MX2007006780A - Produccion de beta-lactamas en celulas individuales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe la transformacion de un microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ??-lactama con polinucleotidos implicados en la biosintesis de compuestos de ??-lactama y el uso de tales organismos transformados en la produccion de compuestos de ??-lactama o en la identificacion de genes o factores implicados en la sintesis de un compuesto de ??-lactama.

Description

PRODUCCIÓN DE ß-LACTAMAS EN CÉLULAS INDIVIDUALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de un compuesto de ß- lactama y a las células que pueden usarse en tal producción.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los compuestos de ß- lactama se producen actualmente a escala comercial mediante microorganismos filamentosos, tales como Penicillium chrysogenum, Streptomyces clavuligerus , Nocardia lactamdurans y Acremonium chrysogenum, como metabolitos secundarios endógenos. Ejemplos de compuestos de ß- lactama producidos por microbios son compuestos de penama, tales como penicilina V, (iso) penicilina N y penicilina G, compuestos de cefema tales como desacetoxicefalosporina y otros ácidos acil-7-aminodesacetoxicefalosporánicos, ácido desacetilcefalosporánico y otros ácidos acil-7-aminodesacetilcefalosporánicos, cefalosporina C y otros ácidos acil-7araino-cefalosporánicos, compuestos de clavama tales como ácido clavulánico, compuestos de carbapenema, tales como imipenem y tienamicina y compuestos de monobactama tales como aztreonam. Ejemplos de microorganismos que producen ß-lactama naturales son Aspergillus (A. nidulans) , Acremonium (A. chrysogenum) , Erwinia (E. carotovora) , Flavobacterium, Kallichroma (K. tethys) , Nocardia (N. lactamdurans , N. uniformis) , Penicillium ( P. chrysogenum, P. nalgiovense, P. griseofulvum) y Streptomyces (S. antibioticus, S. cattleya, S. clavuligerus, S. griseus, S. hygroscopicus, S. lipmanii ) . El nivel de producción de los compuestos de ß-lactama en los microorganismos aplicados comercialmente ha aumentado considerablemente con los años. Por ejemplo, se notificó que una cepa de producción de Penicillium chrysogenum moderna produce aproximadamente 40-50 g/1, mientras que las cepas originales producían aproximadamente 1 mg/l (Elander, R.P. (2002) University of Wisconsin contributions to the early development of penicillin and cephalosporin antibiotics, STM News 52, 270-278; Elander, R.P. (2003) Industrial production of ß-lactam antibiotics, Appl Microbiol Biotechnol 61, 385-392) . Este nivel de producción potenciado se consiguió mediante técnicas de mutagénesis clásicas (Elander, R. (1983) Strain improvement and preservation of ß-lactam producing microorganisms. En A.L. Demain y N. Solomon (eds.) Antibiotics containing the ß-lactam structure I, Springer-Verlag, Nueva York, N.Y., 97-146). Además, la aplicación de técnicas de ADN recombinante dio como resultado la producción de ß- lactamas de cefema en cepas de Penicillium que tienen la capacidad de forma natural de producir ß-lactamas de penama solamente. Por otro lado, las cepas de Acremonium, que producen normalmente compuestos de cefema, se han modificado genéticamente para producir compuestos de penama. Sin embargo, un inconveniente grave del uso de microorganismos que pueden producir de forma natural ß-lactamas es que estos microorganismos generalmente son microorganismos filamentosos durante su fase de producción. Esta naturaleza filamentosa tiene graves dificultades durante la fermentación. La reología actual es sumamente dependiente de las condiciones del cultivo y pueden cambiar de crecimiento granular a crecimiento viscoso. El primero provoca problemas de transporte de nutrientes, el segundo provoca limitaciones en la transferencia de oxígeno. Además, los compartimentos individuales de las hifas se están diferenciando durante la fermentación: desde la célula en crecimiento de la punta o apical (con el denominado "cuerpo apical" ( "spitzenkórper" ) como punto de crecimiento nuevo) , las células subapicales jóvenes y de aspecto sano, y las células viejas y sumamente vacuolizadas . Estas distintas células pueden diferir en los niveles de producción y responder de forma diferente a las condiciones del cultivo, dificultando el control del procedimiento . Además, la investigación dirigida a los factores que están implicados en y/o influyen en la producción de ß-lactama no es viable usando estos microorganismos filamentosos que producen ß-lactama de forma natural. En primer lugar, en comparación con microorganismos como Escherichia coli , son poco accesibles a las técnicas de biología molecular convencionales. La transformación es mediante protoplastos frágiles en polietilenglicol, no se dispone de plásmidos mantenidos de forma episómica completos, y la integración es mayoritariamente al azar y multicopia. Además de esto, los compartimentos de las hifas tienen múltiples núcleos y la especie más importante, P. chrysogenum, no tiene ciclo sexual y además la alternativa, el ciclo parasexual, es muy ineficaz. Todos estos factores dificultan gravemente la identificación de los genes esenciales. Por este motivo, hay un deseo de tener microorganismos que producen ß-lactama que sean más adecuados para la producción a gran escala y que no tengan las propiedades desventajosas típicas de los microorganismos filamentosos. Además, hay un deseo de disponer de microorganismos en los que puedan investigarse más fácilmente los factores implicados en la producción de ß-lactama. Hasta ahora, el establecimiento de la producción de ß-lactama en células individuales microbianas, no filamentosas, no era viable debido a varios factores. La primera etapa comprometida en la síntesis de ß-lactama está catalizada por la clase de enzimas denominada péptido sintetasa no ribosómica, en este caso la d- (L- -aminoadipil) -L-cisteinil-D-valina sintetasa (ACVS) . Estas enzimas modulares catalizan una compleja serie de activación de aminoácidos y la formación posterior de enlaces peptídicos. Las especies como la levadura de panadero ( S . cerevisiae) no tienen tales enzimas, por lo que podrían no estar equipadas para realizar tal reacción. Además, el gen que codifica para ACVS, pcbAB, tiene aproximadamente 12 kb de longitud. Un cásete de expresión de 14 kb necesita integrarse de forma estable en el genoma de la levadura, con un promotor y un terminador. La segunda etapa en la síntesis de ß-lactama es una oxidación no hémica, bioquímica compleja, sin precedentes mediante isopenicilina N sintasa (IPNS) . Esta enzima se inhibe fuertemente mediante muchos compuestos convencionales de la célula (glutatión, Mn, Zn, cambios de pH, etc.). Las levaduras tienen niveles de glutatión bastante elevados en ciertas condiciones de crecimiento, lo que provoca posiblemente una grave inhibición sobre la enzima IPNS. La tercera etapa en la síntesis de ß-lactaraa, catalizada por 6-APA:AcilCoA acil transferasa (AT) , está codificada por un gen interrumpido por tres intrones fúngicos. Dado que las levaduras sólo tienen unos cuantos genes con intrones, que también son diferentes de los intrones fúngicos, necesitan eliminarse para obtener una expresión apropiada en levaduras. Además, AT sólo es funcional como un dímero heterólogo. Los dos componentes se derivan por autoprocesamiento a partir del polipéptido inicial codificado por el gen, generando péptidos de 10 y 29 kDa. No se sabe si este autoprocesamiento funcionará en células de levadura. Las enzimas de ß-lactama son bien conocidas por su inestabilidad y el entorno de los hongos filamentosos está equipado para regenerarse continuamente con nuevas enzimas para dar soporte a la producción continua de ß-lactamas. No se sabe de antemano si las levaduras también tienen esta capacidad regeneradora. Los productores de ß-lactama naturales han desarrollado sistemas de secreción adaptados específicamente para exportar ß-lactama eficazmente para mantener un nivel de producción elevado.

