henikoff féle blosum 62 számító mátrixot használva az igazodási optimálisak legyenek.

A találmány szerinti enzimnek egy olyan polipeptid is lehet a homológja, amelyet az említett, ligáz aktivitású enzim nukleotid szekvenciájának alapján készített oligonukleotid szondával hibridizáló nukleotid szekvencia kódol.

Azokat a molekulákat, amelyekhez ilyen körülmények között hibridizál az oligonukleotid szonda, standard eljárásokkal (például Southern blotting) mutatjuk ki.

A találmány szerinti polipeptid homológjai egy vagy több aminosavra kiterjedő szubsztitúciókat, deléciókat vagy addíciókat tartalmazhatnak. Előnyös, ha ezek a változások csak kisebb mértékűek, azaz olyan konzervatív aminosav szubsztitúciók, amelyeknek nincs káros hatása a protein felgombolyodottságára vagy aktivitására; olyan kis deléciók, amelyek általában körülbelül 1-30 aminosavat érintenek; az amino- vagy karboxi-terminális végeken csekély mértékű meghosszabbítások, ilyen egy amino-terminális metionincsoport, egy kis linker peptid, amely körülbelül 20-25 csoportból áll, vagy egy kis meghosz• · ···· ·· « ···· ·· ····· · • * · · · · ···· · · ·· ·· · · szabbítás, amely megkönnyíti a tisztítást; ilyen egy polihisztin szakasz, egy antigén epitóp vagy egy kötő dómén. Lásd általánosságban: Ford et al., Protein Expression and Purification, 2, 95-107 (1991). A konzervatív szubsztitúciókat például a bázikus aminosavak (arginin, hisztidin, lizin), savas jellegű aminosavak (glutaminsav, aszparaginsav), poláris aminosavak (glutamin, aszparagin), hidrofób aminosavak (leucin, izoleucin, valin), aromás aminosavak (fenilalanin, triptofán, tirozin) és a rövid láncú aminosavak (glicin, alanin, szerin, treonin, metionin) csoportjain belül végezzük.

A szakmában járatos szakemberek számára nyilvánvaló, hogy az ilyen szubsztitúciókat a molekula funkciója szempontjából kritikus területeken kívül lehet csak végrehajtani, amelyek még aktív enzimet eredményeznek. A találmány szerinti enzim aktivitása szempontjából esszenciális aminosavak, amelyek nem képezhetik szubsztitúció tárgyát, a szakterület ismert eljárásai szerint azonosíthatók, ilyen például a helyre irányuló mutagenezis vagy az alanine-scanning mutagenezis [Cunningham and Wells, Science, 244, 1081-1085 (1989)]. Ez utóbbi technika szerint a molekula minden csoportjánál mutatációkat visznek be, és a kapott mutáns molekulát biológiai aktivitásra tesztelik (például ligáz aktivitásra), hogy meghatározzák azokat az aminosav csoportokat, amelyek a molekula aktivitására nézve kritikusak. A ligandum - receporo kölcsönhatás helyeit is meg lehet határozni kristályszerkezet analízissel, ilyen technika a magmágneses rezonancia, krisztallográfia vagy a fotoaffinitás jelzés [lásd például: De Vos et al., Science, 255, 306-312

(1992); Smith et al., J.Mól.Bioi., 224, 899-940 (1992); Wlodaver et al., FEBS Lett., 309, 59-64 (1992)].

A homológ lehet egy alléi változat, azaz egy olyan gén alternatív formája, amely mutáció révén jött létre, vagy egy mutált gén által kódolt módosult enzim, de lényegében ugyanolyan aktivitású, mint a találmány szerinti enzim. A mutációk tehát vagy csendesek (nincs változás a kódolt enzimben), vagy pedig olyan enzimeket kódolhatnak, amelyekben módosult az aminosavszekvencia.

A találmány szerinti enzim homológja species homológ is lehet, azaz egy más fajból származó, hasonló aktivitású enzim.

Az enzim egy homológját úgy izolálhatjuk, hogy a kérdéses faj egy sejtjéből genomiális vagy cDNS tárat készítünk, és olyan DNS szekvenciákra szúrjuk, amelyek az egész homológot vagy egy részét kódolják. A szűrést szintetikus oligonukleotid szondák használatával, standard technikákkal végezzük, például ahogyan Sambrook és munkatársai leírták [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)], vagy polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, specifikus primereket használva, Sambrook és munkatársai (lásd fentebb) szerint.

A találmány szerinti enzim további homológjainak tekinthetők azok, amelyek immunológiai keresztreakciót adnak a találmány szerinti enzim ellen termelt antitestekkel.

A találmány feladatát képezi továbbá, hogy olyan DNS szerkezetet állítsunk elő, amely az említett ligáz aktivitású enzimet kódolja.

A leírásban használt DNS szerkezet kifejezés alatt minden cDNS, genomiális DNS, szintetikus DNS vagy RNS eredetű nukleinsav molekulát értünk. A szerkezet kifejezéssel egy olyan nukleinsav szegmentumra kívánunk utalni, amely egyszálú vagy kétszálű lehet, és amely egy szóbanforgó polipeptidet kódoló teljes vagy részleges, természetben előforduló nukleotid szekvencián alapulhat. A szerkezet adott esetben más nukleinsav szegmentumokat is tartalmazhat.

A találmány szerinti DNS szerkezet, amely a találmány szerinti polipeptidet kódolja, genomiális vagy cDNS eredetű lehet, és például úgy állítjuk elő, hogy készítünk egy genomiális vagy cDNS tárat, amelyet olyan DNS szekvenciákra szúrunk, amelyek a teljes polipeptidet vagy ennek részét kódolják. A szűrést szintetikus oligonukleotid szondákkal való hibridizációval végezzük, standard technikákat haználva [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989)] A találmány szerinti célnak megfelelő polipeptidet kódoló DNS szekvencia előnyösen fonalas gomba vagy bakteriális eredetű.

A polipeptidet kódoló találmány szerinti DNS szekvenciát szintetikus úton is előállíthatjuk eddig már kidolgozott standard módszerek segítségével, például a Beaucage és Cardthers által leírt [Tetrahedron Letters, 22 , 1859-1869)] foszforamidit módszerrel, vagy a Matthes és munkatársai által leírt [EMBO Journal, 3., 801-805 (1984)] módszerrel. A foszforamidit módszer szerint az oligonukleotidokat például automata DNS szintetizátorban szintetizálják, majd tisztítják, anellálják, » · · · · « ligáiják és megfelelő vektorokba klónozzák. A DNS szerkezet ezenkívül szintetikus és genomiális eredetű szekvenciák keverékéből is állhat, továbbá szintetikus és cDNS eredetű vagy genomiális és cDNS eredetű keverékből. Ezeket úgy állítjuk elő, hogy a szintetikus, genomiális vagy cDNS eredetű fragmentumokat (az adott esetnek megfelelően) — azaz a teljes nukleinsav szerkezet különböző részeinek megfelelő fragmentumokat — standard technikák szerint ligáljuk.

A DNS szerkezet polimeráz láncreakcióval is előállítható, specifikus primerek használatával [lásd: US 4,683,202 vagy Saiki et al., Science, 239, 487-491 (1988)]. A találmány egy előnyös kiviteli alakjában a DNS szekvencia Aspergillus, Penicillium, vagy Cephalosporium nemzetséghez tartozó fonalas gombából, előnyösen P.chrysogenum, C.acremonium vagy A.nidulans törzsből, elsősorban a P.chrysogenum BIO törzséből származik.

A találmány a továbbiakban az említett, ligáz aktivitású enzimet kódoló találmány szerinti DNS szerkezetet tartalmazó rekombináns vektorra vagy transzformáció hordozóra vonatkozik.

A rekombináns vektor, amelybe a találmány szerinti DNS szerkezetet beépítjük, minden olyan vektor lehet, amelyet nehézség nélkül kezelhetünk rekombináns DNS eljárásokban. A vektor kiválasztása gyakran attól a gazdasejttől függ, amibe be fogjuk vezetni. Ennélfogva a vektor vagy autonóm módon replikálódó vektor lehet, azaz egy olyan vektor, amely kromoszómán kívüli entitásként létezik, és replikációja független a kromoszóma replikációjától, például ilyen egy plazmid, vagy használhatunk olyan vektort is, amelyet ha beviszünk a gazdasejtbe, a gazda30 sejt genomjába integrálódik, és azzal a kromoszómával (azokkal a kromoszómákkal) együtt replikálódik, amelybe integrálódott.

Előnyös, ha a vektor egy olyan expressziós vektor, amelyben a találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvenica működőképesen kapcsolódik a DNS transzkripciójához szükséges további szegmentumokhoz. Az expressziós vektor — általánosságban — plazmid vagy vírus DNS-ből származik, de tartalmazhatja mindkét elemet. A működőképesen kapcsolódik kifejezés azt jelenti, hogy a szegmentumok elrendezése olyan, hogy a szándékolt célok érdekében összhangban működnek, például a transzkripció egy promoterben indul meg, és a polipeptidet kódoló DNS szekvencia mentén halad előre.

