JP2003527069A - セファロスポリンのｉｎｖｉｖｏ製造の改善 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＤＮＡ、前記ＤＮＡの転写、翻訳または発現の能力を有する異種ホスト細胞、並びに前記ホスト細胞およびその培養をアシル化セファロスポリンの高収量in vivo製造の改善のために利用する方法を提供する。本発明にしたがえば、（主としてペルオキシゾームまたはミクロボディー内またはそれらとともに局在する場合とは対照的に）ホストのサイトゾルにもっぱら局在するエクスパンダーゼ活性を有する酵素を含むホスト細胞が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本発明はリコンビナントＤＮＡ技術の分野に属する。より具体的には、本発明
は、遺伝的に改変したホスト生物を用いるセファロスポリンの製造、そのように
改変したホスト生物、およびその中で使用するＤＮＡに関する。さらに、本発明
は前記ホスト生物のリコンビナントＤＮＡから発現される改変酵素に関する。

【０００２】従来技術 β−ラクタム系抗生物質はもっとも重要な抗生物質のグループに属し、長い臨
床使用歴をもつ。このグループの中で重要なものはペニシリン系およびセファロ
スポリン系である。これらの化合物は、それぞれ例えばペニシリウム・クリソゲ
ヌム（Penicillium chrysogenum)およびアクレモニウム・クリソゲヌム(Acremon
ium chrysogenum)のような糸状菌によって天然に産生される。 古典的菌株改造技術の結果として、Ｐ．クリソゲヌムおよびＡ．クリソゲヌム
の抗生物質産生レベルは、ここ数十年で劇的に増加した。ペニシリンおよびセフ
ァロスポリンを生じる生合成経路に関する情報の増加およびリコンビナントＤＮ
Ａ技術の到来によって、産生株改造およびこれらの化合物のin vivo誘導のため
の新規なツールが利用可能になった。

【０００３】 β−ラクタム生合成に必要なほとんどの酵素が特定され、それらの対応する遺
伝子がクローニングされた。これらは以下の文献で見出される：Ingolia & Quee
ner, Med. Res. Rev. 9:245-264(1989）（生合成経路と酵素について）；Aharon
owitz, Cohen & Martin, Ann. Rev. Microbiol. 46:461-495(1992)（遺伝子のク
ローニングについて）。 Ｐ．クリソゲヌムのペニシリン生合成における最初の２つの工程は、３つのア
ミノ酸、（Ｌ−５−アミノ−５−カルボキシペンタン酸（Ｌ−α−アミノアジピ
ン酸）（Ａ）、Ｌ−システイン（Ｃ）およびＬ−バリン（Ｖ）のトリペプチドＬ
ＬＤ−ＡＣＶへの縮合、それに続くこのペプチドの環状化からイソペニシリンＮ
の生成である。この化合物は典型的なβ−ラクタム構造を含んでいる。 第三の工程は、アシルトランスフェラーゼ酵素の作用によるＬ−５−アミノ−
５−カルボキシペンタン酸の親水性側鎖の疎水性側鎖による交換を伴う。アシル
トランスフェラーゼによって仲介される酵素的交換作用は、ＥＰ−Ａ−０４４８
１８０号で記載されたように細胞小器官（ミクロボディー）の内部で発生する。

【０００４】 セファロスポリンはペニシリンよりもはるかに高価である。その理由の１つは
、いくつかのセファロスポリン（例えばセファレキシン）は、多数の化学的変換
によってペニシリンから製造されるからである。別の理由は、これまでのところ
はＤ−５−アミノ−５−カルボキシペンタノイル側鎖をもつセファロスポリンの
みが醗酵による変換に供することができるということである。この場合にはるか
に重要な出発物質であるセファロスポリンＣはいずれのｐＨでも水への溶解性が
非常に高く、したがって手間がかかり高価なカラム技術を用いる長々とした費用
のかかる単離工程を必要とする。このようにして得られたセファロスポリンＣは
、多数の化学的および酵素的変換によって治療に使用されるセファロスポリンに
変換されねばならない。

【０００５】 中間体７−ＡＤＣＡを製造する工業的に有利なこれまでの方法は、ペニシリン
Ｇの拡張と誘導に至る複雑な化学的工程を必要とする。７−ＡＤＣＡを製造する
ために必要な化学的工程の１つは、５員環ペニシリン環構造の６員環セファロス
ポリン環構造への拡張を必要とする（例えばＵＳ４００３８９４号を参照された
い）。この複雑な化学的処理工程は高価でもあり、環境に有害でもある。 結果として、そのような化学的プロセスを酵素反応、例えば酵素触媒反応、好
ましくはin vivoプロセスで置き換えることが渇望される。化学的拡張プロセス
を酵素的およびin vivoプロセスで置き換えるために不可欠なものは、セファロ
スポリン生合成経路における中心的酵素、デスアセトキシセファロスポリンＣシ
ンセターゼ（ＤＡＯＣＳ）（または"エクスパンダーゼ"と称される）である。

【０００６】 細菌、ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus)由来
のエクスパンダーゼ酵素は、いくつかの事例でペニシリン環拡張を遂行すること
が判明した。Ｐ．クリソゲヌムに導入されたとき、文献に報告されたように（Ca
ntwell et al., Proc. R. Soc. Lond. B. 248:283-289(1992))、それはin vivo
でペニシリン環構造をセファロスポリン環構造に変換させることができる。エク
スパンダーゼ酵素は、その対応する遺伝子（ｃｅｆＥ）と同様に、生化学的にも
機能的にも性状がよく調べられた（ＥＰ−Ａ−０３６６３５４号）。ｃｅｆＥ遺
伝子（ＥＰ−Ａ−０３４１８９２号）、ＤＮＡ配列およびｃｅｆＥによるＰ．ク
リソゲヌムの形質転換実験もともに報告された。

【０００７】 環拡張酵素のまた別の供給源は、例えば細菌のノカルディア・ラクタムデュラ
ンス（Nocardia lactamdurans)（以前はストレプトミセス・ラクタムデュランス
（Streptomyces lactamdurans)）および真菌のアクレモニウム・クリソゲヌム（
以前にはセファロスポリウム・アクレモニウム（Cephalosporium acremonium)）
である。セファロスポリニウム由来のエクスパンダーゼは二機能性酵素で、エク
スパンダーゼ活性（環拡張）および３−ヒドロキシル化活性を有する。この酵素
の生化学的特性およびその遺伝子のＤＮＡ配列はともに報告されている（それぞ
れCortｅs et al., J. Gen. Microbiol. 133:3165-3174(1987); Coque et al.,
Mol. Gen. Genet. 236:453-458(1993))。

