PT97116B - Processo para modular a producao de metabolitos secundarios nomeadamente derivados de beta-lactama - Google Patents

Description

CAMPO TÉCNICO

A presente invenção refere-se a um processo pa ra modular a produção de metabõlitos secundários, de que são exemplo as penicilinas e as cefalosporinas.

ENQUADRAMENTO GERAL

Os antibióticos de beta-lactaxna constituem uma larga família de metabõlitos secundários produzidos na Natureza por microrganismos. Os metabõlitos secundários são metabõlitos gue não têm função metabólica essencial no organismo produtor.

As classes mais importantes de antibióticos de beta-lactama, quer do ponto de vista clínico, quer do ponto de vista económico são as penicilinas (penam) e as cefalosporinas (cefem). A sua bi ossíntese ocorre por meio de uma via complexa de fases enzimãticas; o esclarecimento desta via foi objecto de muitos estudos du

rante as ultimas décadas. As primeiras duas fases da via biossin tética das classes de penam e de cefem de antibióticos de beta-lactama são idênticas. Em seguida, as vias biossintêticas das penicilinas e das cefalosporinas divergem (Figura 1).

A primeira fase da hiossíntese dos antibióticos de penicilina, cefalosporina e cefamicina ê a condensação dos isõmeros L de três aminoãcidos - ãcido L-alfa-amino-adípico, (A), L-cisteína, (C) e L-valina, (V) - com obtenção do tripêptido delta-(L-alfa-aminoadipil)-L-cisteinil-D-valina ou ACV.

Na segunda fase, o tripêptido ACV ê ciclizado por oxidação por acção da isopenicilina-N-sintase (daqui por diante, na presente memória descritiva, designada por IPNS) ou cielase. 0 produto desta reacção ê a isopenicilina N; este composto contém as estruturas típicas de beta-laetama e do anel de tiazolidina e possui actividade antibacteriana.

A partir da isopenicilina N, formam-se as peni cilinas G ou V por troca da cadeia lateral alfa-AAA hidrofílica por uma cadeia lateral hidrofóbica. As cadeias laterais vulgarmente utilizadas nos processos industriais são ãcido fenil-acetico (PA), que origina a penicilina G, ou ãcido fenoxi-acético (POA), que origina a penicilina V. 0 precursor da cadeia lateral in vitro tem de ser activado antes de ocorrer a trans-acilação; foi sugerido que esta activação in vivo ê catalisada pela PAA co enzima A ligase.

A reacção de troca é catalisada pela enzima aeil-transferase (daqui por diante, na presente memória descritiva, designada por AT).

A partir da isopenicilina N, a via para a cefalosporina e as cefamicinas prossegue por racemização da cadeia lateral alfa-AAA, formando a penicilina N. Esta reacção ê catali zada por uma enzima denominada epimerase ou racemase. 0 anel pen tagonal da penicilina N ê expandido com obtenção de um anel hexa gonal por acção da enzima desacetoxicefalosporina C sintase ou expandase. A enzima de fungos verificou-se também catalisar a re acção seguinte da via de síntese, a hidroxilação do grupo metilo na posição 3' do anel hexagonal, formando desacetilcefalosporina

C. Em Streptomycetes, esta última actividade de enzima ê codifi2

cada por um gene separado. A partir da desacetilcefalosporina C, forma-se a cefalosporina C, por acetilação da posição 3'. As cefamicinas são formadas a partir de desacetilcefalosporina C por diversas operações enzimãticas..

A maior parte das enzimas envolvidas na biossíntese das beta-lactamas foi atê agora caracterizada. Os genes de ACVS, IPNS e AT foram clonados e podem ser utilizados em programas de aperfeiçoamento de estirpes. No entanto, pouco se sabe acerca dos outros aspectos da biossíntese da penicilina, tais co mo localização das enzimas e o transporte de produtos intermediã rios e de produtos da via sintética.

No presente pedido de patente, a requerente descreve a localização da AT nas células de micêlio. Com base na localização das enzimas, apresentam-se métodos que permitem fazer a modulação da produção de metabõlitos secundários, tais como compostos de penam e de cefem.

LITERATURA RELEVANTE metabolismo secundário refere-se â produção de metabõlitos que não têm função metabólica essencial no organismo produtos. Para posterior definição e revisão, veja-se Industrial Aspects of Biochemistry¹¹, Vol. 30, parte 1, J. D. Bu' lock (1974), página 335, Ed. B. Spencer, North Holland/American Elsevier, Holanda e L. C. Vining, Biotchnology, um tratado com pleto em oito volumes, Vol. 4, páginas 20 a 38, H. J. Rehm e G. Reed (Ed.) 1986, VCH, Weinheim, Alemanha.

Em Ingolina e Queener, Med. Res. Rev. (1989), 9, 245 - 264, podem encontrar-se referências sobre as vias biossintéticas para obtenção das beta-lactamas.

A biossíntese da maior parte das proteínas celulares inicia-se no citoplasma. Com base na presença de sequências de aminoácidos específicos, estes são transportados para di ferentes compartimentos da célula. 0 tráfego mais importante nas vias de síntese de proteína ê descrito em Molecular Biology of • the Cell, 'Alberts e col. (Ed.'), 1989, Garland Publ., Inc., Nova . Iorque).

As enzimas ACVS, IPNS e AT foram purificadas. ACVS ê uma enzima multifuncional de grandes dimensões com um peso molecular aparente maior do que 250 quilodaltons (kDa) (Van Liempt e col., J. Biol. Chem. (1989), 264 : 3680 - 3684). A massa molecular aparente da IPNS ê de 39 kDa (Ramos e col., Antimicrohial Agents and Chemother. (1985) 27 : 380 - 387) . As prepara ções de enzima purificadas de AT contêm dois polipéptidos com massa moleculares aparentes de 29 e 10 kDa (veja-se Patente de Invenção Europeia Ep-A-336446). Os genes de ACVS, IPNS e AT foram clonados (Carr e col., Gene (1986), 48 : 41 - 75; Ep-A-3202 72, Ep-A-354624, Barredo e col., Gene (1989), 83 : 291 - 300).

O encadeamento dos três genes foi descrito em Ep-A-320727 e em Ep-A-357119. A PAA coenzima A ligase foi descrita por Brunner e Rohr, em Methods in Enzymology (1975), 53 : 476 - 481.

São as seguintes as referências relativas ã lo calização celular de enzimas envolvidas na biossíntese da penici lina).

Kurylowicz e col. sugeriram que a produção de penicilina tem lugar nas vesículas do complexo de Golgi (Kurylow icz e col., Zbl. Bakt. II Abt. (1979), 134 : 706 - 720; Atlas of Ultrastructure of Penicillium chrysogenum in Course of Biosynthe sis of Penlclllln, Kurylowicz e col. (Ed.), 1980, Chemia Publ. Office, Varsóvia; Kurylowicz e col., Archivum Immunologise et Therapeae Experimentalis (1987), 35 : 699 - 724).

Kurylowicz e col. (1987), supra, propuseram que a penicilina se produz nas vesículas de Golgi com 40 a 200 nm, depois do gue a penicilina ê transportada para o plasma da membrana pelas vesículas de 40 nm. Estas vesículas fundem-se sub sequentemente com a membrana do plasma e libertam o seu conteúdo para o caldo de fermentação.

Esta hipótese baseou-se em observações com microscópio electrónico que mostram que a penicilina G se acumula no interior de sub-estruturas compostas por pequenas vesículas ou em vesículas únicas no micêlio de uma estirpe que origina ele vados rendimentos.

Além disso, Kurylowicz e col. (1987), supra, descrevem experiências de fraccionamento de células, a partir das quais eles afirmam que as actividades de ACVS, IPNS, PAA-CoA -ligase e AT estão presentes nas vesículas de Golgi com tamanhos compreendidos entre 40 e 200 nm. Depois da imobilização das vesí cuias com tamanhos de 40 a 200 nm, demonstrou-se a hiossíntese da penicilina livre de células. No entanto, a evidência e a interpretação quanto â localização das enzimas de hiossíntese da penicilina nas vesículas do complexo de Golgi não é muito convin cente visto que (1) o método clássico de seccionamento fino que eles utilizaram para preparar amostras para observação por micro scopia electrônica pode introduzir facilmente artefactos na ultra estrutura e na sua localização (Cryotechniques in Biological Electron Microscopy, Knoll e col., páginas 258 - 271, R. A. Stein brecht e K. Zierold (Ed.), 1987, Springer Verlag, Berlim; e Plat tner e Zingsheim, Subcellular Biochemistry, Vol. 9, páginas 1 235, D. B. Roodyn (Ed.), 1983, Plenum Press, Nova Iorque; e (2) as fracções obtidas nas experiências de fraccionamento das células não foram caracterizadas por enzimas marcadoras e microscopia electrônica.

A localização das enzimas da hiossíntese da pe nicilina foi estudada por alguns outros grupos de investigadores. A ACVS foi referida como estando exclusivamente associada com uma fracção de partículas do produto homogeneizado bruto do micê lio (Fawcett e Abraham, Methods Enzymol. (1975), 43 : 471 - 473; Fawcet e Abraham, Biosynthesis (1976), 4 : 248 - 265), que indica que ela pode estar associada com as membranas celulares.

