FI95810C - Eristetty DNA-yhdiste, joka koodaa rekombinantti DNA isopenisilliini N-syntetaasia, sitä sisältävät vektorit ja menetelmä isopenisilliini N-syntetaasiaktiivisuuden tuottamiseksi näiden avulla - Google Patents

Description

εεδίο

Eristetty DNA-yhdiste, joka koodaa rekombinantti DNA iso-penisilliini N -syntetaasia, sitä sisältävät vektorit ja menetelmä isopenisilliini N -syntetaasiaktiivisuuden tuottamiseksi näiden avulla 5 Tämä keksintö koskee eristettyä DNA-yhdistettä, joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasia. Isopenisilliini N -syntetaasi katalysoi reaktiota, jossa isopenisilliini N muodostuu yhdisteestä 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kystei-10 nyyli-D-valiini. Tämä reaktio on kriittinen vaihe tärkeiden antibioottien biosynteesissä, kuten penisilliinit Pe-nicillium chrysogenumista, Cephalosporium acremoniumista ja Streptomyces clavuligeruksesta, kefalosporiinit C. acremoniumista ja 7<x-metoksikefalosporiinit S. clavuligeruk-15 sesta. Keksintö koskee myös uutta DNA-yhdistettä sisältäviä vektoreita sekä menetelmää isopenisilliini N -synte-taasiaktivisuuden tuottamiseksi isäntäsolussa.

Uusi DNA-sekvenssi, joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden, eristettiin Cephalosporium ac-20 rentoniumista ja sitä on käytetty konstruoimaan rekombina ntti DNA -ekspressiovektoreita, jotka aikaansaavat aktiivisuuden ekspression. Kaksi lajia näiden ekspressiovektoreita ovat erityisen hyödyllisiä. Ensimmäinen vektorityyp-pi aikaansaa isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden 25 korkean tason ekspression E. colissa, ja toinen tyyppi aikaansaa aktiivisuuden ekspression Cephalosporium acre-moniumissa.

E. colin tuottaman isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden on osoitettu in vitro -kokeissa muodostavan 30 isopenisilliini N:ää yhdisteestä 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiini. Tämän keksinnön mukaisilla E. Colin vektoreilla transformoidun E. colin raaka solu-uute osoitti isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta ilman mitään esi-aktivointikäsittelyä. Tämän keksinnön mukaiset 35 E. colin vektorit ovat tehokas keino saada suuria määriä 2 95810 aktiivista isopenisilliini N -syntetaasia. Isopenisilliini N -syntetaasi on hyödyllinen, ei ainoastaan isopenisilliini N:n tuottamiseksi, vaan myös tripeptidien kondensaa-tiossa, muiden kuin 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-5 valiinin, uusien antibioottien tuottamiseksi.

Tämän keksinnön mukaiset Ceplialosporium vektorit ovat hyödyllisiä kannan parannustarkoituksissa. Cephalos-porium on taloudellisesti tärkeä organismi, joka on hyödyllinen penisilliini- ja kefalosporiiniantibioottien 10 tuottamisessa. Cephalosporiumin transformaatio tietyillä tämän keksinnön mukaisilla rekombinantti DNA ekspressio-vektoreilla johtaa suurempiin isopenisilliini N -syntetaa-sin in vivo -tasoihin transformanteissa, joilla näin ollen on lisääntynyt fermentointien tehokkuus ja saanto.

15 DNA-yhdisteet, jotka koodaavat isopenisilliini N - syntetaasia, modifioidaan helposti ekspressiovektoreiden konstruoimiseksi, jotka lisäävät muiden organismien, kuten Penicillium chrysogenum ja Streptomyces clavuligerus, fermentointien tehokkuutta ja saantoa. Vaikkakin tämän kek-20 sinnön mukainen isopenisilliini N -syntetaasia koodaava DNA eristettiin Cephalosporium acremoniumista, voidaan näitä DNA-yhdisteitä käyttää konstruoimaan vektoreita, jotka aikaansaavat isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden ekspressiota suuressa määrässä isäntäsoluja, kuten 25 tämän keksinnön mukaiset E. coli-vektorit havainnollistavat. Kaikki organismit, jotka tuottavat penisilliinejä ja kefalosporiineja, käyttävät tavallisia prekursoreita 6-(L-,a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiini ja isopenisilliini N. Sen tähden voidaan tämän keksinnön mukaisia 30 isopenisilliini N -syntetaasia koodaavia DNA-yhdisteitä ·. käyttää vektoreiden tuottamiseen, jotka ovat hyödyllisiä kaikkiin sukuihin kuuluvien penisilliini ja kefalosporiini-antibiootteja tuottavien organismien fermentointien tehokkuuden ja saannon parantamiseksi.

3

Γ t 6 O

Tämän keksinnön mukaiset DNA-yhdisteet ovat peräisin Cephalosporium acremoniumin genomin DNA:sta ja ne ovat nukleotidisekvenssiltään merkittävästi homologisia DNA-yh-disteisiin nähden, jotka koodaavat isopensiilliini N -syn-5 tetaasin aktiivisuutta Streptomyces clavuligeruksessa,

Penicillium ja chrysogenumissa ja muissa isopenisilliini N -syntetaasia tuottavissa organismeissa. Tämän homologian johdosta voidaan tämän keksinnön mukaisia isopenisilliini N -syntetaasia koodaavia DNA-yhdisteitä merkitä ja käyttää 10 sellaisten organismien geenipankkien seulontaan, jotka tuottavat isopensilliini N:ää tai samankaltaisia yhdisteitä isopenisilliini N -syntetaasityyppisten entsyymien läsnäollessa. Monet organismit sisältävät DNA:ta, joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasiaktiivisuutta, joka olleelli-15 sesti vastaa tämän keksinnön mukaisten DNA-yhdisteiden koodaamaa aktiivisuutta, ja tämä keksintö pitää sisällään nuo ekvivalentit DNA-yhdisteet.

Tämän keksinnön mukaiset isopenisilliini N -syntetaasia koodaavat DNA-yhdisteet saatiin Cephalosporium ac-20 remoniumin genomin DNA:sta ja eristettiin yhdessä transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin kanssa, joka säätelee C. acremoniumin isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan genomisen DNA:n ekspressiota. Tämä keksintö käsittää myös tämän uuden aktivoivan sekvenssin, jota on 25 käytetty, kuten tässä on kuvattu, heterologisten geenien ekspression aikaansaamiseksi C. acremoniumissa.

Tämä keksintö käsittää myös IPS-geenin säätelevät signaalit, jotka sijaitsevat IPS-geenin koodaavan alueen koodaavan säikeen 3' päässä. Nämä 3' säätelevät sekvenssit 30 koodaavat IPS-geenin transkription päättymisen ja mRNA:n ·· polyadenylaation ja prosessoivat signaalit. Näiden signaa lien läsnäolo oikeassa paikassa, joka on ekspressoitavan geenin koodaavan alueen koodaavan säikeen 3' päässä, eks-pressiovektorissa tehostaa halutun tuotteen ekspressiota, 35 jota tuotetta koodaa vektori Cephalosporium acremoniumissa.

4 r r r ' n ^ ^ o

Seuraavassa annetaan yksityiskohtaisempi kuvaus keksinnöstä. Selvyyden vuoksi Ja keksinnön ymmärtämisen helpottamiseksi, määritellään seuraavat kohdat seuraavassa.

5 Antibiootti - mikro-organismien tuottama aine, joka joko luonnollisesti tai rajoitetusti kemiallisesti muunnettuna, inhiboi toisen mikro-organismin tai eukaryoot-tisolun kasvua tai tappaa tämän.

Antibioottinen biosynteettinen geeni - DNA-segment-10 ti, joka koodaa entsymaattisen aktiivisuuden, joka on välttämätön entsymaattiselle reaktiolle prosessissa, jossa primaarimetaboliitit muutetaan antibiooteiksi.

Antibioottia tuottava organismi - mikä tahansa organismi, joihin lukeutuu, näihin rajoittumatta, Strepto-15 myces, Bacillus, Monospora, Cephalosporium, Podospora,

Penicillium ja Nocardia, jotka joko tuottavat antibioottia tai sisältävät geenejä, jotka, jos ilmenevät, tuottaisivat antibioottia.

Antibioottiresistenssin antava geeni - DNA-segment-20 ti, joka koodaa aktiivisuuden, joka antaa resistenssin antibioottia vastaan.

ApR - geeni, joka antaa ampisilliiniresistenssin.

Bifunktionaalinen kloonaussukkula -vektori - rekom-binantti-DNA-kloonausvektori, joka voi replikoitua ja/tai 25 integroitua kahden eri luokan organismeihin.

Ceph DNA - Cephalosporium acremoniumin DNA.

Ceph ori - Cephalosporium acremoniumin mitokondri-aalinen DNA, joka huolehtii rekombinantti-DNA-vektorin ekstrakromosomaalisesta ylläpidosta.

30 Kloonaus - prosessi, jolla viedään DNA-segmentti rekombinantti-DNA-kloonausvektoriin.

cos - faagi A:aan kohesiiviset loppusekvenssit.

Kosmidi - rekombinantti-DNA-kloonausvektori, joka voi replikoitua isäntäsolussa samaan tapaan kuin plasmidi 35 mutta joka voi myös pakkautua faagin päihin.

- 95810 5

Funktionaalinen polypeptidi - talteenotettavissa oleva bioaktiivinen heterologinen tai homologinen polypeptidi tai prekursori, talteenotettavissa oleva bioaktiivinen polypeptidi, joka käsittää heterologisen polypeptidin 5 ja osan tai kokonaan homologisesta polypeptidistä, tai talteenotettavissa oleva bioinaktiivinen fuusiopolypeptidi joka käsittää heterologisen polypeptidin ja bioinaktivoi-van homologisen polypeptidin, joka voidaan spesifisesti katkaista.

10 Geenikirjasto - joukko rekombinantti-DNA-kloonaus- vektoreita, joihin on kloonattu DNA-segmenttejä, jotka pääosin edustavat tietyn organismin koko genomia.

HmR - hygromysiiniresistenssin antava geeni.

Hybridisaatio - prosessi, jossa liitetään toisiinsa 15 kaksi homologista yksisäikeistä DNA-molekyyliä, jolloin muodostuu kaksisäikeinen DNA-molekyyli, joka saattaa olla tai ei ole täydellisesti emäspariutunut.

IPS - isopenisilliini N -syntetaasia koodaava DNA.

IPSp - Cephalosporium acremoniumin isopenisilliini 20 N -syntetaasi (IPS) geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi.

IPSt - IPS-geenin transkription lopetus- ja mRNA:n polyadenylaatio ja prosessisignaalit. Isopenisilliini N -syntetaasi - entsyymi, joka myös tunnetaan nimellä syk-25 laasi,joka katalysoi isopenisilliini N:n muodostusta δ-(L-α-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiinista.

KmR - kanamysiiniresistenssin antava geeni.

mel - tyrosinaasigeeni.

mRNA - lähetti RNA.

30 PGK - Saccharomyces cere-visiae-niivan fosfoglyse- ·· raattikinaasigeenin transkriptiota ja translaatiota akti voiva sekvenssi.

Rekombinantti-DNA-kloonausvektori - mikä tahansa autonomisesti replikoituva tai integroitunut molekyyli, 35 sisältäen, näihin rajoittumatta, plasmidit, jotka käsittä- 6 95810 vät DNA-molekyylin, johon yksi tai useampi lisä-DNA-mole-kyyli voidaan lisätä tai on lisätty.

Rekombinantti-DNA-ekspressiovektori - mikä tahansa autonomisesti replikoituva tai integroitunut molekyyli, 5 sisältäen, näihin rajoittumatta, plasmidit, jotka käsittävät transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin, joka on valmiudessa aikaansaamaan DNA-segmentin ekspression, joka DNA-segmentti koodaa polypeptidia tai RNA:ta, joilla on tutkimus- tai kaupallista kiinnostusta.

10 Rekombinantti DNA-vektori - mikä tahansa rekombi- nantti DNA-kloonaus- tai -ekspressiovektori.

Restriktiofragmentti - mikä tahansa lineaarinen DNA-molekyyli, joka on muodostunut yhden tai useamman entsyymin vaikutuksesta.

15 rRNA - ribosomaalinen RNA.

Sensitiivinen (herkkä) isäntäsolu - isäntäsolu, joka ei voi kasvaa tietyn antibiootin läsnäollessa ilman DNA-segmenttiä, joka antaa sille resistenssin.

TcR-tetrasykliiniresistenssin antava geeni.

20 Transkriptiota aktivoiva sekvenssi - DNA-sekvenssi, joka edistää DNA:n transkriptiota.

Transfektantti - resipientti (vastaanottava)-isäntäsolu, joka on transformoitu faagi-DNA:11a.

Transformantti - resipientti (vastaanottava) 25 isäntäsolu, joka on transformoitu.

Transformaatio - DNA:n vieminen resipientti- isän-täsoluun, mikä muuttaa genotyyppiä ja aiheuttaa muutoksen resipienttisolussa.

Translaatiota aktivoiva sekvenssi - DNA-sekvenssi, 30 joka translaatioituneena mRNAzksi edistää mRNA:n translaa-.. tiota proteiiniksi.

trp - E. colin tryptofaanioperonin transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi.

Kuvioissa 1-7 esitetyt restriktiopaikka- ja toimin-35 takartat ovat tässä kohteena olevien rekombinantti-DNA- 95810 7 vektoreiden summittaisia kuvauksia. Kartalla olevien restriktiopaikkojen etäisyydet ovat suhteessa vektorilla olevien restriktiopaikkojen todellisiin välimatkoihin, mutta havaitut restriktiopaikkojen etäisyydet voivat poiketa 5 jonkin verran lasketuista karttaetäisyyksistä. Restriktio-paikkainformaatio ei ole tyhjentävä; sentähden vektorilla saattaa olla enemmän tietyntyyppisiä restriktiopaikkoja, kuin itse asiassa on kartalla esitetty.

Kuvio 1. Plasmidin pIT335 restriktlopaikka- ja toi-10 mintakartta.

Kuvio 2. Plasmidin pCZ106 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

Kuvio 3. Plasmidin pIT337 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

15 Kuvio 4. Plasmidin pIT221 restriktiopaikka- ja toi- mintakartta.

Kuvio 5. Plasmidin pPS20 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

Kuvio 6. Plasmidin pPS19 restriktiopaikka- ja toi-20 mintakartta.

Kuvio 7. Plasmidin pPS21 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

Kuvio 8. Plasmidin pPS21A restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

• * 25 Kuvio 9. Plasmidin pPS25 restriktiopaikka- ja toi- mintakartta.

Kuvio 10. Plasmidin pPS28 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

Kuvio 11. Plasmidin pPS29 restriktiopaikka- ja toi-30 mintakartta.

Kuvio 12. Plasmidin pPS26 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

Kuvio 13. Plasmidin pPS34 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta.

8 95810

Kuvio 14. Plasmidin pIT336 restriktiopaikka- ja toimintakartta.

Kuvio 15. Plasmidin pPS35 restriktiopaikka- ja toimintakartta .

5 Kuvio 16. Plasmidin pPS27 restriktiopaikka- ja toi mintakartta.

Kuvio 17. Plasmidin pPS37 restriktiopaikka- ja toimintakartta.

Tämä keksintö koskee eristettyä DNA-yhdistettä ja 10 rekombinantti-DNA-kloonaus- ja -ekspressiovektoreita, jot ka koodaavat isopensilliini N -syntetaasin aktiivisuutta.

Keksinnön mukaiselle eristetylle DNA-yhdisteelle on tunnusomaista, että se on a) kuviossa 1 esitetyn plasmidin pIT335 noin 1,5 15 kb:n NcoI-BamHI -restriktiofragmentti, joka voidaan saada E. coli -bakteerin kannasta K12 JA22l/pIT335 (NRRL B-15960), tai b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu edellä määritellyn DNA-yhdisteen kanssa rajoittavissa olosuhteissa ja 20 joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasia.

Erityinen DNA-sekvenssi, joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta on esitettynä alla. Siinä esitetään ainoastaan kaksisäikeisen DNA-molekyylin "sense" - eli koodaava säie ja DNA kuvataan vasemmalta oikealle • · 25 5'-* 3'- suuntaan. Nukleotidisekvenssi on numeroitu; nume rot ilmenevät DNA-sekvenssin yläpuolella. Välittömästi kunkin DNA-sekvenssirivin alapuolella on merkittynä iso-penisilliini N -syntetaasin aminohappotähdesekvenssi vasemmalta oikealle suunnassa aminopää -* karboksipää. Kukin 30 aminohappotähde esitetään sen DNA:n alla, joka koodaa sitä. Aminohappotähdesekvenssi on numeroitu; numerot ilmenevät aminohappotähdesekvenssin alla.

