JPH10506287A - 強いリガーゼ活性を有する微生物を用いるβ−ラクタム系抗生物質の製造法 - Google Patents
強いリガーゼ活性を有する微生物を用いるβ−ラクタム系抗生物質の製造法Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、β-ラクタム系抗生物質の生合成に関する。更に詳細に述べると、本発明は、in vivo及びin vitroにおけるβ-ラクタム系抗生物質の製造法に関する。更に、β-ラクタムの生合成に関連した特定の工程を触媒することが可能な新規酵素も考慮されている。更には、本発明は、前記新規酵素をコードしているDNA構成体、該DNA構成体を含む組換えベクター又は形質転換体ビヒクル、最後に該DNA構成体及び組換えベクターを含む細胞に関する。
Description
【発明の詳細な説明】強いリガーゼ活性を有する微生物を用いるβ-ラクタム系抗生物質の製造法 発明の属する技術分野
本発明は、β-ラクタム系抗生物質の生合成に関する。更に詳細に述べると、
本発明は、β-ラクタム系抗生物質のin vivo及びin vitroにおける製造法に関す
る。
同じくβ-ラクタム系抗生物質の生合成に有利に使用することができる、新規
酵素に関する。更に本発明は、この新規酵素をコードしているDNA構成体、このD
NA構成体を含む組換えベクター又は形質転換ビヒクル、最後にこのDNA構成体又
は組換えベクターを含む細胞に関する。発明の背景 ペニシリンの生合成経路
ペニシリンの生合成の第一工程は、L-α-アミノアジピン酸、L-システイン及
びL-バリンからの、トリペプチドδ-(L-α-アミノアジピル)-L-システイニル-
D−バリン(ACV)の形成である(Fawcettらの論文、Biochem.J.、157:651-660頁(1
976))。この反応は、補助因子ATP及びMg2+と共に、多機能酵素δ-(L-α-アミ
ノアジピル)-L-システイニル-D-バリンシンテターゼ(ACVシンテターゼ)によ
って触媒される(Bankoらの論文、J.Am.Chem.Soc.、109:2858-2860頁(1987))。
ACVシンテターゼ(ACVS)は、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidula s)
(Van Liemptらの論文、J.Biol.Chem.、264:3680-3684頁(1989))、セファロ
スポリウム・アクレモニウム(Cephalosporium acremonium)(Baldwinらの論文、
J.Antibiot.、43:1055-1057頁(1990))、及びストレプトミセス・クラブリゲル
ス(Streptmyces clavuligerus)(Jensenらの論文、J.Bacteriol.、172:7269-727
1頁(1990)、及びZhangらの論文、Biotechnol.Lett.、12:649-654頁(1990))
から精製されている。ペニシリウム・クリソゲナム (Penicillium chrysogenu m)
からのACVシンテターゼの精製は、刊行物に発表されていない。しかし、P.ク
リソゲナム由来のACVシンテターゼは、Diezらによってクローンされている(J.B
iol.Chem.、256:16358-16365頁(1990))。
鎖状トリペプチドであるACVは、イソペニシリンNシンターゼ(シクラーゼ又
はイソペニシリンNシンテターゼ(IPNS)とも称す)、二価鉄イオン、酸素及び電
子供与体(例えばアスコルビン酸塩)の存在下で、イソペニシリンN(IPN)に転換
される。イソペニシリンNシンターゼは、まずRamosらによりP.クリソゲナムから
単離され(Antimicrobial Agents and Chemotherapy、27:380-387(1985))、並
びにCarrらによりP.クリソゲナム由来のイソペニシリウムNシンターゼ構造遺伝
子がクローン化された(Gene、48:257-266(1986))。
ペニシリン生合成におけるこれらの最初の2工程は、ペニシリン及びセファロ
スポリン産生菌及び細菌において、共通である。
例えばP.クリソゲナム及びA.ニディランスのような一部の菌において、イソペ
ニシリンNのα-アミノアジピル側鎖は、細胞内に起源を持つか又は外部から供給
された他の側鎖によって置換される。この置換は、アシルトランスフェラーゼ(
アシルCoA:イソペニシリンNアシルトランスフェラーゼ又はアシルCoA:6-アミノ
ペニシリン酸アシルトランスフェラーゼと称す)によって触媒される。この転換
が、in vivoにおいて、第一にL-α-アミノアジピル側鎖を除去し、6-アミノペニ
シラン酸(6-APA)を生成し、その後アシル化されるという2段階反応で進行する
か、もしくはこの転換で、直接これらの側鎖が置換されるかどうかは、依然とし
て不明である。P.クリソゲナム由来の精製されたアシルトランスフェラーゼは、
イソペニシリンN-アミドヒドロラーゼ活性及びアシル-CoA:6-アミノペニシラン
酸アシルトランスフェラーゼ活性の両方を有す(Alvarezらの論文、Antimicrobi
al Agents and Chemotherapy、31:1675-1682頁(1987))。
ACVシンテターゼ(pcbAB)、イソペニシリンNシンターゼ(pcbC)及びアシル-CoA:
6-アミノペニシラン酸アシルトランスフェラーゼ(penDE)をコードしている遺伝
子は、P.クリソゲナム及びA.ニディランスの同じクラスターで発見されている(
Diezらの論文、J.Biol.Chem.、265:16358-16365頁(1990)及びSmithらの論文、Bi
o/Technology、8:39-41頁(1990))。
各々イソペニシリンNシンターゼ(IPNS)及びアシルトランスフェラーゼ(AT)を
コードしている、P.クリソゲナムWis 54-1255のpcbC-penD遺伝子クラスターの増
幅は、生成物収率の40%もの向上をもたらす(Veenstraらの論文、J.Biotechnol
.、17:81-90頁(1991))。抗生物質収率の上昇は、同じくpcbAB
(ACVシンテターゼ(ACVS)をコードしている)及びpcbC(イソペニシリンNシンテ
ターゼ(INPS)をコードしている)遺伝子の多コピーを含むA.ニディランスの形質
転換体において報告されている(McCabeらの論文、J.Biotechnol.、17:91-97頁
(1991))。
欧州特許第(EP)200425号(エリーリリー(Eli Lilly)社)は、イソペニシリンN
シンテターゼ(IPNS)をコードしているベクターを開示している。これらのベクタ
ーは、C.アクレモニウム及びエシェリヒア・コリ(E.coli)におけるIPNSの高レベ
ルの発現をもたらしている。この開示において、セファロスポリウムベクターは
、菌株の改善に有用であり、抗生物質ペニシリン及びセファロスポリン産生のた
めの発酵における効果及び収率を増している。これらのベクターも同じく修飾さ
れ、P.クリソゲナム、ストレプトミセス・クラブリゲルスなどの、発酵における
生成物収率及び効果を増加するベクターを生じる。
欧州特許第(EP)357119号(ギストブロケード(Gist Brocades)社)は、IPNS、A
T及びACVSをコードしているクラスター化された抗生物質生合成遺伝子を開示し
、かつ有利なことにこれらは微生物における抗生物質の産生の改善、及びこの抗
生物質の生合成に関連した他の遺伝子の単離に使用されている。この発明は、P.
クリソゲナムにおける改善されたペニシリンの産生、別のクラスター化された生
合成遺伝子(複数)の単離、及びアクレモニウム・クリソゲナムにおけるクラス
ター化されたペニシリン生合成遺伝子の発現で例証されている。側鎖の活性化
アシルトランスフェラーゼが触媒した反応においてα-アミノアジピン酸側鎖
を置換するために、新規側鎖のカルボキシル基(carboxilic acid group)を活性
化しなければならない。この活性化は、ペニシリンの生合成の最も解明されてい
ない部分の一つである。2種の理論が提唱されている。
最も広く受け入れられている理論は、この酵素が、Mg2+の存在下で、ATP(ア
デノシン三リン酸)のピロホスホロリシスを通じて進行する2段階機構により、
カルボン酸がCoAチオエステルへエステル化されるのを触媒するというものであ
る。第一に、カルボン酸(新規側鎖)、ATP及びこの酵素は複合体を形成し、ア
シル-AMP-酵素複合体となる。第二にこの複合体は、CoAと反応し、アシル-
CoA及びAMP(アデノシン一リン酸)を放出する。
もう一方の理論は、アシル-S-グルタチオン中間体の形成を基にし、これは対
応するアシル-CoAエステルに転換される(Ferreroらの論文、J.Antibiot.、43:
684-91頁(1990))。
P.クリソゲナム由来のフェナシル:CoAリガーゼは、Mg2+、ATP、CoA及びフェノ
キシ酢酸又はフェニル酢酸の存在下で、フェノキシアセチル-CoA及びフェニルア
セチル-CoAの合成を触媒することができることが、Brunner、Rohr及びZinnerの
論文(Hopper-Seyler's Z.Physiol.Chem.、349:95-103頁(1968))、Brunner及
びRohrの論文(Methods Enzymol.、43:476-481頁(1975))、Kogeker及びDeshpan
deの論文(Ind.J.Biochem.Biophys.、19:257-261頁(1982))、及びKurzatkowski
の論文(Med.Dosw.Mikrobiol.、33:15-29頁(1981))で明らかになっている。Br
unnerらの論文では、リガーゼは、フェニル酢酸、フェノキシ酢酸、及び酢酸に
対して、同程度の活性を示している。しかし、この酵素の同質物は、精製されて
いない。
Martinez-Blancoらは(J.Biol.Chem.、267:5474-5481頁(1992))、Brunnerら
の論文に記されたリガーゼと類似の、対応するアシル-CoAエステルの合成におい
て、酢酸だけでなくフェニル酢酸をも基質とする、P.クリソゲナムWis 54-1255
由来のアセチル-CoAシンテターゼを明らかにしている。しかし、Martinez-Blanc
oらは、フェノキシ酢酸に対する活性は明らかにしていない。Martinez-Blancoら
の論文によると、アセチル-CoAシンテターゼは、ゲルろ過法で定された分子量は
139,000ダルトンで、及びSDS-PAGE(ドデシル硫酸ナトリウム電気泳動)法では7
0,000ダルトンであり、かつ等電点がpH5.6〜6.0の間である、ホモ二量体(α2)
である。
Martinez-Blancoらのアセチル-CoAシンテターゼをコードしている遺伝子は、M
artinez-Blancoらの論文によって特徴づけられている(Gene、130:265-270(1993
))。この遺伝子はacuAと命名され、5個のイントロンを含み、かつ669個のアミ
ノ酸のポリペプチドをコードしている。このポリペプチドは、分子量74,287であ
る。
Goukaら(Appl.Microbiol.Biotechnol.、38:514-519頁(1993))及びVan
Hartingsveldtらは(WO92/07079)は、分子量が約74,000ダルトンに相当する(
各アミノ酸の平均分子量を110g/モルとする)、669個のアミノ酸のタンパク質を
コードしている、P.クリソゲナム由来のアセチル-CoAシンテターゼ(facA)遺伝子
を単離し、かつ配列を明らかにしている。GoukaらのfacA遺伝子の遺伝子配列、
及びMartinez-BlancoらのacuAの配列とには、差異はない。
Brunnerら、並びにKogeker及びDeshpandeによって明らかにされた・フェニル
アシル-CoAリガーゼの詳細な性質については発表されていない。
その活性化体において、アシルトランスフェラーゼが触媒した反応におけるα
-アミノアジピン酸側鎖と置換された新規側鎖は、CoAチオエステル又は他のチオ
エステルの形であってよく、これは他のチオエステル類(例えばアシル-S-シス