Por último, pero no menos importante, las ß-lactamas son productos tóxicos . Los productores no naturales pueden no estar equipados para sobrevivir a estos compuestos .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Según la presente invención, se ha encontrado sorprendentemente que puede establecerse producción de ß-lactama en un microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama, es decir un microorganismo que no tiene la ruta de biosíntesis que conduce a la formación de un compuesto de ß-lactama. Así, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama y que se transforma con un polinucleótido implicado en la producción de un compuesto de ß-lactama. Preferiblemente, el microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama crece en forma de células individuales, más preferiblemente es un microorganismo eucariota que crece en forma de células individuales. Lo más preferiblemente, el microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama es una levadura . Las levaduras adecuadas que van a usarse en la presente invención son Saccharomyces ( S. cerevisiae, S. bayanus, S. exiguus) , Candida ( C. glabrata, C. utilis, C. mal tosa, C. albicans, C. boidinii , C. tropicalis) , Kluyveromyces (K. lactis, K. marxianus, K. thermotolerans) , Yabadazyma ohmeri , Pichia (P. angusta (= Hansenula polymorpha) , P. sorbi tophila) , Yarrowia lipoli tica, Zygosaccharomyces rouxii .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El término "células individuales" tal como se usa en el contexto de la presente invención se refiere a microorganismos que crecen predominantemente o sólo en forma de células individuales, es decir microorganismos que no crecen predominantemente o únicamente en forma de hifas, granulos y/o microorganismos filamentosos. Esto permite ventajosamente el cultivo del microorganismo a una densidad celular mucho mayor de lo que sería posible con microorganismos filamentosos. A veces, el comportamiento del crecimiento de un microorganismo que crece de forma natural como célula individual puede cambiarse debido a, por ejeraplo, modificación genética. Por ejemplo, se sabe que las modificaciones provocan problemas de gemación en levaduras. El experto entenderá que un microorganismo modificado de este tipo que puede no crecer necesariamente sólo en forma de células individuales aún está dentro del alcance de la presente invención. La presente invención tiene varias ventajas: una viscosidad reducida del caldo de fermentación, por ejemplo una velocidad de agitación inferior es suficiente para garantizar un mezclado apropiado del caldo de fermentación, la posibilidad de obtener una tasa de transferencia de oxígeno superior en el fermentador, permitiendo de este modo un aumento de la tasa de alimentación de la fuente de carbono a la fermentación, la posibilidad de obtener un flujo de carbono más elevado a través de la ruta de ß-lactama, sin diferenciación entre las células provocando que todas las células sean células productoras. Un polinucleótido implicado en la producción de un compuesto de ß-lactama comprende una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de la ruta de biosíntesis de ß-lactama. Ejemplos de enzimas que son parte de la ruta de biosíntesis de ß-lactama son: • (Tri) péptido sintetasas tales como d- (L-a-aminoadipil) -L-cisteinil-D-valina sintetasa (ACVS) , por ejemplo, codificada por el gen pcbAB de Penicillium chrysogenum, • Dioxigenasas que contienen hierro no hémico tales como isopenicilina N sintasa (IPNS) , por ejemplo, codificada por el gen pc C de Penicillium chrysogenum, • Epimerasas tales corao IPN epimerasa, por ejemplo, codificada por el gen cefD de Streptomyces clavuligerus, • Acil transferasas tales como 6- APA:AcilCoA acil transferasa (AT) , por ejemplo, codificada por el gen penDE de Penicillium chrysogenum, • Expandasas tales como desacetoxicefalosporina C sintasa (DAOCS) que comprende la enzima codificada por el gen cefEF de Acremonium chrysogenum o el gen cefE de Streptomyces clavuligrerus, • Hidroxilasas tales como desacetilcefalosporina C sintasa que comprende la enzima codificada por el gen cefEF de Acremonium chrysogenum o el gen cefF de Streptomyces clavuligerus, • Transferasas tales como O-carbamoil transferasa (CAT) , por ejemplo, codificada por el gen cmcH de Streptomyces clavuligerus . Preferiblemente, el polinucleótido implicado en la producción de un compuesto de ß-lactama comprende además una secuencia de polinucleótido que codifica para una proteína que tiene una función de soporte en la producción de un compuesto de ß-lactama mediante un microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama. Con una función de soporte se quiere decir que la proteína no es una enzima que forma parte de la ruta de biosíntesis de un compuesto de ß-lactama, sino que la proteína es necesaria para la producción eficaz de ß-lactama. Necesaria para la producción eficaz de ß-lactama significa que la proteína puede ser esencial para la producción de ß-lactama, es decir, cuando está ausente no puede medirse producción de ß-lactama en el microorganismo, incluso cuando están presentes todas las enzimas de biosíntesis relevantes, y/o puede ser necesario