95810 9 DNA-sekvenssi, joka koodaa isopenisilliini N -syn-tetaasin aktiivisuuden ja vastaava aminohapposekvenssi

10 20 30 AO

5’-ATG GGT TCC GTT CCA GTT CCA GTG GCC AAC GTC CCC CGA ATC GAT GTC

MET GLY SER VAL PRO VAL PRO VAL ALA ASN VAL PRO ARG ILE ASP VAL

5 5 10 15 50 60 70 80 90

TCG CCC CTA TTC GGC GAT GAC AAG GAG AAG AAG CTC GAG GTA GCT CGC

SER PRO LEU PHE GLY ASP ASP LYS GLU LYS LYS LEU GLU VAL ALA ARG

20 25 30 10 100 110 120 130 140

GCC ATC GAC GCC GCA TCG CGC GAC ACA GGC TTC TTT TAC GCG GTG AAC

ALA ILE ASP ALA ALA SER ARG ASP THR GLY PHE PHE TYR ALA VAL ASN

35 40 45 150 160 170 180 190

CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG CTC TCG CGC GAG ACG AAC AAA TTC CAC

15 HIS GLY VAL ASP LEU PRO TRP LEU SER ARG GLU THR ASN LYS PHE HIS

50 55 60 200 210 220 230 240

ATG AGC ATC ACG GAC GAG GAG AAG TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC

MET SER ILE THR ASP GLU GLU LYS TRP GLN LEU ALA ILE ARG ALA TYR

65 70 75 80 20 250 260 270 280

AAC AAG GAG CAC GAG TCC CAG ATC CGG GCG GGC TAC TAC CTG CCG ATC

ASN LYS GLU HIS GLU SER GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU PRO ILE

85 90 95 290 300 310 320 330

CCG GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG AAC CCC TCC TTC

25 PRO GLY LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO SER PHE

100 105 110 340 350 360 370 380

AGC CCA GAC CAC CCG CGA ATC AAG GAG CCC ACC CCT ATG CAC GAG GTC

SER PRO ASP HIS PRO ARG ILE LYS GLU PRO THR PRO MET HIS GLU VAL

30 115 120 125 390 400 410 420 430

AAC GTC TGG CCG GAC GAG GCG AAG CAC CCG GGG TTC CGG GCC TTC GCC

ASN VAL TRP PRO ASP GLU ALA LYS HIS PRO GLY PHE ARG ALA PHE ALA

130 135 140 440 450 460 470 480

35 GAG AAG TAC TAC TGG GAC GTC TTC GGC CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC

: GLU LYS TYR TYR TRP ASP VAL PHE GLY LEU SER SER ALA VAL LEU ARG

145 150 155 160 10 95810 490 500 510 520 GGC TAC GCT CTC GCC CTA GGT CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY ARG ASP GLU ASP PHE PHE THR ARG HIS 165 170 175 530 540 550 560 570

TCC CGC CGT GAC ACG ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC ATC CGT TAC CCG 5 SER ARG ARG ASP THR THR LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO

180 185 190 580 590 600 610 620 TAC CTC GAC CCG TAC CCG GAG CCG GCC ATC AAG ACG GCC GAC GAC GGC TYR LEU ASP PRO TYR PRO GLU PRO ALA ILE LYS THR ALA ASP ASP GLY 195 200 205 10 630 640 650 660 670 ACC AAG CTC AGC TTC GAG TGG CAC GAG GAC GTG TCC CTC ATC ACG GTG THR LYS LEU SER PHE GLU TRP HIS GLU ASP VAL SER LEU ILE THR VAL 210 215 220 680 690 700 710 720 TTG TAC CAG TCC GAC GTG CAG AAT CTG CAG GTC AAG ACC CCG CAG GGC 15 LEU TYR GLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS THR PRO GLN GLY 225 230 235 240 730 740 750 760

TGG CAG GAC ATC CAG GCT GAC GAC ACG GGC TTC CTC ATC AAC TGC GGC

TRP GLN ASP ILE GLN ALA ASP ASP THR GLY PHE LEU ILE ASN CYS GLY

245 250 255 20 770 780 790 800 810

AGC TAC ATG GCC CAT ATC ACC GAC GAC TAC TAC CCG GCC CCG ATC CAC

SER TYR MET ALA HIS ILE THR ASP ASP TYR TYR PRO ALA PRO ILE HIS

260 265 270 820 830 840 850 860 CGC GTC AAA TGG GTC AAC GAG GAG CGC CAG TCA CTG CCC TTC TTC GTC 25 ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL 275 280 285 870 880 890 900 910

AAC CTG GGC TGG GAG GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC

ASN LEU GLY TRP GLU ASP THR ILE GLN PRO TRP ASP PRO ALA THR ALA

290 295 300 30 920 930 940 950 960

; AAG GAT GGG GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC TCC TAC

LYS ASP GLY ALA LYS ASP ALA ALA LYS ASP LYS PRO ALA ILE SER TYR 305 310 315 320 970 980 990 1000

GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG AAT GGT 35 GLY GLU TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY

325 330 335 .: 1010 CAG ACC TAA-3*

GLN THR

95810 11 jossa sekvenssissä A on deoksiadenyyli, G on deoksiguanyy-li, C on deoksisytidyyli, T on tymidyyli, ALA on alaniini-tähde, ARG on arginiinitähde, ASN on asparagiinitähde, ASP on asparagiinihappotähde, CYS on kysteiinitähde, GLN on 5 glutamiinitähde, GLU on glutamiinihappotähde, GLY on gly-siinitähde, HIS on histidiinitähde, ILE on isoleusiinitähde, LEU on leusiinitähde, LYS on lysiinitähde, MET on me-tioniinitähde, PHE on fenyylialaniinitähde, PRO on pro-liinitähde, SER on seriinitähde, THR on treoniinitähde, 10 TRP on tryptofaanitähde, TYR on tyrosiinitähde, ja VAL on väliinitähde.

Edellä esitetyn DNA-sekvenssin G ja C- pitoisuus on noin 63 % ja se koodaa polypeptidiä, isopenisilliini N -syntetaasia, jolla on laskettu molekyylipaino 38 476 dal-15 töniä ja havaittu molekyylipaino noin 40 000 daltöniä.

Alan ammattimiehet ymmärtävät, että edellä esitetty DNA-sekvenssi on tärkeä osa tätä keksintöä. Esitetty sekvenssi voidaan tavanomaisesti syntetisoida modifioidulla fosfotriesterimenetelmällä käyttäen täysin suojattuja de-20 oksiribonukleotidi rakenneosia. Sellaiset synteettiset menetelmät ovat hyvin tunnettuja alalla ja ne voidaan suorittaa oleellisesti käyttäen menetelmää Itakura et ai.

Science 198 (1977) 1056 ja Crea et ai., Proc. Nat. Acad.

Sei. USA 75 (1978) 5765. Lisäksi erityisen edullinen me-25 netelmä on esitetty julkaisussa Hsiung et ai. Nucleic Acid Research 11 (1983) 3227 ja Narang et ai. Methods in Enzy-mology 68 (1980) 90. Yllä mainittujen manuaalisten menetelmien lisäksi voidaan DNA-sekvenssi syntetisoida käyttäen automaattisia DNA-syntetisaattoria, kuten Systec 30 1450A - tai ABS 380A - DNA:n syntetisaattoria.

Geneettisen koodin degeneroituneen luonteen takia, mikä johtuu siitä, että on olemassa enemmän kuin yksi kodon! useimpia aminohappotähteitä ja loppusignaalia kohden, voi edellä esitettyä isopenisilliini N -syntetaasin amino-35 happotähdesekvenssiä koodata joukko erilaisia DNA-sekvens- 12 95810 sejä. Koska nämä vaihtoehtoiset DNA-sekvenssit koodaisivat tämän keksinnön mukaisen aminohappotähdesekvenssin, käsittää tämä keksintö lisäksi nämä vaihtoehtoiset sekvenssit.

Lisäksi voisi olla olemassa tämän keksinnön mukai-5 sen isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n geneettisiä variantteja. Näillä geneettisillä varianteilla olisi yhteisenä piirteenä huomattava DNA- ja aminohappotähdesekvenssin homologia tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden kanssa, ja niillä olisi samanlainen, ellei identtinen, 10 aktiivisuus, mutta ne eroaisivat jonkin verran tämän keksinnön mukaisista varsinaisista yhdisteistä. Nämä geneettiset variantit ovat myös tämän keksinnön mukaisten yhdisteiden suhteen ekvivalentteja.

Tämän keksinnön mukaiset isopenisilliini N -synte-15 taasin aktiivisuutta koodaavat DNA-yhdisteet eristettiin Cephalosporium acremonium -kannasta, joka yleisesti tunnetaan nimellä Brotzu-kanta ja joka on saatavissa American Type Culture Collection*ista Rockville, Maryland, talle-tusnumerolla ATCC 11550. C. acremonium -kannan kokonais-20 genomin DNA:n geenikirjasto konstruoitiin ja geenikirjas-toa tutkittiin sekvenssien läsnäolon suhteen, jotka olisivat homologisia 64 erilaisesta deoksiribo-oligonukleoti-dista koostuneen joukon suhteen. Tämä 64 erilaisen deoksi-ribooligonukleotidin joukko konstruoitiin sen informaation 25 mukaisesti, joka oli saatu C. acremoniumin isopenisilliini N -syntetaasin aminoterminaalisesta aminohapposekvenssistä ja geneettisen koodin mukaisesti. Valikoima geenikirjaston vektoreita identifioitiin, jotka olivat homologisia yhdelle tai useammalle 64:lie erilaiselle deoksiribo-oligonuk-30 leotidille. DNA:n sekvensointi paljasti, mitkä vektorit koodasivat C. acremoniumin isopenisilliini N -syntetaasia.

Sen jälkeen kun isopenisilliini N -syntetaasia koodaavat vektorit oli identifioitu, modifioitiin yhtä erityistä isopenisilliini N -syntetaasia koodaavaa vektoria 35 suurimman osan Cephalosporium acremoniumin vektorissa läs- • · 95810 13 näolevan DNA:n poistamiseksi, joka ei koodannut isopeni-silliini N -syntetaasia. Muodostunut vektori, joka nimettiin plasmidiksi pIT335, on transformoitu E. coli K12 JA221 -isäntäsoluihin ja E. coli K12 JA221/pIT335 -trans-5 formantit on talletettu ja saatettu osaksi kantaviljelmä-kokoelmaa talletuslaitoksessa Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15960. Plasmidin pIT335 restriktiopaikka- ja toiminta-kartta on esitetty kuviossa 1.

10 Plasmidi pIT335 voidaan eristää E. colista K12 JA221 menetelmällä, joka on kuvattu esimerkissä 1. Plasmi-dia pIT335 käytettiin lähtömateriaalina konstruoitaessa plasmidia, joka nimettiin pIT337 ja joka toteuttaa korkeatasoisen isopenisilliini N -syntetaasin ekspression E. co-15 llssa. Plasmidi pIT337 konstruoitiin liittämällä plasmidin pIT335 noin 1,5 kb NcoI-BamHI-restriktiofragmentti plasmidin pCZ106 noin 8,7 kb Ncol-Ncol ja noin 1,6 kb NcoIBamHI-restriktiofragmenttiin.

Plasmidi pCZlQ6 käsittää "runaway"-replikonin, 20 trp:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin ja operaattorin, ja DNA-sekvenssin, joka koodaa naudan kasvuhormonin johdannaisen. Plasmidilla pCZ106 olevan "runaway"-replikonityypin käyttöä kuvataan US-patenteissa 4 487 835, 4 499 189 ja 4 495 287. Pääasiallisesti, alhai-25 sissa noin 25°C lämpötiloissa, on plasmidilla, joka sisältää "runaway"-replikonin, kopiomäärä noin 10-15 kopiota E. coli-isäntäsolua kohti, mutta kun lämpötilaa nostetaan noin 37*C:seen, kopiomäärä nousee noin 1000:teen kopiota per E. coli-isäntäsolua kohti. E. coli K12 RV308/ pCZ106-30 isäntäsolut, joista plasmidi pCZ106 voidaan eristää, on talletettu ja saatettu osaksi kantaviljelmäkokoelmaa talletuslaitoksessa Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15959. Plasmidin pCZ106 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty 35 kuviossa 2.

14 95810

Plasmidi pIT337 sisältää plasmidin pCZ106 "runaway" -repi ikonin ja trp:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin ja isopenisilliini N -syntetaasi-geenin proteiinia koodaavan sekvenssin plasmidista 5 pIT335:stä. Plasmidin plT335 noin 1,5 kb NcoI-BamHI rest-riktiofragmentti sisältää isopenisilliini N -syntetaasin koko proteiinia koodaavan sekvenssin, ja Ncol-restriktio-entsyymin tunnistussekvenssi, joka on: 5'-CCATGG-3' #14 it» 10 3' GGTACC-5' sisältää: 5-ATG-3'

I t I

3-TAC-5' joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasin aminoterminaa-15 Iita metionyyliä. Plasmidi pIT337 konstruoitiin siten, että trp:n transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi sijaitsisi niin, että se voisi aikaansaada iso-penisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n ilmenemisen. Plasmidin pIT337 restriktiopaikka- ja toimintakartta on 20 esitetty kuviossa 3. Esimerkki 2 kuvaa plasmidin pIT337 rakennetta yksityiskohtaisemmin.

Noin 37 "C lämpötiloissa plasmidin pIT337 sisältävät E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624)-solut ilmentävät (eks-pressoivat) isopenisilliini N -syntetaasin suurina määri-25 nä, lähestyen noin 9 % solun kokonaisproteiinista. Näiden E. coli K12 RV308/pIT337 -transformanttien raakasolu-uut-teet kykenevät katalysoimaan muutoksen 6-(L-a-aminoadipyy-li)-L-kysteinyyli-D-valiinista isopenisilliini N:ksi, kun taas transformoimattomien E. coli K12 RV308 -solujen so-30 lu-uutteet eivät pysty katalysoimaan tätä muutosta. Kon-versioreaktion määritysmenetelmä ja määritystulokset esitetään esimerkissä 3.

Plasmidi pIT337 tarjoaa tehokkaan keinon tuottaa suuria määriä isopenisilliini N -syntetaasia E. colissa.

35 Koska E. coli -transformantit, joissa on plasmidi pIT337, • · 95810 15 ekspressoivat isopenisilliini N -syntetaasia tasoina, jotka lähestyvät 9 % kokonaissoluproteiinista ja koska E. colin viljely on vähemmän komplisoitua kuin niiden organismien viljely, jotka luonnostaan tuottavat isopenisil-5 liini N -syntetaasia, voidaan E. coli/pIT337 -transfor-mantteja käyttää tuottamaan rekombinantti-isopenisilliini N -syntetaasia tehokkaammin ja taloudellisemmin kuin ei-rekombinantti- tai "luonnollisia" isopenisilliini N -syn-tetaasituottajia. Isopenisilliini N -syntetaasia voidaan 10 käyttää tuottamaan isopenisilliini N tuotteesta 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiini soluvapaassa systeemissä kuten on kuvattu esimerkissä 3. Isopenisilliini N ei ole ainoastaan hyödyllinen antibiootti, vaan se on myös lähtömateriaali sellaisten tärkeiden antibioottien tuotta-15 misessa kuin penisilliini N, kefaleksiini ja muut kefalos-poriinit (katso US-patentti 4 307 192). Ehkä kaikkein tärkein isopenisilliini N -syntetaasin käyttö on entsyymin käyttö tripeptidien kondensoimiseksi, muiden kuin 6-(L-a-aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiinin, uusiksi B-laktaa-20 mi j ohdannaisiksi.

Penisilliiniä tuottavien organismien soluvapaita uutteita voidaan käyttää syntetisoitaessa ei-luonnollisia (ei-luonnossa tuotettuja) B-laktaameja. Tämän keksinnön mukaiset E. colin ekspressiovektorit tarjoavat halvan ja 25 tehokkaan menetelmän isopenisilliini N -syntetaasin saamiseksi, jota voidaan käyttää in vitro kondensoimaan tripep-tidejä, jotka eivät esiinny luonnossa, muodostamaan uusia antibiootteja tai antibioottien ydinrakenteita. Ei-luonnollisten tripeptidien etsintää, jotka toimivat isopeni-30 silliini N -syntetaasin substraatteina, voidaan täydentää etsimällä mutantti-isopenisilliini N -syntetaaseja, jotka hyväksyvät ei-luonnolliset tripeptidit substraateiksi.

Tämä keksintö antaa lähtömateriaalin sellaiselle isopenisilliini N syntetaasi-mutantin etsinnälle. E. coli on 35 paras isäntä mutaatiokloonauskokeisiin ja tämän keksinnön 16 95810 mukaiset E. colin ekspressiovektorit voidaan helposti mu-tatoida menetelmillä, jotka ovat hyvin alalla tunnettuja, kuten esimerkiksi säteilykäsittely (röntgensäde tai UW) tai kemialliset mutageenit (kuten etyylimetaanisulfonaat-5 ti, nitrosoguanidiini, tai metyylimetaanisulfonaatti) tai paikkaspesifinen mutageneesi, mutanttientsyymien saamiseksi, jotka tunnistavat ei-luonnolliset tripeptidit substraatteina ja katalysoivat nuo ei-luonnolliset tripeptidit ei-luonnollisiksi β-laktaameiksi.

10 Tämä keksintö ei ole rajoittunut tässä esimerkkeinä kuvattuihin erityisiin vektoreihin. Sen sijaan tämä keksintö käsittää DNA-yhdisteitä, jotka koodaavat isopenisil-liini N -syntetaasin aktiivisuuden. Tämän keksinnön mukaisia DNA-yhdisteitä voidaan käyttää konstruoimaan ekspres-15 siovektoreita, jotka tuovat esiin isopenisilliini N -syntetaasin ekspression missä tahansa isäntäsolussa, jossa ekspressiovektori replikoituu tai integroituu ja jossa transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi, jota käytetään isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden il-20 menemiseen, toimii.