Promoter lehet minden olyan DNS szekvencia, amely a kiválasztott gazdasejtben transzkripciós aktivitást mutat, és olyan génekből származhat, amelyek a gazdasejthez képest vagy homológok vagy heterológok.

Fonalas gomba gazdasejtekben való felhasználásra alkalmas promoter például az ADH3 promoter [McKnight et al., The EMBO J.,4, 2093-2099 (1985)] vagy a tpiA promoter. További hasznos promoterek például azok, amelyek az A.oryzae TAKA amilázt, a Rhizomucor miehei aszparagin proteinázt, az A.niger semleges alfa-amilázt, az A.niger sav-stabil alfa-amilázt, az A.niger vagy A.awamori glükoamilázt (gluA), Rhizomucor miehei lipázt,

A.oryzae alkalikus proteázt, A.oryzae trióz-foszfát izomerázt vagy az An.nidulans acetamidázt kódoló génből származnak. Előnyösek a TAKA amiláz és gluA promoterek.

Két vagy több bioszintetikus gén szabályozására gyakran előnyös az azonos vagy hasonló promoterek használata amiatt, hogy a béta-laktám antibiotikum szintézisben szereplő köztitermékek szinronizált termelése valósuljon meg. Ha a köztitermékek termelése nem szinkronizált, a köztitermékek felszaporodhatnak (szűk keresztmetszet). Ennek következtében a béta-laktám antibiotikum termelés visszamarad.

A találmány egy megvalósítása során az említett ligáz gén promoterét egy másik olyan gén promoterével cseréltük ki, amely béta-laktámok bioszintézisében vesz részt.

Egy megfelelő promoterre jellemző példa az 1118/94 számú nem közzétett dániai szabadalmi bejelentésben leírt AT promoter .

Bakteriális gazdasejtekben való felhasználásra alkalmas promoter például a Bacillus stearothermophilus maltogén amiláz gén, a Bacillus licheniformis alfa-amiláz gén, a Bacillus amyloliquefaciens BÁN amiláz gén, a Bacillus subtilis alkalikus proteáz gén vagy a Bacillus pumilus xilozidáz gén promotere, vagy a lambda fág P_R vagy Pl promoterei vagy az E.coli lac, trp vagy tac promoterei.

A találmány szerinti enzimet kódoló DNS szekvencia szükség esetén működőképesen kapcsolódhat egy megfelelő terminátorhoz is.

Előnyös lehet, ha a találmány szerinti rekombináns vektor olyan DNS szekvenciát tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a vektor a szóbanforgó gazdasejtben replikálódjék.

A rekombináns vektor szelekciós markert is tartalmazhat, például egy olyan gént, amelynek a terméke kijavít egy hibát a • · · · · * ·« ·· ·· gazdasejtben, ilyen a dihidrofolát reduktázt (DHFR) kódoló gén vagy a Schizosaccharomyces pombe TPI gén [P.R.Russel, Gene, 40, 125-130 (1985)], vagy egy olyan gént, amely rezisztenciát ad egy gyógyszerrel szemben, például az ampicillinnel, kanamicinnel, tetraciklinnel, fleomicinnel, kloramfenikollal, neomicinnel, higromicinnel, vagy metotrexáttal szemben. Fonalas gombáknál használt szelekciósmarker például az amdS, pyrG, argB, niaD és sC.

Annak érdekében, hogy a találmány szerinti ligáz enzimet a gazdasejten belül a kívánt helyre vagy a fermentációs táptalajba irányítsuk, targeting szignállal, illetve szekréciós szignálszekvenciával (vezérszekvencia, prepro-szekvencia vagy pre-szekvencia néven is ismert) láthatjuk el a rekombináns vektort. A targeting szignálok vagy a szekréciós szignálszekvenciák az enzimet kódoló DNS szekvenciához a helyes leolvasási keretben kapcsolódnak. A szekréciós szekvenciák rendszerint az enzimet kódolóDNS szekvenciától 5' felé helyezkednek el, míg a targeting szignálszekvenciák helye rendszerint a DNS szekvenciától 3' felé esik. Használható olyan targeting szignál, vagy használhatók olyan szekréciós szignálszekvenciák, amelyek természetszerűen társulnak az enzimhez, vagy származhatnak egy más proteint kódoló olyan génből, amely a kívánt szignálszekvenciát tartalmazza.

Fonalas gombákban való használathoz megfelel, ha a szignálpeptid egy Aspergillus faj eredetű amilázt vagy glükoamilázt kódoló génből, a Rhizomucor miehei lipázt vagy proteázt vagy a Humicolal anuginosa lipázt, stb. kódoló génből szárma»··· ·· zik. Előnyös, ha a szignálpeptid az A.oryzae TAKA amilázt, az A.niger neutrális alfa-amilázt, az A.niger sav-stabil amilázt, vagy az A.niger glükoamilázt kódoló génből származik.

A találmány szerinti targeting szekvencia előnyösen egy olyan targeting szignál, amely a ligáz aktivitást a kívánt helyre képes irányítani a sejten belül (például a mikrotestekhez). Gyakran megkívánt, hogy fenntartsunk potenciális targeting szignálokat. Azonban a targeting szignált más olyan szignálokra cserélhetjük, amelyeknek azonos a funkciójuk. Ezenkívül, ha egy mikroorganizmusba egy olyan ligáz kódoló szekvenciát építünk be, amelynek nincs alkalmas ligáz targeting szignálja, akkor ezt hozzá is adhatjuk, hogy a ligáz expreszsziója a gazdasejten belül a kívánt helyen menjen végbe.

Fonalas gombákban való használatra például egy olyan peroxiszómális targeting szignál (PTS) felel meg, amely képes a citoszol utazó (passenger) proteinjeit a peroxiszómákhoz (mikrotestekhez) áthelyezni, mint például a Neurospora crassa-ban [lásd: Keller et al., J.Cell.Biol., 114, 893-904 (1991)].

A találmány szerinti enzimet kódoló DNS szekvenciák ligálásához, a promoter és adott esetben a terminátor és/vagy szekréciós szignálszekvencia, illetve targeting szignál szekvencia ligálásához használt eljárások, valamint ezeknek a replikációhoz szükséges információt tartalmazó megfelelő vektorokba való beépítéséhez használt eljárások, jól ismertek azok számára, akik ezen a szakterületen gyakorlattal rendelkeznek [lásd: Sambrock et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. kiadás, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring

Harbor, New York (1989)].

A találmány további tárgyát egy találmány szerinti DNS szerkezetet vagy rekombináns vektrot tartalmazó sejt képezi.

A gazdasejtbe bevezetett találmány szerinti polipeptidet kódoló DNS szekvencia a szóbanforgó gazdasejtre nézve homológ vagy heterológ lehet. Amennyiben ez a DNS szekvencia homológ a gazdasejttel, azaz a természetben a gazdasejt termeli, mesterségesen hozzáköthetjük más olyan promoter szekvenciához vagy — amennyiben alkalmazható — más olyan szekréciós szignálszekvenciához és/vagy terminátorszekvenciához, amelyek természetes környezetében nem fordulnak elő. A homológ kifejezést olyan DNS-re, fél-szintetikus vagy szintetikus úton előállított DNS szekvenciára vonatkoztatjuk, amely a szóbanforgó gazdaszervezet szempontjából természetes polipeptidet kódol. A DNS szekvencia tehát származhat más mikroorganizmusból is, vagy lehet szintetikus szekvencia is.

Egy gazdasejt, amelybe a találmány szerinti DNS szerkezetet vagy rekombináns vektort bevisszük, minden olyan sejt lehet, amelyet képessé tehetünk a találmány szerinti polipeptid (enzim) termelésére, és amelyek előnyösen fonalas gombák és baktérium sejtek.

Az alábbiakban példaként felsorolunk olyan bakteriális gazdasejteket, amelyek — tenyésztésük folyamán — képesek a találmány szerinti enzim termelésére. Ilyenek a Gram-pozitív baktériumok, mint a Bacillus törzsek, például a B.subtilis,

B.licheniformis, B.lentus, B.brevis, B.stearothermophilus, B.alkalophilus, B.amyloliquefaciens, B.coagulans, B.circulans,

B.lautus, B.megaterium vagy B.thuringiensis, vagy a Streptomyces törzsek, mint a S.lividans, S.murinus vagy S.clavuligerus, vagy a Gram-negatív baktériumok, mint az Escherichia coli. A baktériumok transzformálását vagy protoplaszt transzformációval vagy önmagában ismert módon, kompetens sejtek használatával végezhetjük (Sambrook et al., lásd előbb).