テイニル-グリシン及びアシル-S-グルタチオン)が、アシルトランスフェラーゼ
の基質であることが報告されているからである。より可能性があるのは、ジペプ
チド(システイニルグリシン)が、アシルトランスフェラーゼ反応に移る前に、
非酵素反応によって、CoASHによって置換されることである(Ferreroらの論文、
J.Biol.Chem.、265:7084-7090頁(1990))。
チオエステルのチオニル基は、一旦形成されると、非酵素反応により、他のチ
オール類(例えばメルカプトエタノール、1,4-ジチオスレイトール、ACV及びCoA
)と即座に交換される。一般的リガーゼ
酵素のサブクラス6.2.1.群の酸-チオールリガーゼ(酵素命名法、Academic Pr
ess,Inc.,(1992))に属するリガーゼ類も、アシル-CoAシンテターゼ、又はアシ
ル-CoAチオキナーゼと称され、ATP及びMg2+の存在下において、カルボン酸及びC
oAからの、アシル-CoAチオエステルの生成を触媒する。
様々な起源に由来するいくつかのリガーゼ又はアシル-CoAシンテターゼは、例
えばアセチル-CoAシンテターゼ、プロピオニル-CoAシンテターゼ(Grootの論文
、Biochem.Biophys.Acta、441:260-267頁(1976));ブチリル-CoAシンテターゼ
(Wandersらの論文、J.Biol.Chem.、240:29-33頁(1965));中鎖、長鎖及び極長
鎖の脂肪酸アシル-CoAシンテターゼ(Wakuの論文、Biochem.Biophys.Acta、1124
:101-111頁(1992)レヴュー);シュードモナスsp由来のベンゾイル-CoAリガ
ーゼ(Auburgerの論文、Appl.Microbiol.Biotechnol.、37:789-795頁(1992))及
びフェニルアセチル-CoAリガーゼ(Martinez-Blancoらの論文、J.Biol.Chem.、2 65:
7084-7090頁(1990);及びVitovskiの論文、FEMS Microbiol.Letters、108:1-
6頁(1993))として同定されている。これらのほとんどは、広範な基質特異性を
有している。
アシル-CoAシンテターゼ(リガーゼ)は、一般に高エネルギーのチオエステル
結合の形成を通じて、カルボン酸のアシル基を活性化する、脂肪酸及び酢酸の一
次代謝、並びに芳香族酸の分解の最初の工程において、重要な酵素である。β-ラクタムのin vivoでの生成
いわゆる天然のβ-ラクタム類(例えばペニシリンDF、イソペニシリンN、6-AP
A、セファロスポリンCなど)の多くは不安定であり、発酵ブロスから精製するこ
とは困難であり、限定的抗生作用のみを有し、及び/又は生成収量は低い。
天然のβ-ラクタム類の側鎖の、例えばフェノキシ酢酸又はフェニル酢酸によ
る置換は、ペニシリン類(各々、ペニシリンV及びペニシリンG)を形成し、これ
らはより安定であり、単離がより容易であり、かつより高い抗生活性を有す。
工業的に興味を引く直接発酵しただけのペニシリンは、ペニシリンV及びペニ
シリンGであり、各々、フェノキシ酢酸又はフェニル酢酸を発酵タンクに添加す
ることによって生成される。P.クリソゲナムの発酵時に、別の前駆体、例えば2-
チオフェン酢酸又は3-チオフェン酢酸を添加すると、他のペニシリン類を生成す
る。添加した前駆体の一部、例えば1-フェニル-n-アルカン又は1-フェノキシ-n-
アルカンは、ペニシリン生成において、アシルトランスフェラーゼの基質として
使用される以前に、P.クリソゲナム細胞内で、一部分代謝される(Szarkaの論文
、Advances in Biotechnology、3:167-173頁(1980);Szarkaらの米国特許第4,25
0,258号;及びSzarkaらの米国特許第4,208,481号)。いわゆる天然のペニシリ類
:例えばペニシリンDF、ペニシリンK、ペニシリンF及びペニシリンHの生合成に
おいて、各々の側鎖、ヘキサン酸、オクタン酸、3-ヘキサン酸、及びヘプタン酸
は、おそらく一次代謝に由来するであろう。
一部の場合、フェノキシアセチル又はフェニルアセチル側鎖も、β-ラクタム
の発酵及び回収時に保護基として作用し、単離されたペニシリンV及びGが、有
機化学的又は酵素的過程により加水分解されて、6-APAを形成し、これは次に、
ペニシリンV又はG、更には天然のペニシリンと比較して改善された医薬特性を有
する半合成ペニシリンの、基本的構成単位となる。
セファロスポリンの生成においても同様で、天然のセファロスポリンは、単離
することが非常に困難で、かつ低い抗生作用のみを有するので、医薬的価値が制
限される。更に、これらは、より医薬的価値が高い新規セファロスポリンに転換
することが困難である。
発酵されたセファロスポリンの所望の抗生物質への転換、例えば経口のセファ
ロスポリンであるセファレキシン及びセファドロキシルの生成において、多数の
工程が行われ、出発点はペニシリンV又はGであり、これらはその後、フェノキシ
アセチル又はフェニルアセチル側鎖を保護基として保持する、一連の化学反応に
より、セファロスポリンに転換される。環拡大後、各々V-DCA又はG-DCA(V/G-デ
アセトキシセファロスポラン酸)が生成され、その側鎖は、ペニシリンV又はGの
加水分解に類似の方法で加水分解されることによって除去される。最後に、新規
側鎖(例えばD-フェニルグリシン又はD-p-ヒドロキシ-フェニルグリシン)が、
有機化学的方法により付加される。セファロスポリンCからのセファロスポリン
の生成において、D-α-アミノアジピン酸は、化学的加水分解又は2工程の有機化
学酵素的方法のいずれかにより、除去することができる。その後、得られる7-AC
A(7-アミノセファロスポラン酸)がアシル化され、所望の生成物を形成する。
V-CDA、G-CDAの形成及びセファロスポリンCの7-ACAへの加水分解をもたらす両
反応は、工業的規模で行われるが、これらは制御することが困難であり、高価で
あり、一般に収率が低い。
この問題を解決するために、いくつかの代用法が示唆されていて、そのいくつ
かは、例えばC.Cantwellらの論文(248:283-289頁(1992))に記載されている、
ストレプトミセス由来のエピメラーゼ及びイクスパンダーゼ(expandase)によるP
.クリソゲナムの形質転換に関連している。これらは、形質転換されたP.クリソ
ゲナムが、デアセトキシセファロスポラン酸を産生することができることを明ら
かにしている。しかし、V-DCAは見つかっていない。Cantwellは、このイクスパ
ンダーゼは、ペニシリンV又はGを基質とするようその基質特異性を変化するため
に、遺伝子工学により改良され得ることを示した。その後このV/G-DCAは、発酵
によって直接産生することができる。
S.Gutierrezらの論文(Mol.Gen.Genet.、225:56-64頁(1991))は、C.アクレモ
ニウムを、P.クリソゲナム由来のアシルトランスフェラーゼで形質転換し、形質
転換されたC.アクレモニウムによる、ペニシリンGの形成を検出することができ
たが、G-DCAの存在は証明することができなかった。
欧州特許第(EP)532341号(メルク社)は、ストレプトミセス・クラブリゲルス
由来のイクスパンダーゼで形質転換されたP.クリソゲナムにおける、アジポイル
-7-ADCA(アジポイル−7−アミノデスアセトキシセファロスポラン酸)の発酵
を開示している。その後このアジポイル-7-ADCAは、発酵ブロスから抽出するこ
とができ、かつ例えばシュードモナス由来のアジポイルアシラーゼにより、加水
分解することができる。
スペイン特許出願第(ES)2,016,476号は、in vitroにおける、フェニルアセチ
ル-CoA及びベンジルペニシリン(ペニシリンG)の生化学的調製法を明らかにし
ている。フェニルアセチル-CoAは、シュードモナス・プチダ(putida)由来のフェ
ニルアセチル-CoAリガーゼを、ATP、フェニル酢酸及びMgCl2と共に、10〜45℃、
pH5〜10で、10〜180分間インキュベートすることにより形成される。ベンジルペ
ニシリンは、フェニルアセチル-CoAリガーゼ、及びペニシリン・クリソゲナム由
来のアシル-CoA:6-アミノペニシラン酸アシルトランスフェラーゼを、6-アミノ
ペニシラン酸及びフェニル酢酸、ATP、CoA及びMgCl2と共に、10〜40℃、pH5.5〜
9で、30〜180分間、インキュベートすることによって形成される。
スペイン特許出願第(ES)2,033,590号は、ベンジルペニシリン(ペニシリンG)
由来の様々なペニシリン類の、in vitroにおける生成を開示している。この生成
は、シュードモナス・プチダ由来のフェニルアセチル-CoAリガーゼ、及びペニシ
リウム・クリソゲナム由来のアシル-CoA-アミノペニシラン酸アシルトランスフ
ェラーゼ、並びに6-アミノペニシラン酸のような基質、ATP、CoA、MgCl2、ジチ
オスレイトール(DTT)及びペニシリン前駆体などを含む酵素系をインキュベート
することを含んでいる。
先行技術においては、特定のペニシリン及びセファロスポリンの生成について
、in vitroの工程を含む方法が明らかにされている。これらの方法はほとんど制
御することが困難であり、操作が煩雑で及び/又は費用がかかる。発明の要約
本発明の目的は、前述の問題点のいくつかを克服することである。これは、本
来の発酵条件で、該原微生物単独で発酵する際に、現在のリガーゼ活性と比較し
て強化されたリガーゼ活性の存在下で行うという、β-ラクタム系抗生物質の改
善された製造法を提供することによって達成される。
更に本発明は、フェノキシ酢酸、フェニル酢酸、及びアジピン酸などの、重要
なβ-ラクタム系前駆物質に対する基質特異性が高く、かつ酢酸に対する特異性
が低い、リガーゼ活性を示す新規酵素に関する。
本発明において、この酵素は、糸状菌のペニシリウム・クリソゲナム、アスペ
ルギルス・ニディランス又はセファロスポリウム・アクレモニウムに由来する。
この新規酵素は、様々なβ-ラクタム系抗生物質の生合成に関連して使用する
ことができる。
更に、本発明の目的は、in vitroにおけるβ-ラクタム系抗生物質の製造法を
提供することである。
このようなリガーゼ活性を有する新規酵素をコードしているDNA構成体も、意
図されている。
更に、本発明の目的は、前記DNA構成体を含む、組換えベクター又は形質転換
ビヒクルを提供することである。
同じく、本発明は、前記DNA構成体又は前記組換えベクターを含む細胞も意図
している。図面の簡単な説明
図1は、発酵期間の関数としての、ACV及びイソペニシリンNの濃度を示す。
図2は、リガーゼ活性に関する至適pHを示す。
図3は、リガーゼ活性に関する至適温度を示す。発明の詳細な説明
β-ラクタム類の製造において、製造費は重要な因子であり、増加した発酵収
率を導く改善された方法、より容易に制御しかつ操作が煩雑でない、安価な方法
が必要とされている。
本発明の目的は、このように改善されたβ-ラクタム系抗生物質の製造法を提
供することである。
現在驚くべきことに、関心が高いβ-ラクタム抗生物質の製造が、増強された
リガーゼ活性が存在する状態で行われる場合に、このような改善された方法を提
供することができることがわかっている。
本発明のこのような改善されたβ-ラクタム系抗生物質の製造法は:
i)前記β-ラクタム系抗生物質の生成が可能な微生物の発酵工程;及び
ii)このβ-ラクタム系抗生物質の、実質的に純化した形での回収工程を含み、
この発酵は、本来の発酵条件下で、原微生物単独で発酵する場合に存在するリガ
ーゼ活性と比較して、増強されたリガーゼ活性の存在下で行われる。
強化されたリガーゼ活性は、修飾されていない原微生物及び/又は本来の発酵
条件と比較して、該カルボン酸の、対応するアシル-CoAエステルへの増強された
転換と定義される。
本発明の実施態様において、この原微生物は、β-ラクタム類を生成すること
ができ、リガーゼ活性を欠いているか、もしくは低い活性を有している。
このリガーゼ活性の増強された発現は、いずれか適した方法で達成することが
できる。