Sentähden, vaikkakin E. colin ekspressiovektorit, joista tässä on ollut esimerkkejä, käyttävät hyväksi "runaway "-repiikonia, joka toimii E. colissa, sisältää tämä keksintö minkä tahansa E. colin ekspressioplasmidin tai 25 vektorin, joka aikaansaa isopenisilliini N -syntetaasin ekspression E. colissa. Näin ollen tämä keksintö käsittää ekspressiovektorit, jotka aikaansaavat isopenisilliini N -syntetaasin ekspression ja käyttävät hyväksi replikonia, joka toimii E. colissa, kuten esimerkiksi replikoni sel-30 laisista plasmideista kuin pBR322, pACYC184, F, ColV-K94,

Rl, R6-5 tai R100. Tämä keksintö ei myöskään ole yksistään rajoittunut plasmidivektoreihin, sillä tämä keksintö sisältää myös ekspressiovektorit, jotka ekspressoivat isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden ja käyttävät hyö-35 dyksi integraatiota tai virusreplikaatiota replikaation ja 95810 17 ylläpidon varmistamiseksi isäntäsolussa. Tämä keksintö ei ole rajoittunut tiettyyn transkriptiota ja translaatiota aktivoivaan sekvenssiin isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden koodaavan DNA:n ekspression aikaansaamisek-5 si. Tämä keksintö sisältää minkä tahansa transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin käytön, joka toimii E. colissa ja jota käytetään ilmentämään isopenisilliini N -syntetaasi E. colissa. Tunnetaan monia transkriptiota ja translaatiota aktivoivia sekvenssejä, jotka toimivat E.

10 colissa ja ne ovat sopivia isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden ekspression aikaansaamiseksi E. colissa. Sellaiset transkriptiota ja translaatiota aktivoivat sekvenssit sisältävät, näihin rajoittumatta, lpp-, lac-, trp, tae-, 6Pl ja 6Pr transkriptiota ja translaatiota aktivoivia 15 sekvenssej ä.

Yllä kuvattujen erilaisten E. colin transkriptiota ja translaatiota aktivoivien sekvenssien lisäksi voidaan transkriptiota ja translaatiota aktivoivia sekvenssejä muista organismeista liittää näihin isopenisilliini N -20 syntetaasia koodaaviin DNA-yhdisteisiin, jolloin muodostuu ekspressiovektoreita, jotka aikaansaavat isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden ekspression isäntäsoluissa, joissa aktivoitu sekvenssi toimii. Vaikkakin E. coli on isäntä, joka parhaiten sopii isopenisilliini N -syntetaa-25 sin tuotantoon ja sen jälkeiseen puhdistukseen in vitro -käyttöä varten, ovat hyödyllisiä myös vektorit, jotka aikaansaavat isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden ekspression muissa isäntäsoluissa kuin E. coli, erityisesti käyttötarkoituksissa, jotka lisäävät 6-laktaamianti-30 biootin tuottokykyä ja -tehoa tietyllä organismilla. Lu-* kuisat eri organismit tuottavat B-laktaamiantibiootteja.

Seuraavassa taulukossa esitetään ei-tyhjentävä luettelo 6-laktaamiantibiootteja tuottavista organismeista.

Taulukko I

18 95810 β-laktaamiantibioottia tuotavat organismit:

Organismi Antibiootti

Agrobacterium erilaisia β-laktaameja,

Cephalosporium acremonium penisilliniä ja kefalosporii- nia

Chromobacterium erilaisia β-laktaamej a

Gluconobacter erilaisia β-laktaameja

Nocardia

lactamadurans kefamysiini C

uniformis nokardisiini

PeniciIlium chrysogenum erilaisia penisilliiniä ja muita β-laktaameja

Serratia erilaisia β-laktaameja S treptomyce s antibioticus klavulaanihappo, argenteolus asparenomysiini A, MM 4550, ja MM 13902 cattleya tienamysiini chartreusis SF 1623 ja

kefamysiini A ja B cinnamonensis kefamysiini A ja B

clavuligerus PA-32413-I, kefamysiini C, A16886A, penisilliinejä, kefalosporiineja, klavulaanihappo, ja muita klavaameja

fimbriatus kefamysiini A ja B

flavovirens MM 4550 ja MM 13902 flavus MM 4550 ja MM 13902 fulvoviridis MM 4550 ja MM 13902

griseus kefamysiini A ja B

ja karpetimysiini A ja B halstedi kefamysiini A ja B

heteromorphus C2081X ja

kefamysiini A ja B

hygroscopicus deasetoksikefalosporiini C

lipmanii kefamysiini, penisilliini N, 7-metoksikefalosporiini C, AI6884, MM4550, MM13902 olivaceus epitienamysiini F, MM 4550 ja MM 13902 ; pana-yensis C2081X ja

kefamysiini A ja B pluracidomyceticus plurasidomysiini A

rochei kefamysiini A ja B

sioyaensis MM 4550 ja MM 13902

sp OA-6129 OA-6129A

sp KC-6643 karpetimysiini A,

tokunomensis asparenomysiini A

. viridochromogenes kefamysiini A ja B

* wadayamensis WS-3442-D

19 95810

Monia edellä olevista β-laktaamiantibiootin tuotta-jaorganismeista käytetään farmaseuttisessa teollisuudessa antibioottien tuottamiseen. Näiden organismien antibioottien tuottokykyä voidaan lisätä ja tehdä tehokkaammaksi 5 lisäämällä antibiootteja biosyntetisoivien entsyymien so-lunsisäistä konsentraatiota fermentoinnin aikana. Tämän keksinnön mukaisia isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavia DNA-yhdisteitä voidaan käyttää konstruoimaan ekspressiovektoreita, jotka transformoituina sopivaan 10 isäntäsoluun lisäävät transformoidun isäntäsolun solunsi-säistä isopenisilliini N -syntetaasin konsentraatiota ja siten lisäävät tuon solun antibiootin tuottokykyä ja tehokkuutta, edellyttäen, että isäntäsolu tuottaa B-laktaa-miantibioottia välireaktion kautta, johon liittyy isopeni-15 silliini N -syntetaasin aktiivisuus.

Vektori, joka lisää isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden solunsisäistä konsentraatiota tietyssä isännässä, johon vektori transformoidaan, tarvitsee seuraavat elementit: 20 (1) tämän keksinnön mukaisen isopenisilliini N -syntetaa sin aktiivisuutta koodaavan DNA-yhdisteen, (2) transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi, joka ei ainoastaan toimi isäntäsolussa, joka transformoidaan, vaan joka on myös oikeassa lukuvaiheessa ja asemassa 25 toteuttamaan isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavan DNA:n ekspression, ja (3) replikaatio- ja integraatiotoiminnot, jotka vastaavat vektorin ylläpidosta isäntäsolussa.

Tietenkin voisi yllä kuvattu vektori sisältää myös anti-30 bioottiresistenssin antavan geenin tai jonkin muun elementin, joka antaa keinon valikoida vektorin sisältäviä isäntäsolu ja, mutta sellaiset valikoitavat elementit eivät ehkä ole välttämättömiä eikä tavoiteltuja, kun vektori integroituu isäntäsolun kromosomaaliseen DNA:hän.

« - 95810 20

Plasmidi pPS20 on tämän keksinnön mukainen ekspres-siovektori, joka on esimerkkinä vektorityypistä, joka on tarkoitettu lisäämään isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden solunsisäistä konsentraatiota B-laktaamianti-5 bioottia tuottavassa isäntäsolussa. Plasmidi pPS20 konstruoitiin sijoittamalla plasmidin pIT221 noin 2,7 kb Hind- 111-restriktiofragmentti plasmidin plT335 ainoaan Hindlll-restriktioentsyymin tunnistuspaikkaan. Plasmidin pIT22l noin 2,7 kb Hindlll-restriktiofragmentti käsittää hiivan 10 Saccharomyces cerevisiae fosfoglyseraattikinaasi (PGK) -geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin liittyneenä oikeassa asemassa ja suunnassa hygromysii-niresistenssin antavan geenin ekspression toteuttamiseksi.

Koska plasmidin pIT221 noin 2,7 kb HindiII-restriktiofrag-15 mentti voitaisiin sijoittaa HindIII:lla hajotettuun plas-midiin pIT335 molemmissa kahdesta suunnasta, liittyminen, joka tuotti plasmidi pPS20:n, tuotti myös toiminnallisesti ekvivalentin isomeerin, joka on nimetty plasmidiksi pPS20,l. Plasmidin pPS20 restriktiopaikka- ja toiminta-20 kartta on esitetty kuviossa 5; plasmidien pPS20 ja pPS20,l konstruktiota kuvataan esimerkissä 4.

Plasmidi pIT221 -lähtömateriaali, jota käytettiin plasmidien pPS20 ja pPS20,l konstruoinnissa kuvattiin EP-patenttijulkaisussa 177 243. Konstruktion kulkukaaviot 25 I-VI ja esimerkit 1-6 kuvaavat plasmidin pIT221 konstruktiota ja julkaisu liitetään tähän viitteenä. Plasmidin pIT221 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 4.

Plasmidin pIT221 noin 2,7 kb Hindlll-restriktio-30 fragmentti sisältää hygromysiiniresistenssin antavan geenin liittyneenä hiivan PGK transkriptiota ja translaatiota aktivoivaan sekvenssiin oikeassa asemassa ja suunnassa hygromysiiniresistenssin antavan aktiivisuuden ilmenemiseksi (HmR). Kuten on esitetty EP-patenttijulkaisussa 35 177 243 voidaan PGK-HmR -geeniä käyttää transformoimaan 95810 21

Cephalosporium acremonium ja läheisiä isäntäsoluja hygro-mysiiniresistenttin fenotyyppln muodostamiseksi.

Plasmidi pPS20 sisältää PGK-HmR -geenin ja Cephalosporium acremonium/pPS20 -transformantteja voidaan vali-5 koida hygromysiiniresistenssin antavan aktiivisuuden perusteella, minkä transformantit ilmentävät. Plasmidi pPS20 sisältää myös tämän keksinnön mukaisen isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n yhdessä genomin DNA:n kanssa, joka reunustaa isopenisilliini N -syntetaasia koodaava 10 DNA:n Cephalosporium acremoniumin genomissa. Koska plasmidi pPS20 sisältää melkein 3 kb genomin DNA:ta, joka sijaitsi vastavirtaan isopenisilliini N -syntetaasia koodaa-vassa DNA:ssa Cephalosporium acremoniumin genomissa, sisältää plasmidi pPS20 ilman muuta isopenisilliini N -syn-15 tetaasia koodaavan DNA:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin. Useimmat transkriptiota ja translaatiota aktivoivat sekvenssit koodataan aktivoitavan DNA:n suhteen vastavirtaan, vaikkakin jotkut ribosomaalis-ta RNA:ta koodaavat DNA-sekvenssit aktivoituvat transkrip-20 tiota aktivoivien sekvenssien kautta, jotka eivät sijaitse koodaavassa alueessa vastavirtaan. "Vastavirtaan" on sana, jota käytetään molekyylibiologian alalla, ja tässä tekstissä se viittaa DNA:hän 5'-suunnassa isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n koodaavan säikeen 5'-päästä.

25 Cephalosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi koodattuna plasmidilla pPS20 sijaitsee oikein aikaansaamaan isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavan DNA:n ekspression, koska plasmidin pPS20 konstruoinnin yhteydessä ei tehty 30 deleetioita eikä insertioita, jotka olisivat vaikuttaneet transkriptiota ja translaatiota aktivoivaan sekvenssiin, DNA:ssa, joka oli isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavan DNA:n koodittavan säikeen 5'-pään vieressä. Plasmidia pPS20 voidaan sen tähden käyttää lisäämään 35 Cephalosporium acremoniumin ja vastaavien isäntäsolujen « « 22 95810 antibioottien tuottokykyä ja tehokkuutta, soluissa, joissa C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi toimii. Tämä lisääntynyt antibiootin tuottokyky ja tehokkuus johtuu isopenisilliini N -syntetaasin aktii-5 visuuden lisääntyneestä tasosta transformantissa, johtuen isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavan DNA:n ylimääräisten ekspressoituneiden kopioiden läsnäolosta. Plasmidi pPS20 sisältää myös hygromysiiniresis-tenssin antavan geenin, joka toimii C. acremoniumissa ja 10 sallii C. acremonium/pPS20:n transformanttien seulonnan.

Sen jälkeen kun Cephalosporium acremonium/pPS20 -transformantit on seulottu, ei kuitenkaan ole tarvetta ylläpitää seulonta-ainetta, hygromysiini B:tä, transformanttien kasvualustassa. Seulonta-aineeseen ei ole mitään 15 tarvetta, koska C. acremonium/pPS20 -transformantit ovat hyvin stabiileja. Tämän stabiilisuuden uskotaan johtuvan siitä, että plasmidi pPS20 transformoi C. acremoniumin kromosomaalisen integraation kautta. Tämä keksintö ei kuitenkaan rajoitu plasmideihin, jotka aikaansaavat isopeni-20 silliini N -syntetaasin aktiivisuuden ekspression C. acremoniumissa ja transformoivat kromosomaalisen integraation kautta. Ekstrakromosomaalisia replikoituvia ekspressiovek-toreita C. acremoniumia varten on helppo valmistaa US-pa-tentissa 4 492 758 kuvatun mukaisesti. US-patentti 25 4 492 758 kuvaa mitokondriaalisia DNA-segmenttejä, jotka voidaan sijoittaa vektoriin kuten plasmidin pPS20, antamaan välttämättömät toiminnat vektorin replikaatiolle C. acremoniumissa.

Kuten edellä kuvattiin, sisältää plasmidi pPS20 ja 30 yksi plasmideista, joista pPS20 on peräisin, pIT335, Cep-. halosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin. Koska C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa sekvenssiä, joka sijaitsee plasmideissa pIT335 ja pPS20, voidaan käyttää aikaansaa-35 maan laajan DNA-sekvenssijoukon ekspressiota, on aktivoiva « 23 95810 sekvenssi tämän keksinnön tärkeä osa. Vaikkakin C. acremo-niumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin sekvenssitiedot ovat rajoitetut, aktivoivan sekvenssin tiedetään koodautuvan noin 500 bp Sall-Ncol -restriktio-5 fragmentissa, joka sijaitsee välittömästi vastavirtaan isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaavan DNA: n suhteen ja sen vieressä plasmideissa plT335 ja pPS20. Mikä tahansa restriktiofragmentti, joka sisältää edellä mainitun noin 500 bp Sall-Ncol -restriktiofragmen-10 tin, sisältää ilman muuta C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin.

Cephalosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivasta sekvenssistä, joka koodautuu plasmidissa pIT335, on olemassa sekvenssitietoja. Alla 15 oleva sekvenssi on DNA-sekvenssi, joka sijaitsee vastavirtaan isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuutta koodaa-vasta DNA:sta, joka on plasmidissa pIT335. Vain osa noin 500 bp Sall-Ncol -restriktiofragmentin sekvenssistä, joka sisältää aktivoivan sekvenssin, tunnetaan, kuten ilmenee 20 sekvenssissä esitetystä merkinnällä "XXXXXXXXXX" varuste tusta alueesta. Lisäselvityksenä siitä, kuinka aktivoiva sekvenssi on sijoittunut plasmidissa pIT335, kuvataan restriktiofragmentti yksinsäikeisen DNA:n päällekkäissek-vensseinä jotka on ominaisia restriktioentsyymien Sali ja 25 Ncol katkaisulle.

24 95810

Osa Cephalosporium acremoniumin DNA-sekvenssistä-Plasmidissa pIT335 koodautuvat transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi «-Λ.380 bp 1·

5 5'-TCGAC XXXXXXXXXX CGAATACTTG AATATTCCTT GGTCGCTCTT

I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I II I

3'-G XXXXXXXXXX GCTTATGAAC TTATAAGGAA CCAGCGAGAA

CTGATTTTCG AGGCTTCTCC TTCCGCCATC GTCGCCTCAC

llllllllll 111 I I I 11 I I llllllllll llllllllll

GACTAAAAGC TCCGAAGAGG AAGGCGGTAG CAGCGGAGTG

10

GCATATCTCG TCTTTCACAT CTTACACCAG CAGGACAAAC

llllllllll llllllllll llllllllll llllllllll

CGTATAGAGC AGAAAGTGTA GAATGTGGTC GTCCTGTTTG

CGTCAC-3' min GCAGTGGTAC-5' 15 t -1 isopenisilliini N -syntetaasia koodavan alueen alku. "TAC" on komplementaarinen 5'-ATG-3':lie, joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasin aminoterminaalista metionyy-20 liä.

Cephalosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa sekvenssiä voidaan käyttää minkä tahansa DNA-sekvenssin ekspression toteuttamiseen, kuten on havainnollistettu plasmidilla pPS21. Plasmidi pPS21 on * 25 plasmidi pIT221:n johdannainen, joka saadaan, kun korva taan PGK:n transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi, jota käytetään aikaansaamaan hygromysiiniresis-tenssin antavan geenin ekspressio, tämän keksinnön mukaisella C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota ak-30 tivoivalla sekvenssillä. Korvaaminen suoritettiin poista-.1 maila ensin plasmidin pIT221 noin 300 bp Xmal-fragmentti, jolloin syntyy plasmidi pPS19. Tämä Xmal-deleetio suoritettiin BamHl-restriktioentsyymin tunnistuspaikan poistamiseksi, joka olisi voinut häiritä pPS21:n konstruoimista.

35 Plasmidi pPS19 hajotettiin sitten BamHI:llä ja käsiteltiin g . Mt.k M14 I l 4 4** · « · 25 95810 E. colin DNA-polymeraasi I:n Klenow-fragmentilla. BamHI-hajotus poistaa noin 230 bp BamHI-restriktiofragmentin, joka sisältää pGK:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin; Klenow-käsittely muodostaa kaksisäi-5 keistä DNA:ta yksisäikeisistä BamHI:-päällekkäisfragmen-teista. Suuri, noin 7,7 kb plasmidin pPS19 BaHI-fragmentti liitettiin sitten plasmidin pIT335 noin 0,8 kb, Klenow-kä-siteltyyn, Ncol-restriktiofragmenttiin, joka plasmidi sisältää C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota 10 aktivoivan sekvenssin.