Amennyiben az enzimet baktériumokban, például E.coli-bán fejezzük ki, az enzim vagy a citoplazmában marad, általában oldhatatlan szemcsék (zárványtestek) alakjában, vagy pedig bakteriális szekréciós szekvencia segítségével kijut a periplazmatikus térbe. Az előbbi esetben a sejteket lizáljuk, a szemcséket kinyerjük és denaturáljuk, majd ezután a polipeptidet újra felgombolyítjuk a denaturáló szer felhígítása révén. Az utóbbi esetben az enzimet a periplazmatikus térből izoláljuk a sejt feltárásával, amelyet például ultrahanggal vagy ozmotikus sokk segítségével végezhetünk, amikoris a periplazmatikus tér tartalma kiszabadul, és az enzimet izoláljuk.

Fonalas gomba sejtek például a következők: Penicillium, Aspergillus, Neurospora, Fusarium, Trichoderma vagy Cephalosporium fajok, főképpen a P.chrysogenum, P.notatum, A.oryzae, A.nidulans, A.niger vagy C.acremonium törzsek. A gombasejteket olyan eljárással transzformálhatjuk, amely magába foglalja a protoplaszt képzést, a protoplasztok transzformációját, amely után a sejtfal regenerálása következik önmagában ismert módon. Az Aspergillus fajok használatát proteinek expressziójához például az EP 272 277, EP 238 023 és EP 184 438 európai szabadalmi leírások írják le. A F.oxysporum transzformálását példá-

ul Malardier és munkatársai [Gene, 78, 147-156 (1989)] szerint végezhetjük.

Amikor fonalas gombát használunk gazdasejt gyanánt, a sejtet megfelelő módon úgy transzformálhatjuk a találmány szerinti DNS szerkezettel, hogy a DNS szerkezetet a gazda kromoszómájába integráljuk, és így rekombináns gazdasejtet kapunk. Az integrálás általában előnyösnek tekinthető, ugyanis így valószínűbb, hogy a DNS szekvencia stabilan a sejtben marad. A DNS szerkezeteknek a gazda kromoszómájába való integrálását a szokásos módszerekkel végezzük, például homológ vagy heterológ rekombinációval.

A fentiek szerint transzformált vagy transzfektált gazdasejtet megfelelő táptalajban, olyan feltételek mellett tenyésztjük, amelyek lehetővé teszik a találmány szerinti enzim expresszióját. Ezután a kapott enzimet a tenyészetből izolálhatjuk.

A sejtek tenyésztéséhez használt táptalaj bármilyen, a gazdasejtek növekedéséhez alkalmas, szokásos táptalaj lehet. Ilyenek a minimál táptalajok, vagy a megfelelő kiegészítőket tartalmazó komplex táptalajok. A megfelelő táptalajokat vagy kereskedelmi cégektől szerezzük be, vagy pedig elkészítjük leközölt receptek szerint (lásd például az American Type Culture Collection katalógusait) .

A sejtek által termelt enzimet ezután hagyományos módszerekkel nyerjük ki a táptalajból, például úgy, hogy a gazdasejteket centrifugálással vagy szűréssel választjuk el a táptalajtól, a felül úszóból vagy a szűrletből kisózással — példá«« ···· • · · · • · * • · * · »· ·· ·· ul ammónium-szulfáttal — csapjuk ki a protein komponenseket, a tisztítást különböző kromatográfiás és/vagy elektroforetikus eljárásokkal végezzük, például ioncserés kromatográfiával, gélszűréses kromatográfiával, izoelektromos fokuszálással, affinitás -kromatográf iával vagy hasonlókkal, a szóbanforgó polipeptid típusától függően.

Abban az esetben, ha az enzim intracellulárisan van jelen a gazdasejtben, a sejteket először centrifugálással vagy szűréssel nyerjük ki a fermentléből. A sejteket ezután homogenizátorban tárjuk fel, majd a felül úszó vagy szürlet protein komponenseit kisózással csapjuk ki, mint fent említettük. Végül az enzimet a fent leírtak szerint tisztítjuk.

A találmány egy kiviteli alakjában a gazdasejt vagy bakteriális sejt, mégpedig Gram-pozitív baktérium sejt, például Bacillus vagy Streptomyces'nemhez tartozó sejt, vagy Gram-negatív baktérium sejt, például Escherichia nembéli sejt vagy fonalas gomba, például Aspergillus, Cephalosporoium vagy Penicillium nembéli sejt.

Egy előnyös kiviteli alakban a gazdasejt P.chrysogenum és

C.acremonium.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Törzsek.

BIO: P.chrysogenum törzs (beszerezhető: Panlabs, 11804 North

Creek Parkway South, Bothell WA 98011-8805, USA) .

P8: P.chrysogenum törzs (a Panlabs-tól beszerezhető).

Anyagok.

LCS Agar táptalaj: [Z.Vanek, Z.Hostálek (szerk.) Overpro·*♦ • ·

- 38 duction of microbial metabolites, strain improvement and process control strategies (Butterworth, Boston, 1986) című kiadványban J.Lein, The Panlabs penicillin strain improvement program 105-139 old.].

LCS táptalaj: laktóz monohidrát 1,5 %, kukoricalekvár 0,5 %, pepton 0,5 %, nátrium-klorid 0,4 %, magnézium-szulfát—víz (1/7) 0,05 %, kálium-dihidrogén-foszfát 0,06 %, vas(III)-klorid—víz (1/6) 0,0005 %. Tween-80: Merck, kat-szám: 822187.

P-l inokulum táptalaj: [J.Lein, lásd előbb (1986)].

P-2 fermentációs táptalaj: [J.Lein, lásd előbb (1986)].

Vektor.

pUC19: 2,6 kb méretű Asp719-Sall fragmentum.

Transzformáció szelekciós marker.

Aspergillus oryzae által kifejezett E.coli Tn5 fleomicin rezisztencia gén, TPI (trióz-foszfát-izomeráz) promoter és Aspergillus niger AMG (amiloglükozidáz) terminátor.

Készülékek.

Sepharose S FF oszlop (Pharmacia Biotech),

Phenyl-Sepharose CL 4B oszlop (150 ml) (Pharmacia Biotech),

PdlO oszlop (Pharmacia Biotech),

Supelcosil RP C-18 DB oszlop (250x4,6 mm) Supelguard (Supelco), Flow-one/Beta serie 100 radioaktivitás detektor (Radiomatic), Yttrium-szilikát cella (Radiomatic),

Sephacryl S-200 oszlop (181 ml) (Pharmacia Biotech),

Cromatofocussing PBE 94 oszlop (20 ml) (Pharmacia Biotech), Pharmacia LKB PhastSystem (Pharmacia Biotech),

Cibacron Blue 3GA oszlop (Sigma), |«· <« * * • · *>··>·

- 39 ABI 1000S fotodióda sor HPLC detektor (Applied Biosystem) ,

HPLC (Waters),

Applied Biosystems 394 DNA/RNA szintetizátor,

Applied Biosystems 473 Amino Acid szekvenátor,

Waters 991 Pohotiode Array Detector.

Referencia enzimek és vegyületek.

Acetyl-coenzyme A (Sigma), (acetil-koenzim A)

Acetyl-coenzyme A synthetase (Sigma), (acetil-koenzim A szintetáz)

Bovine serum albumin (BSA) (Sigma A7638); (marha szérum albumin)

Gelfiltration Calibration Kit (Pharmacia Biotech), (gélszüréshez kalibrációs készlet)

Fenoxi-ecetsav koenzim A észter [M.J.Alonso et al., J.Antibiot. , 41, 1074-1084 (1988)],

Fenil-ecetsav koenzim A észter (Sigma) (Phenyl acetic acid coenzyme A ester)

Adipinsav koenzim A észter. A következőképpen készült: koenzim A nátrium sójának (400 mg; 5,152 χ 10“⁴ mM, Sigma) vizet (0,6 ml) és 0,2M kálium-hidrogén-karbonátot (a pH 7 fölé való állításához) tartalmazó acetonos (60 ml; Merck PA) szuszpenziójához erős keverés és jeges vízzel való hűtés közben, nitrogén atmoszféra alatt, hozzáadunk adipoil-kloridot (0,14 ml; Aldrich). A reakcióelegy pH-ját 7,7-re emeljük, majd tovább keverjük 60 percig ugyanezen a hőmérsékleten. Ezután az acetont alacsony nyomáson részben eltávolítjuk, a kapott terméket hideg vízben oldjuk és Iofilizáljuk. A kitermelés 0,0890 g. Vé4« ·»

- 40 ·· ·ν«· »·

9 4 · » · ♦ «44 • · 4 4 4 ···« ·· ·€ gül a terméket ultraszűrjük.

Pufferek.