例として、本発明の実施態様においては、このリガーゼ活性は、発酵工程の物
理的条件、例えば温度及びpHなどを変更することによって、増強することができ
る。別の可能性は、該微生物に、化合物又は試薬を施し、リガーゼの発現を増強
させる。この化合物又は試薬の性質は、例えばリガーゼの発現を転写開始するた
めに使用されるプロモーターなどによって決まる。更に、リガーゼ発現を制御す
る細胞内制御機構を妨害することによって、リガーゼ活性の増強された発現を達
成することができる。
本発明のある実施態様において、このリガーゼ活性又は増強されたリガーゼ活
性は、該微生物の修飾によって得られる。
これは、発酵される該原微生物に、リガーゼ活性を示す酵素をコードしている
遺伝子を有する、DNA構成体又は組換えベクターの少なくとも1コピーを導入す
るというような、周知の方法によって行うことができる。
ある実施態様において、前記リガーゼ活性又は増強されたリガーゼ活性は、該
微生物のランダム又は部位特定突然変異導入法によって得られる。
更に増強されたリガーゼ活性をもたらすこの修飾は、下記に示すように該リガ
ーゼ酵素のアミノ酸置換、欠失又は付加によって得られる。
代わりに、前記リガーゼ活性又は増強されたリガーゼ活性は、β-ラクタム系
抗生物質の生成時に、リガーゼ活性を示す酵素を付加することにより得ることが
できる。
別の実施態様において、前記DNA構成体は、それが導入されるべき、該微生物
とは異なる種から得る。
このDNA構成体又は形質転換ビヒクルの導入は、下記の周知の方法で行うこと
ができる。
ある状況では、それ自身は該β-ラクタムを産生することが不可能な別の微生
物に、リガーゼ活性を示す酵素の発現を含む、β-ラクタムの全体の生合成を移
行することが所望となる。これは、受容体(宿主)微生物が、例えば1)より容易
に形質転換される場合、2)高濃度で生合成酵素を発現することができる場合、3)
より優れた増殖特性を有する場合、又は4)回収を妨げるような不純物の生成が少
ないような場合である。このような場合に、β-ラクタムのより高い総収率を得
ることができる。
代わりに、生物において、新規生合成経路が所望であることがある。
本発明の前述の受容体又は宿主微生物は、ペニシリウム、セファロスポリウム
、アスペルギルス、ノカルジア(Nocardia)、ストレプトミセス、バチルス(Bacil
lus)、セロスポラ(Cerospora)、ミクロスポラ(Microspora)、他の真正細菌、他
の放線菌又は糸状菌を含む群から選択される。
好ましい実施態様において、この微生物は、ペニシリウム・クリソゲナム、ペ
ニシリウム・ノタツム(notatum)、セファロスポリウム・アクレモニウム、アス
ペルギルス・ニードランス、ノカルジア・ラクタムヂュランス(lactamdurans)及
びストレプトミセス・クラブリゲルスを含む群から選択された種に属する。
本発明の実施態様において、前記リガーゼ活性の発現は、β-ラクタム生合成
経路に関係する他の遺伝子の発現に同調する。これらの遺伝子は、例えばpcbAB
、pcbC及び/又はpenDE遺伝子である。
前述のβ-ラクタム系抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、セファマ
イシン、モノバクタム及びノカルディシン(nocardisin)を含む群から選択される
。
この抗生物質は、好ましくは、セファロスポリン又はペニシリンであり、例え
ばペニシリンV、ペニシリンG、V-DCA、G-DCA、7-(L-α-5-アミノ-5-カルボキシ
バレルアミド)-セファロスポラン酸(イソセファロスポリンC)、アジポイル-7-AD
CA、又はアジポイル-7-ACAである。
本発明の実施態様においては、該微生物の培養を、該DNA配列の発現を誘発す
る条件下で行い、活性化された側鎖を持つCoAチオエステルを生成し、これは次
にアシルトランスフェラーゼ(AT)の存在下で該側鎖を有するβ-ラクタムを形成
する。
この修飾された微生物の培養は、該DNA構成体又は組換えベクターの発現を誘
発する条件下で行われることが好ましく、その結果所望のβ-ラクタム系抗生物
質の側鎖に対応している酸のCoAチオエステル生成の増加を生じ、次にこれが、
β-ラクタム側鎖がβ-ラクタム核に導入されるような、β-ラクタムの生合成工
程を通じて、代謝フラックスの増加を可能にする。
更にこの微生物の培養は、該リガーゼ活性を誘発するプロモーターに応じた条
件下で行われる。
ペニシリンV又はペニシリンGを生成する特別な場合において、例えば遺伝子工
学によるリガーゼ活性の増強は、この生合成の最終工程を通じての代謝流量の増
加につながる。
本発明の改善された方法の利点は、第一に、本発明の方法は、興味深いβ-ラ
クタム系抗生物質の累積収率を顕著に上昇する。
第二に、廃棄生成物(複数)の形成が少ないので、実質的に純粋な形でのβ-
ラクタム系抗生物質の回収及び精製が容易であることである。
第三に、本発明は、かなりの量の廃棄生成物の生成を伴わずに、興味深いβ-
ラクタム系抗生物質の生成をもたらす。結果として、これは、興味深い生成物の
合成に利用できるエネルギーがより多いために、この方法をより効率的にする。
更にこれらの廃棄生成物は、この生合成経路に有害に作用しうる。
第四に、興味深いβ-ラクタム系抗生物質の収率は、発酵工程中は常に、リガ
ーゼ活性がないかもしくは低い微生物による発酵工程と比較して、顕著に上昇し
ている。本内容において、収率は、全体の収率、又は特定の時間帯の収率である
。
前述の全ての利点は、工業的に重要なβ-ラクタム系抗生物質製造法の経費を
削減する。
ACV及びイソペニシリンNの蓄積が発酵時に認められる、ペニシリンV及びペニ
シリンGの製造において、本発明のリガーゼ活性の増強は、イソペニシリンNのペ
ニシリンVへの転換が“障害”となっている場合に、これらの中間代謝産物の蓄
積の減少をもたらす。
本発明のリガーゼ活性を有さないかもしくは活性が低い微生物における、該リ
ガーゼ活性の発現又はこのリガーゼ活性の単なる増強は、例えばペニシリン及び
セファロスポリンの生成において不必要のβ-ラクタム系抗生物質中間体側鎖の
非酵素的除去を行うことができる。
更に、6-APAの製造におけるβ-ラクタム工業において周知であるように、いわ
ゆる天然のβ-ラクタムの側鎖が、フェノキシ酢酸又はフェニル酢酸のような、
ペニシリンVアシラーゼ又はペニシリンGアシラーゼを用いる酵素的加水分解によ
って容易に除去することができる疎水性側鎖で置換されるならば、発酵されたβ
-ラクタムの回収及びその後の酵素的加水分解を容易に行うことができる。
その結果、これは、in vivoにおける、V-DCA及びG-DCAのような、工業的にあ
る程度重要なβ-ラクタム系抗生物質中間体の生成の可能性を広げる。
本発明に従って、専ら酵素により触媒された方法を用い、従ってあらゆる化学
的方法を使用することなく、特定のβ-ラクタム系抗生物質を生成することが可
能であることがわかっている。
本発明の実施態様において、V-DCA又はG-DCAは、本発明に従い、専らin vivo
の酵素的方法により、本発明の増強されたリガーゼ活性の発現を宿主細胞に誘発
することで、生成される。更に、アシルトランスフェラーゼ(AT)(例えば、P.ク
リソゲナム由来のアシル-CoA:イソペニシリンNアシルトランスフェラーゼ)
及びペニシリンをセファロスポリンに形質転換することができる酵素類(例えば
、S.クラブリゲルス由来のイクスパンダーゼ)が存在する。
本発明は更に、本発明で使用することができる新規酵素に関する。
最近になって、リガーゼ活性を示す適当な新規酵素が得られ、特徴づけられた
。
本発明のこの新規酵素は、アシル-CoAシンテターゼ(リガーゼ)であり、これ
はβ-ラクタム系抗生物質を生成する際に、関心の高い生成物への代謝流量の増
加をもたらす。
本発明のこの酵素の特徴は、ある程度重要な工業的β-ラクタム系抗生物質前
駆体に対する高い特異性である。
本発明のリガーゼは、酢酸に対する明らかな活性を示さないので、そのリガー
ゼ活性の増強された発現は、一次代謝において重要な代謝産物の1種であるアセ
チル-CoAの細胞内利用を妨げることなはいであろう。従って、一次代謝による有
害な妨害リスクは、酢酸並びにフェニル酢酸及び/又はフェノキシ酢酸及び/又は
アジピン酸に対する両方の活性を有するリガーゼの増強された発現をもたらす操
作(例えば遺伝的又は化学的)と比較して低下する。
更に詳細に述べると、本発明の新規酵素は、酢酸に対する活性よりも、フェノ
キシ酢酸に対する活性の方が、少なくとも10〜100倍、好ましくは103倍、更に好
ましくは104〜106倍までも大きい。
更に、本発明の酵素は、基質特異性が、酢酸に対するよりも、フェニル酢酸に
対する方が、少なくとも10〜100倍、好ましくは103倍、更に好ましくは104〜105
倍までも大きい。
本発明の酵素は、前述のように、アシル-CoAシンテターゼであり、更に詳細に
述べると、フェノキシアセチル-CoAシンテターゼであり、以下では“リガーゼ”
と称す。
このリガーゼの触媒活性型の見かけの分子量は、ゲルろ過法によると、40,000
〜60,000ダルトンの範囲、特に約50,000ダルトンである。
このリガーゼの見かけの活性の至適pHは、pH7.0〜9.0の範囲で、特にpH8.0〜8
.5の範囲である。この酵素は、in vitroにおいて、pH7.0以下で低い活性のみを
示し、これはおそらくpHが7.5以下では、リガーゼの安定性が悪いためであ
ろう。
このリガーゼ活性の至適温度は、35℃〜45℃の間で、最高の活性は約40℃で得
られる。
このリガーゼの等電点(pI)は、pH7.25よりも高く、おそらくpH9以上で、約pH1
2よりも低い。
前述の酵素は、P.クリソゲナムの細胞抽出物から、これを硫酸アンモニウムで
沈殿し、かつ各種ゲル(例えばフェニルセファロース、シバクロン(Cibacron)ブ
ルー及 びセファクリル(登録商標)S-200)を充填したカラムで溶出すること
によって、精製することができる。リガーゼの精製の例を下記に示す。しかし、
タンパク質の精製において使用される他の周知の方法、例えばリアクティブレッ
ド、セファロース(登録商標)Q FF及びセファロースS FFのような、他のカラム
充填剤を使用する方法も、使用することができる。
本発明において、前記リガーゼは、Mg2+、ATP、CoASH、並びにフェノキシ酢酸
、フェニル酢酸、アジピン酸又はヘキサン酸から、それぞれ、フェノキシアセチ
ル-CoA、フェニルアセチル-CoA、アジポイル-CoA及びヘキサノイル-CoAの形成を
、触媒することができることが示されている。同じ系でアッセイした場合(例え
ば、下記の実施例に記載した方法)、該リガーゼは、酢酸に対する顕著な活性を
示さなかった。
この酵素は、in vitroでは不安定であるが、ATP、Mg2+、及びメルカプトエタ
ノール、ジチオスレイトール(DTT)、アスコルビン酸又は他の還元剤の添加によ
り、精製及び貯蔵時の活性が著しく安定化される。高濃度の硫酸アンモニウム又
はグリセロールの添加も、この酵素を安定にする。
下記実施例6に記載された試験条件下では、このアッセイにおけるCoASHの消
費を基にした、フェニル酢酸に対する活性は、フェノキシ酢酸に対する活性のお
よそ80%である。
他のチオール類(例えばメルカプトエタノール、ジチオスレイトール(DTT))
が存在しない状態でアッセイした場合にのみ、直接フェノキシ酢酸-CoAの合成活
性が認められた。しかし、リガーゼを、ATP、Mg2+、CoASH、フェノキシ酢酸、及
び例えばメルカプトエタノールと共にインキュベーションすると、フェノキシ
酢酸及びメルカプトエタノールのチオエステル、同じくアシルトランスフェラー
ゼ(AT)の基質として作用する、フェノキシアセチル-S-CH2-CH3と同じUV-スペク
トルを有する化合物が形成される。
本発明の実施態様において、前述の酵素は、ペニシリウム・クリソゲナム菌株
B10由来の本発明の精製されたリガーゼに対して生じた抗体と、免疫反応性であ
る。
この酵素の免疫化学的特性は、交差反応同定試験によって免疫学的に決定する
ことができる。この同定試験は、周知のオクタロニー二重免疫拡散法、又はN.H.