Existem dados controversos quanto à localização da IPNS em Cephalosporium : Abraham e col. (Recent Advances in the Ghemistry of Beta-Lactam Antibiotics, páginas 125 - 134,

G. I. Gregory (Ed.), 1981, Royal Society of Chemistry, Londres) descrevem-na como uma enzima citossólica visto que não precipita por centrifugação a alta velocidade. No entanto, Sawada e col., Antimicrobial Agents Chemother (1980), 18 : 465 - 470) demonstra ram que a actividade de IPNS foi estimulada por ultra-sons e por adição de detergente, o que indica que a enzima está encerrada em vesículas. Luengo e col. mostraram (num trabalho apresentado no 29 Eur. Congr. Biotechnol., Eastbourne, Inglaterra, 1981) que a reacção de troca da cadeia lateral se confina ao espaço periplásmico, Este facto não foi confirmado até hoje. A localização

das enzimas biossintéticas na cefalosporina não foi descrita por menorizadamente.

Para uma revisão da ultra estrutura dos micêlios de fungos, veja-se The Fllamentous Fungi, Volumes 1-4, Smith e Berry (Ed.), 1979, Academic Press, Londres.

Outras referências relativas aos compartimentos dentro do micèlio de fungos incluem as seguintes : Markham e Collinge, FEMS Mlcroblology Reviews (1987), 46 £ 1 - 11; Head e col., Experimental Mycology, 1989, 13 ; 203 - 211; Smith e Berry, supra; Gooday em Fungai Differentiation, a Contemporary Synthesis, Mycology series,paginas 315 - 365 (1983) , J. E. Smith e P. A. Lenke (Ed.), Mareei Dekker, Nova Iorque).

Para rever artigos sobre vacúolos. veja-se Molecular Biology of the Cell (supra)e Kurylowicz e col. (1980, su pra). Os organelos que podem ser encontrados em todos os tipos de células eucariôticas são os núcleos, mitocôndrios, retículo endoplãsmico, complexo de Golgi e microcorpos; para a revisão, veja-se Molecular Biology of the Cell (supra) e Smith e Berry (supra)

Os microcorpos são organelos com uma única mem brana. Exemplos de enzimas contidas em microcorpos incluem as que estão envolvidas.na oxidação beta de ácidos gordos (Borst, Biochimica et Biophysica Acta, 1989, 1008 : 1 - 13). Os microcor pos podem conter catalase. Neste caso, são muitas vezes designados por peroxissomas. Os microcorpos podem também conter enzimas do ciclo de glioxilato. Então, são muitas vezes designados por glioxissomas. Os microcorpos podem adaptar-se a alterações nas condições metabólicas por modificação do teor de enzima. Nas células dos fungos, o seu tamanho varia entre 0,2 e 2,6 micrómetro (Maxwell e col., Planta (1975), 124 : 109 - 123). Referências aos sinais de alvo de proteínas para os microcorpos podem encontrar-se em Gould e col., J. Cell Biol. (1989), 108 : 1657 - 1664

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Fornecem-se métodos e composições para utiliza çâo para modular a produção de metabõlitos secundários. Estes me todos incluem as operações de

- Modulação do numero e/ou do tamanho de organelos, preferivelmente, microcorpos, num microrganismo hospedeiro por, pelo me nos, uma das operações gue consistem em * alterar a expressão de uma proteína presente nos referidos organelos; e/ou * interferir nos organismos de controlo celular para a maturação ou para a fissão dos referidos organelos; e/ou * fazer contactar o microrganismo com agentes capazes de regular o número e/ou o tamanho dos organelos; ou modulação da localização celular de pelo menos uma proteína, opcionalmente derivada de outro microrganismo, directa ou indirectamente envolvida na produção dos citados metabõlitos se cundãrios por adição, eliminação ou alteração de uma ou mais sequências de ADN que codificam um ou mais sinais alvo do gene ou genes de uma ou mais das referidas proteínas.

A presente invenção ê utilizada particularmente na modulação da produção de penicilinas e cefalosporinas.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra esquematicamente a via biossintêtica para a preparação de antibióticos de beta-lactama.

A Figura 2 mostra a detecção de AT por marcação com imuno-oiro num organelo do citoplasma das células de Wis consin 54-1255.

A Figura 3 representa (a) célula de hifa de tenra idade com microcorpos marcados com oiro (pontas das setas) ; ampliações maiores dos microcorpos estão representadas ã direi ta; (b) célula de hifa velha que possui um grande vacúolo, um nú

cleo e um microcorpo marcado com oiro (ponta da seta); na parte inferior está representada uma maior ampliação do microcorpo.

A Figura 4 representa manchas de imunidade de fracções de célula, manchadas com anti-soros contra ACVS, IPNS e AT; os marcadores de massas moleculares estão indicados â esquer da; as bandas que correspondem a ACVS, IPNS e AT estão indicadas com uma seta.

A Figura 5 é uma representação esquemática de pMA-AT.

A Figura 6 ê uma representação esquemática de pMC-AT.

A Figura 7 ê uma representação esquemática das mutações introduzidas no gene penDE. A sequência de nucleôtidos de oligonucleòtidos S (Oli S) e de oligonucleòtidos D (Oli D) e uma sequência parcial de nucleôtidos do penDE são também representadas, assim como a sequência de aminoácidos (no código de uma letra) deduzidos das sequências de ADN.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO ESPECIFICAS

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se processos e composições que permitem a modulação de metabòlitos secundários. Os processos baseiam-se no conhecimento da localização das proteínas envolvidas na produção.de metabòlitos secundários.

termo modulação dentro do contexto do presente pedido de patente, pretende compreender todas as maneiras concebíveis de alterar, por exemplo, reforçar, criar, diminuir ou destruir. A localização refere-se tanto a uma localização específica como ao processo de dirigir para uma localização especí fica dentro da célula.

Os processos para modular a produção de metabòlitos secundários em microrganismos incluem os seguintes : o numero e/ôu o tamanho de um organelo particular pode ser modulado em comparação com o microrganismo original, por exemplo, alte rando a expressão de qualquer proteína presente num organelo par ticular; interferindo nos mecanismos de controlo celular, por exemplo, para maturação ou a fissão de um organelo particular; e

contactando o microrganismo hospedeiro com compostos que modulam o número e/ou o tamanho do referido organelo particular.

As vantagens associadas a estes processos incluem a eliminação de fases potencialmente limitativas no percur so da biossíntese de um metabôlito secundário. Por exemplo, a quantidade de proteínas envolvidas na produção de um metabôlito secundário pode ser limitada pela capacidade dos organelos para conter ou para receber estas proteínas. Aumentando o tamanho ou o número dos organelos, estas limitações podem ser ultrapassadas

As proteínas podem estar directamente ou indirectamente envolvidas na produção do mencionado metabôlito secun dãrio. As proteínas directamente envolvidas são enzimas essenciais nas vias biossintéticaspara os citados metabõlitos secundários, tais como, por exemplo, enzimas biossintéticas da penicili na. As proteínas que são indirectamente envolvidas na produção de metabõlitos secundários são aquelas cuja expressão e/ou cuja actividade têm influência sobre a produção dos referidos metabõlitos secundários. Estas proteínas são, por exemplo, envolvidas na manutenção das condições apropriadas para a produção dos refe ridos metabõlitos secundários, tais como o pH e a disponibilidade de ATP oú estão envolvidas no transporte de proteínas ou subs tratos e produtos que pertencem ao processo biossintêtico.

Os processos para modular a produção de metabõlitos secundários incluem também a modulação da localização ce lúlar de uma ou mais proteínas que estão directa ou indirectamente envolvidas na produção de um metabôlito secundário particu lar, adicicnandc, eliminando ou alterando a sequência de ADN que codifica (a) o sinal ou os sinais de alvo de uma ou mais das citadas proteínas. Um sinal de alvo ê definido na presente memõria descritiva como as sequências de ãminoácidos num polipêptido que fazem com que o polipêptido fique localizado num dos organelos da célula. Esta definição também inclui sinais de retenção, por exemplo, sequências de aminoácidos que fazem com que a proteína fique localizada no retículo endoplásmico.

As vantagens associadas com estes processos incluem as seguintes. Pode conseguir-se o melhoramento da produ ção de metabõlitos secundários alterando o processo de biossín9

tese de tal maneira que produtos intermediários não tenham de ser transportados de uma localização celular para outra. Consegue-se isto colocalizando duas ou mais enzimas envolvidas na pro dução de um metabõlito secundário no citoplasma ou num organelo particular.

Uma outra vantagem consiste na criação de uma via que conduza a um metabõlito secundário particular que não se encontra naturalmente num microrganismo particular. Isto pode conseguir-se proporcionando uma ou mais proteínas directa ou indirectamente envolvidas na biossíntese do referido metabõlito se cundãrio, proteínas estas que, na Natureza, não estão presentes no mencionado organismo, com um sinal de alvo para organelos que contêm um substrato para uma das enzimas envolvidas na produção do metabõlito secundário e clonando estas proteínas no citado microrganismo.

A produção de um metabõlito secundário pode também ser melhorada ou facilitada pela utilização de um organis mo que, na Natureza, não é apropriado para produzir este metabõlito. Consegue-se isto proporcionando uma ou mais proteínas directa ou indirectamente envolvidas na produção do referido metabõlito secundário com um sinal de alvo para um organelo particular e clonando estas proteínas no mencionado microrganismo.

Ainda uma outra vantagem é a utilização de genes que codificam enzimas que não têm sinais de alvejamento, tais como, por exemplo, enzimas de bactérias para o aperfeiçoamento de estirpes de microrganismos eucariõticos envolvidos na produção de um metabõlito secundário particular, proporcionando estas enzimas com um sinal de alvo para um organelo que está envolvido na produção do citado metabõlito secundário e clonando o gene alterado no microrganismo.

