KR20070085955A - 단일 세포에서의 β-락탐의 제조 - Google Patents

Abstract

본 발명은 β-락탐 화합물의 생합성과 관련된 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 β-락탐 화합물을 자연적으로는 생성하지 않는 미생물의 형질전환 및 β-락탐 화합물의 생산 또는 β-락탐 화합물의 합성에 관련된 유전자 또는 인자의 확인에서 이런 형질전환된 미생물의 용도에 관한 것이다. 예를 들면 유전공학에 의해 피. 크리소게늄(P. chrysogenum)의 ACV, IPNS, AT 및 PCL을 암호화하는 유전자를 에스. 세레비시아에(S. cerevisiae)에 삽입한다.

Description

단일 세포에서의 β-락탐의 제조{PRODUCTION OF BETA-LACTAMS IN SINGLE CELLS}

본 발명은 β-락탐 화합물의 제조 방법 및 이런 제조 방법에 사용될 수 있는 세포에 관한 것이다.

β-락탐 화합물은 현재 필라멘트형 미생물, 예를 들면 페니실리움 크리소게늄(Penicillium chrysogenum), 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus), 노카디아 락탐두란스(Nocardia lactamdurans) 및 아크레모늄 크리소게늄(Acremonium chrysogenum)에 의해 내인성 2차 대사물로서 상업적인 규모로 생산되고 있다.

미생물에 의해 생산된 β-락탐 화합물의 예는 페남 화합물, 예를 들면 페니실린 V, (아이소)페니실린 N 및 페니실린 G, 세펨 화합물, 예를 들면 데스아세톡시세팔로스포린 및 다른 아실-7-아미노데스아세톡시세팔로스포란산, 데스아세틸세팔로스포린산 및 다른 아실-7-아미노데스아세틸세팔로스포란산, 세팔로스포린 C 및 다른 아실-7-아미노-세팔로스포란산, 클라밤 화합물, 예를 들면 클라불란산, 카바 페넴 화합물, 예를 들면 이미페넴 및 티에나마이신 및 모노박탐 화합물, 예를 들면 아즈트레오남이다.

천연 β-락탐 생성 미생물의 예는 아스퍼길루스(Aspergillus)(에이. 니둘란스(A. nidulans)), 아크레모늄(Acremonium)(에이. 크리소게늄(A. chrysogenum)), 에위니아(Erwinia)(이. 카로토보라(E. carotovora)), 플라보박테리움(Flavobacterium), 칼리크로마(Kallichroma)(케이. 테티스(K. tethys)), 노카르디아(Nocardia)(엔. 락탐두란스(N. lactamdurans), 엔. 유니포미스(N. uniformis)), 페니실리움(Penicillium)(피. 크리소게늄(P. chrysogenum), 피. 날지오벤스(P. nalgiovense), 피. 그리세오풀붐(P. griseofulvum)) 및 스트렙토마이세스(Streptomyces)(에스. 안티바이오티쿠스(S. antibioticus), 에스. 카틀레야(S. cattleya), 에스. 클라불리게루스(S. clavuligerus), 에스. 그리세우스(S. griseus), 에스. 하이그로스코피쿠스(S. hygroscopicus), (에스. 립마니(S. lipmanii))이다.

상업적으로 적용되는 미생물에서 β-락탐 화합물의 생산 수준은 여러 해동안 상당히 증가되어 왔다. 예를 들면 원래의 페니실리움 크리소게늄 생산 균주는 약 1mg/ℓ를 생산한 반면 현대의 균주는 약 40 내지 50g/ℓ를 생산하는 것으로 보고되었다(문헌[Elander, R.P. (2002) University of Wisconsin contributions to the early development of penicillin and cephalosporin antibiotics, SIM News 52, 270-278]; [Elander, R.P. (2003) Industrial production of [beta]-lactam antibiotics, Appl Microbiol Biotechnol 61, 385-392] 참조).

이 개선된 생산 수준은 전통적인 돌연변이 기법에 의해 실현되었다(문헌[Elander, R. (1983) Strain improvement and preservation of β-lactam producing microorganisms. In A.L. Demain and N. Solomon (eds.) Antibiotics containing the β-lactam structure I, Springer- Verlag, New York, N.Y., 97-146] 참조).

또한, 재조합 DNA 기법을 적용하여 자연적으로는 페남 β-락탐만을 생산하는 능력을 갖고 있는 페니실리움 균주에서 세펨 β-락탐을 생산하였다. 한편, 통상적으로 세펨 화합물을 생성하는 아크레모늄(Acremonium) 균주는 페남 화합물을 생성하도록 유전적으로 개질되어 왔다.

그러나, β-락탐을 천연적으로 생성할 수 있는 미생물을 이용하는데 있어서 심각한 단점은 이들 미생물이 일반적으로 생산 상 동안 필라멘트형 미생물이라는 점이다. 이 필라멘트형 성질은 발효동안 심각한 어려움을 부가한다. 실제 유동성은 배양 배지에 매우 의존적이고, 펠렛 성장에서 점성 성장까지 변화될 수 있다. 펠렛 성장은 영양분 이동 문제를 야기하고, 점성 성장은 산소 이동에 한계를 초래한다. 더욱이, 균사의 개별적인 부분이 발효동안 성장하는 정단 세포 또는 팁 세포(새로운 성장 점으로써 소위 "스피켄쾨르게르(spitzenkorper)"를 갖는)로부터, 어리고 건강해 보이는 정단하(subapical) 세포에서, 늙고 액포가 많은 세포까지 서로 다르다는 것이다. 이런 서로 다른 세포들은 생산 수준이 다르고, 배양 조건에 서로 다르게 반응하여 공정 제어를 방해한다.