Axelsenの双頭交差免疫電気泳動(ゲル免疫沈降法ハンドブック;Blackwell Sci
entific Publications社、第5及び14章、(1983))によって行うことができる。
用語“抗原性(antigenic identity)”及び“部分的抗原性も、同書の第5、19及
び20章に記載されている。
本発明の酵素は、ポリペプチドである。
本内容において、本発明の酵素類は、完全な長さのポリペプチドの活性を実質
的に備える、成熟タンパク質、又はそれらの前駆体形、及びそれらの機能性断片
を含む。
更に本発明は、これらの酵素の相同体を考慮している。このような相同体は、
本発明の酵素のアミノ酸配列と、少なくとも50〜70%、より良くは70〜80%、更
に良くは100%までの同一性を示すアミノ酸配列を含む。
この同一性は、従来の方法で決定され、例えばAltshulらの論文(Bull.Math
.Bio.、48:603-616(1986))、及びHenikoff及びhenikoffの論文(Proc.Natl.A
cad.Sci.USA、89:100915-10919(1992))を参照する。簡単に述べると、2種のア
ミノ酸配列を並べ、ギャップオープニングペナルティー(opening penalty)を10
、ギャップイクステンションペナルティー(extension penalty)を1とし、及び
前述のHenikoff及びhenikoffの“ブロサム(Blosum)62”スコアリングマトリック
スを用い、整列スコアを最適化する。
本発明の酵素の相同体は、代わりに、リガーゼ活性を示す該酵素のヌクレオチ
ド配列を基に調製されたオリゴヌクレオチドプローブと、ハイブリッド形成して
いるヌクレオチド配列によってコードされたものであってよい。
これらの条件下で、オリゴヌクレオチドプローブでハイブリッド形成された分
子は、標準的検出法(例えばサザンブロット法)を用いて検出される。
本ポリペプチドの相同体は、1個以上のアミノ酸の置換、欠失又は付加を含む
ことがある。これらの変化は、小規模であることが好ましく、これは、タンパク
質の折りたたみ又は活性に有害に作用しないアミノ酸の同類置換であり、典型的
には1〜約30個のアミノ酸の小さい欠失であり;例えばアミノ末端のメチオニン
残基、約20〜25残基の小さい結合ペプチドのような小さいアミノ末端又はカルボ
キシ末端の拡張、もしくは例えばポリヒスチジントラクト(tract)、抗原性エピ
トープ又は結合ドメインのような純化を促進する小さい拡張である。Fordらの論
文(Protein Expression and Purification、2:95-107(1991))を全般的に参照
。同類置換の例は、塩基性アミノ酸(アルギニン、リジン、ヒスチジンなど)、
酸性アミノ酸(グルタミン酸及びアスパラギン酸など)、極性アミノ酸(グルタ
ミン及びアスパラギンなど)、疎水性アミノ酸(ロイシン、イソロイシン、バリ
ンなど)、芳香族アミノ酸(フェニルアラニン、トリプトファン、チロシンなど
)及び小さいアミノ酸(グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン
など)の群である。
このような置換は、その分子の機能に重要な領域の外側で行われ、かつ依然と
して活性酵素を生じることは、当業者には明らかであろう。本発明の酵素の活性
に不可欠のアミノ酸、すなわち置換されることが好ましくないアミノ酸は、部位
特定突然変異導入法又はアラニンスキャニング突然変異導入法のような、当該技
術分野で公知の方法を用いて同定することができる(Cunningham及びWellsの論
文、Science、244:1081-1085(1989))。後者の方法では突然変異を、該分子の各
残基に誘起し、得られた突然変異体分子の生物学的活性(例えば、リガーゼ活性
)を試験し、該分子の活性に重要なアミノ酸残基と同定する。リガンド−レセプ
ター相互作用部位は、同じく、核磁気共鳴、結晶学的分析又は光親和性標識のよ
うな方法で明らかにされたように、結晶構造解析により決定することができる。
例えば、de Vosらの論文(Science、255:306-312(1992))、Smithらの論文(J.M
ol.Biol.、224:899-904(1992))、Wlodaverらの論文(FEBS Lett.、309:59-64(
1992))を参照。
この相同体は、対立遺伝子の変異体、すなわち突然変異によって生じた遺伝子
の別の形、もしっくは変異した遺伝子でコードされた別の酵素であることができ
るが、本発明の酵素と実質的に同じ活性を有している。従って、サイレント突然
変異(コードされた酵素には変化がない)であるか、もしくは別のアミノ酸配列
を有する酵素をコードすることができる。
本酵素の相同体は、同じく、種相同体、すなわち別の種由来の類似の活性を示
す酵素であることができる。
この酵素の相同体は、例えばSambrookらの論文(分子クローニング:実験マニ
ュアル、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリン
グハーバー、ニューヨーク(1989))、もしくは前述のSambrookらが発表した特異
的プライマーを用いる複製連鎖反応(PCR)の標準的方法に従って、問題の種の細
胞のゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを作製し、合成オリゴヌクレオチ
ドプローブを用い、この相同体の全部又は一部をコードしているDNA配列をスク
リーニングすることにより、単離することができる。
更に本酵素の相同体は、本発明の酵素に対して生じた抗体に対し、免疫学的に
交差反応性である。
本発明の別の目的は、リガーゼ活性を示す酵素をコードしているDNA構成体を
提供することである。
本願明細書で用いる用語“DNA構成体”とは、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はR
NA起源のいずれかの核酸分子の意味を表している。用語“構成体”は、1本鎖又
は2本鎖であり、かつ興味深いポリペプチドをコードしている天然に生じたヌク
レオチド配列の全部又は一部を基にすることができる、核酸断片の意味を表して
いる。この構成体は、任意に他の核酸断片を含むことができる。
本発明のポリペプチドをコードしている本発明のDNA構成体は、例えば標準的
方法に従って、ゲノムライブラリー又はcDNAライブラリーを作製し、かつ合成オ
リゴヌクレオチドプローブを用いハイブリッド形成することにより、このポリペ
プチドの全部又は一部をコードしているDNA配列をスクリーニングする(Sambroo
kらの論文(分子クローニング:実験マニュアル、第2版、コールドスプリング
ハーバーラボラトリー、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク
(1989)を参照)ことにより得られる、ゲノム又はcDNAを起源とすることが適して
いる。この目的のために、このポリペプチドをコードしているDNA配列は、糸状
菌又は細菌が起源であることが好ましい。
このポリペプチドをコードしている本発明のDNA構成体は、同じく確立された
標準的方法、例えばBeaucage及びCaruthersの論文に記載されたホスホアミジテ(
phosphoamidite)法(Tetrahedron Letters、22:1859-1869(1981))、又はMatthe
sらの論文に記載された方法(EMBO Journal、3:801-805(1984))により、合成的
に調製することができる。ホスホアミジテ法では、例えば自動DNA合成装置を用
いてオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニールし、連結し、かつ適当なベ
クターにおいてクローニングする。
更に、このDNA構成体は、標準的方法に従って、核酸構成物全体の様々な部分
に対応する断片である、合成されたゲノムの又はcDNA起源の断片(適切なものと
して)の連結反応によって調製された、合成及びゲノム起源の混合されたもの、
合成及びcDNA起源の混合されたもの、又はゲノム及びcDNA起源の混合されたもの
であることができる。
このDNA酸構成体(DNA acid construct)も、例えば米国特許第4,683,202号に開
示された方法、又はSaikiらの論文の方法(Science、239:487-491(1988))のよ
うな、特定のプライマーを用いる複製連鎖反応により調製することができる。本
発明の好ましい実施態様において、DNA配列は、アスペルギルス属、ペニシリウ
ム属又はセファロスポリウム属に属する糸状菌に由来することができ、好ましく
はP.クリソゲナム、C.アクレモニウム又はA.ニードランス菌に、特にP.クリソゲ
ナム菌株B10に由来する。
別の態様において、本発明は、リガーゼ活性を示す酵素をコードしている本発
明のDNA構成体を含む組換えベクター又は形質転換ビヒクルに関する。本発明のD
NA構成体が挿入された組換えベクターは、都合が良いことにDNA組換え操作を実
施されたいずれかのベクターであってよく、かつベクターの選択は、それが導入
された宿主細胞に依存することが多い。従って、ベクターは、自律増殖ベクター
、すなわち染色体外の実体として存在するベクターであり、その複製は染色体の
複製からは独立していて、例えばプラスミドであることができる。代わりに、
このベクターは、宿主細胞に導入された場合に、宿主細胞ゲノムに組込まれ、か
つ組込まれている染色体(複数)と共に複製されるものであることができる。
このベクターは、本発明のポリペプチドをコードしているDNA配列が、DNAの転
写に必要な別の断片に操作可能に結合された発現ベクターであることが好ましい
。一般に、この発現ベクターは、プラスミド又はウイルスのDNAに由来するか、
もしくは両方の要素を有することができる。用語“操作可能な結合”とは、例え
ば、プロモーターにおいて転写が開始し、かつポリペプチドをコードしているDN
A配列を通って進行するというように、断片の意図された目的に沿って機能する
ように、断片が配列していることを意味する。
このプロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示すいずれかの
DNA配列であってよく、かつ宿主細胞の相同体又は異種体のいずれかのタンパク
質をコードしている遺伝子に由来することができる。
糸状菌宿主細胞において使用するのに適したプロモーターの例は、例えばADH3
プロモーター(McKnightらの論文、The EMBO J.、4:2093-2099(1985))、又はt
piAプロモーターである。他の有用なプロモーターの例は、A.オリザエ(oryzae)T
AKAアミラーゼ、リゾムコル・ミエハイ(Rhizomucor miehei)アスパラギン酸プロ
テイナーゼ、A.ニゲル中性α-アミラーゼ、A.ニゲル酸安定α-アミラーゼ、A.ニ
ゲル又はA.アワモリ(awamori)グルコアミラーゼ(gluA)、リゾムコル・ミエハイ
リパーゼ、A.オリザエアルカリプロテアーゼ、A.オリザエトリオースリン酸イソ
メラーゼ、又はA.ニードランスアセトアミダーゼをコードしている遺伝子に由来
するものである。TAKA-アミラーゼ及びgluAのプロモーターが、好ましい。
β-ラクタム系抗生物質の合成に関連した中間体の同調された生成を得ること
を目的として、2種以上の生合成遺伝子を調節するために、同一又は類似のプロ
モーターを使用することはしばしば都合が良い。中間体の生成が同調されない場
合は、中間体の蓄積(障害となる)が生じることがある。結果として、β-ラク
タム系抗生物質の生成が維持される。
本発明の実施態様において、前記リガーゼ遺伝子のプロモーターは、β-ラク
タムの生合成に関係した別の遺伝子のプロモーターによって置き換えられる。
適当なプロモーターの具体的な例は、非公開のデンマーク国特許出願第
1118/94号に記載された、ATプロモーターである。
細菌の宿主細胞に適したプロモーターの例は、バチルス・ステアロセスモフィ
ラス(stearothermopppilus)マルトース性アミラーゼ遺伝子、バチルス・リシェ
リニフォルミス(lichniformis)α-アミラーゼ遺伝子、バチルス・アミノクリフ
ァシエランス(amyloliquefaciens)BANアミラーゼ遺伝子、バチルス・サブチリス
(subtilis)アルカリプロテアーゼ遺伝子、又はバチルス・プミラス(pumilus)キ
シロシダーゼ遺伝子のプロモーター、もしくはλファージPA又はPLのプロモー
ター、又はE.coliのlac,trp又はtacプロモーターである。
本発明の酵素をコードしているDNA配列は、必要であるならば、適当なターミ
ネーターと操作可能に連結することもできる。
本発明の組換えベクターは、有利なことに問題の宿主細胞におけるベクターの
複製を可能にするDNA配列を含んでいる。
この組換えベクターは、例えば更にその生成物が宿主細胞の欠損を補っている
遺伝子のような、選択マーカーを含み、例としてジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHF
R)をコードしている遺伝子、又はシゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharom
yces pombe)TPI遺伝子(P.R.Russellの論文、Gene、40:125-130(1985))、もし
くは例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、フレオマイシン、
クロラムフェニコール、ネオマイシン、ハイグロマイシン又はメトトレキサート
などに対し薬剤耐性をもたらす遺伝子がある。糸状菌の選択マーカーは、amdS、
pyrG、arqB、niaD、及びsCである。
本発明のリガーゼ酵素を、宿主細胞内、又は発酵培地の所望の位置に送るため
に、それぞれ標的シグナル又は分泌シグナルの配列(リーダー配列、プレプロ配
列又はプレ配列としても公知)を、組換えベクターに提供することができる。こ
の標的シグナル又は分泌シグナル配列は、正しい読み枠で酵素をコードしている
DNA配列に加えられる。分泌配列は、通常該酵素をコードしているDNA配列の5'末
端に位置し、一方標的シグナル配列は、通常このDNA配列の3'末端に位置する。
これらの標的シグナル又は分泌シグナルの配列は、通常該酵素に関連したもので
あるこり、もしくは所望のシグナル配列を有する別のタンパク質をコードしてい
る遺伝子に由来することができる。
糸状菌において使用するためには、このシグナルペプチドは、便宜上アスペル
ギルスsp.アミラーゼ又はフルコアミラーゼをコードしている遺伝子、リゾムコ
ル・ミエハイリパーゼ又はプロテアーゼ、フミコラ・ラヌギノサ(Humicolalanug
inosa)リパーゼなどをコードしている遺伝子に由来することができる。このシグ
ナルペプチドは、A.オリザエTAKAアミラーゼ、A.ニゲル中性α-アミラーゼ、A.