Outras vantagens são o aperfeiçoamento da produção de um metabõlito secundário proporcionando proteínas direc ta ou indirectamente envolvidas na sua biossíntese com um sinal de alvo alterado, o que tem como resultado o aumento maior ou di minuido da quantidade de proteína no organelo ou nos organelos envolvidos na produção. 0 aperfeiçoamento da produção de um meta bõlito secundário pode também ser obtido por eliminação ou por adição de um sinal de alvo a ou de uma ou mais proteínas directa

ou indirectamente envolvidas na produção do referido metabôlito secundário para remover ou adicionar a proteína ao ou de um organelo envolvido na produção do citado metabôlito secundário.

Os metabólitos secundários incluem metabõlitos tais como os que derivam de sacãridos, por exemplo, ácido cójico os que derivam de aminoácidos, tais como compostos de beta-lacta ma e alcaloides, os derivados de precursores de acilo, tais como carotenôides ou policetidos, aqueles com uma relação com ácidos nucleicos e os de biogénese mista, tais como a família da prodigiosina de pigmentos e ácidos flúor-acéticos.

Para determinar a localização celular das proteínas relacionadas com a produção de um metabôlito secundário de interesse, a ultra-estrutura de uma célula que sintetiza o me tabôlito secundário ê visualisada a nível microscópico, preferivelmente, a nívél do microscópio electrónico.

As técnicas utilizadas para preparar as amostras devem conseguir a preservação óptima das estruturas celulares naturais durante o corte em finas camadas, como se obtêm, por exemplo, por congelação rápida e substituição em congelação; para revisão, veja-se Immunogold Labelling in Cell Biology, A.J. Verkley e J. L. M. Leunissen (Ed.) CRC Press, Boca Raton, Florida (1989). As proteínas são localizadas, por exemplo, por métodos citoquímiGOS, más preferivelmente por métodos imunocitoquími cos, por exemplo, pelo método de marcação com a proteína A/oiro. Um método que pode confirmar a localização celular das proteínas é o fraccionamento de células. Para a descrição deste método, ve ja-se Cell Biology, a Molecular Approach, R.D. Dyson, 1978; e Bi õlógical Membranes, a Practical Approach, Findlay e Evans (Ed.), 1987, IRL Press, Oxford.

Os organelos podem ser parcialmente separados por experiências de fraccionamento de eâlulas. As células são suavemente rompidas e o produto homogéneo assim obtido ê submetido a operações de centrifugação com uma velocidade crescente. Os organelos têm velocidades de sedimentação diferentes. Nas experiências típicas com células de origem animal, os núcleos e as * ~ 2 células nao rompidas sedimentam a 6.12 g x 10 minutos, os mito* 3 cóndrios, os microcorpos e os lisossomas sedimentam a 15.10 g x «r - 3 x 5 minutos e o retículo endoplasmico sedimenta a 100.10 g x 60 minutos. O sobrenadante restante ê a porção solúvel do citoplasma, o citossol (Cell Biology, a Molecular Approach, supra). O fraccionamento com êxito dos organelos depende muito da cuidadosa ruptura das células. Especialmente’a integridade dos microcor pos ê facilmente afectada pela lise das células (Kionka e col., J. Bacteriology (1985), 161 : 153 - 157).

A presença das proteínas de interesse mais nas fracções celulares pode ser determinada, por exemplo se a proteí na fôr uma enzima, por um ensaio de actividade ou por manchamento imune. A localização celular das enzimas relacionadas com a produção de metabôlitos secundários de interesse ê também deduzida do alinhamento das sequências de nucleótidos do gene que co difica a enzima para as sequências de consenço de sinais de alvo.

Uma vez que o envolvimento de um organelo particular na produção de um metabõlito secundário tenha sido demonstrado, o organismo hospedeiro pode ser selectivamente manipulado a fim de aumentar a produção do metabõlito secundário de interesse. O número e ou o tamanho de um organelo particular pode ser modulado em comparação com o microrganismo original. Isto pode realizar-se, por exemplo, alterando a expressão de qualquer proteína presente no citado organelo. Uma proteína que está presente num organelo particular pode ser identificada por meio dos métodos acima descritos.

Subsequentemente, a expressão de uma proteína pode ser alterada por diversas formas ou tentativas. Por exemplo o número de cópias funcionais do gene pode ser aumentado por amplificação do gene ou diminuído por disrupção do gene, preferivelmente por transformação das cópias clonadas do gene. A expres são de uma proteína pode também ser alterada empregando transcri tos em sentido oposto que interferem na translação do mARN, ou por manipulação dos sinais de expressão do gene.

Os sinais de expressão são definidos na presen te memória descritiva como os sinais necessários â iniciação e â terminação da transcrição e os sinais necessários â iniciação é â terminação da translação. A manipulação dos sinais de expres são pode ser conseguida por alterações mínimas nos sinais de ex12

pressão autênticos, mas inclui também a possibilidade da expressão da proteína usando sinais de expressão de outros genes.

Outro método para modular o número e/ou o tamanho de um organelo particular consiste em alterar a expressão de um ou mais genes que codificam uma ou mais proteínas que regu lam o número e/ou o tamanho de um organelo particular de acordo com os métodos acima descritos. Finalmente, o número e/ou o tama nho de um organelo pode ser alterado fazendo contactar o microrganismo com um composto que modula o número e/ou o tamanho do re ferido organelo particular.

Os compostos que modulam o número e/ou o tamanho do referido organelo particular são, por exemplo, compostos que são metabolicamente processados nesse organelo. Por exemplo, em Saccharomyces cerevisiae, a proliferação de microcorpos ê pro vocada por desenvolvimento em oleato (Borst, supra). Se a produção de um metabólito secundário está localizada no organelo que ê induzido pela presença do citado composto, o produto do referi do metabólito secundário ê aumentado.

A seguir à modulação do número e/ou do tamanho de um organelo particular, o organismo hospedeiro pode ser selec tivamente manipulado por técnicas que originam alterações na localização das proteínas ao ou de um organelo. As técnicas serão descritas em termos de alteração de uma localização celular para um ou de um microcorpo, mas podem ser substituídos quaisquer organelos. A localização das proteínas, directa ou indirectamente envolvidas na produção de metabõlitos secundários, pode ser alterada ou a partir da localização natural no microcorpo para outras localizações na célula ou da localização natural de outras partes da célula diferentes de microcorpos para o microcorpo por adição, supressão ou alteração da sequência de ADN que codifica o sinal de alvo do microcorpo da mencionada proteína.

Os sinais de alvo para microcorpos são, por exemplo, a sequência de tripêptidos conservada descrita por Goul d (supra). Os método também se aplicam a outras sequências de aminoãcidos que são envolvidas na sinalização de proteínas para micrócorpos. As sequências envolvidas na marcação do sinal podem ser identificadas, por exemplo, pelos métodos descritos por Goul d (supra) ou comparando as sequências de aminoácidos dos genes

com sequências de consenso para sinais de determinação do alvo.

As sequências de alvo de microcorpos podem ser alteradas, removidas ou adicionadas a proteínas por mutagénese dirigida ao sítio do gene que codifica a proteína de interesse. Técnicas e estratégias para conseguir a mutagénese dirigida ao sítio estão abundantemente disponíveis, são bem conhecidas na técnica e bem documentadas (Smith, Annual Review of Genetics (1985), 19 : 423 - 462; Molecular Cloning ; a Laboratory Manual, Maniatis e col. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press,

Cold Spring Harbor; Μ. A. Innes, D. H. Gelfand, J. J. Sninsky e T. J. White (Ed.), PCR Protocols : a Gulde to Methods and Applications (1990), Academic Press, San Diego).

Aplicam-se preferivelmente dois métodos de aproximação mais importantes. Basicamente, um dos métodos emprega o isolamento de ADN de cordão único (ss) de um plasmídeo contendo o gene de interesse, recosendõ este ADN ss com um oligonucleõtido sintético que contêm a mutação e sintetizando in vitro par te do cordão complementar. O ADN duplo ê transformado em E. coli e escolhem-se moléculas de plasmídeo mutante de cordão duplo (d s) tipicamente por hibridização com o oligonucleõtido mutante.

Um outro método importante emprega a reacção em cadeia de polimerase (PCR). Neste método, as mutações pretendidas são também concebidas em oligonucleõtidos sintéticos, mas, ao contrário do primeiro método, não ê necessário clonar o gene de interesse em primeiro lugar.

sinal pode ser proporcionado na parte da extremidade C do polipéptido ou nas regiões internas. As manipulações incluem a remoção de um ou de vários sinais de alvo de uma proteína para organelos diferentes dé microcorpos e a adição de um ou vários sinais de alvo para os microcorpos; a adição de um sinal dè alvo de um microcorpo para uma proteína que não tem ou tros sinais de alvo; a remoção, a alteração ou a destruição de um sinal de alvo para um microcorpo; ou a troca de um sinal de alvo para um microcorpo por outro.