obtener un nivel de producción de ß-lactama adecuado, es decir, cuando está ausente puede medirse una producción de ß-lactama demasiado baja en el microorganismo. Los ejemplos de proteínas que tienen una función de soporte son: • Proteínas reguladoras de la ruta de biosíntesis de ß-lactama, tales como cpcRI (Schmitt, EK. y Kuck, U (2000) The fungal CPCR1 protein, which binds specifically to beta- lactam biosynthesis genes, is related to human regulatory factor X transcription factors, J Biol Chem. 275:9348-9357); claR (Pérez-Redondo O, Rodríguez -García A, Martin JF, Liras P. (1998) The claR gene of Streptomyces clavuligerus , encoding a LysR-type regulatory protein controlling clavulanic acid biosynthesis, is linked to the clavulanate-9-aldehyde reductase (car) gene, Mol. Microbiol. 27:831-843); ccaR (Perez-Llarena FJ, Liras P, Rodríguez-García A, Martin JF. (1997) A regulatory gene (ccaR) required for cephamycin and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus : amplification results in overproduction of both ß-lactams compounds, J. Bacteriol. 179: 2053-2059), • Proteínas transportadoras que llevan precursores de la ruta de biosíntesis de ß-lactama al sitio apropiado de la célula, tales como las proteínas de cásete de unión de tipo ATP (ABC) como aal , aa5, aa7, aalO, dd2 (documento WO 01/32904) y tales como las proteínas de la superfamilia de proteínas facilitadoras múltiples (MFS) como cefT (Ullán, R.V. , Liu, G., Casqueiro, J., Gutiérrez, S., Bañuelos, O. & Martin, J.F. (2002) The cefT gen of Acremonium chrysogenum encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production. Mol Genet Genómica 267, 673-683), • Enzimas implicadas en el metabolismo primario, especialmente implicadas en la formación de metabolitos primaros que son precursores de cisteína, tales como oasS, que codifica para O-acetil-L-serina sulfhidrilasa (documento WO 99/01561) ; y de aminoadipato, tales corao de lisina (Casqueiro J, Gutiérrez S, Bañuelos O, Hijarrubia MJ, Martin JF. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum : disruption of the lys2 gene leads to penicillin overproduction, J Bacteriol .181 : 1181-1188) , • Enzimas necesarias para la activación de la cadena lateral, tales como fenil acetil coenzima A ligasa, codificada por pcl (documento WO 97/02349) , • Enzimas implicadas en la activación de aminoácidos por ACVS, tales como la fosfopantenoil transferasa de Aspergillus nidulans codificada por npgA (Keszenman-Pereyra D, Lawrence S, Twfieg ME, Price J, Turner G. (2003) The npgA/ cfwA gene encodes a putative 4 ' -phosphopantetheinyl transferase which is essential for penicillin biosynthesis in Aspergillus nidulans, Curr Genet. 43:186-190), • Enzimas implicadas en la proliferación de peroxisomas como PexllP, codificada por pexll (documento WO 00/71579) . Aparte de los genes que se producen de forma natural que codifican para las enzimas de biosíntesis de ß-lactama o polinucleótidos que se producen de forma natural que codifican para proteínas con un uso de función de soporte, también pueden prepararse de secuencias de polinucleótidos que codifican para mutantes artificiales de estas enzimas o proteínas de soporte. Tales mutantes pueden mostrar mayor estabilidad, rendimiento mejorado (tal como una actividad mejorada o una ubicación diferente) o una especificidad diferente en comparación con las enzimas o proteínas naturales . Puede prepararse convenientemente el microorganismo que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama pero en el que se va a establecer ß-lactama según la invención según métodos conocidos habitualmente en la técnica. Brevemente, un polinucleótido implicado en la producción de ß-lactama puede incorporarse dentro de un vector adecuado. Un vector de este tipo puede ser un vector lineal o circular. Además, el vector puede proporcionar replicación episómica, es decir, la replicación del vector fuera del ADN genómico de la célula, o puede necesitar integración del polinucleótido dentro del genoma. Preferiblemente, el vector es un vector de expresión, que proporciona la expresión del polinucleótido implicado en la producción de ß-lactama en el microorganismo en el que se va a establecer la ß-lactama. La secuencia codificante del polinucleótido implicado en la producción de ß-lactama se proporciona con secuencias reguladoras que garantizan la expresión del polipéptido codificado. Las secuencias reguladoras pueden ser las asociadas naturalmente con la secuencia codificante en cuestión o pueden ser secuencias seleccionadas por su capacidad de garantizar la expresión adecuada en el microorganismo de elección. Los polinucleótidos implicados en la producción de ß-lactama pueden incorporarse en un vector o en vectores separados para cada polinucleótido diferente. Si se combinan dos o más polinucleótidos implicados en la producción de ß-lactama, es posible proporcionar cada polinucleótido con una región reguladora individual (organización policistrónica) o usar una región reguladora para los dos o más polinucleótidos (según la estructura denominada monocistrónica u operón) . También es posible combinar algunos polinucleótidos en un vector y usar vectores separados para otros polinucleótidos.