ニゲル酸安定アミラーゼ、又はA.ニゲルグルコアミラーゼをコードしている遺伝
子に由来することが好ましい。
本発明によると、前記標的配列は、リガーゼ活性に細胞内の所望の位置を指示
することができる標的シグナルであることが好ましい(例えば、ミクロボディー
)。可能性のある標的シグナルが維持されることが所望であることが多い。しか
し、この標的シグナルは、同じ機能を持つ他のシグナルで交換することができる
。更に、生物に適当なリガーゼ標的シグナルがなく、生物にリガーゼをコードし
ている配列を挿入する場合には、宿主細胞の所望の位置においてリガーゼ発現を
行うために、標的シグナルを加えることができる。
糸状菌での使用については、例えばニューロスポラ・クラッサ(Neurosporacra
ssa)の、細胞質ゾルのパッセンジャータンパク質をペルオキシソーム(ミクロボ
ディーに分類)に転移する能力がある、ペルオキシソーム標的シグナル(PTS)の
例が、Kellerらの論文に記載されている(J.Cell biol.、114:893-904(1991))。
本酵素をコードしているDNA配列、プロモーター、並びに任意にターミネータ
ー及び/又は各々分泌シグナル配列又は標的シグナル配列を連結するため、並び
にこれらを複製に必要な情報を含む適当なベクターに挿入するために用いた方法
は、当業者には周知である(Sambrookらの論文、分子クローニング:実験マニュ
アル、第2版、コールドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリング
ハーバー、ニューヨーク(1989)を参照)。
本発明の更なる目的は、本発明のDNA構成体又は組換えベクターを含む細胞を
提供することである。
宿主細胞に導入された本ポリペプチドをコードしているDNA配列は、該宿主の
相同体又は異種体のいずれかであることができる。宿主細胞の相同体である場合
、すなわち実際に宿主細胞によってもたらされた場合には、他のプロモーター配
列
に、利用可能ならばその天然の環境以外の別の分泌シグナル配列及び/又はター
ミネーター配列に、操作可能に連結することができる。用語“相同体”は、cDNA
、半合成的又は合成的に作製されたDNA、問題となっている宿主生物に固有のポ
リペプチドをコードしている配列を意図する。用語“異種体”は、宿主細胞では
全く発現されないDNA配列を含むことを意図する。従って、このDNA配列は、別の
生物に由来することができるか、もしくは合成配列でありうる。
本発明のDNA構成体又は組換えベクターが導入された宿主細胞は、本ポリペプ
チド(酵素)を産生することを可能にするいずれかの細胞であってよく、かつ糸
状菌及び細菌の細胞を含むことが好ましい。
培養により、本発明の酵素を産生することが可能でると思われる、細菌の宿主
細胞の例は、グラム陽性菌であり、具体的にはバチルス株、例えばB.サブチリス
、B.リシェニフォルミス、B.レンタス、B.ブレビス、B.ステアロセスモフィラス
、B.アルカロフィラス、B.アミロリクエファシエンス、B.コアギュランス、B.サ
ーキュランス、B.ラウタス、B.メガテリウム又はB.スリンギエンシス株、もしく
はストレプトミセス株、例えばS.リビダンス、S.ムリナス又はS.クラブリゲラス
などであり、もしくはグラム陰性菌であり、具体的には、エシェリヒア・コリで
ある。前述の細菌の形質転換は、それ自体公知の方法である、プロトプラスト形
質転換、もしくはコンピテント細胞の使用によって影響を受ける(前述のSambro
okの論文を参照)。
E.coliのような細菌においてこの酵素を発現する場合は、該酵素を細胞質、典
型的には不溶性顆粒(封入体として公知)中に保持することができるか、もしく
は、細菌の分泌配列によって周辺腔に送ることができる。前者の場合は、これら
の細胞は溶解し、かつ顆粒は、回収され変性され、その後変性剤を希釈すること
によって、ポリペプチドが再び折りたたまれる。後者の場合は、該酵素は、周辺
腔の内容物を放出するために、例えば音波処理又は浸透圧ショックにより、細胞
を破壊し、酵素を回収することにより、周辺腔から回収される。
糸状菌細胞の例は、例えば、ペニシリウムspp.、アスペルギルスspp.、ニュー
ロスポラspp.、フサリウムspp.、トリコデルマspp.、又はセファロスポリンspp.
であり、特にP.クリソゲナム、P.ノタツム、A.オリザエ、A.ニゲル又はC.アクレ
モニウム菌株である。真菌細胞は、それ自身公知の方法である、プロトプラスト
形成、及び該プロトプラストの形質転換、その後の細胞壁の再生に関連した方法
により形質転換することができる。アスペルギルスspp.を用いたタンパク質発現
は、例えば欧州特許第272,277号、第238,023号、第184,438号に開示されている
。例えばF.オキシスポラムの形質転換は、Malardierらの論文に記載された方法
で実行することができる(Gene、78:147-156(1989))。
糸状菌を宿主細胞として使用する場合には、これは本発明のDNA構成体で形質
転換することができ、便宜上はこのDNA構成体を宿主染色体に組込み、組換え宿
主細胞を得る。この組込みは、該DNA配列が細胞内でおそらく安定である場合に
、利点であると一般に考えられる。このDNA構成体の宿主染色体への組込みは、
一般的方法、例えば相同体又は異種体の組換えによって行われる。
前述の形質転換され又は形質移入された宿主細胞は、その後適当な栄養培地に
おいて、本酵素の発現をもたらす条件下で培養され、その後得られる酵素を、培
地から回収する。
この細胞の培養に使用する培地は、適当な補給栄養素を含む無機培地又は複合
培地のような、該宿主細胞の増殖に適した、通常の培地のいずれかであってよい
。適当な培地は、民間の製造業者から入手するか、もしくは公開された方法に従
って調製することができる(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション(ATCC)のカタログに記載)。
これらの細胞によって生成された酵素は、その後、遠心分離又はろ過による培
地から宿主細胞の分離、硫酸アンモニウムのような塩を用いる上清又はろ液から
のタンパク質成分の沈殿、問題となっているポリペプチドの種類に応じた、イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、等電点電気泳動、ア
フィニティークロマトグラフィーなどのような、各種のクロマトグラフィー法及
び/又は電気泳動法による精製を含む、通常の方法によって、培養培地から回収
することができる。
この宿主細胞の細胞内に酵素が存在している場合は、これらの細胞は、まず遠
心分離又はろ過により、発酵培地から回収される。その後細胞を、ホモジネート
し、細胞を破壊し、次に上清又はろ液のタンパク質性成分を前述の塩を用いて沈
殿する。最後に、この酵素を前述の方法で精製する。
本発明の実施態様において宿主細胞は、例えばバチルス又はストレプトミセス
属のようなグラム陽性菌細胞であるか、又はエシェリヒア属のようなグラム陰性
菌細胞である細菌細胞、及びアスペルギルス、セファロスポリウム又はペニシリ
ウムのような糸状菌の細胞である。
好ましい実施態様において、宿主細胞は、P.クリソゲナム及びC.アクレモニウ
ムである。方法及び材料 菌株:
B10:P.クリソゲナム菌株(パンラブス(Panlabs)社から入手、11804ノースクリー
クパークウェイサウス、ボセル、WA、98011-8805、USA)
P8:P.クリソゲナム菌株(パンラブス社から入手)材料:
LCS寒天傾斜培地:(J.Lein、“パンラブス社ペニシリン菌株改善プログラム”10
5-139頁、Vanek,Z.及びHostalek,Z.(編集)、微生物代謝産物の過剰産生、菌
株改善及びプロセス制御法、バターワース、ボストン(1986))
LCS培地:ラクトースモノハイドレート1.5%、corn steep liquor 0.5%、ペプ
トン0.5%、NaCl 0.4%、MgSO4・7H2O 0.05%、KH2PO4 0.06%、FeCl3・6H2O 0.
0005%。
ツイーン(登録商標)-80:メルクアート82218
P-1播種培地:(J.Lein、前述(1986))
P-2発酵培地:(J.Lein、前述(1986))ベクター:
pUC19:2.6kb Asp719-SalI断片形質転換選択マーカー:
E.coli Tn5 フレオマイシン耐性遺伝子
アスペルギルス・オリザエTPI(トリオースリン酸イソメラーゼ)プロモーター
及びアスペルギルス・ニゲルAMG(アミログルコシダーゼ)で発現。装置:
セファロース(登録商標)S FFカラム(ファルマシアバイオテック社)
フェニルセファロースCL 4Bカラム(150ml)(ファルマシアバイオテック社)
PD10カラム(ファルマシアバイオテック社)
スペルコシルRP C-18 DBカラム(250×4.6mm)スペルガード(スペルコ社)
フローワン/βシリーズ100放射能検出器(ラジオマチック社)
ケイ酸イットリウムフローセル(ラジオマチック社)
セファクリルS-200カラム(181ml)(ファルマシアバイオテック社)
クロマトフォーカシングPBE(登録商標)94カラム(20ml)(ファルマシアバイオ
テック社)
ファルマシアLKBファストシステム(ファルマシアバイオテック社)
シバクロンブルー3GAカラム(シグマ社)
ABI 1000SホトダイオードアレーHPLC-検出器(アプライドバイオシステム社)
HPLC(ウォーター社)
アプライドバイオシステム394 DNA/RNA 合成装置
アプライドバイオシステム473アミノ酸配列分析装置
ウォーター(登録商標)991ホトダイオードアレー検出器参照酵素及び化合物
アセチル-CoA(シグマ社)
アセチル-CoAシンテターゼ(シグマ社)
ウシ血清アルブミン(“BSA”)(シグマ社A7638)
ゲルろ過検量用キット(ファルマシアバイオテック社)
フェノキシ酢酸CoAエステル(M.J.Alonsorらの論文、J.Antibiot.、41:1074-10
84(1988))
フェニル酢酸CoAエステル(シグマ社)
アジピン酸CoAエステルは、下記の方法で調製した:塩化アジポイル(0.14ml;
アルドリッヒ社)に、アセトン(60ml;メルク社)+水(0.6ml)+0.2M KHCO3
(pHを7以上に調節)を溶媒とする、良く攪拌したCoA-Na塩(400mg;5.152×10-4
mmol;シグマ社)の氷水で冷やした懸濁液を、窒素大気下で添加した。この
反応物のpHを約7.7に調節し、その後同じ温度で更に60分間攪拌した。その後、
アセトンを一部減圧下で除去し、得られた生成物を冷水に溶解し、凍結乾燥した
。収量は、0.0890gであった。最後に、この生成物を限外ろ過した。バッファー:
バッファ-A:50mMトリス/HCl、pH8.5、1.36M硫酸アンモニウム、4mM EDTA、5mM
ATP、5mMアスコルビン酸、1mM PMSF(フェニル-メチル-スルホニル-フルオリド
)。
バッファーB:50mMトリス/HCl、pH8.5、0.68M硫酸アンモニウム、4mM EDTA、5m
M ATP、5mMアスコルビン酸、1mM PMSF。
バッファーC:50mMトリス/HCl、pH8.5、20%グリセロール、4mM EDTA、5mM ATP
、5mM MgCl2、5mMアスコルビン酸、1mM PMSF。
バッファーD:バッファーCと、150mM KCl。
バッファーE:10mMトリス/HCl、20%グリセロール、4mM EDTA、5mM MgCl2、5mM
ATP、5mMアスコルビン酸、及び1mM PMSF、pH8.2。
バッファーF:50mMトリス/HCl、20%グリセロール、4mM EDTA、5mM MgCl2、5mM
ATP、及び5mMアスコルビン酸、pH7.5。溶液
:
溶液A:50mMトリス/HCl(pH8.5)、35%硫酸アンモニウム、4mM EDTA、5mM ATP
、1mM PMSF、5mMメルカプトエタノール。
溶液B:50mMトリス/HCl(pH8.0)の溶媒中に0.25M MgCl210μl、0.1M ATP 50μl
、50mMトリス/HCl(pH8.0)の溶媒中に20mM CoASH 50μl、及び50mMトリス/HCl(
pH8.0)の溶媒中に0.2Mフェノキシ酢酸又はフェニル酢酸又はアジピン酸又はヘキ
サン酸が30μlを混合し、かつ20℃で、5分間、平衡化した。
溶液C:50mMトリス/HCl(pH8.5)、硫酸アンモニウム(20%飽和)、4mM EDTA、
5mM ATP、5mMアスコルビン酸、1m MPMSF、4mM MgCl2。
溶液D:5ml中に、1.2M MgSO4、10mM NaH2PO4、pH5.8、150mgノボジム(Novozym)
234(バッチ#1199)、キチナーゼ(シグマ社、4U/ml)100μl。
溶液E:0.6Mソルビトール、100mMトリス/HCl、pH7.0。
溶液F:1.2Mソルビトール、10mMトリス/HCl、pH7.5、10mM CaCl2。
溶液G:60%PEG4000(BDH#29576)、10mMトリス/HCl、pH7.5、10mM CaCl2。
溶液H:25mMリン酸ナトリウムバッファー中に、20容量%アセトニトリル、pH6.
5。
溶媒I:20mMリン酸ナトリウム中に、13%メタノール、pH2.5。
基質溶液A:50mMトリス/HCl中に0.25M MgCl2 100μl、0.1M ATP 500μl、50mM
トリス/HCl中に20mM CoASH 500μl、及び50mMトリス/HCl中に0.067M酢酸カリ
ウム300μl。
溶媒A:25mMリン酸ナトリウムバッファー中に、15容量%アセトニトリル、pH6.
5。
溶媒B:25mMリン酸ナトリウムバッファー中に、5容量%アセトニトリル、pH6.