Seguidamente, descreve-se um exemplo da utilização dos métodos acima referidos na produção de compostos de be ta-lactama,'

A localizaçao de AT foi investigada por micros copia electrõnica de imunidade. AT estava presente em vesículas com membrana única com um diâmetro compreendido entre 200 e 800 nm. As vesículas que contêm AT encontravam-se presentes em células novas e nos compartimentos mais velhos das hifas. Com base na morfologia, tamanho e distribuição através das hifas, estas vesículas podem ser classificadas como microcorpos. Nas experiên cias de fraccionamento de células, a actividade de AT separou-se 3 a 15.10 g x 30 minutos juntamente com a actividade de enzimas dos mitocôndrias e dos vacúolos. Nesta fracção também foi encontrada actividade de catalase. A actividade de IPNS localiza-se numa fracção que corresponde às enzimas citossôlicas. Estes resultados foram confirmados por experiências de imuno-manchamento. Alêm disso, verificou-se nestas experiências que ACVS fica localizada ainda noutra fracçao celular que sedimenta a 100.10 g x 60 minutos. Este facto demonstra que uma das fases da biossíntese da penicilina esta localizada em microcorpos. Comparando as estirpes com capacidade de elevado rendimento com as estirpes com capacidade de pequeno rendimento na produção de penicilina, verificou-se a existência de uma correlação íntima entre o número de microcorpos que contêm AT e a quantidade de penicilina. Alêm disso, o número de microcorpos que contêm AT em estirpes de elevado rendimento foi reduzido em condições de produção de não penicilina. Estes exemplos indicam que a modulação do número e/ /ou do tamanho dos microcorpos contendo AT constitui um meio importante para aumentar a produção de penicilina.

As experiências de localização levadas a efeito pela Requerente demonstram ainda que IPNS não se encontra pre sente nos citados microcorpos. Isto implica que os substratos e os produtos de enzimas envolvidos na produção de compostos de be ta-lactama e situados nos microcorpos, por exemplo, substratos da enzima AT, tais como isopenicilina N e pAA ou pAA activada, e produtos tais como penicilina G e ácido alfa-aminoadípico, devem ser transportados para dentro dos referidos microcorpos ou retirados para fora dos mencionados microcorpos. Estee sistemas de importação e de exportação fazem parte dos microcorpos envolvi• dos na produção de penicilina. Elez constituem também uma parte - integrante da via biossintética da penicilina e podem assim ser

responsáveis pela fase de limitação da velocidade dentro da via biossintética. Manipulando a expressão destes sistemas, por exem pio, introduzindo cópias extra dos genes que codificam estes si£ temas ou aumentando o numero e/ou o tamanho dos microcorpos que contêm AT, melhora-se a eficiência de produção de penicilina.

Ê um exemplo da capacidade de influenciar a produção de anticorpos de beta-laetama alterando a localização de uma ou mais proteínas envolvidas na biossíntese de beta-lacta ma, a alteração da localização de AT. A AT. contêm a sequência terminal C, ARL (A = alanina, R = arginina e L = leucina; ARL ê uma das sequências que servem de alvo do microcorpo mencionadas por Gould (supra).

sinal de alvo de ARL foi suprimido do gene que codifica AT, seguindo-se a clonação do gene alterado em P. chrysogenum. AT foi expressa nos transformantes e o extracto isento de células preparado a partir dos transformantes era activo de acordo com o ensaio de actividade de AT. Os transformantes não produziram penicilina em quantidades detectãveis, o que prova que ê possível influenciar a produção de antibióticos de beta -lactama modificando a localização de AT. Nesta experiência, o estabelecimento da enzima envolvida na activação do precursor da cadeia lateral não foi relocalizado, o que pode explicar a razão pela qual a eolocalização de IPNS e de AT não teve como resultado a produção melhorada.

Um outro exemplo da aplicação do processo da presente invenção ê a adição de um sinal de alvo para um organelo específico em relação âs enzimas biossintêticas de beta-lactama de organismos procarióticos. Essas enzimas podem ter uma me lhor estabilidade ou uma mãior actividade ou uma gama de substra tos mais larga do que as enzimas com actividade semelhante prove nientes de organismos eucariõticos. Os genes procarióticos não codificam geralmente sinais que servem de alvo para organelos eu cariõticos. Adicionando um sinal de alvo â enzima procariõtica, esta enzima pode ser dirigida para uma localização pretendida na célula. As enzimas podem ser obtidas a partir de organismos pro cariõticos, preferivelmente a partir de espécies de Streptomyces , Nocardia e Flavobacterium.

É ainda outro exemplo a produção de compostos de beta-lactama que não são naturalmente produzidos num organismo particular mas que serão produzidos depois da introdução de genes que codificam as proteínas envolvidas na biossintese dos citados compostos de beta-lactama. Por exemplo, os genes biossin têticos da cefalosporina não estão presentes nas estirpes de Penicillium. A produção de cefalosporinas (como, por exemplo, eefa losporina C, os seus derivados de desacetilo ou de desacetoxi, ãcido 7-amino-cefalosporânico, os seus derivados de desacetilo óu de desacetoxi, as cefamicinasj em Penicillium poderá ser vantajosa, por exemplo, quando se utilizam estirpes que produzem ca racterísticas melhoradas de crescimento ou de processamento a ju sante ou quando se usam estirpes que produzem elevadas quantida des de isopenicilina N.

A maior parte da isopenicilina N que ê formada por IPNS é transportada para os referidos microcorpos. A epimera se, que ê uma enzima envolvida na biossintese de cefalosporina e os mencionados intermediários têm isopenicilina N como substra to. Impedindo a expressão de AT em P. chrysogenum, por exemplo, por disrupção de genes do gene penDE, por aplicação de tecnologia de sentido contrário ou por uso de mutantes que não expresse mAT e por localização da epimerase e, preferivelmente, das enzimas biossintéticas da cefalosporina subsequentes, tais como expandase e hidroxilase, por exemplo, de Acremonium chrysogenum ou de estirpes de Streptomyces, nos citados microcorpos, melhora-se a eficiência de produção de cefalosporina ou dos referidos inter mediãrios em P. chrysogenum.

De acordo com a presente invenção, também são proporcionados os genes que codificam as proteínas em que a sequência de ADN foi alterada como se descreveu ãcima e os constru tos de ADN que compreendem os citados genes.

Preferivelmente a produção de metabõlitos secun dârios de acordo com o método acima indicado de modulação do número e/ou do tamanho dos organelos, preferivelmente, dos microcorpos, ou a modulação da localização celular de uma ou mais das proteínas., ê realizada em microrganismos eucariõticos, mais pre. ferivelmente em Penicillium chrysogenumz Acremonium chrysogenum 1 ou Aspergillus nidulans.

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Α produção pode também realizar-se num microrganismo gue, de acordo com a sua natureza, não ê capaz de produ zir os citados metabõlitos secundáriospor exemplo, a produção de penicilinas por colocalização de AT, IPNS e ACVS em microcorpos dos referidos microrganismos, como por exemplo levedura.

Além disso, de acordo com a presente invenção proporciona-se também um microrganismo eucariótico, preferivelmente, P. chrysogenum, A. chrysogenum ou A. nidulans, em que o número ou o tamanho dos organelos acima indicados, preferivelmen te microcorpos, ou a localização celular de uma ou mais proteínas foi modulada por qualquer dos métodos acima referidos. Estas proteínas podem ser originadas a partir de organismos eucarioticos, tais como espécies de Penicillium, Acremonium e Aspergillus ou de organismos procariõticos, tais como espécies de Streptomyces e Flavobacterium.

Os microcorpos envolvidos na produção de antibióticos de beta-lactama podem ser isolados. Osmicrocorpos acima indicados podem ser isolados depois do fraccionamento das células e podem ser utilizados na síntese in vitro de metabõlitos se eundãrios, tais como compostos de beta-lactama, por exemplo, de penicilina G/V a partir de isopenicilina N.

Os seguintes Exemplos ilustram ainda mais a presente invenção.

TÉCNICA EXPERIMENTAL

Depósitos Microbiolõgicos

As estirpes mutantes npe6 e npelO, ambas obtidas a partir de Wisconsin 54-1255, foram depositadas no Centraal Bureau voor Schimmelcultures, Oosterstraat 1, 3742 SK Baarn, Holanda. A estirpe npelO foi depositada em 13 de Março de 1990 sob o número de acesso CBS 143.90. A estirpe npe6 foi depositada em 19 de Fevereiro de 1991, sob o número de acesso CBS 117.91.

Procedimentos Gerais

A. Preparação e Caracterização de Anticorpos contra AT, ACVS e e IPNS

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Anticorpos contra AT

A purificação de aciltransferase fez-se essencialmente como foi descrito por Alavarez, com modificações mínimas (Alvarez (1987), supra) Cultivou-se Penicillium chrysogenum em meio de produção como se descreve em EP-A-354624, Rompeu-se o micêlio congelando-o em azoto líquido e esmagou-se num almofariz Utilizou-se a fracção de sulfato de amónio 0 a 45% para posterior purificação.

Depois da purificação, obteve-se uma preparação que continha dois polipêptidos mais importantes com massas moleculares aparentes de 29 kDa e de 10 kDa. Ambos os polipêptidos são produtos do gene AT determinado por comparação da sequên cia de aminoacidos da extremidade N das bandas com a sequência de nucleótidos do gene pelos mesmos processos descritos por Barredo e col. (1989), supra.

Para se obter polipêptidos puros para fins de imunização, realizou-se um ensaio de electroforese em gel de poli-acrilamida com dodecil-sulfato de sódio (SDS-PAGE), como ê descrito por Laemmli, Nature (1970), 227 : 680. A banda de 29 kDa foi cortada do gel de SDS-PA e congelada. O material seco por congelação foi triturado em almofariz e subsequentemente res_ suspenso em NaCl a 0,9%. A suspensão foi misturada com o sistema adjuvante (Ribi Immunochem Research, Hamilton, Montana, Estados Unidos da America). Imunizaram-se coelhos subcutaneamente e intramuscularmente e administraram-se reforços depois de duas, qua tro e seis semanas. Por cada coelho, utilizou-se aproximadamente 1 mg de polipéptido purificado no processo completo de imunização .