【０００８】 エクスパンダーゼは、ペニシリンＮの５員環チアゾリジン環をＤＡＯＣの６員
環ジヒドロチアジン環に拡張するので、本酵素は前記の化学的プロセスの環拡張
工程を代替する論理的候補物質であろう。残念なことに、この酵素はセファロス
ポリン生合成経路のペニシリンＮ中間体に作用するが、Ｐ．クリソゲヌムによっ
て産生される容易に入手できる安価な（ペニシリンＶまたはペニシリンＧのよう
な）ペニシリンとは作用しないかまたは比較的効率が悪い。ペニシリンＮは市販
されておらず、さらに拡張されたときでも、そのＤ−５−アミノ−５−カルボキ
シペンタノイル側鎖はペニシリンアシラーゼで容易に除去することができない。

【０００９】 エクスパンダーゼ酵素は、天然に存在しない側鎖をもつペニシリンを対応する
７−ＡＤＣＡ誘導体に拡張することができることが最近見出された。これらの側
鎖には、アジペート（５−カルボキシル−ペンタン酸）および種々の他の化合物
が含まれる。エクスパンダーゼのこの特性は、ＥＰ−Ａ−０５３２３４１号で開
示されたように、ペニシリウム・クリソゲヌムでのアジポイル−７−ＡＤＣＡの
in vivo製造のためのプロセスで利用された。ペニシリウム・クリソゲヌム株は
ストレプトミセス・クラブリゲルスのエクスパンダーゼで形質転換され、これら
の形質転換体にアジピン酸が供給されたときアジポイル−６−アミノペニシラン
酸（アジポイル−６−ＡＰＡ）が生成される。その後、アジポイル−６−ＡＰＡ
はアジポイル−７−ＡＤＣＡに"拡張"される。種々の他の７−アシル化セファロ
スポリンの製造は、ＷＯ９５／０４１４８号およびＷＯ９５／０４１４９で開示
されている。ＷＯ９５／０４１４８号およびＷＯ９５／０４１４９では、３'−
カルボキシメチルチオプロピオン酸および３，３'−チオジプロピオン酸の培地
への添加は、エクスパンダーゼの基質であるペニシリンを生成し、それぞれ２−
（カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ＡＤＣＡおよび３−（カルボキシメチ
ルチオ）プロピオニル−７−ＡＤＣＡを生じることが開示されている。

【００１０】 エクスパンダーゼが種々の側鎖をもつペニシリンで活性を示すとしても、天然
の基質であるペニシリンＮの拡張と比較して、これらの新規なペニシリンの拡張
はより低い効率で生じる。この知見は、アジポイル−ペニシラン酸に対する活性
を改変することを目的とするエクスパンダーゼ改造の根拠であった。突然変異エ
クスパンダーゼの利用はＷＯ９８／０２５５１号で開示された。

【００１１】 ペニシリン合成の最終工程、ＩＰＮのα−アミノアジポイル側鎖のまた別の側
鎖による交換は、アシルトランスフェラーゼが局在するミクロボディーで発生す
る。ペニシリンの最適拡張のために、好ましいエクスパンダーゼの分布はしたが
ってミクロボディ−内であると考えられる。これは、エクスパンダーゼの基質が
ミクロボディーで産生されると考えられている事実に基づくだけでなく、ミクロ
ボディーでは、エクスパンダーゼがプロテアーゼによる分解からより保護され易
いはずであるという予想によるものである。これは、酵素の製造にＰ．クリソゲ
ヌムを使用することに起因する既知の欠点である（例えば以下の文献を参照され
たい：Theilgaard et al., "Purification and characterization ofδ-(L-α-a
minoadipyl)-L-cysteinyl-D-valine synthetase from Penicillium chrysogenum
", Biochem. J. 327:185-191(1997)）。

【００１２】 β−ラクタム系抗生物質産生に必要な酵素の細胞内分布の改変がＥＰ０４４８
１８０で提唱された。例えば７ページの最後から２つめのパラグラフでは、エピ
メラーゼおよび好ましくはその後のセファロスポリン生合成酵素（アクレモニウ
ム・クリソゲヌムのエクスパンダーゼ／ヒドロキシラーゼまたはストレプトミセ
ス種のエクスパンダーゼのようなもの）を局在させて、ペニシリウム・クリソゲ
ヌムでセファロスポリンまたは中間体の産生効率を改善することが提唱されてい
る。さらにまた、アシルトランスフェラーゼ（アシル−６−ＡＰＡの側鎖の除去
に必要な酵素）のミクロボディー指向シグナルの除去はペニシリン産生を全体的
に破壊することが示されている。このことは、基質の分布だけが理由でないとし
ても少なくとも安定性の理由から、β−ラクタム産生に必要な酵素はミクロボデ
ィーに局在するはずであるということを強く示唆している。

【００１３】発明が解決しようとする課題 本発明は、ＤＮＡ、前記ＤＮＡの転写、翻訳または発現能力を有する異種ホス
ト細胞、並びに高収量のアシル化セファロスポリンのin vivo産生のためにその
ようなホスト細胞およびその培養を利用する改善方法を提供する。本発明にした
がえば、（ペルオキシゾームまたはミクロボディーでもしくはその中で主として
分布するのとは異なって）もっぱらホスト細胞のサイトゾルに局在するエクスパ
ンダーゼ活性を有する酵素を含むホスト細胞が提供される。

【００１４】 好ましい実施態様では、本発明は改変エクスパンダーゼをコードする単離ＤＮ
Ａフラグメントを提供する。前記ＤＮＡフラグメントのペニシリウム・クリソゲ
ヌムホストでの発現後に、このエクスパンダーゼは前記ペニシリウムホストのサ
イトゾルでもっぱら見出される。改変エクスパンダーゼをコードするそのような
ＤＮＡフラグメントは、例えばノカルディア・ラクタムデュランス（Nocardia l
actamdurans)（以前はストレプトミセス・ラクタムデュランス）および真菌アク
レモニウム・クリソゲヌム（Acremonium chrysogenum）および他の関連（すなわ
ちセファロスポリン／セファマイシン産生）微生物で見出されるエクスパンダー
ゼをコードするＤＮＡを改変することによって入手できる。

【００１５】 本発明は、好ましくは異種ホストのミクロボディーの代わりにサイトゾルにも
っぱら局在する改変エクスパンダーゼをコードする単離ＤＮＡフラグメントを提
供する。本発明の好ましい実施態様では、そのようなＤＮＡフラグメントは、エ
クスパンダーゼをコードするストレプトミセス・クラブリゲルスのＤＮＡから入
手できる。これを改変して、ホストのペニシリウム・クリソゲヌムで発現させた
場合このペニシリウムホストのサイトゾルでもっぱら見出されるエクスパンダー
ゼをコードするＤＮＡフラグメントを得ることができる。

【００１６】 そのような改変は、前記エクスパンダーゼをコードするヌクレオチド配列の遺
伝子組換え技術によるクローニングを含むが、好ましくは、前記エクスパンダー
ゼのミクロボディーまたはペルオキシゾーム指向シグナルをコードする配列の遺
伝子組換えによる改変を含む。改変は、エクスパンダーゼをコードする核酸配列
、好ましくは前記エクスパンダーゼのカルボキシ末端のアミノ酸配列をコードす
る配列のシングル変異またはマルチ変異（例えば欠失、挿入、または倒置）を含
むことができる。