Puffer A

Puffer B

Puffer C mM trisz.HCl, pH 8,5, 1,36 M ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorinsav, 1 mM PMSF (fenil-metil-szulfonil-fluorid);

mM trisz.HCl, pH 8,5, 0,68 M ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF;

mM trisz.HCl, pH 8,5, 20 % glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF;

Puffer D: puffer C + 150 mM kálium-klorid;

Puffer E: 10 mM trisz.HCl, 20% glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF, pH 8,2;

Puffer F: 50 mM trisz.HCl, 20 % glicerin, 4 mM EDTA, 5 mM magnézium-klorid, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, pH 7,5.

Oldatok.

A oldat: 50 mM trisz.HCl, pH 8,5, 35 % ammónium-szulfát, 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 1 mM PMSF, 5 mM merkapto-etanol;

B oldat: 10 μΐ 0,25 M magnézium-klorid, 50 μΐ 0,1 M ATP 50 mM trisz.CHl-ben, pH 8,0, 50 μΐ 20 mM CoASH 50 mM triszHCl-ben, pH 8,0 és 30 μΐ 0,2 M fenoxi-ecetsav vagy fenil-ecetsav vagy adipinsav vagy hexánsav 50 mM trisz.HCl-ben, pH 8,0, keverve és egyensúlyba hozva 25 °C-on 5 percen át;

C oldat: 50 mM trisz.HCl, pH 8,5, ammónium-szulfát (20 %-os telítés), 4 mM EDTA, 5 mM ATP, 5 mM aszkorbinsav, 1 mM PMSF, 4 mM magnézium-klorid;

···« »· ····

- 41 D oldat: 5 ml a kővetkezőket tartalmazza: 1,2 M magnézium-szulfát, 10 mM nátrium-dihidrogén-foszfát, pH 5,8, 150 mg Novozym 234 (sarzs szám: 1199), 100 μΐ kitináz (Sigma, 4 U/ml);

E oldat: 0,6 M szorbit, 100 mM trisz.HCl, pH 7,0;

F oldat: 1,2 M szorbit, 10 mM trisz.HCl, pH 7,5, 10 mM kalcium-klorid;

G oldat: 60 % PEG 4000 (EDH 29576), 10 mM trisz.HCl, pH 7,5, 10 mM kalcium-klorid;

Oldószer H: 20 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5;

Oldószer I: 13 % metanol 20 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 2,5;

Szubsztrát oldat A: 100 μΐ 0,25 M magnézium-klorid, 500 μΐ 0,1 Μ ATP 50 mM trisz.HCl-ben, 500 μΐ 20 mM CoASH 50 mM trisz.HCl-ben és 300 μΐ 0,067 m kálium-acetát 50 mM trisz.HCl-ben;

Oldószer A: 15 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5;

Oldószer B: 5 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben, pH 6,5.

··· ·

- 42 MÓDSZEREK

A) Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz klónozása P.chrysogenumból.

Genomiális DNS-t izoláltunk P.chrysogenum-ból Schwarz-Sommer és munkatársai szerint [EMBO J. , 3., 1021-1028 (1984)], majd részlegesen emésztettük Sau3A-val. Ezután a 15-23 kb méretű fragmentumokat izoláltuk, és lambda EMBL3 BamHI karokhoz (Promega) ligáltuk.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz egy részleges aminosavszekvenciáját — amennyiben homogenitásig tisztított — úgy határozhatjuk meg, hogy Edman degradációt alkalmazunk a ligázra vagy egy fragmentumára, majd egy Applied Biosystems 473 aminosav szekvenátort használunk. Az aminosavszekvenciából származtatott primereket a Beaucage és Caruthers által leirt [Tetrahedron Letters, 22. 1859-1869 (1981) ] foszforamidit módszerrel állíthatjuk elő, például az Applied Biosystems féle 394 DNA/RNA szintetizátor használatával.

A lambda EMBL3-ban létrehozott P.chrysogenum DNS genomiális tár plakk hibridizációs módszerrel végzett szűrésével [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] egy olyan klón izolálható, amely a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz génre specifikus primerrel hibridizál.

A működőképes fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz gént tartalmazó lambda klón szakaszt pUC19 vektorba szubklónoztuk Tn5 fleomicin rezisztencia génnel együtt, és a kapott plazmidot például a P.chrysogenum transzformálására használhatjuk.

• ·

- 43 Β) A Ρ.chrysogenum transzformálása.

A Penicillium chrysogenum BIO törzset (nagy hozamú törzs) db, 100-100 ml LCS táptalajt tartalmazó palackban tenyésztettük 36 órán át 26 °C-on. A micéliumokat Myra-szöveten gyűjtöttük össze, majd 500 ml 0,6 M magnézium-szulfát oldattal alaposan átmostuk. A micéliumokat ezután műanyag csőbe helyeztük, ml D oldatban szuszpendáltuk, és 5 percig jégre tettük. A micélium szuszpenzióhoz 750 μΐ BSA-t (12 mg/ml) adtunk, és tovább inkubáltuk 30 °C-on 1-2 órán át, óvatosan rázogatva. A protoplaszt képződést fény-mikroszkóppal ellenőriztük.

A protoplasztokat Myra-szöveten gyűjtöttük össze, majd óvatosan 5 ml E oldatra rétegeztük. Lassú, 2000 ford/perc-nél nem gyorsabb centrifugálás után az E oldat és D oldat közötti fázisban elhelyezkedő protoplasztokat kipipettáztuk, és 2 térfogat F oldat hozzáadásával felhígítottuk. Ezután 5 percig újból centrifugáltuk 2500 ford/perc mellett. A protoplaszt üledéket kétszer mostuk F oldattal, majd az izolált protoplasztokat F oldat hozzáadásával úgy hígítottuk, hogy ml-énként 1-2 x 10⁷ sejtet kapjunk. A transzformáláshoz 100 μΐ protoplasztot használtunk.

Cézium-klorid sürüség-grádiens centrifugálással (Maniatis et al., 1982, lásd előbb) készített 10 ^g DNS-t adtunk a protoplasztokhoz, és 20 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk. Ezután 200 μΐ G oldatot adtunk hozzá, 20 percig szobahőmérsékleten állni hagytuk, majd 3 térfogat 1,2 M szorbit oldatot adtunk hozzá. A protoplaszt — DNS aggregátumot 2500 ford/perc mellett 10 percig centrifugáltuk. Az üledéket 300 μΐ 1,2 M szorbit-oldat hozzáadásával reszuszpendáltuk, majd 3 szelektív lemezre vittük (mindegyikre 100 μΙ-t). A lemezeken lévő LCS agar 50 μ/ml fleomicint tartalmazott. A lemezeket 26 °C-on inkubáltuk addig, amíg a transzformált sejtek meg nem jelentek.

Ezután a transzformált sejteket izolálhatjuk, és rázott palackokban való fermentálással ellenőrizhetjük penicillin termelő képességüket.

C) A P. chrysogenum fermentálása*.

Penicillin chrysogenum BIO vagy P8 (Panlabs) törzs liofilizált spóráit 0,1 % (térf/térf) Tween 80 tartalmú desztillált vízben szuszpendáltuk, majd 10 ml LCS Agar (ferde) táptalajokra oltottuk. Az agart 25 °C-on 10 napig inkubáltuk, majd az egyes ferde agarok felületéről 10 ml 0,1 %-os Tween 80-ban szuszpendáltuk a spórákat. E szuszpenzió 5 ml-ét használtuk 50 ml P-l inokulum táptalajt tartalmazó 300 ml-es Erlenmeyer lombikok beoltására. Az inokulum tenyészeteket 25 °C-on inkubáltuk körforgó rázógépen (290 ford/perc), és 48 óra múlva az inokulum tenyészet 2 ml-es részleteit használtuk a P-2 fermentációs táptalaj — 35 ml 300 ml-es Erlenmeyer lombikokban (a sertés zsírt olívaolajjal helyettesítettük) — beoltásához. A tenyészeteket 25 °C-on inkubáltuk — 250 ford per perc mellett — az aratásig.

D) Aratás, extrahálás és kicsapás.

A P.chrysogenum 3 napos tenyészetéből szűréssel izoláltuk a sejteket, és azonnal mostuk 5 térfogat 0,9 %-os nátrium-klorid oldattal. A sejteket folyékony nitrogénben fagyasztottuk, és mozsárban homogenizáltuk. Az enzimet A oldatban való szusz45 pendálással extraháltuk. A sejttörmelékeket centrifugálással távolítottuk el. A kivonatot 50 %-ig telítettük ammónium-szulfáttal, és a csapadékot centrifugálással távolítottuk el. Ezután az enzimet úgy csaptuk ki, hogy 70 % telítésig adtunk hozzá ammónium-szulfátot. Centrifugálás után az üledéket a C oldatban oldottuk fel.

E) Phenyl-Sepharose CL 4B oszlopkromatográfia.

Az előző fejezet szerint kapott 2280 mg proteint (95 ml) Phenyl-Sepharose CL 48 oszlopra (150 ml) vittük fel, amelyet Puffer A-val — 60 ml/óra átfolyási sebesség mellett — hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot 500 ml Puffer A-val mostuk, majd grádiens elució következett 100 % Puffer C-ig; összmennyiség:

1800 ml. A frakciószedés 8 ml-enként történt.