또한, β-락탐 생산에 관여하고/하거나 영향을 미치는 인자들에 대한 연구 는, 이들 필라멘트성의 자연적으로 β-락탐을 생성하는 미생물을 이용할 경우 용이하지 않다. 먼저, 에스케리치아 콜리(Escherichia coli)와 같은 미생물에 비해, 이들은 표준 분자 생물학 기법에 대한 접근성이 낮다. 형질전환이 폴리에틸렌 글리콜중의 부서지기 쉬운 원형질을 통해 일어나고, 완전히 에피솜적으로 유지되는 플라스미드가 이용가능하지 않고, 통합이 대부분 무작위적이고 멀티카피이다. 무엇보다도 균사 부분이 다핵 형성성이고, 가장 중요한 종인 피. 크리소게늄(P. chrysogenum)이 생식 주기를 갖지 않고, 또한 대안적인 의사 유성생식 주기가 매우 비효율적이다. 이러한 모든 인자는 필수 유전자의 확인을 심각하게 방해한다.

이런 이유로, 대규모 생산에 더욱 적합하고, 필라멘트성 미생물에 전형적인 불리한 성질을 갖지 않는 β-락탐 생성 미생물을 갖는 것이 요망된다. 또한 β-락탐 생성에 관여하는 인자들이 보다 쉽게 조사될 수 있는 미생물을 이용할 수 있는 것이 요망된다.

이제까지, 비-필라멘트성 미생물 단일 세포에서 β-락탐 생성의 확립은 여러 가지 인자로 인해 용이하지 않았다.

β-락탐 합성의 첫 번째 단계는 소위 비-리보솜 펩타이드 합성효소 부류의 효소, 이 경우 δ-(L-α-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린 합성효소(ACVS)에 의해 촉매된다. 이들 조절 효소는 복잡한 일련의 아미노산 활성화 및 후속적인 펩타이드 결합 형성을 촉매반응시킨다. 제빵용 효소(에스. 세레비시아에)와 같은 종은 이런 효소를 갖지 않고, 따라서, 이런 반응을 수행할 수 없다. 또한, ACVS를 암호화하는 유전자인 pcvAB는 약 12kb의 길이를 갖는다. 효모 게놈에 적합하게 통합되 기 위해서는 프로모터와 터미네이터가 있는 14kb의 발현 카세트가 요구된다.

β-락탐 합성의 2번째 단계는 예상치못한 복잡한 생화학중 하나인, 이소페니실린 N 합성효소(IPNS)에 의한 비-헴(non-heme) 산화이다. 이 효소는 세포에서 많은 표준 화합물(글루타티온, Mn, Zn, pH 변화 등)에 의해 심각하게 억제된다. 효모는 일부 성장 조건 하에서는 상당히 높은 글루타티온 수준을 가져서, IPNS 효소를 심각하게 억제할 수 있다.

6-APA:아실코A 아실 트랜스퍼라제(AT)에 의해 촉매되는 β-락탐 합성의 3번째 단계는 3개의 진균 인트론에 의해 차단된 유전자에 의해 암호화된다. 효모는 인트론(이는 또한 진균 인트론과는 다르다)이 있는 단지 몇 개의 유전자만을 갖기 때문에, 효모내에서 적절하게 발현되기 위해서는 이들이 제거되어야만 한다. 또한, AT는 이종 이량체로서만 기능성이다. 2개의 성분은 모두 유전자에 의해 암호화되는 초기 폴리펩타이드로부터 자가 가공에 의해 유래되고, 이들은 10kDa 및 29kDa 펩타이드를 생성한다. 이들 자가 가공이 효모 세포에서 작용하는지는 알려지지는 않았다.

β-락탐 효소는 그의 불안정성으로 유명하고, 필라멘트성 진균에서의 환경은 β-락탐의 연속적인 생성을 지지하는 새로운 효소를 연속적으로 재생시키도록 구비되어 있다. 효모 또한 이러한 재생 능력을 갖고 있는지는 이전에 알려져 있지 않았다.

천연 β-락탐 생산자는 높은 생산 수준을 유지하도록 효율적인 β-락탐 수출자에게 특히 적합한 분비 시스템을 개발하여왔다.

끝으로 중요한 내용을 말하자면, β-락탐은 유독성 생성물이다. 비-천연 생산자는 이들 화합물을 견디도록 갖추어져 있지 않다.

본 발명에 따르면, 놀랍게도 자연적으로는 β-락탐을 생성하지 않는 미생물, 즉 β-락탐 화합물을 형성할 수 있는 생합성 경로를 갖지 않는 미생물에서 β-락탐 생산이 확립될 수 있는 것으로 발견되었다. 따라서, 제 1 양태에서, 본 발명은 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않지만, β-락탐 화합물의 생산에 관여하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 미생물을 제공한다.