Tietenkin Klenow-käsitelty Ncol-restriktiofragment-ti voisi liittyä toiseen kahdesta suunnasta vain yhden mahdollisista sijaintipaikoista saavuttaessa halutun tuloksen oikean Cephalosporium acremoniumin transkriptiota 15 ja translaatiota aktivoivan sekvenssin sijainnin aikaansaamaan hygromysiiniresistanssin antavan geenin ekspressiota. Plasmidin pPS21 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 7 ja plasmidin pPS19 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 6. Yksityiskoh-20 taisempi kuvaus plasmidin pPS21 konstruktiosta on esitetty esimerkissä 5.

Plasmidi pPS21A on toinen tämän keksinnön mukaisista vektoreista, joka käyttää hyväksi IPS-geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa sekvenssiä aikaansaamaan 25 hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspressiota Cephalosporium acremoniumilla. Hyödyllistä välituote plasmi-dia, joka nimetään plasmidiksi pPS23, käytettiin konstruoitaessa plasmidi pPS21A. Plasmidi pPS23 konstruoitiin eristämällä plasmidin pIT335 noin 850 bp Ncol-restriktio-30 fragmentti, joka plasmidi sisältää IPS-geenin aktivoivan sekvenssin, kiinnittämällä linkkerit joissa on BamHI:n ja NcoI:n kanssa yhteen sopivat yksisäikeiset päällekkäis-fragmentit noin 850 bp Ncol-fragmenttiin, ja liittämällä muodostunut plasmidista pIT335 peräisin oleva noin 860 bp 35 BamHI-restriktiofragmentti BamHI:llä hajotettuun plasmi- 26 95810 diin pUC8. Tämä liittäminen tuotti kaksi plasmidia, pPS23 ja pPS23,l, jotka eroavat ainoastaan liitetyn BamHl-res-triktiofragmentin sijoittumisen puolesta. Plasmidi pUC8 on saatavissa Pharmacia P-L Biochemicalsilta, 800 Centennial 5 Ave., Piscataway, N.J. 08854.

Plasmidi pPS23 hajotettiin restriktioentsyymillä BamHI, ja noin 860 bp BamHI-restriktiofragmentti, joka sisältää IPS:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin, eristettiin ja liitettiin BamHI:llä hajotet-10 tuun plasmidiin pPS19. Tämä liitäntä tuotti joukon hyödyllisiä plasmideja, mukaan lukien plasmidin pPS21A. Plasmidi pPS21A muodostuu kun plasmidin pPS23 noin 0,86 kb BamHI-restriktiofragmentti liitetään plasmidin pPS19 noin 7,7 kb BamHI-restriktiofragmenttiin ja se käsittää IPS-geenin 15 transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin oikeassa asemassa aikaansaamaan hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspression. Linkkerit, joita käytettiin plasmidin pPS23 konstruoinnissa varmistivat, että plasmi-dissa pPS21A säilyisi sopiva lukukehys hygromysiiniresis-20 tenssin antavan geenin ilmenemiselle. Plasmidin pPS21A konstruktiota kuvataan esimerkissä 7; plasmidin pPS21A restriktiopaikka- ja toimintakertta on esitetty kuviossa 8.

Useita muita hyödyllisiä plasmideja tuotettiin myös * 25 samassa ligaatiossa, joka tuotti plasmidin pPS21A. Plasmi di pPS22 sisältää samat sekvenssit kuin plasmidi pPS21A, mutta BamHI-restriktiofragmentti, joka sisältää IPS-geenin aktivoivan sekvenssin, on sijoittunut vastakkaiseen suuntaan plasmidin pPS21A sijaintiin nähden. Näin muodoin 30 plasmidi pPS22 ei tuo hygromysiiniresistenssiä Cephalospo- a. rium acremoniumille suurella frekvenssillä, joten plasmidi pPS22 toimii hyödyllisenä negatiivisena kontrollina C. ac-remonium-transformaatioissa.

Toisella tässä ligaatiossa muodostuneella plasmi-35 dilla on käyttöä sekä negatiivisena kontrollina Cephalos- 27 95810 porium acremoniumin transformaatioissa että myös plasmidi-na, jota voidaan käyttää identifioimaan C. acremoniumin sekvenssejä, joilla on transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa aktiivisuutta. Kuten edellä on kuvattu, sisäl-5 tää plasmidi pPS19 Saccharomyces cerevisiaen PGK:n transkriptiota sen ja translaatiota aktivoivan sekvenssin sopivassa asemassa aikaansaamaan hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspression. Plasmidin pPS19 hajotus res-triktioentsyymillä BamHI tuottaa kaksi fragmenttia: toinen 10 fragmentti on kooltaan noin 230 bp ja sisältää PGK:n aktivoivan sekvenssin, ja toinen fragmentti on kooltaan noin 7,6 kb ja sisältää enimmän osan hygromysiiniresistenssin antavan geenin koodaavasta sekvenssistä.

Plasmidin pPS19 noin 7,6 kb BamHI-restriktiofrag-15 mentin renkaanmuodostus tuottaa plasmidin pPS24, jolta puuttuu transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi asemassa, joka tuottaisi hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspression vektorissa. Plasmidi pPS24 voi sen tähden transformoida Cephalosporium acremoniumin hygromy-20 siiniresistentiksi integroitumalla C. acremoniumin DNA:hän sellaiseen asemaan, että C. acremoniumin endogeeninen transkriptiota ja translaatiota aktivoiva sekvenssi tuottaa geenin ekspression. Näin muodoin plasmidin pPS24 DNA:n integraatiopaikan identifiointi hygromysiinlresistenstissä « 25 C. acremonium/pPS24 -transformantissa identifioi myös C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin. Vaihtoehtoisesti voitaisiin C. acremoniumin DNA kloonata plasmidin pPS24 ainoaan BamHI-paikkaan ja syntyneitä plasmideja voitaisiin käyttää C. acremoniumin 30 transformointiin. Ne plasmidit, jotka transformoivat C. acremoniumin hygromysiinlresistenssiksi suurella frekvenssillä, sisältäisivät ilman muuta transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin, joka on toiminnallinen C. acremoniumissa.

28 9 5 8 1 0

Vielä muita hyödyllisiä plasmideja muodostui samassa liigaatiossa, joka tuotti plasmidin pPS21A. Nämä plas-midit, plasmidit pPS25 ja pPS25,l, muodostuivat liittämällä kaksi plasmidin pPS19 BamHl-restriktiofragmenttia plas-5 midin pPS23 noin 860 bp BamHI-restriktiofragmenttiin. Plasmidissa pPS25 sekä PGK:n että IPS:n aktivoivat sekvenssit ovat sopivassa asemassa aikaansaamaan hygromysii-niresistenssin antavan geenin ekspression. Plasmidi pPS25 sisältää IPS:n aktivoivan sekvenssin, joka sijaitsee vä-10 littömästi vastavirtaan hygromysiiniresistenssin antavan geenin koodaavaan sekvenssiin nähden ja PGK:n aktivoivan sekvenssin, joka sijaitsee välittömästi vastavirtaan IPS:n aktivoivaan sekvenssiin nähden. Plasmidi pPS25 antaa hygromysiiniresistenssin Caphalosporium acremoniumille. Plas-15 midin pPS25 restriktiopaikka ja toimintakartta on esitetty kuviossa 9. Plasmidien pPS22, pPS24 ja pPS25 konstruktioita kuvataan myös esimerkissä 7.

Plasmidi pPS25,l eroaa plasmidista pPS25 vain noin 0,23 kb BamHI-restriktiofragmentin aseman puolesta, joka 20 sisältää PGK:n aktivoivan sekvenssin. Plasmidissa pPS25,l ei PGK:n aktivoiva sekvenssi sijaitse sellaisessa asemassa, joka sallii PGK:n aktivoivan sekvenssin aikaansaada hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspression. Kuitenkin, sekä plasmidi pPS25 että pPS25,l transformoivat 25 Cephalosporium acremoniumiin hygromysiiniresistenssifeno- tyypin samalla suurella frekvenssillä, osoittaen, ettei PGK:n aktivoiva sekvenssi ole välttämätön hygromysiinire-sistenssifenotyypin ilmenemiselle.

Muita hyödyllisiä tämän keksinnön mukaisia plasmi-30 deja, jotka antavat hygromysiiniresistenssin Cephalospo rium acremoniumille voidaan konstruoida hajottamalla osittain plasmidia pPS21 restriktioentsyymillä PstI, jota seuraa uudelleenligaatio. Plasmidi pPS28 syntyy, kun poistetaan plasmidista pPS2lA noin 1,85 kb Pstl-restriktiofrag-35 mentti, joka sisältää Cephalosporiumin replikaation aloi- 29 95810 tuskohdan. Plasmid! pPS29 syntyy, kun poistetaan plasmi-dista pPS21A sama Pstl-fragmentti, joka poistettiin, jotta saatiin plasmidi pPS28, yhdessä noin 0,49 kb Pstl-restrik-tiofragmentin kanssa, joka sijaitsee Cephalosporiumin rep-5 likaation aloituskohdan ja plasmidin pPS21A IPS-geenin aktivoivan sekvenssin välissä. Plasmidien pPS28 ja vastaavasti pPS29 restriktiopaikka- ja toimintakartat on esitetty kuvioissa 10 ja 11. Plasmidien pPS28 ja pPS29 konstruktiota on kuvattu esimerkissä 8.

10 Vielä toinen hyödyllinen johdannainen konstruoitiin käyttämällä plasmidia pPS21A lähtömateriaalina. Plasmidin pPS21A noin 3,45 kb Hindlll-restriktiofragmentti sijoitettiin plasmidin plT335 ainoaan Hindlll-paikkaan, jolloin syntyivät plasmidit pPS26 ja pPS26,l, jotka eroavat toi- 15 sistaan ainoastaan plasmidista pPS21A otetun HindIII-res-triktiofragmentin sijoittumisen puolesta. Plasmidit pPS26 ja pPS26,l sisältävät käsittelemättömän Cephalosporium acremoniumin IPS-geenin ja hygromysiiniresistenssin antavan geenin IPS-geenin aktivoivan sekvenssin tuottamana.

20 Plasmidien pPS26 ja pPS26,l konstruktiota kuvataan esimerkissä 9 ja plasmidin pPS26 restriktiopaikka- ja toiminta-kartta on esitetty kuviossa 12.

EP-patenttijulkaisussa 177 243, kuvataan samanlaisen vektorin konstruoimista kuin plasmidi pIT221, plasmi- « 25 di, jota kuten edellä on todettu, kuvataan myös samassa patenttijulkaisussa, mutta tämä samanlainen vektori sisältää lisäksi Cephalosporium acremoniumin ribosomaalisen RNA:n koodaavan DNA:n. Plasmidilla, pPS26, on lisääntynyt kyky integroitua C. acremoniumin kromosomaaliseen DNA:hän 30 rRNA:ta koodaavan DNA:n läsnäolosta johtuen. Plasmidin * pPS26 konstruktio on esitetty em. EP-patenttijulkaisun esimerkissä 13, joka mainitaan tässä viitteenä. Koska plasmidi pPS26 sisältää saman PGK-HmR -geenin kuin plasmidi pIT221, on pPS26-johdannainen, joka voisi syntyä kor- 35 vattaessa PGK:n transkriptiota ja translaatiota aktivoiva 1 ♦ 95810 sekvenssi tämän keksinnön mukaisella C. acremoniumin aktivoivalla sekvenssillä, selvästi tämän keksinnön piirissä.

Plasmidi pPS26 sisältää noin 3,7 kb Xmal-restrik-tiofragmentin, joka sisältää Cephalosporium acremoniumin 5 rRNA-geenit. Tämän Xmal-fragmentin läsnäolo plasmidissa lisää todennäköisyyttä, että plasmidi integroituu C. acremoniumin genomiin homologisen rekombinaation kautta, kun plasmidi transformoidaan C. acremoniumiin. Näin ollen konstruoitiin plasmidit pPS30 ja pPS30,l lisäämällä plasmidin 10 pPS6 noin 3,7 kb Xmal-restriktiofragmentti, joka sisältää osan C. acremoniumin rRNA-geeneistä plasmidin pPS21A ainoaan Xmal-paikkaan; plasmidit pPS30 ja pPS31,l eroavat toisistaan ainoastaan Xmal-restriktiofragmentin sijainti-suunnan puolesta. Plasmidit pPS31 ja pPS31,l konstruoitiin 15 lisäämällä plasmidin pPS6 noin 3,7 kb:n Xmal-restriktiofragmentti plasmidin pPS29 ainoaan Xmal-paikkaan. Plasmi-dien pPS30, pPS30,l, pPS31 ja pPS31,l konstruktiota kuvataan esimerkissä 10.

Tämän keksinnön mukaiset plasmidivektorit, jotka 20 käyttävät hyväksi Cephalosporium acremoniumin XPS-geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa sekvenssiä aikaansaamaan hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspressiota, ovat paljon parempia kuin plasmidit, jotka käyttävät hyväksi Saccharomyces cerevisiaen PGK:n akti-25 voivaa sekvenssiä aikaansaamaan hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspressiota C. acremoniumissa. Näiden vektoreiden paremmuutta osoittaa kaksi havaintoa: (1) transformaatiofrekvenssi mitattuna hygromysiiniresis-tenttien Cephalosporium acremonium -transformanttien luku-30 määränä per mikrogrammaa kohti transformaatiossa käytettyä DNA-vektoria, on 50-300 kertaa suurempi, kuin IPS:n aktivoivaa sekvenssiä, verrattuna PGK:n aktivoivalle sekvenssille, käytetään toteuttamaan vektorissa olevan hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspressiota; ja 35 (2) regeneraatioaika, mitattuna aikana, joka kuluu kunnes 'I · - Mri MK ii 31 95810 pesäkkeet tulevat paljaalla silmällä näkyviksi transformaation jälkeen, on noin 50 % pienempi, kun käytetään IPS:n aktivoivaa sekvenssiä, verrattuna PGK:n aktivoivalle sekvenssille, toteuttamaan vektorilla olevan hygromysiini-5 resistenssin antavan geenin ekspressiota.

Cephalosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaa sekvenssiä voidaan käyttää ilmentämään mitä tahansa DNA-sekvenssiä C. acremoniumissa, kuten edellä kuvatut ekspressiovektorit osoittavat. Näin 10 ollen tämä keksintö käsittää C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin käytön, koodattuna plasmidin pIT335 noin 0,5 kb Sall-NcoI-restriktio-fragmentissa, toteuttamaan minkä tahansa DNA-sekvenssin ekspressio, joka sekvenssi koodaa hyödyllisen aineen.

15 Tämä keksintö perustuu intaktin toiminnallisen,

Cephalosporium acremoniumin DNA-sekvenssin kloonamiseen, joka koodaa ei ainoastaan isopensilliini N -syntetaasin aminohapposekvenssiä, vaan myös transkriptiota ja trans-laatioto aktivoivaa sekvenssiä, joka on välttämätön toteu-20 tettaessa isopenisilliini N -syntetaasin ilmeneminen C. acremoniumissa. Samaten, tämän keksinnön mukainen IPS-gee-ni käsittää sekvenssit, jotka sijaitsevat myötävirtaan koodaavassa alueessa, jotka vastaavat transkription päättämisestä ja mRNA:n polyadenylaatiosta ja prosessisignaa-25 lista. Tavallisesti sekvenssit, jotka vastaavat transkription päättämisestä, polyadenylaatiosta ja mRNA:n prosessoinnista koodautuvat alueella noin 5000 bp myötävirtaan koodausalueen lopetuskodonista. Sen tähden noin 0,5 kb BamHI-PstI -restriktiofragmentti, joka sisältää IPS:n kar-30 boksiterminaalia koodaavan DNA:n ja sen myötävirtasekvens-sit, sisältää myös IPS-geenin transkription lopetus- ja mRNA:n polyadenylaation ja prosessisignaalit.

Yksi vektori, plasmidi pPS27, on konstruoitu, joka sisältää IPS:n transkriptiota ja translaatiota aktivoivan 35 sekvenssin, jota seuraa hygromysiiniresistenssin antava 32 95810 geeni, jota seuraa IPS-geenin transkription lopetus ja mRNA:n polyadenylaatio- ja prosessisignaalit. Plasmidi pPS27:n konstruoimiseksi liitettiin plasmidin pIT335 noin 1,4 kb BamHI-XhoI-restriktiofragmentti SalI-BamHI:llä ha-5 jotettuun plasmidiin pUC8 (Sali- ja Xhol-"overlapit" (päällekkäisfragmentit) ovat yhteensopivia), jolloin saatiin plasmidia pIT336 (kuvio 14).

Plasmidi pIT336 hajotettiin restriktioentsyymillä PstI ja suljettiin renkaaksi kaikkien Cephalosporiumin 10 DNA-sekvenssien poistamiseksi plasmidista paitsi noin 0,5 kb:n BamHI-Pstl-restriktiofragmentti, joka sisältää IPS-geenin transkription lopetus- ja mRNA:n polyadenylaatio-ja prosessisignaalit, jotta saataisiin plasmidi pPS35 (kuvio 15) 15 Plasmidi pPS35 hajotettiin sitten restriktioentsyy millä Hindlll, ja plasmidin pPS29 noin 2,3 kb:n Hindlll-restriktiofragmentti, joka plasmidi sisältää IPS-geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin, jota seuraa hygromysiiniresistenssin antava geeni, inte-20 groitiin HindIII:lla hajotettuun plasmidiin pPS35 sopivassa sijaintiasemassa, jotta saataisiin plasmidi pPS27. Plasmidin pPS27 konstruktiota kuvataan esimerkissä 11, ja plasmidin pPS27 restriktiopaikka ja toimintakartta on esitetty kuviossa 16.