【００１７】 蛋白質のペルオキシゾームまたはミクロボディーへの指向は、真核生物の間で
は非糸状菌酵母で比較的よく研究されてきた。これらの生物では、ペルオキシゾ
ームまたはミクロボディーに向かう蛋白質は一般にＣ−末端の標的指向配列を含
む。そのアミノ酸配列は一般にＳ（セリン）Ｋ（リジン）Ｌ（ロイシン）である
か、より一般的にはＳ／Ｃ／Ａ／−Ｋ／Ｈ／Ｒ−Ｌである。そのような標的指向
配列は、少なくとも同種系では蛋白質（例えば酵素）をミクロボディー（前記蛋
白質の最終的な存在場所である）へ輸送するために必要なシグナルを提供する。

【００１８】 糸状菌の場合（例えばペニシリウム・クリソゲヌム）は、ペルオキシゾームま
たはミクロボディーへの蛋白質の指向は相対的にあまり研究されておらず、さら
に、酵母または真菌のような生物がホスト細胞として異種蛋白質の翻訳または場
合によってその発現に用いられる異種系での蛋白質の標的指向についてはほとん
ど判明していない。これは、特に異種蛋白質が原核生物（例えば細菌）に由来す
る場合の事例である。なぜならば、細菌はペルオキシゾームまたはミクロボディ
ーのような細胞小器官をもたず、したがって同種系のペルオキシゾーム指向シグ
ナルを利用しないからである。一般には、異種発現蛋白質または酵素がそのホス
トで十分に機能するためには、対応する標的指向シグナルは、相応の細胞内局在
場所を見つけるためにホストが用いるシグナルと少なくとも類似していなければ
ならないと考えられる。

【００１９】 細菌Ｓ．クラブリゲルス由来のエクスパンダーゼはＣ−末端配列、ＳＫＡ（セ
リン−リジン−アラニン）を含み、この配列は、前記蛋白質が異種系の真核ホス
トで発現される場合、ペルオキシゾーム指向配列として機能するらしい。例えば
、Ｓ．クラブリゲルスエクスパンダーゼで形質転換されたペニシリウム・クリソ
ゲヌム株は（例えばＥＰ０５３２３４１Ａ１号で考察されたように）、対応する
エクスパンダーゼのペルオキシゾーム内の分布を示す。

【００２０】 ストレプトミセス・クラブリゲルスの野性型エクスパンダーゼは、遺伝子組換
えによってペニシリウム・クリソゲヌムで産生させたときもっぱらミクロボディ
ーに蓄積することが分かった。前記の３アミノ酸配列、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ
は、明らかにペニシリウム・クリソゲヌムでミクロボディー指向シグナルとして
機能する。ただし、それは、酵母のミクロボディー指向シグナルのためのコンセ
ンサス配列とはいくぶん外れている。

【００２１】 ペルオキシゾーム標的指向シグナルを（ペルオキシゾーム内の局在を防止する
べきシグナルと同様に）Ｓ．クラブリゲルスのエクスパンダーゼのカルボキシ末
端について操作したとき、またはセファロスポリン・アクレモニウムのエクスパ
ンダーゼ／ヒドロラーゼについての同様な操作に対して、付加された種々のカル
ボキシ末端アミノ酸配列に関係なくペルオキシゾーム内に局在する傾向には変化
は生じなかった。（Verbung et al., P.35, page 108, "7th Int. Symp. Gen. I
ndustr. Microorg. 26 June-1 July, 1994, Montreal Canada)。

【００２２】 明らかに、この酵素は、効果的な標的指向シグナルをもち、このシグナルは前
記酵素を少なくとも優先的に異種ペニシリウム・クリソゲヌムホスト細胞のミク
ロボディー内に局在させる。しかしながら、本発明の実施態様の１つでは、本発
明は、ミクロボディー内の局在傾向を変化させホストのサイトゾルにもっぱら前
記エクスパンダーゼを局在させるエクスパンダーゼの効果的改変を提供する。

【００２３】 ミクロボディーまたはペルオキシゾームに局在する傾向は、Ｎ−末端またはＣ
−末端ペルオキシゾーム指向シグナル（ＰＴＳ）によって支配され、前記ＰＴＳ
の改変（Ｎ−末端改変であれ、Ｃ−末端改変であれ）は、ミクロボディーにおけ
るそのような局在を実質的に妨げる。そのような改変の例は、カルボキシ末端ト
リペプチドＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードするヌクレオチド配列における改変で、例
えば式中、Ｘ１はセリン、システインおよびアラニンから成る群から選ばれる１
つのアミノ酸で、Ｘ２はリジン、ヒスチジンおよびアルギニンから成る群から選
ばれる１つのアミノ酸で、Ｘ３はロイシンまたはアラニンである。そのようなト
リペプチド配列はまたＳＫＬ様ペプチドと称され、このシグナルの基本的な配列
は、最初の小型のアミノ酸、二番目の塩基性残基およびＣ−末端部の大型の非極
性残基である。本発明は、ＳＫＬ様トリペプチドをコードする前記フラグメント
が、実質的に前記エクスパンダーゼがミクロボディーに局在するのを実質的に妨
げ、したがって前記異種細胞での発現に際して、エクスパンダーゼをもっぱらホ
スト細胞のサイトゾルに局在させるように改変または選別されたエクスパンダー
ゼをコードするＤＮＡフラグメントを提供する。

【００２４】 本発明の好ましい実施態様では、前記ＤＮＡフラグメントはＳ．クラブリゲル
スのエクスパンダーゼをコードするＤＮＡから得られ、このＤＮＡは最初セリン
−リジン−アラニンのカルボキシ末端トリペプチドをコードするヌクレオチド配
列を含むが、エクスパンダーゼがその発現に際してホスト細胞のサイトゾルにも
っぱら局在するように改変される。そのような改変は、セリン−リジン−アラニ
ンをコードする配列をセリン−リジン−アスパラギン酸をコードする配列に改変
させるか、または最後の位置のアミノ酸を欠失させるかもしくは例えば別の非疎
水性残基によって置換させて、特に本発明のＤＮＡフラグメントにより実施され
る。

【００２５】 また別の改変は、セリン−セリン−アスパラギン酸を含むか、または二番目の
位置のアミノ酸が欠失もしくは非陽性荷電残基によって置換された改変を含む。 また別の改変はトリペプチドの最初の位置の欠失を含み、これは、このように
して改変された蛋白質の異種ホストでの輸送を変化させ、使用する異種細胞のサ
イトゾルに前記蛋白質を優先的に局在させる。 さらに他の改変は、これら３つのアミノ酸またはこれらカルボキシ末端アミノ
酸をコードするコドンの組合せのいずれかの欠失または改変を含む。