바람직하게는 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않는 이 미생물은 단일 세포 형태로 성장하고, 보다 바람직하게는 단일 세포 형태로 성장하는 진핵 세포 미생물이다. 가장 바람직하게는 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않는 미생물은 효모이다.

본 발명에서 사용되기에 적합한 효모는 사카로마이세스(에스. 세레비시아에(S. cerevisiae), 에스. 바이아누스(S. bayanus), 에스. 엑시구스(S. exiguus)), 칸디다(Candida)(씨. 글라브라타(C. glabrata), 씨. 우틸리스(C. utilis), 씨. 말토사(C. maltosa), 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 보디니(C. boidinii), 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis)), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces)(케이. 락티스(K. lactis), 케이. 마르시아누스(K. marxianus), 케이. 써모톨레란스(K. thermotolerans)), 야바다지마 오메리(Yabadazyma ohmeri)), 피치아(Pichia)(피. 아구스타(P. angusta)(= 한세눌라 폴리모파(Hansenula polymorpha)), 피. 소프비토필라(P. sorbitophila)), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolitica), 자이고사카로마이세스 룩스(Zygosaccharomyces rouxii)이다.

본 발명의 내용에서 사용되는 용어 "단일 세포"는 주로 또는 순전히 단일 세포의 형태로 성장하는 미생물, 즉, 주로 또는 순전히 균사, 펠렛 및/또는 필라멘트성 미생물의 형태로 성장하지 않는 미생물을 의미한다. 이는 유리하게는 미생물이, 필라멘트성 미생물에서 가능한 것보다 훨씬 더 높은 세포 밀도로 배양될 수 있게 한다.

종종, 단일 세포로서 자연적으로 성장하는 미생물의 성장 행동은 예를 들면 유전적 개질로 인해 변화될 수 있다. 예를 들면 효모에서 발아 문제를 야기하는 개질이 공지되어 있다. 당 분야의 숙련자들은 순전히 단일 세포의 형태로 성장할 필요는 없는 이런 개질된 미생물 또한 본 발명의 범위 이내임을 이해할 것이다.

본 발명은 다음과 같은 여러 이점을 갖고 있다: 발효 배양액의 점도가 감소되어, 예를 들면 더 낮은 교반기 속도에서도 발효 배양액이 적절하게 혼합되고 발효기에서 더 높은 산소 전달 속도가 달성되는 것을 보증하기에 충분하고, 따라서, 탄소 공급원의 발효로의 공급 속도가 증가되어, β-락탐 경로 전체에 걸쳐 더 높은 탄소 플럭스를 수득할 가능성이 있고, 세포들 사이에 차이가 없어서 모든 세포가 생산 세포가 될 수 있다.

β-락탐 화합물의 생산에 관여하는 폴리뉴클레오타이드는 β-락탐 생합성 경로를 위한 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함한다. β-락탐 생합성 경로의 일부인 효소의 예는 다음과 같다:

·(트라이)펩타이드 합성효소, 예를 들면 δ-(L-α-아미노아디필)-L-시스테이닐-D-발린 합성효소(ACVS), 예를 들면 페니실리움 크리소게늄의 pcbAB 유전자에 의해 암호화됨,

· 비-헴 철-함유 다이옥시게나제, 예를 들면 아이소페니실린 N 합성효소(IPNS), 예를 들면 페니실리움 크리소게늄의 pcbC 유전자에 의해 암호화됨,

·에피머라제, 예를 들면 IPN 에피머라제, 예를 들면 스트렙토마이세스 클라불리게루스의 cefD 유전자에 의해 암호화됨,

·아실 트란스퍼라제, 예를 들면 6-APA:아실코A 아실 트랜스퍼라제(AT), 예를 들면 페니실리움 크리소게늄의 penDE 유전자에 의해 암호화됨,

·엑스판다제, 예를 들면 아크레모늄 크리소게늄의 cefEF 유전자 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스의 cefE 유전자에 의해 암호화되는 효소를 포함하는 데스아세톡시세팔로스포린 C 합성효소(DAOCS),

·하이드록실라제, 예를 들면 아크레모늄 크리소게늄의 cefEF 유전자 또는 스트렙토마이세스 클라불리게루스의 cefF 유전자에 의해 암호화되는 효소를 포함하는 데스아세틸세팔로스포린 C 합성효소,

·트란스퍼라제, 예를 들면 O-카바모일 트란스퍼라제(CAT), 예를 들면 스트렙토마이세스 클라불리게루스의 cmcH 유전자에 의해 암호화됨.