Minden frakciót fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitásra és acetil-koenzim A szintetáz aktivitásra analizáltunk.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 115-277 számú frakció között oldódott ki, az aktivitás csúcsa a 175-ös frakcióban mutatkozott. Az acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a

108-157 számú frakció között oldódott ki, az aktivitás csúcsa a 118-as frakcióban mutatkozott.

F) Cibacron Blue oszlop-kromatográfia.

A Phenyl-Sepharose kromatografálással kapott 143-225 frakciókat egyesítettük, és a proteint 65 %-os telítéssel, ammónium-szülfáttál csaptuk ki. A csapadékot 10 ml Puffer C-ben szuszpendáltuk, és PD10 oszlopon sótlanítottuk. A minta végső mennyisége 16 ml volt.

Ezt a mintát Puffer C-vel kiegyensúlyozott 20 ml Cibacron *♦

- 46 Blue-val töltött oszlopra vittük. Az oszlopot 10-szeres oszloptérfogat Puffer C-vel mostuk, és kálium-klorid gradienssel (0 - 0,25 M KCl) eluáltuk, 25 ml/óra átfolyási sebesség használatával. Az eluátumot 8,3 ml-es frakciókként gyűjtöttük. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 36. - 65. számú frakciók között oldódott ki, a 45. számú frakcióban lévő maximummal .

G) Gélszúrés S-200 (Super fine) oszlopon.

A Cibacron Blue kromatográfiával kapott 36-56. számú frakciókat egyesítettük és ultraszűréssel (kizárási molekulatömeg határ = cut off : 10 000) koncentráltuk, PD10 oszlopon sótlanitottuk Puffer D-vel. Ezután 7 mg proteint (3,3 ml) vittünk egy Sephacryl S-200 oszlopra (181 ml), amelyet ugyenezen pufferrel hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot Puffer D-vel eluál tűk (átfolyási sebesség: 10 ml/óra), a frakciókat 1 ml-enként szedtük és vizsgáltuk. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitása a 72 - 118. számú frakciók között oldódott ki, az aktivitás a 87. frakcióban mutatott csúcsot.

H) Kromatofókuszálás PBE 94 oszlopon.

A 79-101. számú frakciókat egyesítettük, ultraszűréssel koncentráltuk (cut off 10 000), és PD10 oszlopon sótlanitottuk Puffer E hasznlatával. A minta végső mennyisége 30 ml.

A mintát Puffer E-vel kiegyensúlyozott 20 ml PBE 94 oszlopra vittük, és az oszlopot Puffer E-vel eluáltuk, 30 ml/óra átfolyási sebesség mellett. A frakciókat 1,5 ml-enként gyűjtöttük. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a 11-40.

számú frakciókban oldódott ki, a maximális aktivitást a 17.

számú frakcióban kaptuk.

I) Sepharose S FF oszlopkromatográfia.

A Phenyl-Sepharose kromatográfiával (lásd fent) kapott 143-225. számú frakciók pooljából egy részletet (protein tartalom: 149 mg) 65 % telítésig hozzáadott ammónium-szulfáttal csaptuk ki. A csapadékot Puffer F-ben reszuszpendáltuk, és PD10 oszlopon sótlanítottuk. A végső minta mennyisége 28 ml volt.

A mintát egy előzőleg Puffer F-fel kiegyensúlyozott 50 ml-es Sepharose S FF oszlopra vittük fel. A minta felvitele után az oszlopot 150 ml Puffer F-fel mostuk, majd kálium-klorid grádiensben (0 — 0,3 M KCl) eluáltuk. Minden lépésben 5 ml/óra átfolyási sebességet használtunk, és 5 ml-énként szedtük a frakciókat. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást a 45 - 120. számú frakciók között eluálódott, a maximális aktivitást a 48. frakció tartalmazta, míg a fő protein csúcs a 16. frakcióban jelent meg.

J) Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.

A reakciót úgy indítjuk, hogy 100 μΐ enzim oldatot adunk a fenoxi-ecetsavat (vagy fenil-ecetsavat) és CoASH-t tartalmazó B oldathoz, majd 30 perces 25 °C-on való inkubálás után a reakciót 240 μΐ 0,5 %-os trifluor-ecetsav hozzáadásával állítjuk le. A kapott csapadékot centrifugálással távolítjuk el, és a képződött fenoxi-ecetsav koenzim A észtert (vagy fenil-ecetsav koenzim A észtert) HPLC-vel analizáljuk.

Fenoxi-ecetsav koenzim A észter vagy fenil-ecetsav koen48 zim A észter kimutatása HPLC-vel.

Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB Supelguard-dal.

Észlelés: UV fényben, 260 nm-en.

Oldószer A: 15 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.

Átfolyás: 1 ml/perc.

A fenoxi-ecetsav koenzim A észter retenciós ideje 9,7 perc és a fenil-ecetsav koenzim A észteré 9,0 perc. A fenoxi-ecetsav koenzim A észter és a fenil-ecetsav koenzim A észter mennyiségi meghatározását standardhoz viszonyítva végeztük.

K) Adipoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.

A reakciót úgy indítjuk, hogy 1 térfogat enzimet adunk 1,4 térfogat, pH 8,5-re beállított, adipinsavat tartalmazó B oldathoz. A szokásos inkubációs elegy 250 μΐ enzimet és 350 μΐ B oldatot tartalmaz. Az inkubációt 30 °C-on végezzük. Szabályos időközönként mintát veszünk az inkubációs elegyből, és azonos mennyiségű 0,5 %-os trif luor-ecetsawal keverjük össze.

A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el. A képződött adipoil-koenzim A észtert HPLC-vel analizáljuk.

Adipoil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel.

Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB.

Észlelés: UV fényben, 257 nm-en.

Oldószer B: 5 % acetonitril 25 mM nátrifum-foszfát pufferben; pH: 6,5.

Átfolyás: 1 ml/perc.

Az adipoil-koenzim A észter retenciós ideje 11,4 perc. Referencia gyanánt adipoil-koenzim A észtert használtunk.

L) Hexanoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.

A reakciót úgy indítjuk, hogy 1 térfogat enzimet adunk 1,4 térfogat, pH 8,5-re beállított, hexánsavat tartalmazó B oldathoz. A szokásos inkubációs elegy 250 μ és 350 μ B oldatot tartalmaz. Az inkubálást 30 °C-on végezzük. Szabályos időközönként mintát veszünk az elegyből, és azonos mennyiségű 0,5 %-os trifluor-ecetsawal keverjük össze. A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el. A képződött hexanoil-koenzim A észtert HPLC-vel analizáljuk.

Hexanoil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel:

Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB.

Észlelés: UV fényben, 257 nm-en.

Oldószer A: 15 % acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.

Átfolyás: 1 ml/perc.

A hexanoil-koenzim A észter retenciós ideje 20,4 perc.

M) Acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata.

Az A szubsztrát oldatot elkészítjük, pH-ját 4 M kálium-hidroxid oldattal 8,0-ra állítjuk be. Hozzáadunk 40 μΐ ecetsav-l-l⁴C nátrium sóit (41,8 mCi/mM; 1 mCi/ml), és az elegyet 35 °C-on egyensúlyba hozzuk.

Vizsgálat: 25 μΐ enzimet és 35 μΐ A szubsztrát oldatot elegyítünk, és az elegyet 35 °C-on 30 percig inkubáljuk. A reakciót 60 μΐ 0,5 %-os trifluor-ecetsav hozzáadásával állítjuk le. A képződött csapadékot centrifugálással távolítjuk el, és a kapott acetil-koenzim A észtert radioaktivitás detektorral ellátott HPLC-vel analizáljuk. A nem-radioaktív vegyületeket

UV fényben, 210 nm-en mutatjuk ki, a Radiomatic detektorral egy sorozatban.

Acetil-koenzim A észter kimutatása HPLC-vel:

Oszlop: Supelcosil RP C-18 DB oszlop Supelguard-dal.

Észlelés: a radioaktív vegyületeket Flow-one/Beta serie 100 radioaktivitás detektorral (Radiomatic) mértük, amely egy 250 μΙ-es yttrium-szilikát mérőcellával volt felszerelve.

UV észlelés 210 nm-en.

Oldószer B: 5 % (térf/térf) acetonitril 25 mM nátrium-foszfát pufferben; pH 6,5.

Átfolyás: 1 ml/perc.

Az acetil-koenzim A észter retenciós ideje: 6,9 perc.

Standardként a Sigma cégtől származó acetil-koenzim A-t használtuk, és az A szubsztrát keveréket is a Sigma féle acetil-koenzim A szintetázzal inkubáltuk, ezután a képződött ¹⁴C-acetil-koenzim A-t HPLC-vel analizáltuk.