Los métodos de transformación para la introducción de un polinucleótido dentro de un microorganismo de elección están disponibles comúnmente para varios tipos de microorganismos . En particular, pueden transformarse células de levadura proporcionando en primer lugar diferentes poblaciones de células de levadura cada una transformada con uno de los polinucleótidos deseados, y el posterior cruzamiento de las poblaciones de células de levadura transformadas respectivas, obteniendo así una población de células de levadura que contienen todos los polinucleótidos deseados. Alternativamente, una vez transformadas, pueden volver a transformarse células de levadura usando o bien un marcador de selección diferente o bien el mismo, eliminando el marcador mediante los sistemas disponibles (por ejemplo cre-lox, FLP-FRT, véase para revisiones Gilbertson L. (2003) Cre-lox recombination: Creative tools for plant biotechnology, Trends Biotechnol. 21:550-555; Luo H, Kausch AP (2002) Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system in plants, Genet Eng (NY) . 24:1-16). En una realización, deben situarse los genes pcbAB, pcbC, penDE y pcl de P. chrysogenum (que codifican para ACVS, IPNS, AT y PCL, respectivamente) bajo el control de un promotor específico de S. cerevisiae como el promotor de MET25 y un terminador específico de S. cerevisiae como el terminador de MET25 ; e integrar los casetes de expresión separados dentro del genoma de la levadura. La determinación de las actividades enzimáticas de estas cuatro enzimas diferentes se realiza según métodos conocidos en la técnica: pueden usarse anticuerpos para detectar la presencia de la proteína y se usan ensayos específicos para determinar la actividad específica de la enzima. Pueden encontrarse ejemplos de tales ensayos en Theilgaard H, van Den Berg M, Mulder C, Bovenberg O, Nielsen J. (2001) Quantitative analysis of Penicillium chrysogenum Wis54-1255 transformants over expressing the penicillin biosynthetic genes, Biotechnol Bioeng 72:379-388. (Para ACVS); Theilgaard et al (2001) (para IPNS) ; Tobin MB, Fleming MD, Skatrud PL, Miller JR. (1990) Molecular characterization of the acil-coenzyme A: isopenicillin N aciltransferase gene (penDE) from Penicillium chrysogenum and Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli . J Bacteriol. 172:5908-5914 (para AT) y Miñambres B, Martinez-Blanco H, Olivera ER, García B, Diez B, Barredo JL, Moreno MA, Schleissner C, Salto F, Luengo JM. (1998) Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenyl acetyl-CoA ligase. Use of this gene to improve the rate of benzyl penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. J Biol Chem. 271:33531-33538 (para PCL) . La producción de un compuesto de ß-lactama según la invención o de un intermedio de ß-lactama como ACV o IPN puede determinarse convenientemente mediante, por ejemplo, ensayos basados en CL-EM. Un segundo aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de un compuesto de ß-lactama usando el microorganismo del primer aspecto. El procedimiento comprende cultivar el microorganismo del primer aspecto bajo condiciones que conducen a la producción de dicho compuesto de ß-lactama. Las condiciones de cultivo no son críticas para la invención, siempre que se produzca un compuesto de ß-lactama. Pueden usarse las condiciones y los medios de cultivo conocidos comúnmente. El experto entenderá fácilmente que el tipo de compuesto de ß-lactama que se produce dependerá de los genes de biosíntesis que se expresan en el microorganismo del primer aspecto . El compuesto de ß-lactama preferiblemente es penicilina G, penicilina V, ácido adipoil-7-aminodesacetoxicefalosporánico (adipoil-7-ADCA) o ácido adipoil- 7 -amino-3-carbaraoiloximetil-3 -cefema-4 -carboxílico (adipoil-7-ACCA) . Opcionalmente, el procedimiento comprende además una desacilación en la posición 6 si el compuesto de ß-lactama es una penama o en la posición 7 si el compuesto de ß-lactama es una cefema, para permitir la producción de, por ejemplo, ácido 6-amino-penicilánico (6 -APA) , 7-ADCA o 7-ACCA, respectivamente. Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso del microorganismo del primer aspecto para identificar genes y/o factores que influyen en la producción de ß-lactama. Esto puede hacerse mediante una variedad de experimentos, por ejemplo: • Hacer crecer S. cerevisiae de tipo natural y S. cerevisiae productor de ß-lactama en condiciones productoras y no productoras, comparando las respuestas individuales con las técnicas "ómicas" disponibles (por ejemplo transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc . ) , • Exponer S. cerevisiae de tipo natural y S. cerevisiae productor de ß-lactama a una variedad de ß-lactamas diferentes mientras se hace crecer en condiciones relevantes y se comparan las respuestas individuales con las técnicas "ómicas" disponibles (por ejemplo transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc . ) , • Modificar la expresión de cada gen en S. cerevisiae (deficientes, subexpresión y sobreexpresión) productor de ß-lactama y analizar las respuestas individuales con las técnicas "ómicas" disponibles (por ejemplo transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc . ) . • Expresar cualquier gen y/o factor regulador (como ARN no codificante, AR?t, AR? reguladores en sentido 5') en S. cerevisiae productor de ß-lactama y analizar las respuestas individuales con las técnicas "ómicas" disponibles (por ejemplo transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc. ) , • Modificar las condiciones del cultivo (por ejemplo, las composiciones de los medios, la forma de los vasos de cultivo y/o esquemas de alimentación) para S. cerevisiae de tipo natural y S . cerevisiae productor de ß-lactama y comparar las respuestas individuales con las técnicas "ómicas" disponibles (por ejemplo transcriptómica, proteómica, metabolómica, etc . ) .