25 Plasmidin pPS27 hyödyllinen johdannainen voidaan konstruoida eristämällä plasmidin pPS27 noin 2,3 kb:n Hindlll- ja noin 0,5 kb:n Hindlll-BamHI -restriktiofrag-mentit ja liittämällä nämä fragmentit sopivassa asemassa plasmidin pIT335 noin 5,9 kb:n Bglll-Hindlll -restriktio-30 fragmentit, jolloin saadaan plasmidi pPS34. Plasmidi pPS34 ·. sisältää sekä hygromysiiniresistenssin antavan geenin että myös isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan geenin, joita kontrolloivat IPS-geenin säätelyelementit. Plasmidin pPS34 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty 35 kuviossa 13.

33 95810

Plasmidia pIT336 voidaan käyttää lähtömateriaalina konstruoitaessa plasmidi, joka integroituu Cephalosporium acremoniumin genomiin isopenisilliini N -syntetaasin geeniin lokukseen. Tällä plasmidilla, pPS37, on käyttöä in-5 sertio- inaktivaatiotutkimuksissa, sillä plasmidin pPS37 transformaatio C. acremonium-kantaan tuottaa kannan IPS-vajäitä mutantteja, kun plasmidi pPS37 integroituu IPS-geenin koodaavaan alueeseen. Plasmidi pPS37 konstruoitiin lisäämällä plasmidin pPS21A noin 3,45 kb:n HindIII-res-10 triktiofragmentti, joka sisältää hygromysiiniresistenssin antavan geenin IPS-geenin aktivoivan sekvenssin säätelyn alaisena, Nrul:llä hajotettuun plasmidiin pIT336. Plasmi-dissa pIT336 on ainutkertainen Nrul-paikka, joka sijaitsee plasmidissa olevan IPS:n koodaavan alueen osassa. Lisää-15 mällä noin 3,45 kb:n Hindlll-fragmentti, joka on tasapäi-nen johtuen Klenow-entsyymikäsittelystä, Nrul:llä hajotettuun plasmidiin plT336 itse asiassa tuotetaan kaksi plasmidia, pPS37 ja pPS37,l, jotka eroavat toisistaan ainoastaan sijoitetun kappaleen orientaation puolesta. Sekä 20 plasmidi pPS37 että plasmidi pPS37,l ovat hyödyllisiä transformoitaessa C. acremonium, hygromysiiniresistent-tien, IPS-vajäiden transformanttien muodostamiseksi.

Tämä keksintö on uraauurtava keksintö siinä suhteessa, että se edustaa ensimmäistä DNA-sekvenssin kloo-25 nausta ja modifiointia, joka sekvenssi koodaa entsymaattista aktiivisuutta jota usein kutsutaan syklaasiaktiivi-suudeksi, joka on välttämätön tripeptidisubstraatin kon-densaation katalysoimiseksi substituoiduksi β-laktaamiksi.

Monet organismit, muut kuin C. acremonium, ekspressoivat 30 suuressa määrin samanlaista, ellei identtistä, syklaasiak- *. tiivisuutta. Eri sukua olevien antibiootteja tuottavien organismien syklaasiaktiivisuuden samanlaisuus johtuu eri syklaasien aminohapposekvenssin vastaavasta samanlaisuudesta ja DNA-sekvenssin samanlaisuudesta, joka koodaa syk-35 laasiaktiivisuutta.

34 95810 Tämä keksintö tarjoaa syklaasientsyyniin sekä aminohappo- että DNA-sekvenssin, erikoisesti Cephalosporium ac-remoniumin isopenisilliini N -syntetaasille, ja sitä voidaan näin ollen käyttää syklaasientsyymia koodaavan DNA:n 5 eristämiseen 6-laktaamia tuottavista organismeista. Näitä DNA-sekvenssejä voidaan esimerkiksi käyttää leimattujen koettimien valmistukseen, joita vuorostaan voidaan käyttää syklaasia koodaavien DNA-sekvenssien seulontaan edellä mainituissa β-laktaamia tuottavissa organismeissa. Tämän 10 isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n suuri G- ja C-pitoisuus, noin 63 %, tekee nämä DNA-yhdisteet erityisen hyödyllisiksi Streptomyces clavuligeruksen isopenisilliini N -syntetaasia koodaavan DNA:n eristämisessä. Streptomy-ces-DNA:lla tiedetään olevan suuri G- ja C-pitoisuus, 15 usein lähestyen 70 %, joten tämän keksinnön mukaisen DNA:n suuri G- ja C- pitoisuus tekee DNA-yhdisteet erityisen hyödyllisiksi homologisten S. clavuligerus- tai muiden Streptomyces-DNA-sekvenssien eristämisessä. Tämä keksintö koskee DNA-yhdisteitä, jotka koodaavat syklaasiaktiivi-20 suutta ja lisäksi ekspressiovektoreita, jotka aikaansaavat syklaasi- aktiivisuuden ekspression suuressa määrässä isäntäorganismej a.

Seuraavat esimerkit annetaan keksinnön edelleen ja valaisemiseksi mutta niiden el ole tarkoitettu mitenkään ϊ 25 rajoittavan tämän keksinnön piiriä.

Esimerkki 1 E. colin K12 JA221/pIT335 viljely ja plasmidin pIT335 eristäminen A. E. colin K12 JA221/pIT335 viljely 30 E. colin K12 JA221/pIT335 lyofilisaattiampulli saa- . daan Northern Regional Research Laboratories'1ta, Peoria,

Illinois, talletusnumerolla NRRL B-15960. Lyofilisaattiam-pullia voidaan suoraan käyttää "viljelmänä" seuraavassa prosessissa.

„ 95810 35

Yksi litra L-lientä (10 g tryptonia, 10 g NaCl, ja 5 g hiivauutetta litraa kohti), joka sisälsi 50 pg/ml am-pisilliinia siirrostettiin E. colin K12 JA221/pIT335 -viljelmällä ja inkuboitiin ilmaravistelijassa 37*C:ssa kunnes 5 optinen tiheys 590 nm:ssa (OD590) oli noin 1 absorbanssi-yksikköä, jolloin 150 mg kloramfenikolia lisättiin viljelmään. Inkubointia jatkettiin noin 16 tuntia. Kloramfeniko-lilisäys estää proteiinisynteesin, ja estää näin solujen edelleen jakautumisen, mutta sallii plasmidin replikoinnin 10 jatkuvan.

B. Plasmidin pIT335 eristäminen

Esimerkissä IA valmistettua viljelmää sentrifugoi-tiin Sorvailin GSA-roottorissa (Dupont Co., Instrument Products, Biomedical Division, Newtown, CN 06470) 6000 rpm 15 5 minuutin ajan 4*C:ssa. Muodostunut supernatantti heitet tiin pois ja solupelletti pestiin 40 ml:11a TES-puskuria (10 mM Tris-HCl, pH - 7,5; 10 mM NaCl ja 1 mM EDTA) ja sitten jälleen pelletoitiin. Supernatantti poistettiin jälleen ja solupelletti jäädytettiin kuivassa jääetanoli-20 hauteessa ja sulatettiin sitten. Sulanut solupelletti sus- pendoitiin 10 ml:aan liuosta, jossa oli 25 % sakkaroosia ja 50 mM EDTA. Seokseen lisättiin 1 ml lysotsyymiliuosta 5 mg/ml, 3 ml 0,25 M EDTA, pH « 8,0, ja 100 μΐ RNA A 10 mg/ ml, sekoitettiin ja inkuboitiin jäiden päällä 15 minuut-25 tia. 3 ml hajottavaa liuosta (valmistettu sekoittamalla 3 ml 10 % Triton-X 100, 75 ml 0,25 M EDTA, pH » 8,0, 15 ml 1 M Tris-HCl, pH * 8,0, ja 7 ml vettä) lisättiin lysotsyymi-käsiteltyihin soluihin, sekoitettiin ja syntynyttä liuosta inkuboitiin jäiden päällä vielä 15 minuuttia. Hajonneet 30 solut jäädytettiin kuivassa jääetanolihauteessa ja sitten sulatettiin.

Solu jäänteet poistettiin liuoksesta sentrifugoimal-la 25 000 rpm 40 minuutin ajan SW27-roottorilla (Beckman, 7360 N. Lincoln Ave., Lincolnwood, IL 60646) ja uuttamalla 35 puskuroidulla fenolilla. Sitten lisättiin 30,44 g CsCl ja 36 95810 noin 1 ml etiumbromidiliuosta 5 mg/ml liuoksen tilavuus säädettiin 40 ml:ksi ja dekantoitiin VTi50 ultra-sentrifu-giputkeen (Beckman). Putken sulkemisen jälkeen liuosta sentrifugoitiin VTi50-roottorissa 42000 rpm noin 16 tunnin 5 ajan. Muodostunut plasmidivyöhyke, tehtynä näkyväksi ultraviolettivalon avulla, eristettiin ja laitettiin sitten Ti75-putkeen ja -roottoriin (Beckman) ja sentrifugoitiin 50 000 rpm 16 tuntia. Kaikki tarvittavat tilavuuden säädöt tehtiin käyttäen TES:iä, joka sisälsi 0,761 g/ml CsCl:a.

10 Plasmidivyöhyke eristettiin jälleen, uutettiin suolalla kyllästetyllä isopropanolilla etiumbromidin poistamiseksi ja laimennettiin 1:3 TES-puskurilla. Kaksi tilavuutta etanolia lisättiin sitten liuokseen, mitä seurasi inkubointi yli yön -20*C:ssa. Plasmidi-DNA pelletoitiin sentrifusoi-15 maila liuosta SS34 roottorissa (Sorvali) 15 minuuttia 10 000 rpm. Noin 1 mg plasmidin pIT335 DNA:ta, joka saatiin tällä menetelmällä, suspendoitiin 1 ml:aan TE-pusku-ria (10 mM Tris-HCl, pH « 8,0, ja 1 mM EDTA) ja säilytettiin -20eC:ssa. Plasmidin pIT335 restriktiopaikka- ja toi-20 mintakartta on esitetty kuviossa 1.

Esimerkki 2

Plasmidin pIT337 konstruointi A. E. colin K12 RV308/pCZ106 viljely ja plasmidin pCZ106 eristäminen 25 E. colin K12 RV308/pCZ106 lyofilisaattiviljelmä saadaan Northern Regional Research Laboratories'lta, Peoria, Illinois, tallentusnumerolla NRRL B-15959. Lyofili-saattia käytetään siirrostamaan 1 litra L-lientä, joka sisältää 50 pg/ml kanamysiiniä, ja siirrostettua lientä 30 inkuboidaan 25°C:ssa ilmaravistelijalla, kunnes OD590 on 0,5-1,0 absorbanssiyksikköä. Kun viljelmän optinen tiheys saavuttaa tason 0,5-1,0 absorbanssiyksikköä, nostetaan lämpötilaa 37eC:seen ja inkubointia jatketaan 2-6 tuntia. "Runaway"-repiikoni on kuten aikaisemmin on todettu, läm-35 pötilaherkkä ja menettää kopiomäärän säätelyn 37°C:ssa.

37 95810 2-6 tunnin inkubointi 37°C:ssa on täysin riittävä aika kontrolloimattomalle replikaatiolle.

2-6 tunnin inkuboinnin jälkeen 37eC:ssa, solut otetaan talteen ja plasmidin pCZ106 DNA eristetään suuressa 5 määrin esimerkin IB menetelmän mukaisesti. Noin 5 mg plasmidin pCZ106 DNA:ta saadaan ja suspendoidaan 5 ml:aan TE-puskuria. Plasmidin pCZ105 restriktiopaikka- ja toiminta-kartta on esitetty kuviossa 2.

B. Plasmidin pCZ106 Ncol- ja BamHI-hajotus ja 10 plasmidin pCZ106 noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol- ja noin 1,6 kb:n Ncol-BamHI -restriktiofragmenttien eristäminen

Suunnilleen 25 yg, vastaten 25 yl:aa, plasmidin pCZ106 DNA:ta, joka valmistettiin esimerkissä 2, lisättiin 15 ja sekoitettiin seuraavien komponenttien kanssa: 10 μΐ 10 x BamHI-reaktiopuskuria [1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 7,9, 60 mM MgCl2, ja 1 mg/ml naudan seerumin albumiini (BSA)], 5 μΐ (noin 50 yksikköä) restriktioentsyymiä**

BamHI, 5 μΐ (noin 50 yksikköä) restriktioentsyymiä Ncol ja 20 55μ1 H20:ta. Syntynyttä reaktioseosta inkuboitiln neljä tuntia 37°C:ssa, minkä ajan jälkeen reaktio oli olennaisesti päättynyt.

NcoI-BamHI -reaktioseokselle suoritettiin sitten elektroforeesi 1 % agaroosigeelillä kunnes halutut noin 25 1,6 kb:n NcoI-BamHI- ja noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol -fragmen tit olivat selvästi erottuneet muusta reaktiotuotteesta, noin 0,3 kb:n restriktiofragmentista. Elektroforeesikäsi-tellyn DNA:n visuaalinen tarkastelu suoritettiin värjäämällä geeli laimeassa etidiumbromidiliuoksessa (0,5 yg/ml) 30 ja altistamalla värjätty geeli pitkäaaltoiselle uv-valolle. Haluttujen fragmenttien paikantamisen jälkeen tehtiin geeliin pieni rako kunkin halutun fragmentin eteen, ja pieni pala Schleicher and Schuell (Keene, NH 03431) NA-45 DEAE -membraania pistettiin kuhunkin rakoon. Elektroforee-35 si jatkettiin, jolloin DNA sitoutui ei-kovalenttisesti 38 95810 DEAE -membraaniin. Sen jälkeen kun halutut fragmentit olivat sitoutuneet DEAE-membraaniin, membraanit poistettiin ja huuhdeltiin matalasuolaisella puskurilla (100 mM KC1, 0,1 mM EDTA, ja 20 mM Tris-HCl, pH 8). Seuraavaksi kukin 5 membraani pistettiin pieneen putkeen ja upotettiin kor-keasuolaiseen puskuriin (1 M NaCl, 0,1 M EDTA ja 20 mM Tris-HCl, pH 8) ja inkuboitiin sitten 65°C:ssa yksi tunti DNA:n poistamiseksi DEAE-paperista. Inkuboinnin jälkeen 65°C:ssa, inkubointipuskuri otettiin talteen ja membraani 10 huuhdeltiin korkeasuolaisella puskurilla. Huuhteluliuos yhdistettiin inkubointipuskurin kanssa ennen haluttujen DNA-fragmenttien talteenottoa.

Korkeasuolaisen DNA-liuoksen tilavuus säädettiin niin, että NaCl-pitoisuus oli 0,25 M ja sitten lisättiin 15 kolme tilavuutta kylmää absoluuttista etanolia. Syntyneet liuokset sekoitettiin ja laitettiin -70eC:seen 10-20 minuutin ajaksi. Jäähdyttämisen jälkeen liuokset sentrifu-goitiin 15 000 rpm 15 minuutin ajan. Toisen saostuksen jälkeen jäännössuolan poistamiseksi, DNA-pelletit huuhdel-20 tiin etanolilla, kuivattiin, suspendoitiin 20 pl:aan TE-puskuria, ja muodostivat noin 5,0 pg haluttuja plasmidin pCZ106 noin 1,6 kb:n NcoI-BamHI- ja noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol -restriktiofragmentteja. Saadut puhdistetut fragmentit liuotettiin erikseen 25 pl:aan TE-puskuria ja säily-: 25 tettiin -20*C:ssa.

#)Ellei toisin ole mainittu, saatiin restriktio- ja ligaa-tioentsyymit New England Biolabs'lta, 32 Tozer Road, Beverly, MA 01915. Tässä olevat yksikkömääritelmät vastaavat valmistajan antamia yksikkömääritelmiä.

30 C. Plasmidin plT335 Ncol- ja BamHI noin 1,5 kb . Ncol-BamHI-hajotus ja -restriktiokappaleen noin eristäminen, joka koodaa isopenisilliini N -syn-tetaasia

Suunnilleen 25 pg, vastaten 25 pl:aa, plasmidin 35 pIT335 DNA:ta, jota valmistettiin esimerkissä IB, hajotet- a, 95810 tiin restriktioentsyymeillä Ncol ja BamHI oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti. Saatu Ncol-BamHI -hajotettu DNA laitettiin 1 % agaroosigeelille ja haluttu 1,5 kb:n NcoI-BamHI -restriktiofragmentti eristettiin oleelli-5 sesti esimerkin 23 menetelmän mukaisesti. Suunnilleen 5 yg haluttua fragmenttia saatiin, suspendoitiin 25 pl:aan TE-puskuria ja säilytettiin -20°C:ssa.

D. Plasmidin pIT337 lopullinen konstruointi 5 μΐ plasmidin pCZ106, noin 1,6 kb:n NcoI-BamHI- ja 10 2,5 μΐ noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol -restriktiofragmentteja, joka plasmidi oli puhdistettu esimerkissä 2B ligatoitiin 5 yl:aan plasmidin pIT335 noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI -restrik-tiofragmenttiin, joka plasmidi oli pundistettu esimerkissä 2C, jolloin muodostui plasmidi pIT337. Reaktiotilavuus oli 15 30 μΐ ja se käsitti edellä mainitut DNA-fragmentit, 1,1 μΐ (noin 100 yksikköä) T4 DNA-ligaasia, 3 μΐ 10 x ligaatio-puskuria (0,5 M Tris-HCl, pH 7,8, 100 mM MgCl2, 200 mM di-tiotreitoli (DTT), 10 mM ATP, ja 1 mg/ml BSA) ja 13,4 μΐ HjO. Reaktioseosta inkuboitiin kaksi tuntia 15°C:ssa, minkä 20 jälkeen reaktio oli oleellisesti päättynyt. Ligatoitu DNA muodosti halutun plasmidin pIT337 DNA:n. Plasmidin pIT337 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 3.