N) Penicillin V és penicillin G kimutatása HPLC-vel.

Inkubálás után a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel analizáltuk penicillin V-re vagy penicillin G-re a következő feltételek mellett.

Oszlop: Supelcosil LC C-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelguard-dal,

Észlelés: UV fényben, 215 nm-en.

Oldószer: Oldószer H.

Átfolyás: 1 ml/perc.

Retenciós idők: penicillin V-nél 13,3 perc, penicillin Gnél 8,7 perc.

···· ·· • · • ·· ·

- 51 O) Minta készítés az ACV és IPNS HPLC-vel való meghatározáshoz .

Rázott lombikból 2 ml mintát veszünk, és gyorsan 0-4 °C-ra hütjük, 25-szörösére hígítjuk 25 mM nátrium-foszfát pufferrel (pH 6,5) és ultraszürjük (out off 10 000). A szűrlethez ditiotreitol-t adunk 5 mM végső koncentrációig, és a mintákat HPLC-vel analizáljuk.

Oszlop: Supelcosil LC-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelgurad-dal.

Észlelés: UV fényben, 210 nm-en.

Oldószer: Oldószer I.

Átfolyás: 2 ml/perc.

Hőmérséklet: 35 ’C.

Injektált térfogat: 10 μΐ

Retenciós idők (RT): izopenicillin N-nél 5,7 perc, ACVnél 17 perc.

P) Acil-koenzim A extrakciója P.chrvsogenum-ból.

Az acil-koenzim A vegyületeket P.chrysogenumból Barbera E. Gorkey és Jude T. Deeney [Acyl CoA regulation of metabolism and signal transduction Progress in Clinica] and Biological Research, 321, 217-232 (1990)] módszere szerint extraháljuk.

A P.chrysogenum törzset (B10 vagy P8) rázott lombikokban tenyésztjük a c) fejezetben — A P.chrysogenum fermentálása — leírtak szerint. A tenyésztést P-2 táptalajban (pH 6,1) végezzük. Négy nap múlva a sejteket só-jég fürdőben gyorsan lehűtjük, és 30 másodpercig 22 000 g mellett centrifugáljuk. Az üledéket folyékony nitrogénben fagyasztjuk le a sejtek le• ·

- 52 aratás után. A sejteket két térfogat 0,6 M triklór-ecetsav oldat hozzáadása után felolvasztjuk. Harminc perces ultrahangos kezelés után a sejtkivonatokat centrífugálással (12 000 g; 30 másodperc) izoláljuk. A triklór-ecetsavat dietil-éteres extrahálással — amíg a vizes fázis pH-ja 6-ra áll be — távolítjuk el. A vizes fázist (ez tartalmazza az acil-koenzim A vegyületeket) liofilizáljuk, majd a mintát végül 25 mM nátrium-foszfát pufferben (pH 6,5) oldjuk fel, és HPLC-vel analizáljuk a Fenoxi-ecetsav koenzim A észter kimutatása című bekezdésben megadott feltételek mellett.

Q) Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrvsogenum-ban.

P.chrysogenum sejteket (B10 vagy P8) tenyésztünk rázott lombikokban A P.chrysogenum fermentálása című fejezetben leírtak szerint P-2 táptalajban (pH 6,1). Négy napos tenyésztés után 10 ml sejtet átviszünk egy 50 ml-es Erlenmeyer lombikba, amely 250 μΐ [1-¹⁴C]-fenoxi-ecetsavat (72 gCi/ml; 9,7 gCi/uM) tartalmaz. A lombikot ezután 26 °C-on, rázás közben inkubáljuk.

Ezután 1, 15, 30, 60, 120, 240 és 360 perc múlva 1-1 ml sejtet kiveszünk a lombikból, azonnal 0 °C-ra hűtjük, és 1 percig 22 000 g mellett centrifugáljuk. Az üledéket 500 μΐ 5 %-os foszforsav és 500 μΐ metanol elegyében szuszpendáljuk, és az elegyet 1 percen át ultrahangozzuk. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel analizáljuk, amikoris a radioaktivitás mérésére detektort használunk a jelzett metabolitok azonosítása végett.

HPLC feltételek.

• ·

- 53 Oszlop: Supelcosil LC-18 DB oszlop (250 x 4,6 mm) Supelguard-dal.

Észlelés:Radiometric A-140 yttrium-szilikát cellával.

Oldószer 1: 25 mM nátrium-foszfát; pH 6,5.

Oldószer 2: acetonitril.

Grádiens:

idő	oldószer 1	oldószer 2
(perc)	(%)	(%)
0	100	0
40	70	30
45	70	30
46	100	0
60	100	0

Átfolyás: 1 ml/perc.

A kromatogrammon csak a következő vegyületeknek megfelelő csúcsok jelentek meg: fenoxi-ecetsav (RT: 14,5 perc), p-hidroxi-fenoxi-ecetsav (RT: 8,4 perc) és penicillin V (RT: 34 perc). A p-hidroxi-fenoxi-ecetsav-nak és a penicillin V-nek megfelelő csúcsok csak 60 perces inkubálás után voltak detektálhatok.

Az alábbi példák a találmány szemléltetését szolgálják, de nem korlátozzák annak oltalmi körét.

1. példa:

Ligáz aktivitás egy magas és egy alacsony hozamú P.chrysoqenum törzsben.

Penicillium hozamok szempontjából a P.chrysogenum P8 • · · ·

- 54 törzs fermentációját általában alacsony hozamúnak tartjuk intermedier tekintetében, míg a P.chrysogenum BIO törzset magas hozamú törzsnek tartjuk.

P.chrysogenum törzseket (BIO és P8) fermentálunk a P. chrysogenum fermentálása fejezetben leírtak szerint. A sejteket learatjuk és a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt úgy extraháljuk, ahogyan a D) fejezetben — Aratás, extrahálás és kicsapás — leírtuk, majd a két kivonatban meghatározzuk a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt (ligáz) a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata címú fejezetben leírtak szerint.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás meghatározások eredményét az alábbi táblázatban utatjuk be.

1. táblázat

P.chrysogenum törzs

Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás (relatív érték) (%)

Képződött penicillin V (relatív érték) (%)

P8 27,5 40

BIO 100 100

A példa világosan mutatja, hogy a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás a törzs penicillin termelésével korrelál.

2. példa:

Intermedier metabolitok felszaporodása.

P.chrysogenum (B10) sejteket tenyészünk rázott lombikok·»*· ····

- 55 bán, ahogyan ezt a P.chrysogenum fermentálása című fejezetben [C) fejezet] leírtuk. A P-2 fermentációs táptalaj beoltása után 7 napon át minden nap meghatároztuk a fermentlében az ACV és izopenicillin N koncentrációját. A vizsgálatot HPLC-vel, a fent leírt eljárás szerint végeztük.

Az 1. ábrán az ACV és izopenicillin N koncentrációkat adjukmeg a fermentációs idő függvényében.

Az ábra világosan mutatja, hogy a P.chrysogenum fermentálásakor a tenyészetben ACV és izopenicillin N szaporodik fel.

3. példa:

Penicillin V és penicillin G in vitro szintézise.

μΐ 60 mM fenoxi-ecetsav, 25 μΐ 40 mM ATP, 25 μ 6 mM koenzim A és 10 μΐ 6 mM 6-amino-penicillinsav elegyét (az egyes komponenseket 50 mM trisz.HCl, pH 7,8, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM aszkorbinsav tartalmú oldatban oldottuk fel) 30 °C-on 10 μΐ fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz [a kromatofókuszálás (PBE 94 oszlopon) 11-40. számú frakcióinak pooljából (lásd fent) származik] és 10 μΐ acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz (P.chrysogenum-ból tisztítva Emilio Alvarez és munkatársa szerint) [A.Alvarez et al., Pufification to Homogeneity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-aminopenicillianic Acid Acyltransferase of Penicillium Chrysogenum című közlemény az Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987) folyóiratban] jelenlétében inkubáltuk .

A penicillin G in vitro szintézisénél a fenoxi-ecetsavat

- 56 25 μΐ 60 mM fenil-ecetsawal helyettesítettük.

Az inkubálást 15 perc múlva 100 μΐ metanol hozzáadásával állítottuk le, és a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel penicillin V-re vagy penicillin G-re analizáltuk, mint fent leírtuk.

A penicillin V vagy penicillin G azonosítása.

A kromatogrammon a penicillin V vagy penicillin G csúcsok azonosításának ellenőrzésére standard penicillin V, illetve penicillin G oldatokat használtunk. A csúcs-inflexiós pontoknál és a csúcs-pontoknál összehasonlítottuk az UV spektrumot a két penicillin standard spektrumával egy ABI 1000S fotodióda sor (photodiode array) HPLC-detektor használatával, mint fent leírtuk.