바람직하게는, β-락탐 화합물의 생산에 관여하는 폴리뉴클레오타이드는 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않는 미생물에 의한 β-락탐 화합물의 생산에서 지지 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 추가로 포함한다. 지지 기능이란, 단백질이 β-락탐 화합물의 생합성 경로의 일부인 효소는 아니지만, 그 단백질이 효과적인 β-락탐 생산에 필요함을 의미한다. 효과적인 β-락탐 생성에 필요하다는 것은, 단백질이 β-락탐 생성에 필수적일 수 있고/있거나(즉, 모든 관련된 생합성 효소가 존재하는 경우에조차 이 단백질이 없으면 미생물에서 β-락탐 생성이 측정되지 않는다), 적합한 β-락탐 생산 수준을 달성하는데 필요할 수 있다(즉, 이 단백질이 없을 경우, 미생물에서 β-락탐 생성이 너무 낮은 것으로 측정된다)는 것을 의미한다. 지지 기능을 갖는 단백질의 예는 다음과 같다:

·β-락탐 생합성 경로의 조절 단백질, 예를 들면 cpcRI(문헌[Schmitt, EK. and Kuck, U (2000) The fungal CPCR1 protein, which binds specifically to beta-lactam biosynthesis genes, is related to human regulatory factor X transcription factors, J Biol Chem. 275:9348-9357]); claR(문헌[Perez-Redondo R, Rodriguez-Garcia A, Martin JF, Liras P. (1998) The claR gene of Streptomyces clavuligerus, encoding a LysR-type regulatory protein controlling clavulanic acid biosynthesis, is linked to the clavulanate-9-aldehyde reductase (car) gene, MoI. Microbiol. 27:831-843]); ccaR(문헌[Perez-Llarena FJ, Liras P, Rodriguez-Garcia A, Martin JF. (1997) A regulatory gene (ccaR) required for cephamycin and clavulanic acid production in Streptomyces clavuligerus: amplification results in overproduction of both [beta]-lactam compounds, J. Bacteriol. 179: 2053-2059]),

·β-락탐 생합성 경로의 전구체를 세포내의 적절한 부위로 전달하는 전달자 단백질, 예를 들면 aa1, aa5, aa7, aa10, dd2와 같은 ATP-유형 결합 카세트(ABC) 단백질(WO 01/32904) 및 예를 들면 cefT와 같은 멀티-파실리테이터 슈퍼패밀리(Multi- Facilitator Superfamily)(MFS) 단백질(문헌[Ullan, R. V., Liu, G., Casqueiro, J., Gutierrez, S., Banuelos, O. & Martin, J. F. (2002) The cefT gene of Acremonium chrysogenum encodes a putative multidrug efflux pump protein that significantly increases cephalosporin C production. MoI Genet Genomics 267, 673-683]),

· 주로 물질대사, 특히 시스테인의 전구체인 1차 대사물의 형성에 관여하는 효소, 예를 들면 O-아세틸-L-세린 설피하이드릴라제를 암호화하는 oasS(WO 99/01561); 및 아미노아디페이트, 예를 들면 라이신의 전구체인 1차 대사물의 형성에 관여하는 효소(문헌[Casqueiro J, Gutierrez S, Ba[eta]uelos O, Hijarrubia MJ, Martin JF. (1999) Gene targeting in Penicillium chrysogenum: disruption of the Iys2 gene leads to penicillin overproduction, J Bacteriol.181:1181-1188]),

· 측쇄 활성화에 필요한 효소, 예를 들면 pcl에 의해 암호화되는 페닐 아세틸 코엔자임 A 리가제(WO 97/02349),

·ACVS에 의한 아미노산 활성화에 관여하는 효소, 예를 들면 npgA에 의해 암호화되는 아스퍼길루스 니둘란스의 포스포판테노일 트란스퍼라제(문헌[Keszenman-Pereyra D, Lawrence S, Twfieg ME, Price J, Turner G. (2003) The npgA/ cfwA gene encodes a putative 4'-phosphopantetheinyl transferase which is essential for penicillin biosynthesis in Aspergillus nidulans, Curr Genet. 43:186- 190]),

·페록시좀 증식에 관여하는 효소, 예를 들면 pex11에 의해 암호화되는 Pex11P(WO00/71579).

β-락탐 생합성 효소를 암호화하는 자연적으로 발생하는 유전자 또는 지지 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오타이드와는 별개로, 이들 효소 또는 지지 단백질의 인공적인 돌연변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또한 이용할 수 있다. 이런 돌연변이체는 또한 천연 효소 또는 단백질에 비해 더 큰 안정성, 개선된 성능(예를 들면 개선된 활성 또는 상이한 국소화) 또는 다른 특이성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않지만 β-락탐이 확립된 미생물은 당 분야에 널리 알려진 방법에 의해 편리하게 제조될 수 있다.