Los resultados de estos análisis pueden integrarse y usarse ventajosamente para generar compuestos líderes para mejorar adicionalmente la producción de ß-lactama en las especies productoras de ß-lactama (incluyendo los productores naturales como P. chrysogenum, A . chrysogenum y S. clavuligerus) .

EJEMPLOS Ejemplo 1: Construcción de vectores de expresión Se crearon los vectores de expresión basándose en el plásmido de levaduras pRS406 (Sikorski, R.S. y Hieter, P (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae, Genetics 122:19-27). Se aisló la región promotora y terminadora de Met25 (Johnston, M. et al (1997) The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII, Nature 387 (6632 Supl.), 87-90) a partir de pRS416Met25 (Mumberg D, Muller O, Funk M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156:119-122) . Construcción de pRS403Met25 y pRS405Met25: se digirió pRS416Met25 con Sstl y Nael dando como resultado un fragmento promotor y terminador de Met25. El ligamiento posterior de este fragmento en pRS403 y pRS405 digeridos con SstI/Nael (Sikorski, R.S. y Hieter, P, 1989) dio como resultado los plásmidos deseados. Construcción de pRS404Met25 y pRS406Met25: se digirió pRS416Met25 con Sstl y Kpnl dando como resultado un fragmento promotor y terminador de Met25. El ligamiento posterior de este fragmento en pRS404 y pRS406 digeridos con Sstl/Kpnl (Sikorski, R.S. y Hieter, P, 1989) dio como resultado los plásmidos deseados. Se preparó el plásmido pRS406Met25pcbC (gen de IPNS) , que se usó para la integración del gen de IPNS en el cromosoma de levaduras, mediante amplificación por PCR del gen pcbC de P. chrysogenum (Carr, L.G., Skatrud, P.L., Scheetz, M.E. II, Queener, S.W. y Ingolia, T.D. (1986) Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium chrysogenum, Gen 48:257-266) con los cebadores 5 ' - CAAGTTTTCACCGCGGTTTTTCTAGTTAACATGATATCGATTCCC-3 ' (SEQ ID NO: 1) y 5'- GAGTCCGGGATTTCTAGATCCCGGTCGAC-3' (SEQ ID NO : 2), que se clona después en el vector pCR TOP02.1 (Invitrogen, según los protocolos suministrados por el fabricante) , seguido por digestión con enzimas de restricción con Xhol y Spel, y ligamiento posterior del fragmento pcbC en un vector pRS406Met25 digerido con Xhol/Spel. Construcción del plásmido de integración de PCL, pRS403Met25pcl: se digirió pRS403Met25 con Xbal/BaraHl y se ligó con el gen de PCL amplificado por PCR digerido con Xbal/BamHl (documento WO 97/02349), usando los cebadores 5 ' -CCATTATTTTTCTAGACACCCATATGGTTTTTTTACCTCC-3 ' (SEQ ID NO : 3 ) y 5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3' (SEQ ID NO : 4).