【００２６】 驚くべきことには、明らかにミクロボディー指向シグナルとして機能するトリ
ぺプチド配列ＳＫＡの、通常の組換えＤＮＡ技術を用いた意図的な改変（または
上記で説明したその機能的変種）は、異種発現酵素をミクロボディーよりもむし
ろホスト細胞のサイトゾルにもっぱら蓄積させることが一方で判明した。

【００２７】 しかしながら、他方、実在する蛋白質の変種は豊富で、さらに、異種ホストで
発現されたとき前記ホストのサイトゾルにもっぱら局在するエクスパンダーゼの
ような酵素を含む微生物を発見することは今や可能である。上記の特定標的指向
配列から逸脱したＣ−末端配列をもつ特に蛋白質または酵素は、サイトゾル分布
について検査し、セファロスポリン産生の収量改善で今後使用するために選別す
るべき候補蛋白質であろう。個々の実施態様では、本発明は、ペニシリウム・ク
リソゲヌムホスト細胞での発現に際してサイトゾルにもっぱら局在し、それによ
ってミクロボディーでまたはミクロボディー内で該当する酵素を発現するホスト
細胞のセファロスポリン収量を改善するエクスパンダーゼをコードするヌクレオ
チド配列を提供する。

【００２８】 全く予想に反して、本発明によって提供される酵素はミクロボディー外で安定
であるようである。本発明によって提供されるエクスパンダーゼは、ペニシリン
を（天然に存在しない側鎖をもつペニシリンでさえも（例えばＥＰ９７２０１１
９６．９号およびＥＰ９７２０１１９７．９号を参照されたい))対応する７−Ａ
ＤＣＡ誘導体に拡張することができる。

【００２９】 本発明はまた、本発明によって提供される改変または選別酵素をコードする単
離ＤＮＡフラグメントを提供する。このフラグメントはさらに、真核ホスト細胞
で前記ＤＮＡを発現させるための調節領域を含む。種々の生物、例えば動物また
は植物または酵母または真菌起源の１つまたは２つ以上のホスト細胞で機能する
調節領域をもつＤＮＡフラグメントを提供することは例えば当業者の技術範囲内
である。好ましい実施態様では、本発明は、微生物（例えば酵母または真菌）に
由来するホスト細胞での発現を調節するために適した調節領域を含む、本発明で
提供される改変酵素をコードするＤＮＡフラグメントを提供する。

【００３０】 驚くべきことには、ミクロボディー内ではなく主にサイトゾルに蓄積されるエ
クスパンダーゼで形質転換されたホスト細胞（例えばペニシリウム・クリソゲヌ
ム）では、セファロスポリン系抗生物質（例えばアジピル−７−ＡＤＣＡ）の産
生は減少するのではなくむしろ増加する。これは、ミクロボディーに局在するこ
と以外は他の全ての特徴が類似しているエクスパンダーゼをコードするＤＮＡで
形質転換したホスト細胞と比較したときでもそのとおりである。

【００３１】 本発明はまた、本発明によって提供されるサイトゾル局在酵素をコードする改
変または選別リコンビナントＤＮＡフラグメントを含むホスト細胞またはホスト
生物（またはその子孫）を提供する。そのようなホスト生物は、例えば前記ホス
ト生物または前記ホスト生物の元の生物の形質転換の結果として、本発明によっ
て提供される改変酵素をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡフラグメント
（場合によって調節領域または配列を含む）を例えば取り込んでいる。そのよう
なホストは好ましくは、植物および微生物から成る群から選ばれ、好ましくはペ
ニシリウム・クリソゲヌム、アスペルギルス・ニデュランスまたはＡ．ニガー（
Aspergillus niger)およびセファロスポリウム・アクレモニウムから成る群から
選ばれる真菌である。

【００３２】 本発明はまた、本発明によって提供されるホスト細胞培養またはホスト生物を
提供する。そのような培養は、（天然に存在しない）側鎖をもつペニシリンを対
応する７−ＡＤＣＡ誘導体に拡張できる機能をもつエクスパンダーゼがもっぱら
サイトゾルで見出される細胞を含む。好ましい実施態様では、本発明は大規模醗
酵用培養を提供し、この場合、サイトゾルに局在する改変エクスパンダーゼは、
共通の起源をもつ野性型エクスパンダーゼを利用する同様な規模の醗酵培養の場
合よりも高いアジポイル−７−ＡＤＣＡ産生レベルをもたらす。

【００３３】 さらにまた別の実施態様では、本発明は、他のものから特に選択されたエクス
パンダーゼを含むホスト細胞およびその培養を遺伝子組換え技術によって提供す
る。前記エクスパンダーゼは同種系でミクロボディーに存在するか否かに関係な
く、異種ホストのサイトゾルにもっぱら局在するその能力または傾向のために他
のものから選択される。そのようなホスト細胞は、エクスパンダーゼをコードす
るＤＮＡフラグメントを含むホスト細胞を提供し、さらに前記エクスパンダーゼ
がもっぱらサイトゾルに局在するか否かを検査することによって選別することが
できる。好ましい実施態様では、前記酵素の分布についての検査は、本明細書の
実験の部で説明するように電子顕微鏡によって実施される。

【００３４】 本発明はまた、本発明によって提供される改変または選別された酵素をコード
する改変または選別されたＤＮＡフラグメントをもつホスト細胞または生物の製
造方法を提供する。本方法は、形質転換条件下で細胞を本発明によって提供され
るＤＮＡフラグメントと接触させ、さらに前記ＤＮＡを獲得した細胞を選別する
ことを含む。ホスト細胞、例えばＰ．クリソゲヌムまたは他の真菌の形質転換は
、一般に種々のＤＮＡ供給手段（例えばプロトプラストのＰＥＧ−Ｃａ仲介取り
込み、電気穿孔または粒子銃技術）および形質転換体の選別によて達成される。
例えば以下の文献を参照されたい：Van den Hondel en Punt, "Gene and Transf
er and Vector Development for Filamentous Fungi", in:Applied Molecular G
enetics of Fungi(Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridge Univer
sity Press(1991)。優性および非優性選別マーカーの適用は文献に記載されてい
る（Van den Hondel, 上掲書）。同種（Ｐ．クリソゲヌム由来）および異種（非
Ｐ．クリソゲヌム由来）起源の両選別マーカーが報告されている（Gouka et al.
, J. Biotechnol. 20:189-200(1991))。

【００３５】 形質転換体の選別における種々の形質転換体選別マーカーの利用については、
それらマーカーが同種であれ異種であれ、ベクター配列が存在しているものいな
いもの、非選別性ＤＮＡに物理的に連結されているものまたは連結されたいない
ものにかかわらず当業者には周知である。