5。方法
:A)P. クリソゲナム由来のフェノキシアセチル-CoAシンテターゼのクローニング
P.クリソゲナム由来のゲノムDNAを、Schwartz-Sommerらの論文(EMBO J.、3:
1021-1028(1984))の方法に従って単離し、かつSau3Aで部分消化した。その後、
大きさが15-23kbの断片を単離し、かつλEMBL3 BamHIアーム(プロメガ(Promega
)社)に連結した。
精製して均一にし、フェノキシアセチル-CoAシンテターゼの部分的アミノ酸配
列を、アプライドバイオシステムズ473アミノ酸配列自動決定装置を用いて、リ
ガーゼ又はその断片にエドマン分解を施して決定した。このアミノ酸配列から、
縮退したプライマー類を、Beaucage及びCaruthersの論文(Tetrahedron Letters
、22:1859-1869(1981))に記されたホスホアミジテ法、例えばアプライドバイオ
システムズ394 DNA/RNAシンセサイザーを用いることによって調製することがで
きる。
プラークハイブリダイゼーション法(Maniatisらの論文、分子クローニング:
実験マニュアル、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク)に
より、λEMBL3中に構成されたP.クリソゲナムDNAのゲノムライブラリーをスクリ
ーニングすることによって、クローンを単離することができ、これは、フェノキ
シアセチル-CoAシンテターゼ遺伝子に特異的な縮退したプライマーと、ハイブ
リッドする。
機能性フェノキシアセチル-CoAシンテターゼ遺伝子を含むλクローンの領域を
、Tn5 フレオマイシン耐性遺伝子と共に、pUC19ベクターにサブクローンし、得
られたプラスミドを、例えばP.クリソゲナムの形質転換に使用することができる
。B)P. クリソゲナムの形質転換
ペニシリウム・クリソゲナム菌株B10(高収量菌株)を、LCS 培地100mlが入っ
た2個のフラスコにおいて、26℃で、36時間培養した。菌糸体をマイラ(Myra)布
上で収集し、かつ0.6M MgSO4500mlで完全に洗浄した。その後菌糸体を、プラス
ティックチューブに移し、溶液D5mlで懸濁し、氷上に5分間放置した。この菌
糸体懸濁液に、BSA(12mg/ml)750μlを添加し、更に、30℃で、1〜2時間、緩や
かに攪拌しながらインキュベートした。プロトプラスト形成を、光学顕微鏡で制
御した。
プロトプラストを、マイラ布上に収集し、かつ溶液E5ml上に、慎重に重ねた
。2000rpm×15分で、低速遠心分離した後、溶液E及び溶液Dの境界に局在した
プロトプラストを、ピペットで採取し、かつ2倍量の溶液Fを加えて希釈し、再
度2500rpm×5分遠心分離した。プロトプラストペレットを、溶液Fで2回洗浄
し、単離したプロトプラストを、溶液Fで希釈し、1-2×107細胞/mlを得た。プ
ロトプラスト100μlを用いて、形質転換した。
CsCl密度勾配で調製したDNA 10μg(Maniatisらの論文、(1982)上記)を、前
述のプロトプラストに添加し、室温で20分間放置した。その後溶液G200μlを添
加し、かつ室温で20分間放置した。次に、1.2Mソルビトールを3倍量添加し、か
つプロトプラスト−DNA凝集体を、2500rpm×10分遠心分離した。その後、このペ
レットを、1.2Mソルビトール300μlで再懸濁し、LCS寒天傾斜培地中にフレオマ
イシンを50μg/ml含有する3個の選択プレート(各100μl)上に拡げた。プレー
トを、形質転換体が出現するまで、26℃でインキュベートした。
その後得られた形質転換体を単離し、かつ振盪フラスコ中で発酵することによ
り、それらのペニシリン産生能を試験した。C)P. クリソゲナムの発酵
ペニシリウム・クリソゲナム菌株B10 又はP8(パンラブス社)の凍結乾燥した
胞子を、ツイーン(登録商標)-80 0.1容量%含有する蒸留水中に懸濁した後、L
CS寒天傾斜培地10mlに接種した。25℃で10日間インキュベートした後、各傾斜培
地表面から得た胞子を、0.1%ツイーン(登録商標)-80 10mlに懸濁し、かつこ
の懸濁液5mlを、300mlエーレンマイヤーフラスコに入れたP-1接種培地に接種し
た。この接種培地を、回転振盪器で290rpmで回転しながら、25℃でインキュベー
トした。48時間後、接種培地のアリコート2mlを、300mlエーレンマイヤーフラス
コ内の35mlのP-2発酵培地(ラード油をオリーブ油に交換)への接種に用いた。
この培地を、収集するまで、25℃、290rpmでインキュベートした。D) 収集、抽出および沈殿
ろ過により、P.クリソゲナムの3日間培養物から細胞を単離し、5倍量の0.9
%塩化ナトリウムで迅速に洗浄した。これらの細胞を、液体窒素で凍結し、かつ
モーターでホモジネートした。溶液Aの懸濁液で酵素を抽出した。細胞デブリは
、遠心分離により除去した。この抽出物に硫酸アンモニウムを添加し50%飽和と
し、生じた沈殿を遠心分離で除去した。その後、硫酸アンモニウムを70%飽和ま
で添加することによって、該酵素を沈殿した。遠心分離した後、ペレットを溶液
Cに溶解した。E) フェニルーセファロース(登録商標)CL 4Bカラムクロマトグラフィー
タンパク質2280mg(95ml)(前項記載)を、バッファ−Aで平衡化したフェニル
-セファロースCL 4Bカラム(150ml)に添加した、流速:60ml/時。このカラムを
、500mlのバッファーAで洗浄し、その後バッファーB100%からバッファーC10
0%への勾配をつけ、総量1800mlで溶出した。8mlの分画を収集した。
全分画について、フェノキシアセチル-CoAシンテターゼ活性及びアセチル-CoA
シンテターゼ活性を測定した。分画番号115〜277の間に溶出されたフェノキシア
セチル-CoAシンテターゼ活性は、分画番号175で活性のピークを示した。分画番
号108〜157の間に溶出されたアセチル-CoAシンテターゼ活性は、分画番号118で
活性のピークを示した。F) シバクロンブルーカラムクロマトグラフィー
前述のフェニル-セファロースクロマトグラフィーでの分画番号143〜225を一
緒にし、かつ硫酸アンモニウムを65%飽和まで添加し、タンパク質を沈殿した。
この沈殿を、バッファーC10ml中で再懸濁し、PD10カラムを用いて脱塩した。最
終の試料体積:16ml。
この試料を、シバクロンブルー20mlを充填し、バッファーCで平衡化したカラ
ムに添加した。このカラムをカラム容量の10倍量のバッファーCで洗浄し、流速
25ml/時で、KCl勾配(0-0.25M KCl)で溶出した。溶出液は、8.3mlの分画で収
集した。フェノキシアセチル-CoAシンテターゼ活性は、分画番号36〜65の間に溶
出し、分画番号45において最大であった。G) ゲルろ過S-200(超微粒子)
シバクロンブルークロマトグラフィーの分画番号36〜56を一緒にし、限外ろ過
で濃縮し(カットオフ(cut off)10.000)、PD10カラム上で、バッファーDで脱
塩し、タンパク質7mg(3.3ml)を、同じバッファーで平衡化したセファクリルS-
200カラム(181ml)に添加した。このカラムを、バッファーDで溶出し(流速10ml
/時)、1mlのアリコートを収集し、アッセイした。フェノキシアセチル-CoAシ
ンテターゼは、分画番号72〜118に溶出し、ピークの活性は分画番号87であった
。H) クロマトフォーカシングPBE(登録商標)94
分画番号79〜107を一緒にし、限外ろ過で濃縮し(カットオフ10.000)、かつバ
ッファーEを用い、PD10カラムで脱塩した。最終試料体積:3.0ml。
この試料を、バッファーEで平衡化した20ml PBE(登録商標)94カラムに添加
し、このカラムを、流速30ml/時を用いバッファーEで溶出した。1.5mlの分画
で収集した。フェノキシアセチル-CoAシンテターゼ活性は、分画番号11〜40に溶
出し、ピークの活性は分画番号17であった。I) セファロース(登録商標)S FFカラムクロマトグラフィー
フェニル-セファロースカラムクロマトグラフィー(上記)の分画番号143-225
を一緒にしたアリコート中のタンパク質(149mg)に、硫酸アンモニウムを65%飽
和まで添加し沈殿させた。この沈殿を、バッファーFに再懸濁し、PD10カラムを
用いて脱塩した。最終試料体積:28ml。
この試料を、バッファーFで平衡化した50mlセファロースS FFカラムに添加し
た。試料を添加した後、このカラムを、バッファーF150mlで洗浄し、KCl勾配
(0-0.3M KCl)で溶出した。全行程において、流速は50ml/時であり、分画は5m
lであった。フェノキシアセチル-CoAシンテターゼの活性は、分画番号45〜120の
間に溶出し、分画番号16に、タンパク質の最大値が現れたにもかかわらず、活性
のピークは、分画番号48であった。J) フェノキシアセチル-CoAシンテターゼ及びフェニルアセチル-CoAシンテターゼ の直接アッセイ
酵素溶液100 μlを、フェノキシ酢酸(又はフェニル酢酸)及びCoASHを含有す
る溶液Bに添加して、反応を開始した。25℃で30分間インキュベートした後、0.
5%トリフルオロ酢酸240 μlを添加して、反応を停止した。生成した沈殿を遠心
分離により除去し、かつ生成したフェノキシ酢酸CoAエステル(又はフェニル酢
酸CoAエステル)の量を、HPLCを用いて測定した。
HPLCによるフェノキシ酢酸CoAエステル又はフェニル酢酸CoAエステルの検出:カ
ラム:スペルガードを伴うスペルコシルRP C-18 DB
検出:260nmでのUV検出
溶媒A:25mMリン酸ナトリウムバッファーを溶媒とする、15容量%のアセトニト
リル、pH6.5
流速:1ml/分
フェノキシアセチルCoAエステルの保持時間:9.7分、及びフェニルアセチルCoA
エステルの保持時間:9.0分。
フェノキシアセチルCoAエステル及びフェニルアセチルCoAエステルは、標準品に
対して定量した。K) アジポイル-CoAシンテターゼの直接アッセイ
酵素1容量を、アジピン酸を含有し、pH8.5に調節した溶液B1.4容量に添加し
、反応を開始した。典型的インキュベーション混合物は、酵素250μl及び溶液B
350μlからなる。インキュベーションは、30℃で行った。一定の時間間隔で、こ
のインキュベーション混合物から試料を採取し、かつ等量の0.5%トリフルオロ
酢酸に混合した。生成した沈殿を遠心分離により除いた。生成したアジポイル-C
oAエステルの量を、HPLCで分析した。
HPLCによるアジポイル-CoAエステルの検出:
カラム:スペルコシルRP C-18-DB
検出:257nmでのUV検出
溶出液:25mMリン酸ナトリウムバッファーを溶媒とする、5%のアセトニトリル
、pH5.6
流速:1ml/分
アジポイルCoAエステルの保持時間:11.4分。
アジポイル-CoAエステルを、対照として用いた。L) ヘキサノイル-CoAシンテターゼの直接アッセイ
酵素1容量を、ヘキサン酸を含有し、pH8.5に調節した溶液Bを1.4容量に添加
し反応を開始した。典型的インキュベーション混合物は、酵素250μl及び溶液B3
50μlからなる。インキュベーションは、30℃で行った。一定の時間間隔で、こ
のインキュベーション混合物から試料を採取し、かつ等量の0.5%トリフルオロ
酢酸に混合した。生成した沈殿を遠心分離により除いた。生成したヘキサノイル
-CoAエステルの量を、HPLCで分析した。
HPLCによるヘキサノイル-CoAエステルの検出:
カラム:スペルコシルRP C-18-DB
検出:257nmでのUV検出
溶出液:25mMリン酸ナトリウムバッファーを溶媒とする、15%のアセトニトリル
、pH6.5
流速:1ml/分
ヘキサノイルCoAエステルの保持時間:20.4分。M) アセチル-CoAシンテターゼの直接アッセイ
基質溶液Aを混合し、pHを、4M KOHで8.0に調節した。酢酸-1-14Cナトリウム4
0μl(41.8mCi/mmol、1.0mCi/ml)を添加し、かつこの混合物を35℃で平衡化し
た。
アッセイ:酵素25μl及び基質溶液A35μlを混合し、かつ35℃で30分間インキュ
ベートした。0.5%トリフルオロ酢酸60μlを添加して、反応を停止した。生成し
た沈殿はすべて、遠心分離により除去し、生成したアセチル-CoAエステルの量を
放射能検出器を装備したHPLCで測定した。非放射性化合物は、ラジオマチッ
ク社の検出装置に配置されたUV検出器で、210nmで測定した。
HPLCによるアセチル-CoAエステルの検出:
カラム:スペルガードを伴うスペルコシルRP C-18-DB
検出:放射性化合物は、250μlのケイ酸イットリウムフローセルを装備した、フ
ローワン/βシリーズ100放射能検出器(ラジオマチック社)を用いて、測定し
た。210nmでのUV検出
溶媒B:25mMリン酸ナトリウムバッファーを溶媒とする、5容量%のアセトニト
リル、pH6.5
流速:1ml/分
アセチル−CoAエステルの保持時間:6.9分。
対照として、アセチル-CoA(シグマ社)、更にアセチル-CoAシンテターゼ(シ
グマ社)の基質混合物Aとのインキュベーションを用い、生成した14C-アセチル-
CoAを、HPLCで測定した。N)HPLC によるペニシリンV及びペニシリンGの検出
インキュベーション後、容器を10分間氷冷した。遠心分離後、上清を、下記の
条件下で、HPLCによりペニシリンV又はペニシリンGについて分析した:カラム
:スペルガードを伴うスペルコシルLC-C-18-DBカラム(250×4.6mm)
検出:215nmでのUV検出
溶媒:溶媒H
流速:1ml/分
注入体積:10μl
ペニシリンVの保持時間(RT):13.3分で、ペニシリンGのRT:8.7分。O)ACV 及びIPNSのHPLC測定用試料の調製
試料2mlを、振盪フラスコから取り出し、迅速に0〜4℃で冷却し、25倍量の2
5mMリン酸ナトリウム(pH6.5)で希釈し、かつ限外ろ過した(カットオフ10.000)
。ろ液に、最終濃度5mMになるようジチオスレイトール(DTT)を添加し、かつ試料
をHPLCで分析した。
カラム:スペルガードを伴うスペルコシルLC-18-DBカラム(250×4.6mm)
検出:210nmでのUV検出
溶媒:溶媒I
流速:2ml/分
温度:35℃
注入体積:10μl
イソペニシリンN及びACVの保持時間(RT):各々、5.7分及び17分。P)P. クリソゲナム由来のアシル−CoAの抽出
P.クリソゲナム由来のアシル−CoA化合物を、Barbera E.Corkey及びJude T.