간략하게는, β-락탐 생성에 관여하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 벡터에 혼입될 수 있다. 이런 벡터는 원형 또는 선형 벡터일 수 있다. 또한, 벡터는 에피좀 복제(즉, 벡터가 세포의 게놈 DNA 외부에서 복제된다)를 제공하거나, 또는 폴리뉴클레오타이드의 게놈으로의 통합을 요구할 수 있다. 바람직하게는 벡터는 발현 벡터이고, β-락탐이 확립되는 미생물에서 β-락탐 생산에 관여되는 폴리뉴클레오타이드의 발현을 위해 제공된다. β-락탐 생산에 관여되는 폴리뉴클레오타이드의 암호화 서열은 암호화된 폴리펩타이드의 발현을 보증하는 조절 서열과 함께 제공된다. 조절 서열은 문제가 되는 암호화 서열과 자연적으로 연관된 것들중 하나이거나, 또는 선택된 미생물에서 적합한 발현을 보증하는 능력에 대해 선택된 서열일 수 있다. β-락탐 생성에 관여하는 폴리뉴클레오타이드는 하나의 벡터로 혼입되거나 또는 각각 서로 다른 폴리뉴클레오타이드를 위한 개별적인 벡터로 혼입될 수 있다. β-락탐 생성에 관여하는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드가 조합되는 경우, 개별적인 조절 영역(폴리시스트론 조직)을 갖는 각각의 폴리뉴클레오타이드를 제공하거나, 또는 (소위 모노시스트론 또는 오페론 구조에 따라) 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드에 대해 1개의 조절 영역을 이용할 수 있다. 또한 하나의 벡터에서 일부 폴리뉴클레오타이드를 조합하고 다른 폴리뉴클레오타이드를 위한 별개의 벡터를 이용하는 것 또한 가능하다.

선택된 미생물에 폴리뉴클레오타이드를 도입하기 위한 형질전환 방법은 다양한 유형의 미생물에 공통적으로 이용될 수 있다.

특히, 효모 세포는, 먼저 각각 원하는 폴리뉴클레오타이드중 하나로 형질전환된 서로 다른 효모 세포 개체군을 제공하고, 그런 다음 각각의 형질전환된 효모 세포를 교배함으로써 원하는 모든 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 효모 세포의 개체군을 수득함으로써 형질전환될 수 있다. 다르게는, 일단 형질전환된 효모 세포를 다른 선택 마커, 또는 이용가능한 시스템(예를 들면 cre-lox, FLP-FRT, 이에 대해서는 문헌[Gilbertson L. (2003) Cre-lox recombination: Creative tools for plant biotechnology, Trends Biotechnol. 21:550-555; Luo H, Kausch AP (2002) Application of FLP/FRT site-specific DNA recombination system in plants, Genet Eng (NY). 24:1-16]을 참고할 수 있다)에 의해 마커를 제거하였을 때에는 동일한 선택 마커를 이용하여 다시 형질전환시킬 수 있다.

한 양태에서는, 피. 크리소게늄 pcbAB, pcbC, penDE 및 pcl 유전자(이들이 각각 ACVS, IPNS, AT 및 PCL을 암호화한다)를 MET25-프로모터와 같은 에스. 세레비시아에 특이적 프로모터 및 MET25-터미네이트와 같은 에스. 세레비시아에 특이적 종결자의 제어 하에 두고; 개별적인 발현 카세트를 효모 게놈으로 통합시켰다. 이들 4가지 서로 다른 효소의 효소 활성은 당 분야에 공지된 방법에 따라 측정되었다: 단백질의 존재를 검출하기 위해 항체를 이용할 수 있고, 효소의 비활성을 결정하기 위해 특이적 분석법을 이용하였다. 이런 분석법의 예는 문헌[Theilgaard H, van Den Berg M, Mulder C, Bovenberg R, Nielsen J. (2001), Quantitative analysis of Penicillium chrysogenum Wis54-1255 transformants over expressing the penicillin biosynthetic genes, Biotechnol Bioeng 72:379-388](ACVS의 경우); 문헌[Theilgaard et al (2001)] (IPNS의 경우); 문헌[Tobin MB, Fleming MD, Skatrud PL, Miller JR. (1990) Molecular characterization of the acyl-coenzyme A:isopenicillin N acyltransferase gene(penDE) from Penicillium chrysogenum and Aspergillus nidulans and activity of recombinant enzyme in Escherichia coli. J Bacteriol. 172:5908-5914(AT의 경우) 및 문헌[Minambres B, Martinez- Bianco H, Olivera ER, Garcia B, Diez B, Barredo JL, Moreno MA, Schleissner C, Salto F, Luengo JM. (1998) Molecular cloning and expression in different microbes of the DNA encoding Pseudomonas putida U phenyl acetyl-CoA ligase. Use of this gene to improve the rate of benzyl penicillin biosynthesis in Penicillium chrysogenum. J Biol Chem. 271:33531- 33538](PCL의 경우)에서 발견할 수 있다.

본 발명에 따른 β-락탐 화합물, 또는 ACV 또는 IPN과 같은 β-락탐 중간체의 생성은 예를 들면 LC-MS계 분석법에 의해 편리하게 측정될 수 있다.

본 발명의 제 2 양태는 제 1 양태의 미생물을 이용하여 β-락탐 화합물을 생성하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기 β-락탐 화합물의 생산을 유도하는 조건 하에서 제 1 양태의 미생물을 배양시키는 단계를 포함한다. β-락탐 화합물이 생성되기만 하면 배양 조건은 본 발명에서 중요하지 않다. 흔히 알려진 배양 배지 및 조건을 사용할 수 있다. 당 분야의 숙련자들은 생성되는 β-락탐 화합물의 유형이 제 1 양태의 미생물에서 발현되는 생합성 유전자에 의존할 것이라는 것을 쉽게 이해할 것이다.