Amikor a reacióelegyből akár a koenzim A-t vagy a 6-amino-penicillinsavat vagy az ATP-t vagy a fenoxi-ecetsavat vagy a fenil-ecetsavat kihagytuk, nem szintetizálódott penicillin V vagy G.

Ez a kísérlet igazolta, hogy az izolált enzim fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást és fenil-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást (ligáz aktivitást) fejt ki.

4. példa:

V-DCA in vitro szintézise.

μΐ 60 mM fenoxi-ecetsav, 25 μΐ 40 mM ATP, 25 μΐ 6 mM koenzim A és 10 μΐ 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) elegyét (az egyes komponenseket 50 mM trisz.HCI, pH 7,8, 10 mM magnézium-klorid és 5 mM aszkorbinsav tartalmú oldatban oldot- 57 tűk fel) 30 °C-on 10 μΐ fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz [ a kromafókuszálás (PBE 94 oszlopon) 11-40. frakcióinak pooljából (lásd fent) származik] és 10 μΐ acil-koenzim A:6-amino-penicillinsav aciltranszferáz (P.chrysogenum-ból tisztítva Emilio Alvarez és munkatársai szerint) [E.Alvarez et. al., Purification to Homogenity and Characterization of Acyl-Coenzyme A: 6-aminopenicillanic Acid Acyltransferase of Penicillium chrysogenum című közlemény, lásd: Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 31, 1675-1682 (1987)] jelenlétében inkubáltuk.

A penicillin G in vitro szintézisénél a fenoxi-ecetsavat 25 μΐ 60 mM fenil-ecetsawal helyettesítettük.

Az inkubálást 15 perc múlva 100 μΐ metanol hozzáadásával állítottuk le, és a fiolát 10 percre jégre tettük. Centrifugálás után a felül úszót HPLC-vel V-DCA-ra analizáltuk a Q) fejezetben (Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrysogenumban) leírtak szerint. A V-DCA retenciós ideje 32 perc.

A V-DCA azonosítása.

A kromatogrammon a V-DCA csúcs azonosítását úgy ellenőriztük, hogy standard V-DCA oldatokat használtunk, és a csúcs inflexiós pontoknál és a csúcspontoknál Waters 991 Photodiode Array Detector használatával összehasonlítottuk az UV spektrumot a V-DCA standard specktrumával.

5. példa:

Molekulatömeg meghatározás gélszűréssel.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) molekulatömegének meghatározását úgy végeztük, hogy összehasonlítottuk a »*··

- 58 gélszűrésnél [lásd a gélszűrés S-200 (super fine) oszlopon című fejezetet] kapott eluciós térogatot a standard Calibration Kit-tel (ribonukleáz A: 13 700 dalton, kimotripszinogén A: 25 000 dalton, ovalbumin: 43 000 dalton, marha szérum albumin: 67 000 dalton és aldoláz: 158 000 dalton) ugyanezen az oszlopon, azonos feltételek mellett végzett gélszűrésnél kapott aluciós térfogatokkal. A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz valószínű molekulatömege körülbelül .50 000 dalton.

6. példa:

Izoelektromos pont (pl).

Az izoelektromos pont meghatározásánál úgy járjunk el, hogy a Sepharose S FF oszlopkromatográfiánál (leírását lásd előbb) használt F pufferben (pH 7,5) a pH-t 8,5-re változattuk. A többi paramétert konstansnak tartva, azt találtuk, hogy fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) nem maradt vissza az oszlopon az F pufferrel (pH 8,5) való elució folyamán.

A kísérlet azt mutatta, hogy ahol az enzim töltése zéró (azaz az izoelektromos pont), a pH 7,25 felett van.

7. példa:

Fenoxi-acetil-koenzim A a kivonatokban.

Annak érdekében, hogy bizonyítékot kapjunk a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz (ligáz) aktivitás jelenlétéről, acil-koenzim A-t extraháltunk, ahogyan ezt az Acil-koenzim A extrakciója P.chrysogenumból című fejezetben leírtuk, és HPLCvel analizáltuk.

Bár a HPLC vizsgálat kimutatási határa 50 pM alatt van, a sejtkivonatokban nem tudtunk azonosítani fenoxi-ecetsav-koenzim A-t. Jelzett fenoxi-ecetsav metabolitok extrakciója sem mutatott észlelhető fenoxi-ecetsav-koenzim A-t a sejtkivonatokban, ahogyan a Fenoxi-ecetsav metabolitok jelzése P.chrysogenumban című fejezetben leírtuk.

8. példa:

VIZSGÁLAT

Az alábbiakban leírt tisztítással kapott fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt (ligázt) használtuk az enzim további vizsgálatához.

Hőmérséklet és pH optimum.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz meghatározása című fejezetben leírt módon vizsgáltuk 15 - 50 °C hőmérsékletet használva, és a vizsgálati pH értékek 6,5-től 9,0ig való változatásával.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitás pH 8 - 8,5 körül érte el maximumát, mint ezt a 2. ábra mutatja. A 3. ábra 40 °C körül mutatja a hőmérséklet optimumát.

Szubsztrátspecifitás.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetázt fenoxi-ecetsavval, fenil-ecetsavval, adipinsawal, hexánsavval és ecetsavval inkubáltuk a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben, az Acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című feje60 zetben, az Adipoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben és a Hexanoil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben megadott feltételek mellett, és a következő eredményeket kaptuk:

Szubsztrát_Relatív aktivitás

Fenoxi-ecetsav	100
Fenil-ecetsav	80
Adipinsav	19
Hexánsav	320
Ecetsav	1

A Km konstans meghatározása ATP-re, fenoxi-ecetsavra, koenzim A-ra és macrnézium-kloridra.

A fenoxi-acetil-koenzim a szintetáz aktivitását a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz és fenil-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk különböző koncentrációjú szubsztrátumok jelenlétében, egyidőben egy szubsztrátumot véve. A Kpj értékeket (az ebben a vizsgálatban használt feltételek mellett) az Eadie-Hofstee, Hanes és Lineweaver-Burk féle görbék alapján határoztuk meg, ahogyan Nicholas C. Price és Lewis Stenens leírták a Fundamentals of Enzymology (Oxford University Press, 1982) című kiadvány 123. oldalán. A görbék világosan mutatták, hogy a fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz a Míchaelis-Menten kinetikát követi az egyes szubsztrátumok vonatkozásában.

Az eredményeket az alábbi, 2. táblázatban foglaljuk öszsze.

- 61 2. táblázat

Koncentrációk (mM) Kjq (mM)

Fenoxi-ecetsav	- 40	3,2
ATP	- 10	0,22
Koenzim A	- 4,0	0,57
MgCl₂	- 15	1,6

Kjvj: Michaelis konstans

Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz fenil-ecetsav és ecetsav eredetű gátlása.

A fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz aktivitást a Fenoxi-acetil-koenzim A szintetáz közvetlen vizsgálata című fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk, vagy fenil-ecetsav vagy ecetsav változó koncentrációi jelenlétében a fenoxi-ecetsav különböző koncentrációi mellett.

A vizsgálatban a következő fenoxi-ecetsav koncentrációkat használtuk: 1,7; 3,3; 6,6; 20 és 42 mM. A fenil-ecetsav és ecetsav koncentrációk a következők voltak: 0; 1,0; 5,0; 10, illetve 25 mM.

A Lineweaver-Burk görbék azt mutatták, hogy a fenil-ecetsav kompetitív inhibitorként viselkedik a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázzal szemben, míg az ecetsav nem hatott kompetitív inhibitorként a fenoxi-acetil-koenzim A szintetázra a használt vizsgálati feltételek mellett.

A szakterületen gyakorlattal rendelkezők az előzőekben • · · ·

- 62 előadottak alapján nyilvánvalóan megértik, hogy a találmány kivitelében számos változtatást és módosítást végezhetnek anélkül, hogy a találmány szellemétől vagy oltalmi körétől eltérnének. A találmány oltalmi körét ennélfogva a következő igénypontokban meghatározott lényegnek megfelelően kell értelmezni .