【００３６】 本発明はまたエクスパンダーゼをコードするＤＮＡフラグメントをホスト細胞
で発現する方法を提供し、本方法では、前記ＤＮＡフラグメントは、もっぱらサ
イトゾルで産生されそこに局在するエクスパンダーゼを生じるエクスパンダーゼ
をコードする。本発明の好ましい実施態様では、そのような方法は、カルボキシ
末端のアミノ酸配列、好ましくはストレプトミセス・クラブリゲルスのエクスパ
ンダーゼで見出されるＳＫＡのようなトリペプチド配列をコードするヌクレオチ
ド配列中に改変を含む前記ＤＮＡフラグメントを提供することを含む。本発明に
よって提供されるそのような方法は、好ましくはホストとしてペニシリウム・ク
リソゲヌム細胞を使用して用いられる。

【００３７】 本発明はまた、β−ラクタム化合物の５員環を拡張して６員環セフェム化合物
を生成する方法を提供する。本方法は、前記β−ラクタム化合物を産生すること
ができるホストをそれを促進する条件下で増殖させ、前記ホストにリコンビナン
トの手段により異種エクスパンダーゼを発現させ、さらに前記β−ラクタム化合
物の５員環を拡張させて前記セフェム化合物を生成することを含み、前記エクス
パンダーゼは、ホスト細胞のサイトゾルで産生されるか、または少なくとも前記
サイトゾルにもっぱら局在するエクスパンダーゼをコードするように改変または
選別されたＤＮＡフラグメントから発現することを特徴とする。

【００３８】 好ましい実施態様では、本発明は、β−ラクタム化合物の５員環を改変エクス
パンダーゼによって拡張させる方法を提供する。本方法では、前記エクスパンダ
ーゼは、それをコードするＤＮＡフラグメントの改変（したがってミクロボディ
ー指向シグナルの改変）のためにホスト細胞のサイトゾルに局在し、好ましくは
、この場合、例えばストレプトミセス・クラブリゲルス由来のエクスパンダーゼ
から得られるようなトリペプチドアミノ酸配列を含む標的指向シグナルが改変さ
れている。

【００３９】 本明細書の実験の部では、本発明によって提供される方法の実施例が提供され
るが、この場合ホスト細胞はペニシリウム・クリソゲヌムである。 本発明の好ましい実施態様では、前記β−ラクタム化合物は、フェニルアセチ
ル−６−ＡＰＡ、フェノキシアセチル−６−ＡＰＡ、アルファ−アミノアジポイ
ル−６−ＡＰＡ、アジポイル−６−ＡＰＡ、グルタリル−６−ＡＰＡから成る群
、またはスベリル−６−ＡＰＡ、ピメリル−６−ＡＰＡ、トランス−β−ヒドロ
ムコニル−６−ＡＰＡまたはそれに匹敵する化合物から選ばれる方法が提供され
る。さらに、本発明はまたセファム化合物の製造方法を提供し、本方法は、本発
明のプロセスまたは方法で前記β−ラクタム化合物の５員（ペナム）環を拡張し
、さらにそのようにして生成されたセフェム化合物を回収する工程を含む。好ま
しい実施態様では、本発明は大規模醗酵用ホスト細胞培養でセフェム化合物を製
造する方法を提供する。本方法では、前記ホスト細胞のサイトゾルにもっぱら局
在するエクスパンダーゼが、もっぱらミクロボディーに局在する類似の起源のエ
クスパンダーゼ（野性型または改変型）を用いる対応する規模の醗酵培養によっ
てセフェム化合物を製造する場合よりも高いレベルのアジポイル−７−ＡＤＣＡ
製造に寄与する。

【００４０】課題を解決するための手段 ホスト細胞、例えばＰ．クリソゲヌムまたは他の真菌の形質転換は、一般に種
々のＤＮＡ供給手段（例えばプロトプラストのＰＥＧ−Ｃａ仲介取り込み、電気
穿孔、または粒子銃技術のようなもの）および形質転換体の選別によって達成で
きる。例えば以下の文献を参照されたい：Van den Hondel en Punt, "Gene and
Transfer and Vector Development for Filamentous Fungi", in: Applied Mole
cular Genetics of Fungi (Peberdy, Laten, Ogden, Bennett, eds.), Cambridg
e University Press(1991)。優性および非優性選別マーカーの利用については文
献に記載されている（Van den Hondel, 上掲書）。同種（Ｐ．クリソゲヌム由来
）および異種（非Ｐ．クリソゲヌム由来）起源の両選別マーカーは報告されてい
る（Gouka et al., J. Biotechnol. 20:189-200(1991))。 形質転換体の選別における種々の形質転換体選別マーカーの利用は、それらマ
ーカーが同種であれ異種であれ、ベクター配列が存在しているものいないもの、
非選別性ＤＮＡに物理的に連結されているものいないものにかかわらず周知であ
る。

【００４１】 改変または選別されたエクスパンダーゼ酵素によって仲介される環拡張反応は
、Ｐ．クリソゲノム、例えばウィスイコンシン５４−１２４４株（登録番号２８
０８９でＡＴＣＣに寄託）にこのようにして導入され発現される。β−ラクタム
の収量が改善されたＰ．クリソゲノムの他の株（ウィスコンシン５４−１２５５
株の変異体を含む）もまた適切である。 さらにまた、改変ｃｅｆＥ遺伝子は、真菌遺伝子の制御エレメントの転写及び
翻訳制御下に置かれる。これらのエレメントは、Ｐ．クリソゲノムＩＰＮＳまた
はｐｃｂＣ遺伝子、ｂ−チュブリン遺伝子、アスペルギルス・ニデュランスのｇ
ｐｄＡ遺伝子、またはアスペルギルス・ニガーのｇｌｃＡ遺伝子のようなクロー
ニングされた真菌遺伝子から入手できる。

【００４２】 本発明にしたがえば、β−ラクタム中間体アジポイル−７−ＡＤＣＡは、アジ
ピン酸またはその塩またはそのエステルを培地に添加することによって、エクス
パンダーゼ発現Ｐ．クリソゲノム形質転換体で産生される。適切な塩は、例えば
ナトリウム塩またはカリウム塩である。アジポイル−７−ＡＤＣＡは、例えば以
下のような簡単な溶媒抽出により培地から効率的に回収される： ブロスをろ過し、水に非混和性の有機溶媒をろ過物に添加する。水層からセフ
ァロスポリンを抽出するためにｐＨを調節する。ｐＨ範囲は４．５より下でなけ
ればならず、好ましくは４から１、より好ましくは２から１である。このように
して、セファロスポリンは醗酵ブロスに存在する多くの他の不純物から分離され
る。好ましくは小容量の有機溶媒を用いてより濃縮されたセファロスポリン溶液
が得られ、容量移動率を少なくすることができる。第二の可能性は、ｐＨ４また
はそれより下での全ブロスの抽出である。好ましくは、ブロスは水に非混和性の
有機溶媒を用いてｐＨ４から１で抽出される。