Colectou-se sangue dos coelhos imunizados e prepararam-se fracções de IgG a partir do soro por cromatografia de afinidade em proteína-G Sepharose. Para eliminar as imunoglobulinas que possam aderir não especificamente aos componentes das paredes das células, absorveu-se a fracção de IgG com micêlio intacto. Para esta finalidade, desenvolveu-se P.chrysogenum durante quatro dias. Lavou-se o micêlio três vezes com solução salina fisiológica tamponizada com fosfato. Ressuspendeu-se 0,4 grama (peso em húmido) em 20 ml de PBS. Misturou-se a fracção

contendo IgG com o micêlio lavado (1 : 4) e incubou-se â temperatura ambiente durante trinta minutos. Separou-se então o micé lio por centrifugação a pequena velocidade.

Para se investigar a especificidade dos anticorpos, analisou-se a reaetividade da fracção IgG com extractos isentos de células de Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) e npelO, um mutante em que falta o sequenciamento completo biossintêtico da penicilina, por manchamento imune. Prepararam-se extractos Isentos de células de npelO procedendo da seguinte maneira. Congelou-se o micêlio em azoto líquido e romperam-se as células do micêlio congelado por esmagamento em almofariz. Ressuspendeu-se o material esmagado em tampão de PED (i^HPO^ 50 mM, EDTA 5 mM, DTT 5 mM e PMSF 1 mM (ph 7,5), a 4°C, 10 gramas de pó/50 ml de tampão PED).

Precipitou-se o ADN com sulfato de protamina (0,4%). Depois de trinta· minutos a 4°C, separou-se o precipita~ 3 do por centrifugação a 10.10 x g durante 15 minutos. Realizou-se o manchamento de imunidade como se descreve seguidamente. Separaram-se os polipêptidos por ensaio de SDS-PAGE em geles de separação de acrilamida a 13,3% (peso/volume) (Mini PROTEAN II, BioRad). Por cada pista, aplicaram-se 20 mierogramas de extracto isento de células. Os polipêptidos foram transferidos por electroforese do gel da tira para folhas de nitrocelulose utilizando um aparelho de manchamento Multiphor II Nova (LKB) de acor do com a maneira de proceder indicada pelo fabricante. O manchamento imune realizou-se com o sistema Ap de mancha de Western ProtoBlot (Promega) de acordo com a maneira de proceder indicada pelo fabricante; diluiram-se as fracções contendo IgG com tam pão de bloqueio.

A fracção de IgG reage especificamente com uma banda 29 kDa, que está presente nos extractos isentos de cê lulas obtidos a partir da estirpe Wisconsin 54-1255. Não se observou manchamento com extractos preparados a partir da estirpe mutante npelO.

Anticorpos contra ACVS e INPS

Provocou-se a formação de anti-soro contra ACVS em coelhos e purificou-se contra ACVS natural a partir de Aspergillus nidulans (Van Liempt e col., supra)

Purificou-se IPNS como ê descrito por Ramos e col. (1985, supra). A análise por ensaio de SDS-PAGE revelou a presença de uma banda mais importante com uma massa molecular aparente de 39 kDa. Esta banda foi cortada e utilizada na imunização de coelhos de acordo com o protocolo descrito para AT.

Isolaram-se anticorpos de IgG da anti-ACVS e os anti-soros anti-IPNS, como se descreveu acima. Para separar os anticorpos não específicos, absorveram-se as fracções contendo IgG com extracto de micêlio npelO. Ressuspenderam-se 100 mg do micêlio seco por congelação e esmagado em almofariz em 250 microlitros de Tris/Hcl 50 mM, pH 7,5. Esta suspensão foi adicio nada a 500 microlitros de IgG. Depois de uma hora à temperatura ambiente, separaram-se os resíduos das células por centrifugação 3 durante 15 minutos a 12.1o x g.

Investigou-se a especificidade dos anti-soros por manchamento imune. Para detectar ACVS por manchamento imune prepararam-se os extractos isentos de células procedendo da seguinte forma: congelou-se o micêlio em azoto líquido e romperam-se as células esmagando o micêlio congelado em almofariz. 0 material esmagado foi ressuspenso em tampão B (Tris/HcL 50 mM, pH 7,5, ditioeritritol 1 mM, EDTA 0,1 mM e 9% (peso/volume) de glicerol).

Precipitou-se o ADN com polimina B (0,1%), depois de trinta minutos a 4°C, separou-se o precipitado por cen~ 3 trifugaçao a 10.10 x g durante quinze minutos. Ao sobrenadante adicionou-se gradualmente solução saturada de sulfato de amónio. A fracção de proteína que precipita entre 0 e 45% de saturação foi retomada em tampão B. Precipitou-se este material adicionando 1 volume de ácido tricloro-acêtico a 20% em peso/volume. Depois de sessenta minutos a 4°C, colectou-se o precipitado por centrifugação a 10.10 x g durante quinze minutos. Como o ACVS • tem uma massa molecular aparente igual a 260 kDa, usaram-se ge, les de acrilamida a 5% (peso/volume). G manchamento imune reali21

zou-se eomo se descreveu acima, aplicando 20 microgramas de extracto isento de células por pista.

A fracção de IgG contra IPNS absorvida reagiu com um polipêptido de 39 kDa em extractos isentos de células de Wiseonsin 54-1255, enquanto não se observou o manchamento com extractos obtidos a partir de npelO.

A fracção de IgG contra ACVS absorvida reagiu com um polipêptido de 260 kDa em extractos isentos de células provenientes de Wiseonsin 54-1255, enquanto não se observou man chamento com extractos a partir de npelO.

B. Métodos de Microscopia Electrõnica

Corte de Amostras Finas Clássicas

Lavou-se Penicillium chrysogenum cultivado sub merso com solução salina tamponizada com 0,1 M de fosfato (PBS, pH 7,4) . Fixou-se quimicamente o micêlio com 2% de paraformaldei do, 0,5% de glutaraldeído, 0,1% de DMSO e 2% de ácido tânico em PBS 0,1 M durante quarenta e oito horas a 4°C. Depois de lavagem com PBS, o material mieelar foi pós-fixado com solução de OsO^ aquosa a 1% durante uma hora â temperatura ambiente.

O material mieelar quimicamente fixado foi lavado com acetona, a 50% e transferido para uma solução de acetona a 70% durante dezasseis horas a 4°C. O manchamento de bloco realizou-se com uma solução de acetato de uranilo (1%) em acetona a 70% à temperatura ambiente durante trinta minutos. O material foi desidratado numa série gradual de acetona e filtrado com Araldit (Merck) de acodo com as seguintes condições: 33%,

50% (uma hora cada), 66% (dezasseis horas), 75% (uma hora) e 100% de Araldit (2x3 horas). O material infiltrado foi coloca do em tubos de Eppendorf. O fluido que contém a Araldit de impregnação foi imediatamente adicionado ao micêlio. Endureceu-se o meio de impregnação por incubação a 70°C durante quarenta e oito horas. Cortaram-se amostras finas (100 nm) com uma faca de diamante num ultramicrõtomo de Reichert-Jung.

Congelamento Rápido, Substituição do Congelamento e Impregnação a Baixa Temperatura

Preparou-se micêlio para congelamento rápido em propano líquido previamente arrefecido com azoto com um aparelho de Reichert-Jung KF 80 (H. Sitte e col., 1985, The Science of Biological Specimen Preparation of Microscopy and Microanaly sis, páginas 103 - 118, M. Muller, R. P. Becker, A. Boyde, J.J. Wolosewich, S.A. Batho (Ed.), S.E.M., Inc., Chicago, Estados Unidos da América).

A substituição do banho de congelamento e a impregnação a baixa temperatura realizaram-se na eãmara de auto-substituição de Reichert-Jung CS a -90°C. Enquanto se transferiu para a câmara, teve-se o cuidado de manter o material congelado a uma temperatura inferior a -90°C. As amostras congeladas foram colocadas em solução a 0,5% de acetato de.uranilo em metanol puro a-9o°C. Depois de dois dias, subiu-se a temperatura para -45°C a uma velocidade de 5°C por hora. As amostras foram sub sequentemente lavadas oom metanol anidro e infiltradas com Lowicryl HM20 em três fases de concentração crescente de 50%, 66% e 100% de Lowicryl HM20, durando cada fase duas horas. Depois de dezasseis horas, as amostras foram transferidas para um molde de impregnação, que foi cheio com Lowicryl HM20 a -45°C. A polimerização demorou quarenta e oito horas a -45°C no auto-aparelho CS, seguida de polimerização à temperatura ambiente durante quarenta e oito horas no auto-aparelho CS por acção de uma fonte de luz UV (360 nm).

Os blocos de Lowicryl HM20 contendo as amostra s foram retirados do molde de embebição e cortados perpendicular mente ou longitudinalmente com um ultramicrõtomo de Reichert-Jung.

Preparação e Exame dos Cortes Finos

As lâminas finas preparadas por seccionamento clássico fino e substituição de congelamento a baixa temperatura foram montadas em grelhas de um orifício com 0,7% de carbono . evaporado revestido com formvar, manchadas com solução aquosa a

4% de acetato de uranilo durante quinze minutos e citrato de

chumbo ou com solução aquosa a 1% de KMnO^ durante dez minutos.

As secções finas foram examinadas num microscópio Phillips EM420 a 80 kV.