β-락탐 화합물은 바람직하게는 페니실린 G, 페니실린 V, 아디포일-7-아미노데스아세톡시 세팔로스포란산(아디포일-7-ADCA) 또는 아디포일-7-아미노-3-카바모일옥시메틸-3-세펨-4-카복실산(아디포일-7-ACCA)이다. 선택적으로, 본 발명은 β-락탐 화합물이 페남인 경우에는 6위치에서, β-락탐 화합물이 세펨인 경우에는 7 위치에서 탈아실화시켜 각각 6-아미노-페니실란산(6-APA), 7-ADCA 또는 7-ACCA를 생성하는 단계를 추가로 포함한다.

본 발명의 제 3 양태는 β-락탐 생성에 영향을 미치는 유전자 및/또는 인자를 확인하기 위한 제 1 양태의 미생물의 용도에 관한 것이다. 이는 예를 들면 다음과 같은 범위의 실험에 의해 수행될 수 있다:

·야생형 에스. 세레비시아에 및 β-락탐 생성 에스. 세레비시아에를 생성 및 비-생성 조건 하에서 성장시키고, 이용가능한 "오믹스(omics)" 기법(예를 들면 트랜스크립토믹스(transcriptomics), 프로테오믹스(proteomics), 메타볼로믹스(metabolomics) 등)을 이용하여 각각의 반응을 비교한다

·야생형 에스. 세레비시아에 및 β-락탐 생성 에스. 세레비시아에를 관련된 조건하에서 성장시키면서 일정 범위의 상이한 β-락탐으로 공격하고, 이용가능한 "오믹스" 기법(예를 들면 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스, 메타볼로믹스 등)을 이용하여 각각의 반응을 비교한다

·β-락탐 생성 에스. 세레비시아에에서 각각의 유전자의 발현을 개질(낙-아웃(knock-out), 저발현, 과발현)시키고, 이용가능한 "오믹스" 기법(예를 들면 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스, 메타볼로믹스 등)을 이용하여 각각의 반응을 비교한다

· β-락탐 생성 에스. 세레비시아에에서 임의의 이용가능한 유전자 및/또는 조절 인자(예를 들면 비-암호화 RNA, tRNA, 업스트림 조절 RNA 등)을 발현시키고, 이용가능한 "오믹스" 기법(예를 들면 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스, 메타볼로믹스 등)을 이용하여 각각의 반응을 비교한다

·야생형 에스. 세레비시아에 및 β-락탐 생성 에스. 세레비시아에에 대한 배양 조건(예를 들면 배지 조성, 배양 용기의 형태 및/또는 급식 계획)을 변화시키고, 이용가능한 "오믹스" 기법(예를 들면 트랜스크립토믹스, 프로테오믹스, 메타볼로믹스 등)을 이용하여 각각의 반응을 비교한다 .

이들 분석 결과를 유리하게는 통합시키고 β-락탐 생성 종(피. 크리소게눔, 에이. 크리소게눔 및 에스. 클라불리게루스와 같은 천연 생성자를 포함한다)에서 β-락탐 생성의 추가 개선을 이끌어내는데 사용할 수 있다.

실시예 1: 발현 벡터의 구축

효모 플라스미드 pRS406에 근거하여 발현 벡터를 생성하였다(문헌[Sikorski, R.S. and Hieter, P (1989) A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae, Genetics 122:19-27)]). Met25 프로모터 및 터미네이터 영역(문헌[Johnston, M. et al (1997) The nucleotide sequence of Saccharomyces cerevisiae chromosome XII, Nature 387 (6632 Suppl.), 87-90])을 pRS416Met25(문헌[Mumberg D, Muller R, Funk M. (1995) Yeast vectors for the controlled expression of heterologous proteins in different genetic backgrounds. Gene 156:119-122])로부터 단리하였다.

pRS403Met25 및 pRS405Met25의 구축: pRS416Met25을 SstI 및 NaeI으로 제한효소분해하여 Met25 프로모터 및 터미네이터 분획을 생성하였다. 후속적으로 이 분획을 SstI/NaeI 분해된 pRS403 및 pRS405(문헌[Sikorski, R.S. and Hieter, P, 1989])에 결찰시켜 원하는 플라스미드를 생성하였다.

pRS404Met25 및 pRS406Met25의 구축: pRS416Met25를 SstI 및 KpnI으로 제한 효소 분해하여 Met25 프로모터 및 터미네이터 분획을 생성하였다. 후속적으로 이 분획을 SstI/KpnI 분해된 pRS404 및 pRS406(문헌[Sikorski, R.S. and Hieter, P, 1989])에 결찰시켜 원하는 플라스미드를 생성하였다.

IPSN 유전자를 효모 크로모좀으로 통합시키는데 이용되는 플라스미드 pRS406Met25pcbC(IPNS 유전자)는, 피. 크리소게늄 pcbC 유전자(문헌[Carr, L.G., Skatrud, P.L., Scheetz, M.E. II, Queener, S.W. and Ingolia, T.D. (1986) Cloning and expression of the isopenicillin N synthetase gene from Penicillium chrysogenum, Gene 48:257-266])를 5'CAAGTTTTCACCGCGGTTTTTCTAGTTAACATGATATCGATTCCC-3' (서열 번호: 1) 및 5'- GAGTCCGGGATTTCTAGATCCCGGTCGAC-3' (서열 번호: 2)의 프라이머를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, pCR TOPO2.1 벡터(인비트로겐(Invitrogen), 제조자에 의해 공급된 프로토콜에 따라)로 클로닝한후, XhoI 및 SpeI으로 제한 효소 분해시킨 후, pcbC 분획을 XhoI/SpeI 제한효소 분해된 pRS406Met25 벡터로 결찰시켰다.