Construcción del plásmido de integración de AT (penDE) pRS405Met25penDE: se amplificó por PCR el gen penDE (Tobin et al, 1990) con los cebadores 5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG -3' (SEQ ID NO: 5) y 5'- CCATTATTTTTCTAGACCATATGCTTCACATCC -3' (SEQ ID NO: 6) y se digirió posteriormente con Xbal, BamHl, se ligó el fragmento penDE resultante en pRS405Met25 digerido con Xbal , BamHl . La construcción del plásmido de integración de ACVS (pcbAB) pRS404DestACVS se realizó del siguiente modo. Se construyó el plásmido pRS404Dest amplificando en primer lugar el cásete de selección CapccdB de pDEST15 (Invitrogen) usando los cebadores GGGGGCGGCCGCACAACTTTGTATAGAAAAGTTGAGAAACGTAAAATGATATAAAT- 3' (SEQ ID NO: 7) y 5' - GGGGCGCCGGCGACAACTTTTTTGTACAAAGTTGAGAAACGTAAAATGATATAAAT - 3' (SEQ ID NO: 8) , seguido por ligamiento en pCR2.1 TOPO dando el plásmido pCR2.1/catccdB. Después se digirió el plásmido pCR2.1/catccdB con Muñí y se ligó el fragmento catccdB en pRS404Met25 digerido con EcoRI para dar pRS404Dest. Se obtuvo el gen pcbAB (Diez, B., Gutiérrez, S., Barredo, J.L., van Solingen, P., van der Voort, L.H. y Martin, J.F. (1990) The cluster of penicillin biosynthetic genes.