【００４３】 セファロスポリン分子と緩衝しないいずれの溶媒も用いることができる。例え
ば適切な溶媒はブチルアセテート、エチルアセテート、メチルイソブチルケトン
、ブタノールのようなアルコールなどである。好ましくは１−ブタノールまたは
イソブタノールが用いられる。 この後、セファロスポリンは、ｐＨ４から１０、好ましくは６から９で水で逆
抽出される。繰り返せば、最終容積は減少させることができる。回収は０から５
０℃で、好ましくは周囲温度で実施できる。 このようにして得られたセファロスポリン水溶液を、アジポイル側鎖を除去し
所望の７−ＡＤＣＡを得るために適切な酵素で処理する。

【００４４】 好ましくは、繰り返し酵素を利用することができるように固定酵素を用いる。
そのような粒子の製造方法および酵素の固定方法は、ＥＰ−Ａ−０２２２４６２
号で詳しく記載されている。水溶液のｐＨの値は例えばｐＨ４からｐＨ９であり
、そのｐＨではセファロスポリンの分解反応は最小限で酵素による所望の変換は
最適化される。したがって、ｐＨを適切なレベルで維持しながら、例えば無機塩
基（例えば水酸化カリウム溶液）を添加しながら、または陽イオン交換樹脂を利
用しながら酵素をセファロスポリン水溶液に添加する。反応が終了したとき、固
定酵素をろ過によって回収する。別の可能性は、流動または固定ベッドカラムで
の固定酵素の利用または、溶液中で酵素を使用し膜ろ過によって生成物を取り除
くものである。続いて反応混合物を水に非混和性の有機溶媒の存在下で酸性にす
る。

【００４５】 適切な酵素は、例えば６２、１７７、１７８および１７９位の１つまたは２つ
以上に変異を有する微生物シュードモナスＳＹ７７に由来する。他のシュードモ
ナス、好ましくはシュードモナスＳＥ８３（場合によってシュードモナスＳＹ７
７の６２、１７７、１７８および１７９位に対応する部位の１つまたは２つ以上
に変異を有する）に由来する酵素もまた用いることができる。 ｐＨを約０．１から１．５に調節した後、層を分離し水層のｐＨを２から５、
好ましくは３から４に調節する。結晶７−ＡＤＣＡを続いてろ過によって取り出
す。 脱アシル化はまた、当分野で知られているように、例えば五塩化リンを１０℃
より低い温度で続いてイソブタノールを周囲温度またはそれより低い温度で添加
してイミノクロリド側鎖を生成することによって化学的に実施できる。

【００４６】 以下の実施例は詳述のために提供され限定を意図するものではない。全体的ア
プローチは以下を含む：ｉ）標的指向特異性に必要とされるエクスパンダーゼの
残基の特定、ｉｉ）エクスパンダーゼ蛋白質の選別または変異エクスパンダーゼ
蛋白質の構築、ｉｉｉ）Ｐ．クリソゲヌム発現ベクターにおける変異体または選
別エクスパンダーゼ遺伝子のサブクローニングとＰ．クリソゲヌムにおけるエク
スパンダーゼの発現、ｉｖ）アジポイル−７−ＡＤＣＡ産生対α−Ｄ−アミノア
ジポイル−７−ＡＤＣＡおよびアジポイル−６−ＡＰＡ産生の測定。 アジポイル側鎖について開示したものと同様な態様で、当業者はまたＷＯ９５
／０４１４８およびＷＯ９５／０４１４９号に開示された方法で改変エクスパン
ダーゼ酵素を用いることができる（前述の文献では、３'−カルボキシメチルチ
オプロピオン酸および３，３'−チオジプロピオン酸を側鎖として用い、２−（
カルボキシエチルチオ）アセチル−７−ＡＤＣＡ並びに、３−（カルボキシメチ
ルチオ）プロピオニル−７−ＡＤＣＡおよび２−（カルボキシエチルチオ）アセ
チル−７−ＡＤＣＡの混合物がそれぞれ得られる）。

【００４７】実施例 実施例１：Ｓ．クラブリゲルスのｃｅｆＥ遺伝子の位置特異的突然変異 エクスパンダーゼ遺伝子の遺伝子操作に必要な技術は詳しく記載されている。
ＰＣＲ反応の鋳型として用いることができる供給源には、公共施設から入手可能
なストレプトミセス・クラブリゲルス株（例えばＡＴＣＣ２７０６４）由来の染
色体ＤＮＡ調製物、または発現カセット、例えばｐＺＥｘ（ＰＣＴ／ＥＰ９７／
０３８７９に記載）およびｐＩＳＥＷＡ（ＥＰ−０２８１２Ｐに記載）が含まれ
る。エクスパンダーゼ発現カセットｐＩＳＥＷＡ（図１）は、ＩＰＮＳプロモー
ターおよびＡＴターミネーターを含む野性型ストレプトミセス・クラブリゲルス
のエクスパンダーゼ遺伝子を含んでいる。エクスパンダーゼのペルオキシゾーム
指向を破壊するために、ＣｅｆＥのＣ−末端の配列をＳＫＡからＳＫＤに変異さ
せる。その目的のために、鋳型としてｐＩＳＥＷＡを用い、ＰＣＲ反応をプライ
マー１および２（表Ｉ参照）を用いて実施する。ＰＣＲは読み取り保証ポリメラ
ーゼを用いて実施する。変性工程（９８℃ ２分）の後、ｃｅｆＥ遺伝子の部分
を２５サイクルで増幅させ（９４℃ １．１５分、５５℃ ４５秒、７２℃ １
分）、続いて伸長工程（７２℃ ８分）を実施する。この反応生成物は、ｃｅｆ
ＥのＳｔｕＩ部位（翻訳開始部位から約４５０ｂｐ；例えば以下を参照されたい
："Cloning, characterisation, and expression in Escherichia coli of the
Streptomyces clavuligerus gene encoding desacetoxycephalosporin C synthe
tase", J. Bacteriol. 171:754-760(1989)）から終止コドンの下流のＮｓｉＩ部
位に及ぶ。ヌクレオチド配列決定によって前記配列を確認した後、ＳｔｕＩ−Ｎ
ｓｉＩフラグメントを用いてｐＩＳＥＷＡの"野性型"ｃｅｆＥフラグメントと交
換した。したがって、プラスミドｐＩＳＥＷＡ−ＳＫＤが作製される（図２）。

【００４８】 表Ｉ．変異エクスパンダーゼの構築で用いたプライマー プライマー１のＳｔｕＩ部位およびプライマーのＮｓｉＩ部位には下線が施さ
れている。プライマー 配列（５'から３'） １ ＧＡＧＧＣＣＴＴＣＣＴＣＧＡＣＴＧＣＧＡＧＣＣＧ ２ ＣＡＡＡＧＡＴＧＣＡＴＡＴＧＣＴＣＧＴＣＡＴＧＡＡＧＡＧＣＣＴ ＡＣＴＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＴＧＴＧＣＧＧＣＧ

【００４９】 実施例２：Ｐ．クリソゲヌム株の形質転換 Ｐ．クリソゲヌムのプロトプラストへのＤＮＡの移転に必要な技術は当分野で
周知で、以下を含む多くの参考文献に記載されている（Finkelstein & Ball(eds
.), Biotechnology of filamentous fungi, technology and products, Butterw
orth-Heinemann(1992); Bennett & Lasure(eds.), More Gene Manipulations in
fungi, Academic Press(1991); Turner, in: Pｕhler(ed), Biotechnology, se
cond completely revised edition, VHC(1992))。ＥＰ６３５５７４号に記載さ
れているように、Ｃａ−ＰＥＧ仲介プロトプラスト形質転換を用いる。したがっ
て前記構築物ｐＩＳＥＷＡおよびｐＩＳＥＷＡ−ＳＫＤをＰ．クリソゲヌムウィ
スコンシン５４−１２５５（ＡＴＣＣ２８０８９）にＧＢＧＬＡ２８（ＥＰ６３
５５７４号）との同時形質転換によって導入する。後者は、Ｐ．クリソゲヌム形
質転換菌が唯一の窒素供給源としてアセトアミドを含む選別培地で増殖するのを
可能にする。より好ましくは、ペニシリン産生により顕著な能力をもつ株が利用
される。その例は例えばＣＢＳ４５５．９５のような株である。

【００５０】 実施例３：選別；液体培地 形質転換菌は選別培地で繰り返し培養することによって精製される。ただ１つ
の安定なコロニーを用いて、バイオアッセイによるエクスパンダーゼ遺伝子の存
在についてさらにスクリーニングする。形質転換菌を寒天培地で増殖させる。大
腸菌（E. coli)ＥＳＳ２２３１を寒天重層で指示菌として使用する。この指示菌
もまた、当分野で周知の方法にしたがってペニシリンとセファロスポリン産生と
を識別することができるバクトペナーゼを含んでいる（前述の方法はさらに例え
ば以下の文献に記載されている：Guttiｅrez et al., Mol. Gen. Genet. 225:56
-64(1991)）。形質転換菌のｃｅｆＥ遺伝子の存在は、プライマー１および２（
表）を用いて染色体ＤＮＡについてＰＣＲによって確認される（例えばＷＯ９５
／０４１４９号に記載）。エクスパンダーゼ陽性形質転換菌は、例えばＷＯ９５
／０４１４９号に記載されているようにセファロスポリン産生能力についてさら
にスクリーニングするために選別される。形質転換菌は、例えば以下（ｇ／ｌ）
から成るシード培地に２＊１０⁶分生子／ｍｌで接種される：グルコース、３０
；（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、１０；ＫＨ₂ＰＯ₄、１０；微量元素溶液Ｉ（ＭｇＳＯ₄／７
Ｈ₂Ｏ、２５；ＦｅＳＯ₄／７Ｈ₂Ｏ、１０；ＣｕＳＯ₄／５Ｈ₂Ｏ、０．５；Ｚｎ
ＳＯ₄／７Ｈ₂Ｏ、２；Ｎａ₂ＳＯ₄、５０；ＭｎＳＯ₄／Ｈ₂Ｏ、２；ＣａＣｌ₂／
２Ｈ₂Ｏ、５）１０（ｍｌ／ｌ）（滅菌前ｐＨは６．５）。

【００５１】 シード培地を２５−３０℃で４８−７２時間保温し、続いて１０−２０容の生
産培地に接種するために使用する。生産培地は以下を含む（ｇ／ｌ）：ラクトー
ス、８０；ＣａＳＯ₄、４；尿素、３；ＭｇＳＯ₄／７Ｈ₂Ｏ、２；ＫＨ₂ＰＯ₄、
７；ＮａＣｌ、０．５；（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄、６；ＦｅＳｏ₄／７Ｈ₂Ｏ、０．１；
アジピン酸、２から５；微量元素溶液ＩＩ（ＣｕＳＯ₄／５Ｈ₂Ｏ、０．５；Ｚｎ
ＳＯ₄／７Ｈ₂Ｏ、２；ＭｎＳＯ₄／Ｈ₂Ｏ、２；Ｎａ₂ＳＯ₄、５０）１０（ｍｌ／
ｌ）（滅菌前ｐＨは５．５−６．０）。さらに保温を９６−１２０時間継続する
。アジポイル−７−ＡＤＣＡの産生について、よく増殖した培養の濾液をＨＰＬ
ＣおよびＮＭＲで分析する。図３に示すように、もっぱらサイトゾルに局在する
エクスパンダーゼをもつ形質転換菌は、ミクロボディーに局在するエクスパンダ
ーゼをもつ形質転換菌よりも性能は極めて良好である。

【００５２】 実施例４：エクスパンダーゼの分布 エクスパンダーゼのＣ−末端の変異がエクスパンダーゼのペルオキシゾームへ
の輸送の阻害をもたらすか否かを調べるために電子顕微鏡を用いた。文献の記載
にしたがって（Waterham et al., J. Cell Biol. 127:737-749(1994)）、サンプ
ルをグルタルアルデヒドで固定する。分布実験は、抗エクスパンダーゼポリクロ
ーナル抗体により免疫細胞化学を用いて実施される。図４は、エクスパンダーゼ
がもっぱらサイトゾルまたはミクロボディーに蓄積しているのを示している。

【００５３】 実施例５：より大規模でのエクスパンダーゼ変異体の性能 より大規模な醗酵での変異エクスパンダーゼを含む形質転換菌の性能を決定す
るために、両形質転換から更なる分析用菌株を選択する。したがって、野性型エ
クスパンダーゼ遺伝子による形質転換から選別された形質転換菌よりも１０％以
上のアジポイル−７−ＡＤＣＡを産生する変異エクスパンダーゼ形質転換菌が選
別される。菌株を１０Ｌの醗酵槽で増殖させたとき、もっぱらサイトゾルに局在
するエクスパンダーゼを含む培養のアジポイル−７−ＡＤＣＡ量は、もっぱらミ
クロボディーに局在するエクスパンダーゼをもつ醗酵物の場合よりも多い。した
がって、もっぱらサイトゾルに局在するエクスパンダーゼは安定な生産性を維持
するために明らかに十分に安定で、長期的または大規模醗酵における収量を改善
した。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１はプラスミドｐＩＳＥＷＡの模式図である。

【図２】 図２はプラスミドｐＩＳＥＷＡ−ＳＫＤの模式図である。

【図３】 図３は、プラスミドｐＩＳＥＷＡ（白棒）およびプラスミドｐＩＳＥＷＡ−Ｓ
ＫＤ（黒棒）による形質転換から得られた多数（約８０）の形質転換菌のアジポ
イル−７−ＡＤＣＡ生産性を示す。Ｘ軸：生産性等級（任意単位）；Ｙ軸；各等
級の形質転換菌の％。