Fracturação da Massa Congelada

As hifas foram fracturadas no estado de congeladas num aparelho de Balzers BAF300. As amostras foram fracturadas a -105°C e foram subsequentemente depositadas com platina/ carbono e carbono (pt/C a um ângulo de 45 graus e 90 graus). Depois de se retirarem do BAF300 e de se descongelarem, as réplicas foram limpas com 3% de Cr/10% de H₂ ^SO4 durante a noite e foram subsequentemente lavadas com agua destilada. As réplicas lim pas foram colocadas numa grelha EM de quatrocentas malhas, não revestida, e foram examinadas com o microscópio Phillips EM420 a 80 kV.

Marcação com Imuno-Oiro .

O manchamento imune das secções finas realizou ”se como foi descrito por P. Μ. P. van Bergen en Henegouwen e Col. (1986, Histochemistry 85 : 81-87). Resumidamente, incubaram -se as secções finas com anticorpos contra AT. A preparação de anticorpos de IgG e a sua absorção realizou-se como se descreve em Procedimentos Gerais A, utilizando uma diluição de 1 : 1 003 da fracçao de IgG absorvida. Depois da lavagem, incubaram-se as secções finas com anticorpos anticoelho de cabra, a que se ligaram partículas de oiro com diâmetro de 10 nm (Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Bélgica).

Gongelamento Rápido Comparado com Fixação Química

Comparou-se a ultra-estrutura de micêlios não fixados e quimicamente fixados depois da fractura após congelação. Enquanto as células das hifas não fixadas apresentam membra nas vacuolares e de plasma regulares com partículas intramembra• na homogeneamente distribuídas, as células quimicamente fixadas

apresentam membranas vacuolares e do plasma onduladas, com segre gação de partículas intramembrana. Quando se comparam as secções finas de hifas quimicamente fixadas com as secções finas de hifas preparadas por congelação rãpida e substituição da congelação a baixa temperatura, observa-se uma grande quantidade de colapsos de vacuolos nas secções finas preparadas pelo primeiro processo. Este facto estã de acordo com o consenso geral de que o congelamento rápido evita as alterações estruturais (Knoll, su pra) .

Além disso, a marcação com oiro imune com anticorpos contra AT não foi possível com estas secções finas de hifas quimicamente fixadas, enquanto se conseguiu o manchamento positivo no caso de secções finas preparadas por uma combinação de congelamento rápido cem a substituição de congelação. Muito provavelmente, a antigenicidade dos polipêptidos foi destruída pelo processo anterior, como foi frequentemente observado por ou tros investigadores neste domínio (Marcação com Oiro Imune em Cell Biology, supra).

Exemplo 1

Localização de AT em Organelos Específicos de Penicillium chrysogenum

As estirpes de P. chryssogenum, Wisconsin 54-1255 e npelQ, foram desenvolvidas em balões sujeitos a agitação contendo meio de produção (Patente de Invenção Europeia EP-A-354 624). As secções finas foram preparadas por uma combinação de congelamento rápido e de substituição de congelamento, como se descreve no Procedimento GERAL B. Realizou-se o manchamento de imunidade com anticorpos contra AT (veja-se . Procedimento Geral A), como se descreve no Procedimento Geral B.

Em secções finas preparadas a partir de npelQ não foi possível detectar uma estirpe em que falta o conjunto de genes biossintêticos de penicilina não foi possível detectar a etiquetagem. No entanto, em secções finas preparadas a partir de Wisconsin 54-1255, detectaram-se partículas de oiro predominantemente em organelos de membrana simples com o diâmetro compreendido entre 200 e 800 nm. Em contraste com os vacuolos, es25

tes organelos têm um denso teor de electrões. Os organelos foram encontrados através da célula. Algumas vezes, os organelos de menores dimensões encontravam-se em associação com o núcleo ou com o retículo endoplãsmico. Na Figura 2, estã representado um organelo marcado.

Exemplo 2

Presença de Organelos Contendo AT através das Hlfas

Desenvolveram-se esporos de P. chrysogenum entre tubos de diãlise dissectados em placas de agar contendo meio de produção. Depois de seis dias, removeram-se os tubos de diãlise que contêm as colónias da chapa e colocaram-se numa lâmina de observação ao microscópio. Desdobrou-se o tubo de diãlise com uma pinça fina. A colónia e o tubo de diãlise de suporte foram cortados em quadrados com uma lâmina de barbear e colocaram-se os quadrados numa placa com agar durante quinze minutos. Os quadrados foram submetidos a congelamento rápido como se descreve no Procedimento Geral B.

desenvolvimento de colónias de P.chrysogenum ocorre radialmente e centrifugamente em todas as direcçoes. As células mais novas estão na periferia e as mais velhas estão no centro da colónia. Investigaram-se partes específicas da colónia por corte longitudinal. A célula do vértice tem muitos ribossomas, mitocóndrias e vesículas, no primeiro terço da célula. Além deste organelos, o segundo terço das células contém também núcleos. 0 último terço da célula do vértice contêm menos núcleos e abundância de pequenos vacúolos. 0 tamanho destes vacúolos aumenta em direcção ao septo. Os vacúolos das células subapicais são maiores do que os vacúolos na célula da.ponta, mas o número de vacúolos ê menor. Nas células mais velhas, encontram-se vacúolos muito grandes que ocupam quase o volume total da célula,obtendo-se como resultado uma margem de citoplasma entre a membrana vacuolar e a membrana do plasma.

Realizou-se o manchamento imune em cortes longitudinais de secções finas de células jovens assim como células mais velhas, como se descreve no Exemplo 1. Detectaram-se orga26

nelos marcados com oiro através das hifas. 0 número de organelos detectados por superfície quadrada de érea de célula não diferia fundamentalmente entre as células mais novas e as células mais velhas, a não ser uma célula de hifas velha que estava totalmente ocupada por um vacúolo de grandes dimensões. Na Figura 3, estão representados exemplos de organelos marcados em células mais novas e em células mais velhas. Com base na morfologia, tamanho e distribuição através das hifas, estes organelos são cias sifiçados como microcorpos.

Exemplo 3

Fracoionamento de células de Penicillium ehrysogenum

Distribuição de ACVS, IPNS e AT

Procedeu-se à colheita da estirpe P2 (ATCC 482 71) de P. ehrysogenum setenta e duas horas depois da inoculação. Layou-se o micêlio uma vez com solução a 0,9% de NaCl. Ressuspen deram-se 20 gramas (peso húmido) em 100 ml de tampão A (2 gramas /litro de ãcido cítrico, pH 6,4, 60 gramas de KCl/litro). Subsequentemente, adicionaram-se 500 mg de novõzima (Novo Biolabs, Bagsvaerd, Dinamarca). Sacudiu-se a suspensão durante quatro horas a 25° C e a 100 rotações por minuto. Lavaram-se os protoplas •tas por três vezes com tampão B (0,1 M de ãeido 2-(N-morfolino)-etano-sulfõnico (MES), pH 7,5, contendo 60 gramas de KCl/litro) Ressuspenderam-se os protoplastas em tampão C (0,1 M de MES, pH 7,5, 5 mM de DTT, 1 mM de EDTA, contendo 25 gramas/litro de NaCl ) e foram submetidos a lise por cinco passagens com um Potter.

Separaram-se os fragmentos das células por cen trifugação a 1.1^ x g durante quinze minutos a 4°C. Fraccionou-se o sobrenadante (14KS) com obtenção de um pelete (14KP) e um ~ 3 sobrenadante (14KS) por centrifugação a 14.1 x g durante trinta minutos a 4°C. Finalmente, fraccionou-se o sobrenadante 14KS a 100.1^ x g durante uma hora a 4°C, obtendo-se as fraeções lOOKs e 100KP.

Separaram-se por SDS-PAGE os polipêptidos presentes nas fraeções 1KS, 14KS, 14KP, 100KS e 100KP e transferiram-se depois para nitrocelulose como se descreve no Procedimen

to Geral A. Determinou-se a proteína como ê descrito por Peterson em Analytical Biochem. (1977) 83 : 346 - 356, aplicando-se 20 microgramas por cada pista. Realizou-se o manchamento de imunidade com as fracções de IgG absorvidas, que se prepararam como se descreveu em Procedimento Geral A.

O manchamento imune com anticorpos contra AT mostrou que AT estava presente em todas as fracções excepto em 100KP. 0 manchamento imune com anticorpos contra IPNS mostrou que IPNS estava presente em 1KS, 14KS e 100KS, mas não em 14KP e 100KP. O manchamento imune com anticorpos contra ACVS mostrou que ACVS estava presente em 1KS, 14KS e 100KP. Estes resultados estão representados na Figura 4.

A partir destas experiências, conclui-se que as três enzimas estão presentes em diferentes fracções celulares A IPNS comporta-se como uma enzima citossõlica. A enzima ACVS es tã associada â fraeção que corresponde ao retículo endoplãsmico ou a outras pequenas vesículas da membrana., A AT estã situada em organelos com uma velocidade de sedimentação que corresponde a mitocôndrias, vaeuolos e microcorpos. A ausência de AT em 100KP sugere que AT não estã associada a vesículas da membrana de pequenas dimensões. A presença de AT em todas as fracções excepto em 100KP explica-se pela lise dos microcorpos durante o fraccionamento das células.

Para confirmar que AT estã localizada nos mierocorpos na fraeção 14KP, visualizaram-se os constituintes da fraeção 14KP por microscopia electrónica. Prepararam-se cortes ultrafinos por uma combinação de congelamento rápido e substitui ção de congelamento como se descreveu no Procedimento Geral B. O pelete continha mitocôndrias e numerosas vesículas de diferentes tamanhos. Algumas dessas vesículas continham material denso em electrões. Por manchamento imune da 14KP com a fraeção IgG contra AT, verificou-se que muitas dessas vesículas contêm AT.