Identification and characterization of the pcbAB gene encoding the alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase and linkage to the pcbC y penDE genes, J. Biol . Chem. 265: 16358-16365) mediante amplificación usando los cebadores 5'- CACCATGACTCAACTGAAGCCAC -3' (SEQ ID NO : 9) y 5'- ATAGCGAGCGAGGTGTTC -3' (SEQ ID NO : 10).

Se clonó el fragmento de PCR de extremos romos en el vector pENTR/SD/D-Topo (Invitrogen) , según el manual del proveedor, para dar pENTR/SD/ACVS . Se obtuvo el plásmido de integración final pRS404DestACVS mediante reacción LR Gateway del plásmido pENTR-SD-ACVS con pRS404Dest según el manual de Gateway de Invitrogen.

Ejemplo 2: Transformación de S . cerevisiae Se transformaron los plásmidos resultantes que llevan los genes que codifican para ACVS, IPNS, PCL y AT en la levadura Saccharomyces cerevisiae CEN-Pk2-lc (Wieczorke 0, Krampe S, Weierstall T, Freidel K, Hollenberg CP, Boles E, (1999) Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett. 464:123-128). Se usó como protocolo el procedimiento de transformación de levaduras de alta eficacia basado en el tratamiento con iones de litio y ADN transportador de esperma de arenque tal como se describe por Gietz RD, Woods RA (2002, Transformation of yeast by lithium acétate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350:87-96). Se empleó selección de levaduras integrantes usando los marcadores auxótrofos HIS, LEU, TRP y URA, tal como se conoce en la técnica. La cepa resultante albergaba los genes de biosíntesis de penicilina que codifican para ACVS, IPNS, AT y PCL, tal como se valoró mediante análisis por PCR y transferencia de tipo Southern.