Esimerkki 3 25 E. colin K12 RV308/pIT337 konstruointi ja E. colin tuottaman isopenisilliini N -syntetaasin määritys A. E. colin K12 RV308/pIT337 konstruointi 50 ml E. coli K12 RV308 (NRRL B-15624) -viljelmää L-liemessä kasvatettiin OD590-arvoon noin 0,5 absorbanssi-30 yksikköä. Viljelmä jäähdytettiin jäiden päällä kymmenen minuutin ajan, ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla. Solupelletti suspendoitiin 25 ml:aan kylmää 100 mM CaCl2 ja inkuboitiin jäiden päällä 25 minuuttia. Solut pelletoitiin taas kerran sentrifugoimalla, ja pelletti suspendoitiin 35 2,5 ml:aan kylmää 100 mM CaCl2 ja inkuboitiin jäiden päällä yli yön.

40 95810 200 μΐ tätä solususpensiota sekoitettiin ligatoidun DNA:n kanssa, jota oli valmistettu esimerkissä 2D ja inku-boitiin jäiden päällä 20 minuuttia ja sitten solut kerättiin talteen sentrifugoimalla. Solupelletti suspendoitiin 5 noin 1 ml:aan L-lientä ja suspensiota inkuboitiin 25eC:ssa yksi tunti. Soluseoseriä viljeltiin L-agarmaljoilla (L-liemi, jossa oli 15 g/1 agaria), joissa oli 50 pg/ml kana-mysiiniä, ja maljoja inkuboitiin 25°C:ssa. E. coli K12 RV308/pIT337 -transformantit todettiin oikeiksi seulomalla 10 kanamysiiniresistenssin suhteen ja transformanttien plas-midi-DNA:n restriktioentsyymianalyysillä plasmidi-DNA:ta saatiin E.colin K12 RV308/pIT337 -transformanteista oleellisesti esimerkissä 2A kuvatun mukaisesti, mutta pienemmässä mitassa, ja CsCl-gradientti -vaiheet jätettiin pois.

15 B. E. colin K12 RV308/pIT337 viljely isopenisillii- ni N -syntetaasin aktiivisuuden ekspressoimisek-si

Useita E. colin K12 RV308/pIT337 transformanttien isolaatteja, jotka transformantit oli valmistettu esimer-20 kin 3A mukaisesti, siirrostettiin kukin erikseen 5 ml:n L-liemieriin, joissa oli 50 pg/ml kanamysiiniä, ja viljelmiä inkuboitiin ilmaravistelijalla 25°C:ssa kunnes OD590 oli noin 0,2 absorbanssiyksikköä. Viljelmät siirrettiin sitten 37eC:sen ilmaravistelijalle ja inkuboitiin 37*C:ssa noin 6 25 tunnin ajan.

6 tunnin kuluttua, 37°C:ssa inkuboiden, yksi ml kutakin viljelmää otettiin talteen, ja solut pelletoitiin sentrifugoimalla Solupelletit pestiin kukin erikseen 1 ml:11a 10 mM NaCl ja suspendoitiin sitten 1 ml:aan 1PS-30 uuttopuskuria (0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,01 M KC1 ja 0,01 M MgS04). Soluja sonikoitiin kuudessa viiden sekunnin so-nikointierässä, joka aikaansaatiin Sonifier Cell Disrup-tor'illa, Malli W185, Heat Systems-Ultrasonics, Inc.,

Plainview, Long Island, NY, käyttäen mikrokärkeä. Soni-35 kointikäsittelyerien välinen aika oli 60 sekuntia, ja 41 95810 seosta pidettiin jääetanolihauteessa käsittelyn aikana. Sonikoinnin jälkeen soluseosta sentrifugoitiin jäännösten poistamiseksi ja käytettiin sitten suoraan määrityksessä.

C. Isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden 5 määritys

Seuraava määritysmenetelmä on muunnettu Shenin et ai. menetelmästä, [J. of Antibiotics 37 (1984) 1044-1048].

Isopenisilliini N -syntetaasin määritysreaktio suoritettiin kokonaistilavuuden ollessa 500 μΐ. Reaktion 10 aloittamiseksi 1,0 ml liuosta, jossa oli 1,4 mM 6-(L-a- aminoadipyyli)-L-kysteinyyli-D-valiinia ja 3,75 mM DTT:tä annettiin reagoida huoneenlämmössä 30-60 minuutin ajan kaiken dimeerisen tripeptidin pelkistämiseksi monomeeri-seen muotoon. 50 μΐ kutakin seuraavaa kantaliuosta jaet-15 tiin kuhunkin määritysputkeen (steriilit, lasiset, kertakäyttöiset 13 x 100 mm putket): 500 mM Tris-HCl, pH 7,4, 100 mM KC1, 100 mM MgS04, 2,0 mM FeS04 ja 6,7 mM askorbii-nihappo. Seuraavaksi lisättiin vaihtelevia määriä uutetta, joka oli laimennettu vedellä 150 piiksi. Kuhunkin putkeen 20 lisättiin sitten noin 100 μ1:η erinä tripeptidiliuosta; tripeptidin lisäys aloittaa reaktion. Kutakin putkea sekoitettiin substraatin lisäyksen yhteydessä. Reaktioseos-astiat sijoitettiin sitten pyörivää liikettä tekevään ravi stelijahauteeseen 250 rpm, inkubaatiolämpötilassa 25°C.

* 25 Reaktioaika oli 45 minuuttia. 45 reaktiominuutin jälkeen otettiin kaksi 100 μ1:η näytettä ja annosteltiin biomääri-tyslevyjen kuoppiin, ja 100 yksikköä penisiliinaasi A:ta lisättiin näytteen loppuosaan. Penisillinaasi A saatiin Riker's Laboratories Inc.'1ta, entsyymiä myydään 100 000 30 yksikön ampulleissa, jotka liuotettiin 5 ml:n vesierillä.

Viisi μΐ (100 yksikköä) liuotettua penisillinaasi A:ta lisättiin kuhunkin reaktioseokseen, annettiin reagoida 5 minuuttia huoneenlämmössä ja sitten 100 μΐ kutakin penisillinaasi A:11a käsiteltyä uutetta annosteltiin biomää-35 rityslevyjen kuoppiin. Tämä penisillinaasi A -käsittely 42 95810 tehdään, jotta voitaisiin tarkistaa, että biomääritysle-vyjen vyöhykkeet johtuvat penisilliinin läsnäolosta eikä kefalosporiinin tai muun kontaminantin läsnäolosta.

Penisilliini N:n standardikäyrä valmistettiin li-5 säämällä 0,5, 1,0, 2,0, 5,0, 10,0 ja 20,0 pg penisilliini N:ää biomäärityskuoppiin. Penisillinaasi A:n aktiivisuus tarkistettiin myös lisäämällä 4 μΐ entsyymivalmistetta noin 200 pl:aan penisilliini N:ää (0,2 pg/ml).

Biomäärityslevyt koostuivat K131-ravintoagarista, 10 joka valmistetaan liuottamalla 30,5 g BBL:n Antibiotic Mediumia # 11 (Becton Dickinson & Company, Cockeysville, MD) yhteen litraan deionisoitua vettä, kiehauttamalla liuos, jäähdyttämällä 70°C:seen ja sitten autoklavoimalla 35 minuuttia 121eC:ssa ja 15 psi. Maljoille levitettiin 4 15 ml tuoretta yli yön kasvanutta Micrococcus luteusta (ATCC 9341) per 700 ml agaria. M. luteusta kasvatettiin K544-ravintoliemessä, jonka koostumus on: Difcon peptoni, 5,0 g, Difcon hiivauute 1,5 g, natriumkloridi, 3,5 g, dika-liumfosfaatti (vedetön), 3,7 g, monokaliumfosfaatti, 1,3 20 g, Difcon lihauute, 1,5 g, yhdessä litrassa deionisoitua vettä - - liuos kiehautetaan, jäähdytetään 25°C:seen, pH säädetään 7,0:ksi IN HCl:n ja IN NaOH:n avulla, ja sitten autoklavoidaan 20 minuuttia ja 15 psi ennen käyttöä. Siir-rostettu agar annosteltiin 100 x 15 mm:n maljoille, 15 ml 25 siirrostettua agaria maljaa kohti. Kuopat valmistettiin imun avulla käyttäen kertakäyttöistä 5 ml:n pipettiä, kukin kuoppa oli 10 mm halkaisijaltaan.

Kun maljat oli valmistettu ja näytteet annosteltu kuoppiin, maljat laitettiin 37eC:n inkubaattoriin 18 tun-30 niksi. Määritystulokset määritettiin mittaamalla kunkin näytekuopan ympärillä olevan kirkkaan alueen halkaisija, joka on seurauksena siitä, ettei M. luteus kykene kasvamaan, kun penisilliiniä on läsnä.

Määritystulokset on alla taulukoituna.

43 · 95810

Taulukko II

Isopenisilliini N -syntetaasln aktiivisuus E. colin K12 RV308/pIT337 solu-uutteissa Näyte Vyöhykkeen koko 5 (mm) 2 pg penisilliini N -standardi 16 5 " penisilliini N -standardi 18 10 " penisilliini N -standardi 27 20 " penisilliini N -standardi 31 10 25 " E. coli K12 RV308/PIT337 solu-uutetta 10 50 " E. coli K12 RV308/pIT337 solu-uutetta 22 100 " E. coli K12 RV308/pIT337 solu-uutetta 27 150 " E. coli K12 RV308/pIT337 solu-uutetta 29

Kaikki käsitellyt penisilliininäytteet 0 15 E. coli K12 RV308/pCZ106 solu-uutekontrolli 0

Kontrollireaktiot ilman substraattia 0

Vaikkakin määrityksen lineaarisuus, mitattuna vyöhykkeen kokona, putoaa huomattavasti kun vyöhykekoko kas-20 vaa yli 21 mm, osoittavat määritystulokset selvästi, että E. colin K12 RV308/pIT337 transformantit ilmentävät iso-penisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden, kun taas E. colin K12 RV308/pCZ106 transformantit eivät.

E. colin tuottama materiaali on huomattavasti pysy-• 25 vämpää kuin Cephalosporium acremoniumista peräisin oleva isopenisilliini N -syntetaasi. Tämä suurempi pysyvyys havaittiin ensiksi jäädytys-sulatuskokeissa. C. acremoniumin isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuus inaktivoituu nopeasti uudelleen jäädytettäessä ja sulatettaessa, mutta 30 tämän keksinnön mukainen E. colin tuottama isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuus on melkoisen resistentti jäädyttämiselle ja sulattamiselle.

Suurempi stabiilisuus johtuu luultavasti eroavaisuudesta entsyymiä valmistettaessa C. acremoniumin ja E.

35 colin välillä. Esimerkiksi, C acremoniumista eristetyllä 44 95810 isopenisilliini N -syntetaasilla ei näytä olevan ensimmäisiä kahta aminoterminaalista aminohappotähdettä, metionii-nia ja glysiiniä, jotka koodautuvat C. acremoniumin iso-penisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden koodaavassa 5 DNA:ssa ja jotka ovat myös läsnä tämän keksinnön mukaisessa E. colin tuottamassa materiaalissa. Kuten tuodaan esiin julkaisussa Tsunasawa et ai. J. of Biol. Chem. 260 (1985) 5382-91, E. coli tuottaa peptidaasia, joka katkaisee ami-noterminaalisen metioniinitähteen proteiinista, kun seulo raavalla tähteellä on suhteellisen pieni sivuketju. IPS-proteiinissa seuraa aminoterminaalista metioniinia gly-siinitähde, joten aminoterminaalinen metioniini katkeaa.

Huomioon ottaen E. colin tuottaman isopenisilliini N -syntetaasin aktiivisuuden suurempi stabiilisuus ja eri-15 lainen aminohappotähdesekvenssi, sisältää tämä keksintö myös uuden proteiinin: E. colin tuottaman isopenisilliini N -syntetaasin.

Esimerkki 4

Plasmidin pPS20 konstruointi 20 A. HindIII:lla hajotetun plasmidin pIT335 valmis taminen 5 μΐ plasmidin pIT335 DNA:ta valmistettuna esimerkissä IB, joka vastaa noin 5 pg plasmidin DNA:ta, lisättiin ja sekoitettiin 5 pl:aan 10 x HindiII-puskuria (500 25 mM NaCl, 500 mM Tris-HCl, pH 8,0, 100 mM MgCl2 ja 1 mg/ml BSA), 5 pl:aan (noin 50 yksikköä) restriktioentsyymiä Hindi II ja 35 pl:aan H20. Syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 37°C:ssa neljä tuntia. HindIII:lla hajotettu plasmidin pIT335 DNA uutettiin kerran fenolilla ja kerran CHCl3:lla.

30 Uuttamisten jälkeen, HindIII:lla hajotettu plasmidin pIT3-35 DNA tehtiin 0,25 M:ksi NaCl:ssa, laimennettiin kahdella tilavuudella absoluuttista etanolia, jäähdytettiin kuivassa jääetanolihauteessa ja sitten saostunut DNA otettiin talteen sentrifugoimalla. Noin 5 pg HindiII-hajotettua 35 plasmidin pIT335 DNA:ta, joka saatiin tällä menetelmällä, 45 95810 liuotettiin 10 pl:aan TE-puskuria ja säilytettiin -20°C:-ssa.

B. Plasmidin pIT221 HindiII-hajotus ja plasmidin pIT221 noin 2,7 kb:n Hindlll-restriktiofragmen- 5 tin eristäminen, joka plasmidi sisältää hygro- mysiiniresistenssin antavan geenin EP-patenttijulkaisussa 177 243 kuvataan vektoreita ja olosuhteita Cephalosporium acremoniumin transformoimi-seksi. Konstruktiokulkukaaviot 1-6 ja esimerkit 1-6 jotka 10 sisällytetään tähän viitteenä, kuvaavat plasmidin pIT221 konstruoinnin. Plasmidin pIT221 restriktiopaikka- ja toi-mintakartta on esitetty kuviossa 4.

Plasmidi pIT221 eristettiin E. colista K12 JA221/ pIT221 oleellisesti tämän julkaisun esimerkin 1 menetelmän 15 mukaisesti. Noin 50 pg plasmidia pIT221 hajotettiin 100 pl:ssa 1 x HindiII-reaktiopuskuria, jossa oli 100 yksikköä restriktioentsyymiä HindiII, oleellisesti esimerkin 4A menetelmän mukaisesti. HindIII:lla hajotetun plasmidin pIT221 DNA:n uuttamisen, saostamisen ja uudelleenliuotuk-20 sen jälkeen esimerkin 4A menetelmän mukaisesti, laitettiin DNA 1 %:lle agaroosigeelille elektroforeesia varten. Haluttu plasmidin pIT221 noin 2,7 kb:n HindiII-restriktio-fragmentti, joka plasmidi sisältää hiivan Saccharomyces cerevisiae fosfoglyseraattikinaasin transkriptiota ja 25 translaatiota aktivoivan sekvenssin ja koodaa hygromysii-niresistenssin antavan fosfotransferaasientsyymin, eristettiin ja puhdistettiin geelistä ja muista liuotustuot-teista oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti.

Noin 5 pg haluttua noin 2,7 kb:n HindiII restrik-30 tiofragmenttia eristettiin edellä kuvatulla menetelmällä.

Saatu puhdistettu fragmentti liuotettiin 10 pl:aan TE-puskuria ja säilytettiin -20°C:ssa.

C. Plasmidin pPS20 lopullinen konstruointi

Noin 1 pi HindiII-hajotettua plasmidin pIT335 35 DNA:ta, joka oli valmistettu esimerkissä 4A, ja 4 pl plas- 46 9 5 8 1 0 midin pIT221 noin 2,5 kb:n Hindlll-restriktiofragmenttia, joka oli valmistettu esimerkissä 4B, liitettiin 30 pl:ssa ligaatiopuskuria, jossa oli 100 yksikköä T4 DNA -ligaasia oleellisesti esimerkin 2C menetelmän mukaisesti. Ligatoitu 5 DNA muodosti halutun plasmidin pPS20. Plasmidin pPS20 res-triktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 5.

Noin 2,7 kb:n HindiII-restriktiofragmentti voisi sijoittua plasmidiin pIT335 molemmissa kahdesta orientaatiosta, joten ligatoitu DNA muodosti myös toisen plasmidin 10 pPS20,l. Plasmidi pPS20,l on toiminnallisesti ekvivalenttien plasmidin pPS20 kanssa ja eroaa plasmidista pPS20 vain noin 2,7 kb:n HindiII-restriktiofragmentin orientaation suhteen.

D. E. colin K12 JA221/pPS20 konstruointi ja plasmi-15 din pPS20 DNA:n eristäminen 50 ml E. colin K12 JA221 (NRRL B-15211) viljelmää L-liemessä kasvatettiin OD590-arvoon noin 0,2. Viljelmää jäähdytettiin jäillä kymmenen minuuttia ja solut otettiin talteen sentrifugoimalla. Solupelletti suspendoitiin 25 20 ml:aan kylmää 100 mM CaCl3 ja inkuboitiin jäillä 25 minuuttia. Solut pelletoitiin jälleen kerran sentrifugoimalla ja pelletti suspendoitiin 2,5 ml:aan kylmää 100 mM CaCl2 ja inkuboitiin jäillä yli yön.