【図４】 図４は、野性型エクスパンダーゼを発現している形質転換菌（パネルＡ）およ
び標的非指向シグナルをもつエクスパンダーゼを発現している形質転換菌（ＳＫ
Ａ−＞ＳＫＤ、パネルＢ）の電子顕微鏡写真である。金粒子はエクスパンダーゼ
の存在を示す。Ｎ：核、Ｍ：ミトコンドリア、Ｐ：ペルオキシゾーム（ミクロボ
ディー）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，Ｅ Ａ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ， ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，Ｇ Ｅ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ， ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ， ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，Ｚ Ａ，ＺＷ (72)発明者 ボーフェンベルフ ルーロフ アリー ラ ンス オランダ エヌエル−3062 ゼットデー ロッテルダム スフラーフェンウェッヒ 121 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA07 BA80 CA04 DA11 EA04 GA11 4B050 CC03 DD02 LL05 4B064 AH11 CA05 CA19 CA21 CB30 CC24 DA02 4B065 AA50Y AA58X AA60X AA62X AA68X AB01 CA27 CA34 CA44

Claims (23)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エクスパンダーゼをコードする単離ＤＮＡフラグメントであ
   って、ペニシリウム・クリソゲヌムで前記ＤＮＡフラグメントが発現された後、
   前記エクスパンダーゼが前記ホストのサイトゾルでもっぱら見出される前記単離
   ＤＮＡフラグメント。
2. 【請求項２】 Ｃ−末端のミクロボディー指向シグナルをコードするヌクレ
   オチド配列が改変されている請求項１に記載のＤＮＡフラグメント。
3. 【請求項３】 Ｃ−末端のトリペプチド配列Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする
   ヌクレオチド配列（式中Ｘ１はセリン、システインおよびアラニンから成る群か
   ら選ばれる１つのアミノ酸残基で、Ｘ２はリジン、ヒスチジンおよびアルギニン
   から成る群から選ばれる１つのアミノ酸残基で、さらにＸ３はロイシンまたはア
   ラニンである）が、前記エクスパンダーゼがホスト細胞での発現時にホスト細胞
   のミクロボディーに局在するのを実質的に妨げるように改変されている請求項２
   に記載のフラグメント。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡフラグメントがストレプトミセス・クラブリゲル
   スから得ることができる請求項３に記載のフラグメント。
5. 【請求項５】 Ｃ−末端のトリペプチド配列セリン−リジン−アラニンをコ
   ードするヌクレオチド配列が、ホスト細胞での発現時に前記エクスパンダーゼが
   ホスト細胞のミクロボディーに局在するのを実質的に妨げるように改変されてい
   る請求項４に記載のＤＮＡフラグメント。
6. 【請求項６】 Ｃ−末端のトリペプチド配列セリン−リジン−アラニンをコ
   ードするヌクレオチド配列が、トリペプチド配列セリン−リジン−アスパラギン
   酸をコードするヌクレオチド配列に改変されている請求項５に記載のＤＮＡフラ
   グメント。
7. 【請求項７】 さらに前記ＤＮＡの発現のための調節配列を含む、先行する
   請求項のいずれかに記載のＤＮＡフラグメント。
8. 【請求項８】 前記ホスト細胞が酵母または真菌のような微生物から選ばれ
   る請求項７に記載のＤＮＡフラグメント。
9. 【請求項９】 前記ホスト細胞がペニシリウム・クリソゲヌムである請求項
   ８に記載のＤＮＡフラグメント。
10. 【請求項１０】 場合によって原細胞の形質転換の結果として、かつ発現可
    能な形態で請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡフラグメントを取り込んで
    いるホスト細胞。
11. 【請求項１１】 微生物、好ましくは、ペニシリウム・クリソゲヌム、アス
    ペルギルス・ニデュランス、Ａ．ニガーおよびアクレモニウム・クリソゲヌムか
    ら成る群から選ばれる真菌から選ばれる請求項１０に記載のホスト細胞。
12. 【請求項１２】 前記ホストがペニシリウム・クリソゲヌムの株である請求
    項１１に記載のホスト。
13. 【請求項１３】 もっぱらサイトゾルに局在する機能的エクスパンダーゼを
    含む請求項１０から１２のいずれかに記載のホスト細胞。
14. 【請求項１４】 請求項１０から１３のいずれかに記載の細胞を含む培養。
15. 【請求項１５】 請求項１から９のいずれかに記載のＤＮＡと細胞を形質転
    換条件下で接触させ、さらに前記ＤＮＡを獲得した細胞を選別する工程を含む、
    請求項１０から１３のいずれかに記載のホスト細胞を製造する方法。
16. 【請求項１６】 さらに、エクスパンダーゼがサイトゾルにもっぱら局在す
    る細胞を選別することを含む請求項１５に記載のホスト細胞の製造方法。
17. 【請求項１７】 前記ホスト細胞がペニシリウム・クリソゲヌム細胞である
    請求項１６に記載の方法。
18. 【請求項１８】 ベータ−ラクタム化合物の５員環を拡張して６員環セフェ
    ム化合物を生成する方法であって、前記方法が、前記ベータ−ラクタム化合物の
    製造を促進する条件下で前記化合物を製造することができるホスト化合物を増殖
    させ、さらに、前記ベータ−ラクタム化合物の５員環を拡張することができる異
    種エクスパンダーゼをそれをコードするＤＮＡフラグメントから発現させ、それ
    によって前記６員環セフェム化合物を生成する工程を含み、ホスト細胞のサイト
    ゾルにもっぱら局在するエクスパンダーゼをコードするＤＮＡフラグメントから
    前記エクスパンダーゼが発現されることを特徴とする前記ベータ−ラクタム化合
    物の５員環拡張方法。
19. 【請求項１９】 前記エクスパンダーゼが、それをコードするＤＮＡフラグ
    メントの改変のためにサイトゾルにもっぱら局在し、したがってミクロボディー
    指向シグナルが改変されている請求項１８に記載の方法。
20. 【請求項２０】 前記エクスパンダーゼをコードするＤＮＡフラグメントが
    ストレプトミセス・クラブリゲルスから入手できる請求項１８または１９に記載
    の方法。
21. 【請求項２１】 前記ホストがペニシリウム・クリソゲヌムである請求項１
    ８から２０のいずれかに記載の方法。
22. 【請求項２２】 前記ベータ−ラクタム化合物が、フェニルアセチル−６−
    ＡＰＡ、フェノキシアセチル−６−ＡＰＡ、アルファ−アミノアジポイル−６−
    ＡＰＡ、アジポイル−６−ＡＰＡ、グルタリル−６−ＡＰＡ、スベリル−６−Ａ
    ＰＡ、ピメリル−６−ＡＰＡ、またはトランス−ｂ−ヒドロムコニル−６−ＡＰ
    Ａから成る群から選ばれる請求項１８から２２に記載の方法。
23. 【請求項２３】 請求項１８から２３のいずれかに記載の方法で前記ベータ
    −ラクタム化合物のペナム環を拡張し、さらにそのようにして生成されたセフェ
    ム化合物を回収する工程を含むセフェム化合物を製造する方法。