O tamanho dessas vesículas estã compreendido entre 200 e 800 nanõmetros. As vesículas que contêm AT estavam presentes em cêlulãs jovens e em compartimentos mais velhos das hifas. Com base na morfologia, tamanho e distribuição através das hifas, estas vesículas podem ser classificadas como microcorpos e não como vesículas de Golgi.

Exemplo 4

Experiência de Fraccionamento de Células com Penicillium chrysogenum

Distribuição de Actlvidades de Enzima Marcadora e Actividades de IPNS e de AT

Fraccionaram-se protoplastas de P. chrysogenum como se descreveu no Exemplo 3. Utilizaram-se as seguintes enzimas marcadoras : Determinou-se a actividade de ATPase a pH 6,0 como marcador para a membrana do plasma como ê descrito por Navarette e col. (Navarette, Biochim. Biophys. Acta (1983), 728 :

: 403 - 408), a actividade de 5'-nucleo-tidase como marcador para a membrana do plasma pelo método descrito por Onishi e col., Anal. Biochem. (1975), 69 : 261 - 267. Determinou-se a activida-de de tiamina-pirofosfatase como marcador do complexo de Golgi pelo processo descrito por Morrê (Meth. Enzymol. (1971), 22 :

: 138 - 139), com a diferença de o volume da mistura reaccional ter sido 0,5 ml. Determinou-se a actividade da glucose-6-fosfatase como marcador no retículo endoplãsmico pelo processo descri to por Morrê (supra), com a diferença de o volume da mistura re accional ser 0,5 ml. Determinou-se a actividade de melato-desidrogenase como marcador dos mitocôndrias pelo processo descrito por Gross, Phytochem. (1977), 16 : 319 - 321. Determinou-se a actividade de alfa-manosidase como marcador dos vacúolos pelo processo descrito por Van der Wilden, Naturforschung (1973), 28: : 416 - 421. Determinou-se a actividade de catalase como marcador de peroxissomas pelo método descrito por Cohen e col., J. Anal. Biochem. (1970), 34 : 30-38.

A actividade de AT foi determinada como ê descrito por Alvarez (supra), a actividade de INPS foi determinada como ê descrito por Ramos (supra).

A actividade das enzimas por miligrama de proteína nas fracções 14KP, 100KS e 100KP foi expressa como a fracção de actividade encontrada por miligrama de proteína na fracção 1KS. Determinou-se a proteína pelo processo descrito por Peterson (supra).

A distribuição das enzimas marcadoras nas frac

ções 14KP, 100KS e 100KP variou em diferentes experiências; no entanto, geralmente, a fracção 14KP estava enriquecida nas enzimas marcadoras para malato-desidrogenase, alfa-manosidase e catalase. A actividade de tiamina-pirofosfatase foi encontrada em 14KP, assim como em 100KP. As actividades de AT maiores foram geralmente encontradas na fracção 14KP; no entanto, em algumas experiências, a actividade de AT foi encontrada predominantemente na fracção 100KS. Isto pode estar relacionado com a lise de microcorpos durante a lise dos protoplastas. A actividade mais elevada de IPNS estava sempre presente na fracção 100KS.

Na Tabela 1, estã exemplificada a distribuição das enzimas marcadoras numa experiência típica. N. D. = não detectada.

Exemplo 5

Números relativos de células Contendo Microcorpos Marcados que

Contêm AT nas Estirpes NRRL 1951, Wisconsin 54-1255 e Panlabs 2 de Penicillium chrysogenum

Compararam-se três estirpes de P. chrysogenum com diferentes capacidades de produção de penicilina em relação ao número de células que contêm microcorpos marcados com AT. AS estirpes utilizadas foram NRRL 1951, Wisconsin 54-1255 (ATCC 28089) e a estirpe produtora P2 (ATCC 48271), uma das estirpes originais do programa de melhoramento de estirpes panlabs.

As estirpes foram desenvolvidas em balões com agitação contendo meio de produção. As estirpes NRRL 1951 e Wisconsin 54-1255 foram recolhidas quarente e oito horas depois da inoculação, P2 foi recolhida setenta e duas horas depois da inoculação. A quantidade relativa de penicilina produzida no momento da colheita (a quantidade de penicilina produzida por NRRL 1951 foi considerada igual â unidade) estã indicada na Tabela 2.

Prepararam-se cortes finos de micêlio por uma combinação de congelamento rápido e substituição de'congelamento como se descreve no Procedimento Geral B. Mancharam-se as • secções finas com anticorpos contra AT como se descreve no Exem. pio 1.

.3.0 «ί 1

Reforçou-se o manchamento de partículas de oiro imune por precipitação de prata de acordo com o método descri to por Danscher, Histochem, (1981), 71 : 81 - 88, para revelar microcorpos marcados a pequena ampliação.

Determinou-se o numero de microcorpos marcados em secções cortadas perpendicularmente. Contaram-se 100 células de hifa com a ampliação de mil vezes. O número de células que contêm um ou mais microcorpos marcados foi dividido pela quantidade total de células contadas para se obter a quantidade relativa de microcorpos marcados contendo células existentes na estirpe. Os resultados estão indicados na Tabela 2.

Este Exemplo mostra claramente que a quantidade relativa de microcorpos contendo AT numa estirpe está correlacionada com a produção de penicilina por essa estirpe.

Tabela 2

	Produção de penicilina e quantidade relativa de células que contêm microcorpos marcados com AT em três
estirpe	s de Penicillium chrvsogenum
	Estirpe	Penicilina produzi da (unidades arbi trarias	Quantidade relativa de células com microcorpos marcados
	NREL 1951	1	0 - 15%
	Wisconsin 54-1255	5	30 - 50%
	P2	20	75 - 90%

Exemplo 6

Comparação entre a quantidade Relativa de células que Contêm Microcorpos Marcados com AT na Estirpe P2. de Penicillium chrysogenum sob Condições de Produção de Penicilina e de não Produção de

Penicilina

Cultivou-se a estirpe P2 em balões sacudidos . em condições de produção de penicilina e em condições de não pro ’ dução de penicilina (lactose substituida por glucose), como se

descreveu no Exemplo 5.

De acordo com os métodos descritos no Exemplo 5, determinou-se a quantidade relativa de células que contêm mi crocorpos marcados contendo AT. Em condições de não produção de penicilina, aproximadamente 20% das células continham um ou mais microcorpos marcados. Pelo contrario, nas condições de produção 75 a 90% das células continham um ou. mais microcorpos.marcados.

Este Exemplo mostra claramente que a quantidade relativa de células que contêm microcorpos marcados com AT está correlacionada com a produção de penicilina por esta estirpe.

Exemplo 7

Eliminação do ginal de Alvo dos Microcorpos de AT por Mutagénese

Dirigida ao Sitio do Gene penDE gue Elimina a Produção de Penicilina isolamento e a caracterização do gene penDE que codifica AT de P. chrysogenum foram jã descritos pormenoriza damente (Patente de Invenção Europeia EP-A-357119; Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms, Veenstra e col., paginas 262 - 269, 1989, American Society for Microhiology, Washington; Barredo e col., supra.

O gene penDE completo estã contido num fragmen to de restrição com 2,3 quilobases (kb), HindIII-SalI, do plasmídio pGJ02 (Patente de Invenção Europeia EP-A-357119). Este fra gmento foi isolado de pGJ02 por digestão com as enzimas de restrição Hind III e Sall e electroforese em gel de agarose e liçfou -se nos vectores pMA e pMC, também digeridos com as enzimas de restrição HindIII. Os plasmídeos resultantes foram designados pMA-ΑΤ e pMC-ΑΤ (Figuras 5 e 6, respectivamente.)

Os vectores pMA e pMC são plasmídeos que foram especialmente desenvolvidos para mutagenese eficiente in vitro (Stanssens e col., Nucl. Acids Res. (1989), 17 : 4441 - 4453).

A estirpe WK6 de E. coli (R. Zell e H. J. Fritz, EMBO Journal (1987), 6 : 1809 - 1815) foi utilizada para a propagação de pias mídeos. Técnicas normalizadas de recADN utilizadas são adequada32 -

mente descritas por Maniatis e col.) (1989) supra).

Conseguiu-se a mutagénese dirigida ao sitio do gene penDE usando oligonucleõtidos quimicamente sintetizados (Applied Biosystems, CA., Estados Unidos da América) contendo as mutações pretendidas. A sequência de oligonucleõtidos baseou-se na sequência publicada do gene penDE de P. chrysogenum (Bar redo e col., supra).

Utilizou-se o oligonucleõtido S 5'-GG TCT GCG AAC TGA AGG CTT TGA AGG-3' para modificar o codão GCC que codifica alanina (A) na sequência A-R-L-End em TGA, que é o codão autêntico de interrupção do gene penDE.

Utilizou-se o oligonucleõtido D 5'-GG TCT GCG CTC AAC TGA AGG CTC TTC-3' para suprimir os codões terminais de carboxi, GCC AGG CTT, que codificam A-R-L, do gene penDE.

Muito embora as mutações introduzidas no gene penDE sejam diferentes quando se utilizam oligonucleõtidos S ou o oligonucleõtido D, as sequências das mutações na estrutura de AT são idênticas. A translação do mARN de penDE mutante em ambos os casos para na asparagina (N) que deixa uma enzima vazia do si nal de alvo do microcorpo ARL da extremidade C (Figura 7).