200 μΐ tätä solususpensiota sekoitettiin ligatoidun 25 DNA:n kanssa, joka oli valmistettu esimerkissä 4C, ja inkuboitiin jäiden päällä 20 minuuttia. Seosta inkuboitiin sitten 2 minuutin ajan 40°C:ssa, mitä seurasi 10 minuutin inkubointi huoneenlämmössä. 3 ml L-lientä lisättiin so-luseokseen, ja sitten soluja inkuboitiin ilmaravistelijas-30 sa 37°C:ssa kaksi tuntia.

Soluseoksen jakeita viljeltiin L-agarmaljoilla (L-liemi, jossa on 15 g/1 agaria), joissa oli 100 pg/ml ampi-silliinia, ja maljoja inkuboitiin sitten 37°C:ssa. E. colin K12 JA221/pPS20-transformantit osoitettiin oikeiksi 35 ampisilliiniresistenttien transformanttien plasmidi DNA:n 47 9 5 8 1 0 restriktioentsyymianalyysillä. Plasmidi-DNA:ta saatiin E. colin K12 JA221/pPS20 ja E. colin K12 JA221/pPS20,1 trans-formanteista oleellisesti esimerkin 1 menetelmän mukaisesti, mutta pienemmässä mitassa, ja CsCl-gradienttivaiheet 5 jätettiin pois.

Esimerkki 5 A. Plasmidin pIT335 DNA:n Ncol-hajotus ja Klenow-käsittely ja syntyneen noin 0,85 kb:n fragmentin eristäminen, joka fragmentti koodaa Cephalosporium 10 acremoniumin transkriptiota ja translaatiota akti voivan sekvenssin

Noin 50 μΐ, vastaten 50 pg, plasmidin pIT335 DNA: ta, jota oli valmistettu esimerkissä 1, lisättiin ja sekoitettiin 10 pl:aan 10 x BamHI-puskuria, 5 pl:aan (noin 15 50 yksikköä) restriktioentsyymiä Ncol, ja 35/ul:aan H20.

Syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 37eC:ssa neljä tuntia. Reaktioseos tehtiin sitten 0,25 M:ksi NaCl:ssa, laimennettiin kahdella tilavuudella absoluuttista etanolia, jäähdytettiin 10 minuuttia kuivassa jää-etanoli -hauteessa 20 ja; sentrifugoitiin saostuneen DNA pelletoimiseksi. Nsol-hajotettu plasmidin pIT335 DNA-pelletti liuotettiin 50 μΐ: aan 1 x Klenow-puskuria (40 mM KP04, pH 7,5, 6,6 mM

MgCl2, 1,0 mM 2-merkaptoetanoli, 33 μΜ dATP, 33 μΜ dCTP 33 μΜ dGTP, ja 33 μΜ TTP). 2 μΐ (noin 10 yksikköä, New • 25 England Biolabs) E. colin DNA-polymeraasi I:n, tunnettu nimellä Klenow, suurta fragmenttia lisättiin ja sekoitettiin DNA:n kanssa, ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 16°C:ssa yksi tunti. Reaktio lopetettiin uuttamalla puskuroidulla fenolilla.

30 Ncol-hajotettu, Klenow-käsitelty plasmidin pIT335 DNA laitettiin sitten 1 %:lle agaroosigeelille elektroforeesia varten. Noin 0,85 kb:n restriktiofragmentti, joka sisältää Cephalosporium acremoniumin IPS-geenin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin, eristettiin 35 geeliltä ja puhdistettiin oleellisesti esimerkin 2B mukai- 4 48 95810 sesti. Noin 4 pg haluttua fragmenttia saatiin ja suspen-doitiin 10 pl:aan TE-puskuria.

B. Välituote plasmidin pPS19 konstruointi 1 μΐ plasmidin pIT221 DNA:ta liuotettiin viiteen 5 pl:aan 10 x Xmal-puskuria (250 mM NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 7,5, 60 mM MgCl2, 60 mM 2-merkaptoetanoli ja 1 mg/ml BSA), 43 pl:aan H20:ta ja 2 pl:aan (noin 10 yksikköä) restriktio-entsyymiä Xmal. Syntynyttä reaktiota inkuboitiin 37eC:ssa neljä tuntia. Reaktio lopetettiin fenoliuutolla. Xmal-re-10 aktioseos uutettiin CHCl3:lla, minkä jälkeen reaktioseos tehtiin 0,25 M:ksi NaClissa, laimennettiin 2:11a tilavuudella absoluuttista etanolia, jäähdytettiin 10 minuuttia kuivassa jää-etanoli-hauteessa ja saostunut Xmal-hajotettu plasmidin pIT221 DNA pelletoitiin sentrifugoimalla.

15 Xmal:llä hajotettu plasmidin pIT221 DNA liuotettiin uudelleen 100 pl:aan IX ligaatiopuskuria, jossa oli 500 yksikköä T4 DNA -ligaasia. Ligaatioreaktiota inkuboitiin 12eC:ssa noin 16 tuntia ja käytettiin sitten E. colin K12 JA221 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 4D mene-20 telmän mukaisesti. Ampisilliiniresistentit plasmidin pPS19 transformantit identifioitiin transformanttien plasmidi-DNA:n restriktioentsyymianalyysillä. Plasmidin pPS19 DNA:-ta valmistettiin oleellisesti esimerkin 1 menetelmän mukaisesti. Plasmidin pPS13 restriktiopaikka ja toiminta-* 25 kartta on esitetty kuviossa 6.

C. Plasmidin pPS19 DNA:n BamHI-hajotus ja Klenow-käsittely ja noin 7,7 kb:n fragmentin eristäminen 50 pg plasmidin pPS19 DNA:ta hajotettiin restrik-30 tioentsyymillä BamHI ja käsiteltiin Klenowilla oleellisesti esimerkin 4A menetelmän mukaisesti, paitsi että BamHI-restriktioentsyymiä, eikä Ncol-restriktioentsyymiä, käytettiin hajottamaan plasmidin pPS19 DNA:ta. BamHI:llä hajotettu, Klenow-käsitelty plasmidin pPS19 DNA laitettiin 1 35 %:lle agaroosigeelille, ja noin 7,7 kb:n fragmentti eris- > . «U.. Mu Ι.ΙΛ.ΛΛ . t - 95810 49 tettiin ja puhdistettiin oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti. Noin 5 pg haluttua fragmenttiä saatiin, liuotettiin 10 pl:aan TE-puskuria ja säilytettiin -20eC:-ssa.

5 D. Plasmidin pPS2l lopullinen konstruointi 2 μΐ noin 0,85 kb:n fragmenttiä, joka oli valmistettu esimerkissä 5A, liitettiin 2 pl:aan noin 7,7 kb:n fragmenttia, joka oli valmistettu esimerkissä 5C, 30 μΐ:-ssa 1 x ligaatiopuskuria, joka sisälsi 500 yksikköä T4 DNA 10 -ligaasia. Ligaatioreaktioseosta inkuboitiin 12°C:ssa 16 tuntia, ja liitetty DNA muodosti halutun plasmidin pPS21 DNA:n.

E. E. colin JA221/pPS21 konstruointi Ligatoitua DNA:ta, jota oli valmistettu esimerkissä 15 5D, käytettiin E. colin K12 JA221 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 4D menetelmän mukaisesti. Ampisil-liiniresistentit transformantit seulottiin plasmidin pPS21 läsnäolon suhteen transformanttien plasmidi-DNA:n restrik-tioentsyymianalyysillä. Koska noin 0,8 kb: n fragmentti 20 saattoi sijoittua plasmidin pPS19 noin 7,7 kb:n fragmenttiin jommassa kummassa kahdesta orientaatiosta, ja koska vain yksi sijainti on oikeassa asemassa Cephalosporium acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivaan sekvenssiin nähden hygromysiiniresistenssin antavan geenin : 25 ekspressiota varten, vain noin puolet transformanteista olivat haluttua E. colia K12 JA221/pPS21. Yhtä sellaista E. colin K12 JA221/pPS21 -transformanttia käytettiin plasmidin pPS21 DNA:n valmistamiseksi oleellisesti esimerkin 1 menetelmän mukaisesti.

- 95810 50

Esimerkki 6

Cephalosporium acremoniumin geneettinen transfor-mointi plasmideilla pPS20 ja pPS21 EP-patenttijulkaisussa 177 243 kuvataan seuraava 5 transformaatiomenetelmä.

Ά. Cephalosporium acremonium -kannat Edullinen Cephalosporium-kanta transformaatiota varten saadaan American Type Culture Collectionista, Rockville, Maryland, talletusnumerolla ATCC 11550. Muut Cep-10 halosporium-kannat tai mitkä tahansa kaupalliset kannat, jotka on johdettu ATCC 11550:stä mutaatiolla, valinnalla tai geneettisellä jalostuksella kefalosporiini C:n parannetun tuoton aikaansaamiseksi, ovat myös sopivia käytettäväksi transformanttien valmistukseen tämän keksinnön mu-15 kaisilla vektoreilla ja plasmideilla.

B. Soluviljelmän siirroksen valmistaminen Cephalosporium acremonium -solujen geneettiseksi transformoimiseksi tehokkaasti, on välttämätöntä poistaa soluseinät stabiilien protoplastien muodostamiseksi. Sel-20 laisten protoplastien valmistuksessa on hyvin edullista aloittaa tasalaatuisella siirroksella. Muutoin solujen preparointi viljelmässä el ole toistettavissa ja aikaa menetetään yrityksissä valmistaa C. acremoniumin proto-plasteja epäsopivista ja riittämättömistä solumääristä.

25 C. Soluviljelmän tasalaatuisen siirroksen valmis taminen

Ampulli itiöitä (suunnilleen 109 konidiaa 1,5 ml:ssa säilytysalustaa: 5 % laktoosi, 10 % glyseroli ja 0,1 %

Tween 80)1 joko lyofilisoituna tai otettuna nestetyppiva-30 rastosta ja sulatettu huoneenlämmössä, laimennetaan 5 mitään steriiliä saliinia. Noin 0,1 ml tätä suspensiota käytetään siirrostettaessa jokainen noin 50:stä vinopinnasta, jotka sisältävät 20 ml Tryptikaasi*-Soy Agar-(BBL™, Division of Becton, Dickinson & Company, Cockeysville, Mary-35 land 21030) -alustaa. Ennen siirrostamista alustan anne- - 95810 51 taan kuivua kunnes plntakosteutta ei enää havaita. Siirros tettuja vinopintoja lnkuboidaan noin neljä päivää 25 °C:ssa. Noin 10 ml säilytysalustaa lisätään myseelikasvus-toon, joka peittää jokaisen vinopinta-alustan pintaa. Vi-5 nopintoja sekoitetaan koeputkisekoittajalla konidioiden suspendoimiseksi ja kunkin vinopinnan konidiosuspensio yhdistetään ja jäädytetään 10 ml:n erinä -80eC:ssa. Jäätynyt konidiosuspensio menettää hitaasti elinkykynsä, eikä sitä tulisi käyttää noin kolmen kuukauden säilytyksen jäl-10 keen -80eC:ssa.

• D. Solujen kasvatus protoplastien valmistusta varten

Noin 106 ml nestemäistä alustaa 500 ml:n ravistelu-pullossa siirrostetaan soluilla jäätyneestä 10 ml:n itiö-15 suspensiosta, joka oli valmistettu esimerkissä 6C. Solut saadaan sentrifugoimalla (10 min x 2600 rpm), ja suspen-doidaan sitten suoraan nestemäiseen kasvualustaan *’. Su-pernatantin dekantointi on välttämätöntä ennen suspendoin-tia, koska laktoosi ja glyseroli vaikuttavat haitallisesti 20 solujen kasvuun. Pullo, jossa suspendoidut solut ovat, laitetaan pyörivää liikettä tekevään vesihauderavisteli-jaan ja lnkuboidaan 29-30eC:ssa 24 tuntia 285 rpm 1 tuuman liike. Suositeltu 29-30°C:n lämpötila viljelyvaiheessa on erityisen edullinen transformoitavien protoplastien val-: 25 mistukseen, mutta myös alemmat noin 25°C:n lämpötilat ovat sopivia. Alan ammattimiehet, huomaavat, että 29-30*C on erilainen kuin lämpötila (25*C), joka on edullinen viljel-täessä Cephalosporium acremoniumia antibioottien tuotanto-tarkoituksissa .

30 ^Nestemäinen kasvualusta valmistettiin seuraavasti: 100 ml liuosta A annostellaan 500 ml:n ravistuspulloon, pullo suljetaan kaupallisella tulpalla ja autoklavoidaan 121°C:-ssa 20 minuutin ajan. 2 ml liuosta B ja 4 ml liuosta C lisätään sitten liuokseen A nestemäisen kasvualustan valmis-35 tamiseksi.

52 9 5 8 1 0

Liuos A: sakkaroosi, 36 g/1, L-asparagiini, 7,5 g/1, KH2P04, 15 g/1, K2HP04, 21 g/1, Na2S04, 0,75 g/1, MgS04 7H20; 0,18 g/1, CaCl2, 0,06 g/1, suolaliuos 1 ml/1, säätämätön pH. Suolaliuos: Fe(NH4)(S04)2-6H20, 15 g/1, MnS04 4H20, 3 5 g/1, ZnS04 7H20, 3 g/1, CuS04 5H20, 0,8 g/1) Liuos B: glu koosi, 108 g/1 (autoklavoitu 12leC, 30 min). Liuos C: sakkaroosi, 25 g/1, maissin liotusvesi (4 % w/v typpi), 12,5 ml, ammoniumasetaatti, 5,5 g/1, CaC03, 5 g/1, pH säädetty KOHrlla 6,5, ja autoklaavissa 121eC:ssa 20 minuuttia.

10 Ε· Cephalosporium-protoplastien valmistaminen

Solut 24 tunnin ikäisestä viljelmästä otetaan talteen imusuodatuksella (Whatman # 1 paperi BOchnersuppilossa) ja suspendoidaan Mcllvain's puskuriin, pH 7,1 (0,1 M sitruunahappo ja 0,2 M kaksiemäksinen natriumfosfaatti), 15 johon on lisätty ditiotreitolia pitoisuuteen 0,01 M. Riittävä määrä puskuria lisätään jotta saataisiin lopullinen solupitoisuus 1 g (punnittu imusuodatuksen jälkeen) solu-massaa 20 ml puskuria kohti. Solususpensio laitetaan pyörivää liikettä tekevään vesihauderavistelijaan 50 ml:n 20 ravistuspullossa ja inkuboidaan 29-30eC:ssa 90 minuuttia 140 rpm, yhden tuuman liike. Ditiotreitolilla käsitellyt solut pestään vedellä ja suspendoidaan sitten entsyymi-liuokseen (25 mg/ml beta-glukuronidaasi, Sigma Chemical Company, Mcllvaine's puskurissa, pH 6,35, johon on lisätty * 25 0,8 M NaCl ja 0,02 M MgS04). Lopullinen solupitoisuus on 1 g käsiteltyä solumassaa 10 ml entsyymiliuosta kohti. Solususpensio laitetaan sitten pyörivää liikettä tekevälle vesihauderavistelijalle 29-30°C:ssa kolmeksi tunniksi 120 rpm, 1 tuuman liike. Protoplastien suspensio laimennetaan 30 4 tilavuudella pesuliuosta (0,8 M NaCl ja 0,02 M MgS04) ja sitten suodatetaan ilman imua kahden paperipyyhekerroksen läpi. Suodos, joka sisältää protoplastit, sentrifugoidaan huoneenlämmössä 5 minuuttia 2600 rpm. Supernatantti dekan-toidaan ja protoplastipelletti suspendoidaan 10 ml:aan 35 pesuliuosta. Pesumenettely toistetaan kahdesti, sitten 53 95810 protoplastit suspendoidaan riittävään määrään 0,8 M NaCl konsentraation 2-3 x 10® protoplastia ml kohti saavuttamiseksi, laskettuna hemasytometrilla.

F. Transformaatiomenettely 5 Kutakin transformoitavaa plasmidia varten lisätään 1 ml Cephalosporiumin protoplastisuspensiota (2-3 x 10® per ml) 0,8 M NaCl:ssa 0,005 ml:aan juuri tislattua DMS0:ta ja tehdään sitten 80 mM:ksi CaCl,:ssa. Noin 20 pg transformoivaa plasmidia, transformaatiosta riippuen joko pPS20 tai 10 pPS21, ja polyetyleeniglykolia 4000 (Baker, > 20 % w/v vedessä) lisätään protoplastisuspensioon, seoksen muodostamiseksi, jonka tilavuus on 10 ml. Seosta inkuboidaan 10 minuuttia huoneenlämmössä ja sentrifugoidaan sitten 700 rpm 5 minuuttia, mitä seuraa sentrifugointi 2500 rpm 10 15 minuuttia. Protoplastipelletti suspendoidaan 1 ml:aan 0,8 M NaCl:ia. Jakelta (0,1 ml) siirretään tryptikaasi-soija-agaralustan pinnalle (BBL), joka on rikastettu 10,8 %:lla sakkaroosia protoplastien osmoottiseksi stabiloimiseksi. Petrimaljat inkuboidaan 24 tuntia 15°C:ssa, minkä jälkeen 20 jokaiseen maljaan lisätään 4 ml nesteytettyä agaria (0,41 % w/v, 42°C:ssa), jossa on 0,8 M NaCl ja riittävästi hyg-romysiiniä, jotta saavutetaan loppukonsentraatio 100 pg/ ml. Kun päällimäinen kerros on jähmettynyt, inkuboidaan petrimaljoja sitten 25°C:ssa kosteuskaapissa. Vaikkakin 25 jatkoviljelyyn riittävän kokoiset transformanttipesäkkeet ovat läsnä 12 päivää transformaation jälkeen, hitaammin kasvavilta transformanteilta voi viedä niinkin kauan kuin 60 päivää, että ne saavuttavat sopivan koon jatkoviljelyä varten. Epäonnistuneet transformantit on helposti erotet-30 tavissa pysyvistä transformanteista, koska epäonnistuneet transformantit eivät pysty kasvamaan jatkoviljeltäessä tuoreessa kasvualustassa, jossa on 100 pg/ml hygromysii-niä.