PCL 통합 플라스미드 pRS403Met25pcl의 구축: pRS403Met25를 Xbal/BamH1로 제한효소 분해시키고, Xbal/BamH1 제한효소 분해되고 PCR-증폭된 PCL 유전자(WO 97/02349)에 프라이머 5'-CCATTATTTTTCTAGACACCCATATGGTTTTTTTACCTCC-3'(서열 번호: 3) 및 5'- CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3'(서열 번호: 4)를 이용하여 결찰시켰다.

AT(penDE) 통합 플라스미드 pRS405Met25penDE의 구축: penDE 유전자(문헌[Tobin et al, 1990])를 프라이머 5'-CAAAAGATGGATCCGCTCGTCATGAAGAG-3'(서열 번 호: 5) 및 5'-CCATTATTTTTCTAGACCATATGCTTCACATCC-3'(서열 번호: 6)를 이용하여 PCR 증폭시킨 후, Xbal, BamH1로 제한효소 분해시키고, 생성된 penDE 단편을 Xbal, BamH1으로 제한효소 분해된 pRS405Met25에 결찰시켰다.

ACVS (pcbAB) 통합 플라스미드 pRS404DestACVS를 다음과 같이 구축하였다. 플라스미드 pRS404Dest는, 먼저 프라이머 5'-GGGGGCGGCCGCACAACTTTGTATAGAAAAGTTGAGAAACGTAAAATGATATAAAT-3' (서열 번호: 7) 및 5'-GGGGCGCCGGCGACAACTTTTTTGTACAAAGTTGAGAAACGTAAAATGATATAAAT-3' (서열 번호: 8)를 이용하여 pDEST15(인비트로겐)의 CapccdB 선택 카세트를 증폭시킨 후, pCR2.1 TOPO에 결찰시켜 플라스미드 pCR2.1/catccdB를 생성하였다. 그런 다음, 플라스미드 pCR2.1/catccdB를 MunI으로 분해시키고, catccdB 단편을 EcoRI-분해된 pRS404Met25로 결찰시켜 pRS404Dest를 생성함으로써 구축되었다. pcbAB 유전자(문헌[Diez, B., Gutierrez, S., Barredo, J.L., van Solingen, P., van der Voort, L.H. and Martin, J. F. (1990) The cluster of penicillin biosynthetic genes. Identification and characterization of the pcbAB gene encoding the alpha-aminoadipyl-cysteinyl-valine synthetase and linkage to the pcbC and penDE genes, J. Biol. Chem. 265: 16358-16365])는, 프라이머5'-CACCATGACTCAACTGAAGCCAC-3'(서열 번호: 9) 및 5'-ATAGCGAGCGAGGTGTTC-3'(서열 번호: 10)을 이용한 증폭에 의해 수득되었다.

블런트-말단을 갖는 PCR 분획을 제조자의 매뉴얼에 따라 pENTR/SD/D-Topo 벡터(인비트로겐)로 클로닝하여 pENTR/SD/ACVS를 생성하였다.

인비트로겐의 게이트웨이(Gateway) 매뉴얼에 따라 pRS404Dest를 이용하여 pENTR-SD-ACVS 플라스미드를 게이트웨이 LR-반응시켜 최종 통합 플라스미드 pRS404DestACVS를 수득하였다.

실시예 2: 에스. 세레비시아에 의 형질전환

ACVS, IPNS, PCL 및 AT를 암호화하는 유전자를 갖는 생성된 플라스미드를 효모 사카로마이세스 세레비시아에 CEN-Pk2-1c(문헌[Wieczorke R, Krampe S, Weierstall T, Freidel K, Hollenberg CP, Boles E, (1999) Concurrent knock-out of at least 20 transporter genes is required to block uptake of hexoses in Saccharomyces cerevisiae, FEBS Lett. 464:123-128])로 형질전환시켰다. 프로토콜로서 문헌[Gietz RD, Woods RA (2002, Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier D N A/polyethylene glycol method, Methods Enzymol. 350:87-96]에 개시된 바와 같은 리튬-이온 및 헤링(Herring) 정자 담체 DNA 처리법에 근거한 고-효율 효모 형질전환 방법을 이용하였다. 영양요구성 마커인 HIS, LEU, TRP 및 URA을 이용한 통합체의 선택은 당 분야에서 공지된 바와 같이 이용되었다. 생성된 균주는 ACVS, IPNS, AT 및 PCL을 암호화하는 페니실린 생합성 유전자를 갖고, 이는 PCR 및 써던 블럿(Southern blot) 분석법에 의해 판단되었다.