Ejemplo 3: Detección de enzimas de biosíntesis y actividad enzimática Se examinaron las posibles cepas de levadura de producción de penicilina para determinar las actividades enzimáticas mediante crecimiento en medio mínimo de levaduras (YNB IX, fosfato 20 mM pH 6,8, glucosa al 2%). En estas condiciones, el promotor Met25 está sin reprimir en absoluto debido a la ausencia de metionina. Se hizo crecer la levadura durante toda la noche hasta que se alcanzó una DOgoo final de 4-5. Posteriormente, se sedimentaron las células y se obtuvo un extracto libre de células usando sonicación o perlas de vidrio. Se examinaron las fracciones lisadas y el sobrenadante soluble para determinar la producción de enzimas de biosíntesis de penicilina. Se llevaron a cabo los análisis en geles de SDS-PAGE teñidos con Coomassie y mediante inmunotransferencia de tipo Western, mostrando la producción de las enzimas de biosíntesis. Se usó CL-EM para demostrar la formación de los productos intermedios de la biosíntesis de penicilina ACV, IPN y Pen G.

Ejemplo 4: Detección de la actividad de antibióticos Se transfirieron colonias de las cepas de levadura purificadas a placas de agar que estimulan la producción de ß-lactama y se incubaron durante de 24-168 horas a 25 °C. Se cultivó la cepa ESS de JE?, coli sensible a ß-lactama (Hsu JS, Yang YB, Deng CH, Wei CL, Liaw SH, Tsai YC. (2004) Family shuffling of expandase genes to enhance substrate specificity for penicillin G. Appl Environ Microbiol .70 : 6257-6263) en TY 2x hasta la fase semilogarítmica y se diluyó en agar TY 2x al 0,8% precalentado y se distribuyó cuidadosamente sobre las colonias de levadura. Tras incubación a 37 °C durante toda la noche, las levaduras productoras de ß-lactama son visibles por una zona aclarada alrededor de las colonias, denominada halo .

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES

1.- Un microorganismo caracterizado porque que no produce de forma natural un compuesto de ß-lactama pero que es capaz de producir un compuesto de ß-lactama mediante la modificación genética de dicho microorganismo.

2.- El microorganismo según la reivindicación 1, caracterizado porque se transforma con un polinucleótido implicado en la producción de dicho compuesto de ß-lactama de manera que se proporciona al microorganismo la capacidad de producir dicho compuesto de ß-lactama.

3.- El microorganismo según la reivindicación 2, caracterizado porque el que el polinucleótido implicado en la producción de dicho compuesto de ß-lactama es una secuencia de polinucleótido que codifica para una enzima de la ruta de biosíntesis de dicho compuesto de ß-lactama.

4.- El microorganismo según la reivindicación 3, caracterizado porque la enzima de la ruta de biosíntesis de dicho compuesto de ß-lactama se selecciona del grupo que consiste en ACVS, IPNS y AT.

5.- El microorganismo según las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque se transforma adicionalmente con una secuencia de polinucleótido que codifica para una proteína que tiene una función de soporte en la producción de dicho compuesto de ß-lactama.

6. - El microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque es una levadura .

7.- Levadura según la reivindicación 6, caracterizado porque la levadura pertenece al género seleccionado del grupo que consiste en Saccharomyces, Candida, Kluyveromyces, Yabadazyma , Pichia, Yarrowia, Neurospora, y Zygosaccharomyces .

8. - Un procedimiento para la producción de un compuesto de ß-lactama, caracterizado porque comprende cultivar un microorganismo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en condiciones que conducen a la producción de dicho compuesto de ß-lactaraa, comprendiendo opcionalmente el método una desacilación en posición 6 si el compuesto de ß-lactama es una penama o en la posición 7 si el compuesto de ß-lactama es una cefema.

9.- El procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto de ß-lactama es penicilina G, penicilina V, 6-APA, adipoil-7-ADCA, adipoil-7-ACCA, 7-ADCA, 7-ACCA, 7 -ACÁ.

10.- El uso del microorganismo según las reivindicaciones 1-7 para identificar factores que influyen en la producción de ß-lactama.