Deeneyの方法“代謝におけるアシル−CoA調製及びシグナル形質導入”(Prgress
in clinical and Biological Research、321:217-232(1990))に従って抽出し
た。
P.クリソゲナム(菌株P10又は菌株P8)を、“A)P.クリソゲナムの発酵”の項
に記載したように振盪フラスコ内で増殖した。P-2培地(pH6.1)で4日間培養し
た後、氷塩浴で、細胞を急激に冷却し、22000gav×30秒遠心分離し、かつ細胞を
収集した後、ペレットを、3分以内に液体窒素中で凍結した。これらの細胞は、
2倍量の0.6Nトリクロロ酢酸を添加した後、解凍した。30秒音波処理した後、こ
の細胞抽出物を、遠心分離により単離した(12000gav×30秒)。トリクロロ酢酸
を、水相のpHが6になるまで、ジエチルエーテルで抽出除去した。この水相(ア
シル−CoA化合物を含有)を凍結乾燥し、かつこの試料を最終的に25mMリン酸ナ
トリウムバッファーpH6.5に溶解し、かつ“フェノキシ酢酸-CoAの検出”の項で
使用した条件で、HPCLで分析した。Q)P. クリソゲナムにおけるフェノキシ酢酸代謝産物の標識
P.クリソゲナム(B10又はP8)を、“P.クリソゲナムの発酵”の項に記載した
ように、振盪フラスコ内で増殖した。P-2培地(pH6.1)で4日間培養した後、細
胞10mlを、[1-14C]-フェノキシ酢酸250μl(72μCi/ml、9.7μCi/μmol)を入れ
た50mlのエーレンマイヤーフラスコに移した。その後このフラスコを、振盪しな
がら26℃でインキュベートした。
1、15、30、60、120、240及び360分後、細胞1mlを採取し、急激に0℃に冷
却し、22000gav×1分遠心分離した。得られたペレットを、5%リン酸500μl及
びメタノール500μlに懸濁し、この混合物を、1分間音波処理した。遠
心分離後、上清を、放射能検出器を用いてHPLCで分析し、標識した代謝産物を同
定した。
HPLC条件:
カラム:スペルガードを伴うスペルコシルLC-18-DBカラム(250×4.6mm)
検出:ケイ酸イットリウムフローセルを装備したラジオマチィック社のA-140
溶媒1:25mMリン酸ナトリウム、pH6.5
溶媒2:アセトニトリル
流速:1ml/分
このクロマトグラムに現れたピークのみが、フェノキシ酢酸(RT:14.5分)、p
-ヒドロキシーフェノキシ酢酸(RT:8.4分)及びペニシリンV(RT:34分)に相当
していた。p-ヒドロキシ-フェノキシ酢酸及びペニシリンVのピークのみが、60分
間インキュベーションした後に検出可能であった。実施例 実施例1 P. クリソゲナムの高及び低収量の菌株におけるリガーゼ活性
P.クリソゲナム菌株P8の発酵時のペニシリン収量は、一般に中間体が少ないと
考えられる一方、P.クリソゲナム菌株B10は高収量菌株と考えらる。
P.クリソゲナム(B10及びP8)の菌株を、“P.クリソゲナムの発酵”の項に記
載したように発酵した。これらの細胞を収集し、フェノキシアセチル−CoAシン
テターゼを、“B)収集、抽出及び沈殿”の項に記載したように抽出し、かつ2種
の抽出物のフェノキシアセチル−CoAシンテターゼ(リガーゼ)の活性を、“フ
ェノキシアセチル−CoAシンテターゼ及びフェニルアセチル−CoAシンテターゼの
直接アッセイ”の項に記載したように、測定した。
得られたフェノキシアセチル−CoAシンテターゼ活性の結果を、下表に示した
。
この実施例は、フェノキシアセチル−CoAシンテターゼの活性が、該菌株によ
って生成されたペニシリン量に相関していることを明らかに示している。実施例2 中間代謝産物の蓄積
P.クリソゲナム(B10)を、“A)P.クリソゲナムの発酵”の項に記載したように
、振盪フラスコ内で増殖した。P-2発酵培地に接種した後、該発酵ブロス中のACV
及びイソペニシリンNの濃度を、前述の方法に従い、HPLCで、7日間毎日測定し
た。
発酵時間の関数としてのACV及びイソペニシリンNの濃度を、図1に示した。
この図は、P.クリソゲナム発酵に由来する培養ブロス中のACV及びイソペニシ
リンNの蓄積を明らかに示している。実施例3 ペニシリンVペニシリンGのin vitro合成
60mMフェノキシ酢酸*25μl、40mM ATP* 25 μl、6mM CoA *25μl、及び6mM
6-アミノペニシラン酸*10μlの混合物を、フェノキシアセチル−CoAシンテタ
ーゼ10μl(クロマトフォーカシングPBE(登録商標)94クロマトグラフィー(上
記)の分画番号11〜40を一緒にしたもの)、並びにアシル−CoA:6-アミノペニ
シラン酸アシルトランスフェラーゼ10μl(Emilio Alvarezらの論文に記載され
たP.クリソゲナムから精製したもの)の存在下で、30℃でインキュベートした(
“ペニシリウム・クリソゲナムのアシル−CoA:6-アミノペニシラン酸アシルト
ランスフェラーゼの均質物の精製及び特徴づけ”、Antimicrobial Agents and C
hemotherapy、31(11): 1675-1682(1987))。
(*:50mMトリス/HCl(pH7.8)、10mM MgCl2、及び5mM アスコルビン酸に溶解し
た。)
in vitroでのペニシリンGの合成のために、フェノキシ酢酸を、60mMフェニル
酢酸25μlに変更した。
15分後、メタノール100μlを添加してインキュベーションを停止し、かつこの
容器を、10分間氷上に放置した。遠心分離後、上清を、前述のようにペニシリン
V又はペニシリンGについて、HPLCで分析した。ペニシリンV又はペニシリンGの同定
クロマトグラムにおけるペニシリンV又はペニシリンGのピークの同定は、それ
ぞれペニシリンV又はペニシリンGの標準溶液を加え(spiking)、かつ前述のABI 1
000SホトダイオードアレーHPLC検出器を用いて、UVスペクトルを、2種のペニシ
リン標準品のスペクトルと、最大屈折及び頂点で比較することによって証明した
。
前述の反応混合物に、CoA、6-アミノペニシラン酸、ATP、もしくはフェノキシ
酢酸又はフェニル酢酸のいずれかを添加しなかった場合には、ペニシリンV又はG
は合成されなかった。
このことは、単離された酵素が、フェノキシ酢酸−CoA活性及びフェニル酢酸
−CoA活性(リガーゼ活性)を有することを確証している。実施例4 V-CDA のin vitro合成
フェノキシ酢酸*25μl、40mM ATP* 25μl、6mM CoA *25μl、及び7-アミノ
デスアセトキシセファロスポラン酸(7-ADCA)*10μlの混合物を、フェノキシア
セチル−CoAシンテターゼ10μl(クロマトフォーカシングPBE(登録商標94クロ
マトグラフィー(上記)の分画番号11〜40を一緒にしたもの)、並びにアシルト
ランスフェラーゼ10μl(Emilio Alvarezらの論文に記載されたP.クリソゲナム
から精製したもの)の存在下で、30℃でインキュベートした(“ペニシリウム・
クリソゲナムのアシル−CoA:6-アミノペニシラン酸アシルトランスフェラーゼ
の均質物の精製及び特徴づけ”、Antimicrobial Agents and Chemotherapy、31( 11)
: 1675-1682(1987))。
(*:50mMトリス/HCl(pH8.0)、10mM MgCl2、及び5mMアスコルビン酸に溶解し
た。)
15分後、0.5%トリフルオロ酢酸100μlを添加してインキュベーションを停止
し、かつこの容器を、10分間氷上に放置した。遠心分離後、上清を、“Q)P.クリ
ソゲナムにおけるフェノキシ酢酸代謝産物の標識”に記載したように、V-DCAに
ついて、HPLCで分析した。V-DCAの保持時間:32分。V-DCA の同定
クロマトグラムにおけるV-DCAのピークの同定は、V-DCAの標準溶液を加え、か
つウォーター(登録商標)991ホトダイオードアレー検出器を用いて、UVスペク
トルを、V-DCAの標準品のスペクトルと、最大頂点で比較することによって証明
した。実施例5 ゲルろ過による分子量決定
フェノキシアセチル−CoAシンテターゼ(リガーゼ)の分子量を、前述の条件
で、“ゲルろ過S-200(超微粒子)”の項に記載されたゲルろ過の溶出量を、同
一のカラム上での、ゲルろ過キャリブレーションキット(リボ核酸A(13,700ダ
ルトン)、キモトリプシノーゲンA(25,000ダルトン)、オボアルブミン(43,0
00ダルトン)、ウシ血清アルブミン(67,000ダルトン)及びアルドラーゼ(158,
000ダルトン))の標準品を用いた溶出量と比較することによって決定し、フェ
ノキシ酢酸−CoAシンテターゼの見かけの分子量が約50,000ダルトンであること
を示した。実施例6 等電点(pI)
等電点(pI)を、セファロースS FFカラムクロマトグラフィー(上記)を用いて
、バッファーF(pH7.5)のpHを、8.5まで変更して算出した。他のパラメーター
は一定に保ち、フェノキシアセチル−CoAシンテターゼ(リガーゼ)は、バッフ
ァーF(pH8.5に調節)による溶出の間は、カラム上に保持されないことがわか
った。
このことは、この酵素の荷電の総和が0であるpH(すなわち等電点)が、7.25
以上であることを示している。実施例7 抽出物中のフェノキシアセチル−CoA
フェノキシアセチル−CoAシンテターゼ(リガーゼ)活性の存在を確認するた
めに、“P.クリソゲナムのアシル−CoAの抽出”の項に記載したように、アシル
−CoAを抽出し、HPLCで分析した。
HPLCアッセイの検出限界は、50pmol以下であるにもかかわらず、フェノキシ酢
酸−CoAは、細胞抽出物中では確認されなかった。標識されたフェノキシ酢酸代
謝産物の抽出は、“P.クリソゲナムのフェノキシ酢酸−CoAの標識”の項に記載
したような、細胞抽出物の中の検出可能なフェノキシ酢酸−CoAを示さなかった
。実施例8 特徴
精製(前述)したフェノキシアセチル−CoAシンテターゼ(リガーゼ)を用い
て、本酵素を更に特徴づけた。至適温度及びpH
“フェノキシ−CoAシンテターゼの直接アッセイ”の項に記載したように、フ
ェノキシアセチル−CoAシンテターゼを、温度15〜50℃、かつpH値6.5〜9.0に変
更して、アッセイした。
図2に示したように、フェノキシアセチル−CoAシンテターゼ活性は、pH8〜8.