실시예 3: 생합성 효소 및 효소 활성 결정

추정되는 페니실린 생산 효모 균주를, 효모 최소 배지(1XYNB, 20mM 포스페이트, pH 6.8, 2% 글루코즈)에서의 성장에 의해 효소 활성에 대해 스크리닝하였다. 이런 조건 하에서 Met25 프로모터는 메티오닌의 부재로 인해 완전히 발현활성화된 다. 최종적으로 4 내지 5의 OD₆₀₀에 도달할 때까지 하룻밤동안 효모를 성장시켰다. 그런 다음, 세포를 펠렛화시키고, 초음파분리 또는 유리 비드를 이용하여 세포가 없는 추출액을 수득하였다. 용균액 분획 및 가용성 상층액을 페니실린 생합성 효소 생산에 대해 스크리닝하였다. 쿠마시(Coomassie)-염색된 SDS-PAGE 겔상에서 분석하고 웨스턴 블럿팅(Western blotting)하여, 생합성 효소의 생산을 나타내었다. LC-MS를 이용하여 페니실린 생합성 중간체인 ACV, IPN 및 PenG의 형성을 입증하였다.

실시예 4: 항생 활성의 검출

콜로니 정제된 효모 균주를 β-락탐의 생산을 자극하는 아가 플레이트로 이동시키고 25℃에서 24 내지 168시간동안 항온처리하였다. β-락탐 민감성 이. 콜라이(E. coli) ESS 균주(문헌[Hsu JS, Yang YB, Deng CH, Wei CL, Liaw SH, Tsai YC. (2004) Family shuffling of expandase genes to enhance substrate specificity for penicillin G. Appl Environ Microbiol.70:6257-6263])를 2xTY에서 미드-로그(mid-log) 상까지 배양하고, 미리 가온시킨 0.8% 2xTY 아가로 희석시키고, 효모 콜로니상에 조심스럽게 분배하였다. 37℃에서 하룻밤동안 항온처리하고 나면, β-락탐 생성 균주는 소위 할로(halo)라 불리는 콜로니 근처의 투명한 영역에 의해 가시화된다.

SEQUENCE LISTING <110> DSM IP Assets B.V. <120> Production of beta-lactams in single cells <130> 20757W0 <160> 10 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 45 <212> DNA <213> synthetic <400> 1 caagttttca ccgcggtttt tctagttaac atgatatcga ttccc 45 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic <400> 2 gagtccggga tttctagatc ccggtcgac 29 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> synthetic <400> 3 ccattatttt tctagacacc catatggttt ttttacctcc 40 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic <400> 4 caaaagatgg atccgctcgt catgaagag 29 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> synthetic <400> 5 caaaagatgg atccgctcgt catgaagag 29 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> synthetic <400> 6 ccattatttt tctagaccat atgcttcaca tcc 33 <210> 7 <211> 56 <212> DNA <213> synthetic <400> 7 gggggcggcc gcacaacttt gtatagaaaa gttgagaaac gtaaaatgat ataaat 56 <210> 8 <211> 56 <212> DNA <213> synthetic <400> 8 ggggcgccgg cgacaacttt tttgtacaaa gttgagaaac gtaaaatgat ataaat 56 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> synthetic <400> 9 caccatgact caactgaagc cac 23 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> synthetic <400> 10 atagcgagcg aggtgttc 18

Claims (10)

1. 자연적으로는 β-락탐 화합물을 생성하지 않지만, 그의 유전적 개질에 의해 β-락탐 화합물을 생성할 수 있는 미생물.
2. 제 1 항에 있어서,

   β-락탐 화합물을 생성하는 능력을 갖는 미생물을 제공하도록 β-락탐 화합물의 생성에 관여하는 폴리뉴클레오타이드로 형질전환된 미생물.
3. 제 2 항에 있어서,

   β-락탐 화합물의 생성에 관여하는 폴리뉴클레오타이드가 β-락탐 화합물의 생합성 경로의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열인 미생물.
4. 제 3 항에 있어서,

   β-락탐 화합물의 생합성 경로의 효소가 ACVS, IPNS 및 AT로 구성된 군에서 선택되는 미생물.
5. 제 2 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,

   β-락탐 화합물의 생산에 대해 지지 작용을 갖는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로 추가로 형질전환된 미생물.
6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,

   효모인 미생물.
7. 제 6 항에 있어서,

   효모가 사카로마이세스(Saccharomyces), 칸디다(Candida), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 야바다지마(Yabadazyma), 피치아(Pichia), 야로위아(Yarrowia), 뉴로스포라(Neurospora) 및 자이고사카로마이세스(Zygosaccharomyces)로 구성된 군에서 선택되는 속에 속하는 효모.
8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항의 미생물을 β-락탐 화합물의 생성을 유도하는 조건 하에서 배양시키는 단계를 포함하며, 선택적으로, β-락탐 화합물이 페남인 경우에는 6위치에서, β-락탐 화합물이 세펨인 경우에는 7 위치에서 탈아실화시키는 단계를 포함하는, β-락탐 화합물의 제조 방법.
9. 제 8 항에 있어서,

   β-락탐 화합물이 페니실린 G, 페니실린 V, 6-APA, 아디포일-7-ADCA, 아디포일-7-ACCA, 7-ADCA, 7-ACCA 또는 7-ACA인 방법.
10. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항의 미생물의, β-락탐 화합물 생성에 영향을 주 는 인자를 확인하기 위한 용도.