Obteve-se um duplex com intervalo recozendo o ADN de codão único (ss) derivado de pMA-AT com o fragmento de restrição Sacl-Nsll de aproximadamente 4,8 kb isolado de PMC-AT. 0 tamanho do intervalo no duplex com intervalo é aproximadamente igual a 320 pares de bases (pb) de comprimento. 0 oligonucleõtido S ou o oligonucleõtido D foram subsequentemente recozidos nes te duplex com intervalo.

As condições experimentais e as maneiras de proceder utilizadas para a introdução das mutações foram exactamente reproduzidas do trabalho de Stanssens e col. (supra). Iden tificaram-se células WK6 de E, coli contendo genes penDE mutantes por hibridização das colónias utilizando o oligonucleõtido específico usado para a mutagénese como amostra. A introdução correcta das mutações pretendidas no gene penDE foi confirmada por análise de sequência de nucleõtidos. Ambos os oligonucleõti- 3 '3 ,£S3SS^ '

J dos S e D foram utilizados com êxito para criar genes penDE mutantes, que foram designados respectivamente penDE-S (oligonucle õtido S) e penDE-Ρ (oligonucleótido D).

Os genes penDE-S, penDE-Ρ e penDE (como contro lo positivo) foram introduzidos na estirpe npe6 de P.chrysogenum como fragmentos de restrição lineares HlndlII-SalI de 2,3 kb, pu rificados a partir das sequências do vector pMA-AT por cotransformação com o plasmídeo pPS47, que contêm o gene da resistência a fleomicina de S. hindustanus como marcador de selecção do fungo (Patente de Invenção Europeia EP-A-357119), utilizando um pro cedimento normalizado para a transformação de P.chrysogenum (Pa tente de Invenção Europeia EP-A-357119). Ê evidente para os peritos no assunto que se podem utilizar outros marcadores de selecção, homólogos ou heterólogos, na presença ou na ausência de sequências de vectores, fisicamente ligados ou não ao ADN não seleccionãvel, para a selecção de transformantes.

A estirpe npe6 de P. chrysogenum ê um derivado não produtor da estirpe Wisconsin 54-1255, caracterizado pela ausência de AT do micêlio, como foi revelado por analises do anticorpo AT dos extractos isentos de células em manchas de Wester n e por análises microscópicas electrônicas de npe6 com anticorpos AT, como se descreve nos Procedimentos Gerais A e B e no Exemplo 1.

Os transformantes foram primeiramente escolhidos pela sua resistência â fleomicina, purificados e depois ensaiados por cotransformação de genes penDE usando o ensaio biológico como se descreve na Patente de Invenção Europeia EP-A-357119 e por Veenstra e col, supra.

A produção de penicilina pôde ser facilmente restaurada em npe6 usando o gene penDE de tipo natural, mas nunca se observou a restauração da produção de penicilina quando se utilizam os genes penDE-5 e penDE-Ρ. No entanto, os genes pen DE-S e penDE-D são co transformados e expressos em alguns transformantes como foi confirmado por anãlise de manchamento de Western com anticorpos AT e ensaios da actividade AT em extractos isentos de células. A localização de AT nestes transformantes foi estudada por microscopia electrõnica. Não se detectou marcação específica em organelos. Em contrapartida, secções finas de

3:4 -

acreaja transformantes penDE mostraram marcação específica em organelos. A intensidade e o aspecto da marcação nestes transformantes foram idênticos aos observados na estirpe de partida Wisconsin 54-1255.

Conclui-se destas experiências que a marcação do alvo de AT para microcorpos ê mediada pela sequência ARL da extremidade Ç. A eliminação da sequência ARL da AT tem como resultado a localização inadequada da enzima com a concomitante perda de produção da penicilina. Este exemplo demonstra que a manipulação do sinal de alvo do microcorpo ê um método poderoso para influenciar a produção de metabõlitos secundários.

Neste caso, a localização das enzimas biossintêticas de penicilina foi investigada pela primeira vez por um método de preparação microscópica electrónica digna de confiança em combinação com a marcação com oiro de imunidade.

A localização da AT, ACVS e IPNS foi também es tudada por experiências de fraccionamento de células. A Requeren te descobriu surpreendentemente que a AT, a ultima enzima do pro cesso de síntese biossintêtica da penicilina, fica situada nos microcorpos. Esta ê a primeira vez que se descobriu que uma enzima envolvida na produção de metabõlitos secundários está localizada em microcorpos.

Descobriu-se uma nítida correlação entre a qua ntidade relativa de microcorpos e a produção de penicilina : as estirpes de elevado rendimento contêm mais microcorpos marcados com AT do que as que originam pequeno rendimento. Além disso, a quantidade relativa de. microcorpos que contêm AT nas estirpes de elevado rendimento diminui em condições de produção de não penicilina.

Proporcionam-se métodos tais como a manipulação dó sinal de alvo do microcorpo, que permitem a modulação da produção de metabólitos secundários, tais como compostos de beta -lactama.

Todas as publicações e pedidos de patente citados na presente memória descritiva são incorporados nesta como referência como se cada publicação individual ou pedido de paten te individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado como referência.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e de exemplificação para finalidades de clareza e de compreensão, ê facilmente evidente aos peritos no assunto, â luz das indicações da presente invenção, que nela se podem fazer certas alterações e modificações sem afastamento do espírito e do âmbito das reivindicações anexas.

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES

   Processo para modular a produção de metabõlitos secundários num microrganismo, que compreende a utilização de um microrganismo hospedeiro, caracterizado pelo facto de se modular o numero e/ou o tamanho de organelos, preferivelmente, de microcorpos em relação ao microrganismo original mediante alteração da expressão de uma proteina nos referidos organelos e/ou interferência com mecanismos de controlo celulares para maturação ou fissão dos mencionados organelos e/ou contacto do microrganismo com agentes capazes de regular o nu mero e/ou o tamanho dos citados organelos ou se modular a localização celular de pelo menos uma proteína, opcionalmente derivada de outro microrganismo, directa ou indirectamente envolvido na produção dos referidos metabõlitos secundários adicionando, suprimindo ou alterando uma ou mais sequências de ADN que co dificam um ou mais sinais que servem de alvo no gene ou nos genes de uma ou mais das citadas proteínas.

   - 2^a Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se reforçar a produção de metabõlitos secundários num microrganismo.

   - 3:6 -

   - 3^a Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por compreender a colocalização de duas ou mais enzimas envolvidas nas vias biossintêticas que constituem uma ou mais fases de reacções que originam os diferentes metabôlitos se cundãrios, nos microcorpos.

   - 4^a Processo de acordo com qualquer das reivindica ções anteriores, caracterizado pelo facto de os referidos metabõ litos secundários serem derivados de P-lactama, preferivelmente, penicilinas ou cefalosporinas.

   - 5^a Processo para obtenção de um gene que codifica uma enzima, de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por se ter alterado a sua sequência de ADN.

   - 6^a Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por se empregar um material construído de ADN especif icamente preparado.

   - 7^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a utilização de Penicillium chrysogenum, Aspergillus nidulans ou Acremonium chryso genum como microrganismo que produz os mencionados metabôlitos secundários.

   - 8^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, caracterizado por compreender a utilização de um microrganismo por sua natureza incapaz de produzir os citados me tabõlitos secundários.

   - 9^a Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, caracterizado por se empregar microrganismos

   - 3*7 - eucariõticos, utilizáveis na produção de metabõlitos secundários caracterizado por se modular o numero e/ou o tamanho de organelos, preferivelmente, microcorpos em comparação com o microrganismo original mediante alteração da expressão de uma proteína nos referidos organelos e/ou interferência com os mecanismos de controlo celulares de maturação ou fissão dos mencionados organelos e/ou contacto do microrganismo com agentes capazes de regular o número e/ou o tamanho dos citados organelos ou se modular a localização celular de pelo menos uma proteína, opcionalmente derivada de outro microrganismo, directa ou indirectamente envolvida na produção dos referidos metabõlitos secundários por adição, supressão ou alteração de uma ou mais sequências de ADN que codificam um ou mais sinais que servem de alvo no gene ou nos genes de uma ou mais mencionadas proteínas.

   - 10^a Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo facto de o citado microrganismo ser Penicillium chrysogenum, Acremonium chrysogenum ou Aspergillus nidulans.

   - 11^a Processo para a preparação de metabõlitos secundários,· caracterizado por se empregar uma célula ou uma parte de uma célula enriquecida em microcorpos envolvidos na síntese dos referidos metabõlitos secundários.

   - 12^a Processo para a preparação in vitro de metabõlitos secundários, caracterizado por se empregar uma fracção de uma célula enriquecida em microcorpos envolvidos na síntese dos mencionados metabõlitos secundários.

   3 8 13

   Processo de acordo com as reivindicações 11 ou 12, caracterizado por compreender a síntese de derivados de p-lactama.

   A requerente reivindica a prioridade do pedido de patente europeia apresentado em 23 de Março de 1990 , sob o NO. 90200695.6.

   RESUMO

   PROCESSO PARA MODULAR A PRODUÇÃO DE METABÕLITOS SECUNDÁRIOS NO MEADAMENTE DERIVADOS DE p-LACTAMA

   A invenção refere-se a um processo para modular a produção de metabòlitos secundários nomeadamente derivados de β-lactama em microrganismos alterando o número e/ou o ta manho de organelos, preferivelmente, microcorpos e modulando a localização celular de enzimas em relação aos organelos.

   acido L-a-aminodípico L-cisteína L-valina

   Fig. 1

   Cefamicina C Cefalosporina C

   F f G. 2

   FIG 3α

   F I G. 3b

   V

   CL* prot-oplasi-as hsadas M ~ marcador

   HindI 11XbaI