5で最大に達し、図3に示したように、至適温度は40℃付近であった。基質特異性
フェノキシアセチル−CoAシンテターゼを、フェノキシ酢酸、フェニル酢酸、
アジピン酸、ヘキサン酸及び酢酸とともに、“フェノキシアセチル−CoAシンテ
ターゼ の直接アッセイ”の項、“アセチル−CoAシンテターゼの直接アッセイ
”の項、“アジポイル−CoAシンテターゼの直接アッセイ”の項及び“ヘキサノ
イル−CoAシンテターゼの直接アッセイ”の項、に記載されたアッセイ条件を用
いて、インキュベートし、下記の結果を得た:
基質 比活性
フェノキシ酢酸 100
フェニル酢酸 80
アジピン酸 19
ヘキサン酸 320
酢酸 <1ATP 、フェノキシ酢酸、CoA、及びMgCl2に関する見かけのKMの決定
フェノキシアセチル−CoAシンテターゼの活性を、“フェノキシアセチル−CoA
シンテターゼの直接アッセイ”の項に記載された方法で、様々な濃度の基質の存
在下で、一個ずつアッセイした。見かけのKM値(このアッセイで使用した条件で
の)を、Nicholas C.Price 及びLewis Stenensの“酵素の基礎”(オックスフ
ォード大学出版、123頁(1982))に記載された、イーディー・ホフスティープロ
ット、ハーネスプロット、及びラインウィーバー・バークプロットで決定した。
これらのプロットから、フェノキシアセチル−CoAシンテターゼは、個々の基質
について、ミカエリス-メンテンの式に従うことは明らかであった。
結果を表2に示した。
フェニル乳酸及び酢酸によるフェノキシアセチル−CoAシンテターゼ阻害
フェノキシアセチル−CoAシンテターゼを、様々な濃度のフェノキシ酢酸と、
様々な濃度のフェニル乳酸又は酢酸のいずれかが存在する中で、“フェノキシア
セチル−CoAシンテターゼの直接アッセイ”の項に記載されたようにアッセイし
た。
このアッセイに使用したフェノキシ酢酸の濃度は、1.7、3.3、6.6、20及び
42mMであり、かつフェニル乳酸及び酢酸の濃度は、各0、1.0、5.0、10及び25mM
であった。
ラインウィーバー・バークプロットにより、使用したアッセイ条件では、フェ
ニル乳酸が、フェノキシアセチル−CoAシンテターゼの競合的阻害剤として作用
する一方、酢酸はフェノキシアセチル−CoAシンテターゼの競合的阻害剤として
作用しないことが明らかになった。
前述の内容を考慮する当業者に明らかであるように、本発明の実施において、
多くの変更及び修正が、本発明の精神又は範囲を逸脱しない範囲で可能である。
従って、本発明の範囲は、下記のクレームによって定義された物質に従い説明さ
れる。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 FI
//(C12N 15/09
C12R 1:82)
(C12N 1/15
C12R 1:82)
(C12N 9/00
C12R 1:82)
(C12P 37/04
C12R 1:82)
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FR,GB,GR,IE,IT,LU,M
C,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF,CG
,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,SN,
TD,TG),AP(KE,MW,SD,SZ,UG),
AM,AT,AU,BB,BG,BR,BY,CA,C
H,CN,CZ,DE,DK,EE,ES,FI,GB
,GE,HU,IS,JP,KE,KG,KP,KR,
KZ,LK,LR,LT,LU,LV,MD,MG,M
N,MW,MX,NO,NZ,PL,PT,RO,RU
,SD,SE,SG,SI,SK,TJ,TM,TT,
UA,UG,US,UZ,VN
(72)発明者 メールガールド ヘンリク
デンマーク デーコー2800 リングビー
フューグレヴァドスヴェイ 65
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1.i)前記β-ラクタム系抗生物質を製造することが可能な微生物の発酵工程; 及び ii)前記β-ラクタム系抗生物質の実質的に純化した形での回収工程を含む、β- ラクタム系抗生物質の製造法であって、前記発酵が、本来の発酵条件下において 原微生物単独での発酵時に生ずるリガーゼ活性と比較して、強化されたリガーゼ 活性の存在下で行われる製造法。 2.前記原微生物が、リガーゼ活性を有さないか、もしくは活性が低い、請求の 範囲第1項記載の方法。 3.前記リガーゼ活性の発現が、該発酵工程の物理的条件の変更により増強され る、請求の範囲第1又は2項記載の方法。 4.前記リガーゼ活性の発現が、該発酵時の温度の変更により増強される、請求 の範囲第3項記載の方法。 5.前記リガーゼ活性の発現が、該発酵時のpHの変更により増強される、請求の 範囲第4項記載の方法。 6.前記リガーゼ活性が、該微生物に、リガーゼ発現を誘発する化合物又は試薬 を作用することによって増強される、請求の範囲第1〜5項のいずれか1項記載 の方法。 7.前記リガーゼ活性が、発酵される微生物の細胞制御機構が妨害されることに よって増強される、請求の範囲第1〜6項記載の方法。 8.前記リガーゼ活性又は増強されたリガーゼ活性が、該微生物の改良により得 られる、請求の範囲第1〜7項記載の方法。 9.前記リガーゼ活性又は増強されたリガーゼ活性が、該微生物のランダム又は 部位特定突然変異導入によって得られる、請求の範囲第8項記載の方法。 10.前記リガーゼ活性の確立された発現又はリガーゼ活性の増強される発現が、 発酵される原微生物への、リガーゼ活性を示す酵素をコードしている遺伝子又は DNA配列を含む、DNA構成体又は組換えベクターの少なくとも1個のコピーの導入 を含む、請求の範囲第1〜9項のいずれか1項記載の方法。 11.前記改良が、アミノ酸の置換、欠失又は付加によって行われる、請求の範囲 第8〜10項のいずれか1項記載の方法。 12.前記DNA構成体が、それが導入される微生物とは異なる種から得られる、請 求の範囲第10項記載の方法。 13.前記原微生物が、ペニシリウム、セファロスポリウム、アスペルギルス、ノ カルジア、ストレプトミセス、バチルス、セロスポラ、ミクロスポラ、他の真正 細菌、他のアクチノミセテス及び糸状菌を含む群から選択される、請求の範囲第 1〜12項記載の方法。 14.前記原微生物が、ペニシリウム・クリソゲナム、ペニシリウム・ノタツム、 セファロスポリウム・アクレモニウム、アスペルギルス・ニードランス、ノカル ジア・ラクタムヂュランス、及びストレプトミセス・クラブリゲルスを含む群か ら選択された種に属する、請求の範囲第13項記載の方法。 15.前記リガーゼ活性の発現が、β-ラクタム生合成経路に関係する他の遺伝子 の発現と同調している、請求の範囲第1〜14項のいずれか1項記載の方法。 16.前記リガーゼ活性の発現が、pcbAB、pcbC及び/又はpenDE遺伝子の発現と同 調している、請求の範囲第15項記載の方法。 17.前記原微生物が生成することが可能なβ-ラクタム系抗生物質が、ペニシリ ン、セファロスポリン、セファマイシン、モノバクタム、及びノカルディシンを 含む群から選択される、請求の範囲第13又は14項記載の方法。 18.前記抗生物質が、セファロスポリン又はペニシリンであり、好ましくはペニ シリンV、ペニシリンG、V-DCA、G-DCA、7-(L-α-5-アミノ-5-カルボキシバレル アミド-セファロスポラン酸(イソセファロスポリン-C)、アジポイル-7-ADCA、 又はアジポイル-7-ACAである、請求の範囲第17項記載の方法。 19.前記改良された微生物の培養が、該DNA構成体の発現を誘発する条件下で行 われ、従って所望のβ-ラクタム系抗生物質の側鎖に相当するカルボン酸のCoAチ オエステルの増加量の生成をもたらす、請求の範囲第8〜18項記載の方法。 20.前記微生物の培養が、該DNA構成体の発現を誘発する条件下で行われ、従っ て活性化された側鎖のCoAチオエステルを生じ、次にこれがアシルトランスフェ ラーゼ(AT)の存在下で、該側鎖を有するβ-ラクタムの形成をもたらす、請求の 範囲第8〜18項記載の方法。 21.前記リガーゼ酵素が、フェノキシ酢酸及びフェニル酢酸に対し、酢酸に対す るよりも少なくとも10倍以上の活性があり、かつゲルろ過によって測定された見 かけの分子量が約50,000ダルトンであることを特徴とする、請求の範囲第1〜20 項記載の方法。 22.リガーゼ活性を示し、フェノキシ酢酸に対しては、酢酸に対するよりも少な くとも10倍以上の活性があることを特徴とする、新規酵素。 23.フェニル酢酸に対しては、酢酸に対するよりも少なくとも10倍以上の活性が あることを特徴とする、請求の範囲第22項記載の酵素。 24.アジピン酸に対しては、酢酸に対するよりも少なくとも10倍以上の活性があ ることを特徴とする、請求の範囲第22又は23項記載の酵素。 25.ヘキサン酸に対しては、酢酸に対するよりも少なくとも10倍以上の活性があ ることを特徴とする、請求の範囲第22〜24項のいずれか1項記載の酵素。 26.ゲルろ過によって測定された見かけの分子量が、40,000〜60,000の範囲であ り、特に約50,000ダルトンであることを特徴とする、請求の範囲第22〜25項のい ずれか1項記載の酵素。 27.見かけの至適活性pHが、7.0-9.0の範囲、特に8.0-8.5の範囲であることを特 徴とする、請求の範囲第22〜26項のいずれか1項記載の酵素。 28.見かけの至適活性温度が、35-45℃の範囲、特に約40℃であることを特徴と する、請求の範囲第22〜27項のいずれか1項記載の酵素。 29.アスペルギルス、ペニシリウム、又はセファロスポリウム属に属する糸状菌 、好ましくはP.クリソゲナム又はC.アクレモニウム菌に由来し、特にP.クリソゲ ナム菌株B10によって生成可能であることを特徴とする、請求の範囲第22〜28項 のいずれか1項記載の酵素。 30.前記P.クリソゲナム菌株B10由来の精製されたリガーゼに対して生じた抗体 に対し免疫反応があることを特徴とする、請求の範囲第22〜29項のいずれか1項 記載の酵素。 31.請求の範囲第22〜30項のいずれか1項記載の酵素をコードしている、DNA構 成体。 32.前記DNA配列が、アスペルギルス、ペニシリウム又はセファロスポリウム属 に属する糸状菌に由来することができ、好ましくはP.クリソゲナム又はC.アクレ モニウム菌に、特にP.クリソゲナム菌株B10に由来する、請求の範囲第31項項記 載のDNA構成体。 33.請求の範囲第31及び32項のいずれか1項記載のDNA構成体を含む、組換えベ クター又は形質転換ビヒクル。 34.前記DNA構成体が、プロモーター配列に、及び任意にターミネーター配列に 、操作可能なように連結される、請求の範囲第33項記載のベクター又は形質転換 ビヒクル。 35.前記リガーゼ遺伝子のプロモーターが、β-ラクタムの生合成に関連した他 の遺伝子に由来するプロモーターで置換される、請求の範囲第33及び34項のいず れか1項記載のベクター。 36.前記DNA構成体が、標的シグナル又は分泌シグナルをコードしている配列に 、操作可能なように連結される、請求の範囲第33〜35項のいずれか1項記載のベ クター又は形質転換ビヒクル。 37.請求の範囲第31及び32項のいずれか1項記載のDNA構成体、又は請求の範囲 第33〜36項のいずれか1項記載のベクターを含む細胞。 38.微生物細胞である、請求の範囲第37項記載の細胞。 39.細菌細胞又は菌類の細胞である、請求の範囲第38項記載の細胞。 40.前記細菌細胞が、バチルス又はストレプトミセス属のようなグラム陽性菌細 胞、又はエシェリヒア属のようなグラム陰性菌細胞、並びにアスペルギルス、セ ファロスポリウム又はペニシリウム属のような糸状菌の細胞である、請求の範囲 第39項記載の細胞。 41.カルボン酸、CoA、請求の範囲第22〜30項記載のリガーゼ活性を示す酵素、 アシルトランスフェラーゼ及びβ-ラクタム中間体をインキュベートすることを 含む、β-ラクタムの製造法。 42.前記リガーゼ活性が、β-ラクタムが産生される場合、リガーゼ活性を示す 酵素を用いることによって確立される、請求の範囲第41項記載の方法。 43.前記β-ラクタム中間体が、イソペニシリンN(IPN)、6-アミノペニシラン酸( 6-APA)、7-アミノセファロスポラン酸(7-ACA)、7-アミノデスアセトキシセフ ァロスポラン酸(7-ADCA)及び7-アミノデスアセチルセファロスポラン酸、7-(L- α-5-アミノ-5-カルボキシバレルアミド)-セファロスポラン酸(イソセファロス ポリンC)、アジポイル-7-ADCA、又はアジポイル-7-ACAである、請求の範囲第41 及び42項記載の方法。 44.前記カルボン酸が、フェノキシ酢酸、フェニル酢酸、アジピン酸、ヘキサン 酸、2-チオフェン酢酸又は3-チオフェン酢酸である、請求の範囲第41記載の方法 。 45.前記インキュベーションが、Mg2+及びATPの存在下で行われる、請求の範囲 第41〜44項記載の方法。 46.前記インキュベーションが、還元剤、例えばジチオスレイトール(DTT)、メ ルカプトエタノール、アスコルビン酸又はグルタチオンの存在下で行われる、請 求の範囲第41〜45項記載の方法。 47.前記インキュベーションが、温度10〜60℃の範囲、好ましくは約15〜50℃の 範囲、特に20〜45℃の範囲で行われる、請求の範囲第41〜46項記載の方法。 48.前記インキュベーションが、pH5.5〜9の範囲、好ましくは約pH8で行われる 、請求の範囲第41〜47項記載の方法。
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