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás béta-laktám antibiotikum termelésére, azzal jellemezve, hogy

i) olyan mikrooganizmust fermentálunk, amely képes az említett béta-laktám antibiotikum termelésére; és ii) az említett béta-laktám antibiotikumot lényegében tiszta formában izoláljuk, amikoris az említett fermentációt megnövelt ligáz aktivitás jelenlétében végezzük, összehasonlítva azzal a ligáz aktivitással, amely akkor van jelen, amikor kizárólag az eredeti mikroorganizmussal fermentálunk, az eredeti fermentációs feltételek mellett.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eredeti mikroorganizmusnak nincs ligáz aktivitása, vagy csak alacsony ligáz aktivitása van.
3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expresszióját a fermentációs eljárás fizikai feltételeinek modulálásával növeljük.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozása érdekében a fermentáció folyamán a hőmérsékletet moduláljuk.
5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozása érdekében a fermentáció folyamán a pH-t moduláljuk.
6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz aktivitás expresszióját úgy fokozzuk, hogy a mikroorganizmust ligáz expresszió indukáló vegyületek vagy szerek hatásának tesszük ki.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz aktivitást úgy fokozzuk, hogy beavatkozunk a fermentálandó mikroroganizmus sejtes szabályozó mechanizmusába .
8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitást vagy fokozott ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus módosítása révén kapjuk meg.
9. A 8. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitást az említett mikroorganizmus random vagy hely-specifikus mutagenezisével érjük el.
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a ligáz aktivitás expressziójának a megvalósítását vagy a ligáz aktivitás expressziójának a fokozását úgy érjük el, hogy egy olyan DNS szerkezet legalább egy másolatát vagy egy olyan rekombináns vektort vezetünk be az említett fermentálandó eredeti mikroorganizmusba, amely ligáz aktivitású enzimet kódoló gént vagy DNS szekvenciát tartalmaz.
11. A 8-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a módosítást aminosav szubsztitúcióval, delécióval vagy addícióval hajtjuk végre.
12. A 10. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett DNS szerkezet nem abból a mikroorganizmus fajból származik, amelybe azt bevezetjük.
13. Az 1-12. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett eredeti mikroorganizmust a következő csoportból választjuk ki: Penicillium, Aspergillus,

Nocardia, Streptomyces, Bacillus Cerospora, Microspora, különböző Eubacterium, különböző Streptomyces fajok és fonalas gombák.
14. A 13. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett eredeti mikroorganizmus a következő csoportba tartozó fajokhoz tartozik: Penicillium chrysogenum, Penicillium notatum, Cephalosporium acremonium, Aspergillus nidulans, Nocardia lactamdurans és Streptomyces clavuligerus.
15. Az 1-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett ligáz aktivitás expresszióját a béta-laktám bioszintetikus folyamathoz tartozó más gének expressziójával szinkronizáljuk.
16. A 15. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett ligáz aktivitás expresszióját a pcbAB, pcbC és/vagy a penDE gének expressziójával szinkronizáljuk.
17. A 13. vagy a 14. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett eredeti, béta-laktám antibiotikum termelésére képes mikroorganizmust penicillineket, cefalosporinokat, cefamicineket, mono-baktámokat és nokardicineket termelő mikroorganizmusok csoportjából választjuk ki.
18. A 17. igénypont szerinti eljárás, amelyben az említett antibiotikum cefalosporin vagy penicillin, előnyösen penicillin V, penicillin G, V-DCA, 7-(L-a-5-amino-5-karboxi-valeramido)-cefalosporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA vagy adipoil-7-ACA.
19. A 8-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett módosított mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek előmozdítják az említett DNS szerkezet expresszióját, ennek eredményeként a kívánt béta-laktám antibiotikum oldalláncának megfelelő karbonsav koenzim A-val alkotott tioésztere nagyobb mennyiségben termelődik.
20. A 8-18. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett mikroorganizmust olyan körülmények között tenyésztjük, amelyek előmozdítják az említett DNS szerkezet expresszióját, ez aktivált oldallánc-koenzim A-tioészter termelést eredményez, amely ezután egy aciltranszferáz (AT) jelenlétében az említett oldalláncot tartalmazó béta-laktám képződéséhez vezet.
21. Az 1-20. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben a ligáz enzimet az jellemzi, hogy legalább tízszer aktívabb a fenoxi-ecetsavval és a fenil-ecetsavval szemben, mint az ecetsavval szemben és valószínű molekulatömege — gélszűréssel meghatározva — körülbelül 50 000 dalton.
22. Ligáz aktivitású új enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb fenoxi-ecetsavval szemben, mint ecetsavval szemben.
23. A 22. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb fenil-ecetsawal szemben, mint ecetsavval szemben.
24. A 22. vagy a 23. igénypont szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb adipinsawal szemben, mint ecetsawal szemben.
25. A 22-24. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy legalább tízszer aktívabb hexánsavval szemben, mint ecetsavval szemben.
26. A 22-24.igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy valószínű molekulatömege — gélszűréssel meghatározva — 40 000 és 60 000 dalton között van, pontosabban körülbelül 50 000 dalton.
27. A 22-26. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy aktivitásának valószínű pH optimuma 7,0 -9,0 közé esik, pontosabban 8,0 - 8,5 tartományban van.
28. A 22-27. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy aktivitásának valószínű hőmérséklet optimuma 34-45 °C közötti tartományban van, pontosabban körülbelül

40 °C.
29. A 22-28. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium nemhez (genus-hoz) tartozó fonalas gomba, előnyösen P. chrysogenum vagy C.acremonium törzs eredetű fonalas gomba termeli, pontosabban a P.chrysogenum B10 törzs termeli.
30. A 22-29. igénypontok bármelyike szerinti enzim, azzal jellemezve, hogy a P.chrysogenum törzsből származó tisztított ligáz ellen termelt antitesttel immunológiai reakciót ad.
31. DNS szerkezet, amely a 22-30. igénypontok bármelyike szerinti enzimet kódolja.
32. A 31. igénypont szerinti DNS szerkezet, amelyben a DNS szekvencia egy Aspergillus, Penicillium vagy Cephalosporium genushoz tartozó fonalas gombából származik, előnyösen egy

Ρ.chrysogenum vagy C.acremonium törzsből, pontosabban a P.chrysogenum BIO törzsből származik.
33. Rekombináns vetor vagy transzformációs plazmid, amely a 31. és 32. igénypont bármelyike szerinti DNS szerkezetet tartalmazza.
34. A 33. igénypont szerinti vektor vagy transzformációs plazmid, azzal jellemezve, hogy az említett DNS szerkezet működőképesen kapcsolódik egy promoter szekvenciához és adott esetben egy terminátor szekvenciához.
35. A 33. és 34. igénypont bármelyike szerinti vektor, amelyben az említett ligáz gén promoterét egy, a béta-laktámok bioszintézisében résztvevő másik génből származó promoterrel helyettesítjük.
36. A 33-35. igénypontok bármelyike szerinti vektor vagy transzformációs plazmid, amelyben az említett DNS szerkezet működőképesen kapcsolódik egy targeting szignált vagy szekréciós szignált kódoló szekvenciához.
37. Sejt, amely a 31. és a 32. igénypont bármelyike szerinti DNS szerkezetet, vagy a 33-36. igénypontok bármelyike szerinti vektort tartalmazza.
38. A 37. igénypont szerinti sejt, amely mikrobiális sej t.
39. A 38. igénypont szerinti sejt, amely baktérium sejt vagy gomba sejt.
40. A 39. igénypont szerinti sejt, azzal jellemezve, hogy a baktérium sejt egy Gram-pozitív baktérium sejt, ilyenek például a Bacillus vagy Streptomyces genus-hoz tartozó sejtek, • * ·· • · · ··*· vagy egy Gramnegatív baktérium sejt, ilyen például az Excherichia genus-hoz tartozó sejt, továbbá, hogy a gomba sejt például egy Aspregillus, Cephalosporium vagy Penicillium genus-hoz tartozó fonalas gomba.
41. Eljárás béta-laktámok termelésére, azzal jellemezve, hogy egy karbonsavat, koenzim A-t és egy, a 22-30. igénypontok bármelyike szerinti ligáz aktivitású enzimet, aciltranszferázt és egy béta-laktám intermediert inkubálunk.
42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett ligáz aktivitáshoz úgy jutunk, hogy a béta-laktámok termelésében ligáz aktivitást kifejtő enzimeket használunk.
43. A 41. és 42. igénypont bármelyike szerinti eljárás, amelyben a béta-laktám köztitermékek a következők: izopenicillin Ν (IPN), 6-amino-penicillánsav (6-APA), 7-amino-cefalosporánsav (7-ACA), 7-amino-dezacetoxi-cefalosporánsav (7-ADCA) és 7-amino-dezacetil-cefalosporánsav, 7-(L-a-5-amino-5-karboxi-valeramido)-cefalosoporánsav (izocefalosporin C), adipoil-7-ADCA vagy adipoil-7-ACA.
44. A 41. igénypont szerinti eljárás, amelyben a karbonsav fenoxi-ecetsav, fenil-ecetsav, adipinsav, hexánsav, 2-tiofén-ecetsav vagy 3-tiofén-ecetsav.
45. A 41-44. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást magnézium ionok és ATP jelenlétében végezzük .
46. A 41-45. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást redukáló szer — ilyen a ditiotreitol »···

- ΊΟ (DTT), merkapto-etanol, aszkorbinsav vagy glutation — jelenlétében végezzük.
47. A 41-46. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást 10 - 60 °C között, előnyösen 15 - 50 °C között és főképpen 20 - 45 °C között végezzük.
48. A 41-47. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, amelyben az inkubálást pH 5,5 - 9 között, előnyösen körülbelül pH 8 mellett végezzük.