54 95810 G. Cephalosporium acremoniumi/pPS20 - ja C. acremo-nium/pPS21 -transformanttien analyysi Cephalosporium acremonlum/pPS20 -transformantlt ekspressoivat merkittävästi suurempia tasoja isopenisil-5 liini N -syntetaasin aktiivisuutta kuin kontrolliplasmi-dien X. acremonium-transformantit, kuten plasmidi pIT221.

Tästä suuresta aktiivisuustasosta seuraa transformanttien lisääntynyt kyky valmistaa isopenisilliini N:ää, joko fer-mentaatiossa tai C. acremonium/pPS20 -transformanttien so-10 lu-uutteissa. Cephalosporium acremonium/pPS21 -transfor-mantit ovat hygromysiiniresistenttejä, mikä osoittaa tämän keksinnön mukaisen C. acremoniumin transkriptiota ja translaatiota aktivoivan sekvenssin toimivuuden.

Esimerkki 7 15 Plasmidien pPS21A, pPS22, pPS23, pPS23,l, pPS24, pPS25 ja pPS25,l konstruoiminen A. Välituoteplasmidien pPS23 ja pPS23,l konstruointi (i) BamHI-hajotetun plasmidin pUC8 valmistaminen 20 Noin 5 pg plasmldia pUC8 (saatu Pharmacia P-L Biochemicals' ilta) liuotettiin 5 pl:aan 10 x BamHI-reaktiopuskuria ja 40 μΐ:aan H20. Noin 5 μΐ (50 yksikköä) restriktioentsyy-miä BamHI lisättiin DNA-liuokseen, ja syntynyttä reaktio-seosta inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia. Reaktio lopetet-: 25 tiin uuttamalla puskuroidulla fenolilla, jota seurasi uut- to kloroformilla. BamHI:llä hajotettu plasmidin pUC8 DNA seostettiin säätämällä NaCl-pitoisuus 0,25 M:ksi, lisäämällä 2 tilavuutta etanolia ja jäähdyttämällä -70°C:ssa 10 minuuttia. BamHI-hajotetun plasmidin pUC8 DNA otettiin 30 talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin 5 plraan H20.

. (ii) Plasmidin pIT335 noin 0,85 kb:n Ncol-restriktiofrag- mentin eristäminen

Noin 10 pg plasmldia pIT335 liuotettiin 5 pl:aan 10 x BamHI-puskuria ja 40 pl:aan H20. Noin 5 μΐ (50 yksikköä) 35 restriktioentsyymiä Ncol lisättiin DNA-liuokseen, ja syn- : : BH '4 ii»*i Iita·- 55 95810 tynyttä reaktioseosta inkuboitiin 37°C:ssa kaksi tuntia. Reaktioseos laitettiin sitten 1 %:lle agaroosigeelille, ja haluttu noin 0,85 kb:n Ncol-restriktiofragmentti, joka sisältää IPS-geenin transkriptiota ja translaatiota akti-5 voivan sekvenssin, eristettiin oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti. Noin 1 pg haluttua fragmenttia saatiin ja suspendoitiin 5 plraan H20.

(iii) Plasmidin pPS23 konstruoinnissa käytetyn linkkerin valmistaminen 10 Seuraavan linkkerin yksinkertaiset säikeet synteti soitiin käyttäen automaattista DNA:n synteesilaitetta: 5'-CATGAAGAAG-3*

IMMI

3'-TTCTTCCTAG-5' 15

Noin 75 pikomoolia linkkerin kutakin yksittäistä säiettä liuotettiin jokainen erikseen 22,5/pl:aan H20 ja 2,5 pl:aan ligaasi-puskuria. Noin 1/μ1 (10 yksikköä) T4 DNA -kinaasia (Bethesda Research Laboratories) lisättiin kuhunkin yksi-20 säikeisen DNA:n liuokseen ja reaktioseoksia inkuboitiin 37°C:ssa 10 minuuttia. Kinaasireaktion jälkeen reaktio-seoksia inkuboitiin 70°C:ssa 15 minuuttia. Sitten, yksi-säikeisen DNA:n sulkemiseksi renkaaksi ja linkkerin muodostamiseksi, kaksi reaktioseosta yhdistettiin, inkuboi-25 tiin 65°C:ssa 10 minuuttia, inkuboitiin huoneenlämmössä 2 tuntia ja inkuboitiin sitten 4°C:ssa yli yön.

(iv) Plasmidien pPS23 ja pPS23,l lopullinen konstruointi l/μΐ BamHI-hajotetun plasmidin pUC8 DNA:ta lisättiin seokseen, jossa oli 4 μΐ plasmidin pIT335 noin 0,85 30 kb:n Ncol-restriktiofragmenttia ja 10 μΐ suljettua linkke-riä. Noin 4 μΐ 10 x ligaasipuskuria, 2 μΐ (500 yksikköä) T4 DNA -ligaasia, ja 29 μΐ H20:ta lisättiin DNA-seokseen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin yli yön +4eC:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutut plasmidit pPS23 j a pPS23,1.

35 50 ml E. colin K12 JM109 -viljelmää, saatavissa Pharmacia 56 95810 P-L Biochemicalsilta, L-liemessä kasvatettiin ODS90-arvoon noin 0,5 absorbanssiyksikköä. Viljelmää jäähdytettiin jäiden päällä 10 minuuttia, ja solut otettiin talteen sentri-fugoimalla. Solupelletti suspendoitiin 25 ml:aan kylmää 5 100 mM CaCl2:a ja inkuboitiin jäiden päällä 25 minuuttia.

Solut pelletoitiin jälleen kerran sentrifugoimalla, ja solupelletti suspendoitiin 2,5 ml:aan kylmää 100 mM CaCl2:a ja inkuboitiin jäiden päällä yli yön.

200 μΐ tätä solususpensiota sekoitettiin ligatoidun 10 DNA:n kanssa, jota valmistettiin edellä, ja inkuboitiin jäiden päällä 20 minuuttia. Tämän jakson lopussa solut asetettiin vesihauteeseen 42eC:seen 2 minuutiksi ja palautettiin sitten jäihin vielä 10 minuutiksi. Solut otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin 1 ml:aan 15 L-lientä ja inkuboitiin 37*C:ssa 2 tuntia.

Eriä soluseoksesta viljeltiin L-agarmaljoilla (L-liemi, jossa oli 15 grammaa litra agaria kohti), joissa oli 100 pg ampisilliinia/ml, 40 pg X-gal/ml, ja 40 pg IPTG/-ml. Maljoja inkuboitiin 37°C:ssa yli yön. Pesäkkeet, 20 jotka sisältävät plasmidin ilman inserttiä, kuten E. coli K12 JM109/PUC8, näyttävät sinisiltä näillä maljoilla. Pesäkkeet, jotka sisältävät plasmidin insertin kanssa, kuten E. coli K12 JM109/pPS23, ovat valkoisia. Useita valkoisia pesäkkeitä valittiin ja seulottiin suorittamalla niiden 25 plasmidi-DNA:n restriktioanalyysi noin 0,85 kb:n BamHI -restriktiofragmentin läsnäolon suhteen, jossa fragmentissa on IPS:n aktivoiva sekvenssi. Plasmidi-DNA:ta saatiin E. colin K12 JM109/pPS23 ja E. colin K12 JM109/pPS23,1 soluista oleellisesti kuten esimerkissä 2A on kuvattu.

30 B. Plasmidin pPS23 noin 0,85 kb:n BamHI-restriktio fragmentin eristäminen

Noin 50 pg plasmidin pPS23 DNA:ta liuotettiin 15 pl:aan 10 x BamHI-reaktiopuskuria ja 125 pl:aan H20. Noin 10 pl (100 yksikköä) restriktioentsyymiä BamHI lisättiin DNA-liuok-35 seen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 37°C:ssa kak- 57 9 5 8 1 0 si tuntia. BamHI:llä liuotettu plasmidi pPS23 DNA laitettiin 1 % agafoosigeelille, ja noin 0,85 kb:n BamHI-rest-riktiofragmentti, joka sisältää IPS-geenin aktivoivan sekvenssin, eristettiin oleellisesti esimerkin 2B menetelmän 5 mukaisesti. Haluttua fragraenttia saatiin noin 5 pg ja se suspendoitiin 10 pl:aan H20.

C. BamHl:llä hajotetun plasmidin pPS19 DNA:n valmistaminen

Noin 5 pg plasmidin pPS19 DNA:ta liuotettiin 10 10 pl:aan 10 x BamHI-reaktiopuskuria ja 35 pl:aan H20. Noin 5 pl (50 yksikköä) restriktioentsyymin BamHI lisättiin plasmidin pPS19 DNA-liuokseen, ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 37*C:ssa kaksi tuntia. Reaktioseosta, jossa oli BamHI:llä hajotettua plasmidin pPS19 DNA:ta, uutettiin 15 kerran puskuroidulla fenolilla ja sitten kahdesti fenolilla. DNA saostettiin sitten, otettiin talteen sentrifugoi-malla ja suspendoitiin uudelleen 10 pl:aan H20.

D. Plasmidien pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 ja pPS25,l lopullinen konstruktio 20 Noin 1 pl noin 0,86 kb:n BamHI-restriktiofragment- tia lisättiin seokseen, jossa oli 1 pl BamHI:llä hajotettua plasmidin pPS19 DNA:ta, 3 pl 10 x ligaasipuskuria, 2 pl T4 DNA -ligaasia, ja 23 pl H20. Syntynyttä ligaatioreak-tioseosta Inkuboitiin yli yön 15°C:ssa. Ligatoitu DNA kä-25 sitti halutut plasmidit pPS21A, pPS22, pPS24, pPS25 ja pPS25,1.

Ligatoitua DNA:ta käytettiin E. coli K12 C600:n transformointiin, mikä kanta on saatavissa American Type Culture Collectionista, Rockville, MD 20852, talletusnu-30 merolla ATCC 33525, oleellisesti esimerkin 7A (iv) menetelmän mukaisesti. Transformoidut solut viljeltiin L-agar-maljoilla, joissa oli 100 pg/ml ampisilliinia, ja maljoja inkuboitiin yli yön +37eC:ssa.

Yksittäisiä pesäkkeitä poimittiin transformaatio-35 maljoilta, viljeltiin ja käytettiin plasmidi-DNA:n valmis- 58 95810 tukseen. Plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyymiana-lyysillä. Seuraavassa taulukossa osoitetaan sopivat res-triktioentsyymien hajotustuotteet, joita voidaan käyttää plasmidien erottamiseksi toisistaan.

5

Plasmidi Entsyymi_kappaleiden koko(kb) pPsl9 BamHI 7,62 ja 0,23

PstI 5,15, 1,85 ja 0,85 10 pPS2lA BamHI 7,62 ja 0,85

PstI 5,15, 1,85, 0,99 ja 0,49 pPS22 BamHI 7,62 ja 0,85

PstI 5,15, 1,85, 0,94 ja 0,54 15 _ pPS24 BamHI 7,62

PstI 7,62 pPS25 BamHI 5,15, 1,85, 0,99 ja 0,72 20 ja pPS25,1 PstI 7,62, 0,85 ja 0,23

Plasmidien pPS21A ja pPS25 restriktiopaikka- ja toiminta-25 kartat esitetään kuvioissa 8 ja 9, vastaavasti.

Plasmideja -PS21A, pPS25,l ja pPS25 käytettiin Cep-halosporium acremoniumin transformoimiseksi oleellisesti : esimerkin 6 menetelmän mukaisesti. C. acremonium/pP521A-, C. macremonium/pPS25,1- ja C. acremonium/pPS25 -transfor-30 mäntit olivat hygromysiiniresistenttejä. Plasmideja pPS22 ja pPS24 käytettiin myös C. acremonium transformoimiseksi, mutta nämä plasmidit transformoivat C. acremoniumin hygro-mysiiniresistentiksi paljon alhaisemmalla frekvenssillä . kuin plasmidit pPS21A, pPS25,l ja pPS25, oletettavasti sen 35 vuoksi, että plasmidien pPS22 ja pPS24 täytyy liittyä C. acremoniumin genomiin sopivassa orientaatiossa, jotta C. acremoniumin genomin aktivoiva sekvenssi voisi toteuttaa hygromysiiniresistenssin antavan geenin ekspression.

i 59 95810

Esimerkki 8

Plasmidien pPS28 ja pPS29 konstruointi

Noin 20 μΐ plasmidin pPS2lA DNA:ta liuotettiin 10 pl:aan 10 x Pstl-reaktiopuskuria (1,0 M NaCl, 100 mM 5 Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, ja 1 mg/ml BSA) ja 88 pl:aan H20. Noin 2 μΐ (150 yksikköä) restriktioentsyymiä PstI lisättiin DNA-liuokseen, reaktioseosta inkuboitiin 4 minuuttia 37°C:ssa, ja sitten reaktio lopetettiin inkuboi-malla 10 minuuttia 70eC:ssa. Osittain PstI-hajotettu plas-10 midin pPS21A DNA laitettiin agaroosigeelille ja elektroforeesin ja geelin värjäyksen jälkeen havaittiin seuraavat kappaleet: 8,5 kb (lineaarisoitu plasmidi), 8,0 kb, 7,5 kb, 7,0 kb, 6,6 kb, 6,1 kb, 5,2 kb, 3,3 kb, 2,3 kb, 1,9 kb, 1,5 kb, 1,0 kb, ja 0,5 kb. Noin 6,6 kb:n ja noin 6,1 15 kb:n Pstl-restriktiofragmentit eristettiin erikseen oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti; kumpaakin fragmenttia saatiin talteen noin 0,5 pg. Noin 6,6 kb:n Pstl-restriktiofragmentti liuotettiin 3 pl:aan 10 x ligaa-sipuskuria ja 25 pl:aan H20. Noin 2 μΐ T4 DNA -ligaasia li-20 sättiin DNA-liuokseen, ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin yli yön 15*C:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutun plasmidin pPS28 DNA:n, jota käytettiin E. colin K12 C600 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 7 menetelmän mukaisesti. Samalla tavalla suljettiin noin 6,1 kb:n - 25 Pstl-restriktiofragmentti ligatoimalla, jolloin saatiin pPS29, joka myös transformoitiin E. coliin K12 C600. Plasmidien pPS28 ja pPS29 restriktiopaikka- ja toimintakartat on esitetty kuvissa 10 ja 11, vastaavasti.

Plasmideja pPS28 ja pPS29 käytettiin Cephalosporium 30 acremoniumin transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 6 menetelmän mukaisesti. C. acremonium/pPS28 - ja C. acre- monium/pPS29, -transformanteilla oli hygromysiiniresis-tentti fenotyyppi ja plasmidien pPS28 ja pPS29 DNA transformoi C. acremoniumin hygromysiiniresistentiksi suurella 35 frekvenssillä.

60 95810

Esimerkki 9

Plasmidien pPS26 ja pPS26,l konstruointi

Noin 20 pg plasmidia pPS21A liuotettiin 10 pl:aan 10 x HindiIl-reaktiopuskuria ja 85μ1 H20. Noin 5 μΐ (50 yk-5 sikköä) restriktioentsyymiä HindiII lisättiin DNA-liuokseen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin kaksi tuntia 37eC:ssa. HindiII-hajotettu plasmidin pPS21A DNA laitettiin 1 % agaroosigeelille ja suoritettiin elektroforeesi kunnes noin 3,45 kb:n, noin 3,16 kb:n, noin 1,2 kb:n ja 10 0,69 kb:n HindiII-restriktiofragmentit erottuivat selvästi geelillä. Noin 3,45 kb:n Hindlll-restriktiofragmentti eristettiin oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti. Noin 5 pg haluttua noin 3,45 kb:n Hindlll-restriktio-fragmenttia saatiin ja suspendoitiin 10 pl:aan H20.

15 Noin 2 μΐ plasmidin pPS21A noin 3,45 kb:n Hindlll- restriktiofragmenttia lisättiin 1 pl:aan HindiII-hajotettua plasmidia pIT335, jota oli valmistettu esimerkissä 4A, 3 pl:aan 10 x ligaasipuskuria, 22 pl:aan H20 ja 2 μΐ T4 DNA -ligaasia. Syntynyttä ligaatioreaktioseosta inkuboitiin 20 yli yön 15°C:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutut plasmidit pPS26 ja pPS26,l. Ligatoitua DNA:ta käytettiin E. colin K12 C600 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 7 menetelmän mukaisesti. E. coli K12 C600/pPS26 - ja E. coli K12 C600/pPS26,l -transformantit identifioitiin ampisilliini-25 resistentin fenotyypin suhteen ja niiden plasmidi-DNA:n restriktioentsyymianalyysillä. Plasmidin pPS26 restrik-tiopaikka ja toimintakartta on esitetty kuviossa 12.

Plasmideja pPS26 ja pPS26,l käytettiin Cephalospo-rium acremoniumin transformoimiseksi oleellisesti esimer-30 kin 6 menetelmän mukaisesti. Plasmidit pPS26 ja pPS26,l transformoivat C. acremoniumin hygromysiinille resistentiksi suurella frekvenssillä ja C. acremonium/pPS26 - ja C. acremonium/pPS26,1 -transformantit tuottivat merkittävästi enemmän isopensilliini N:ää, mitattuna Micrococcus 35 luteuksen kasvun inhibiitiovyöhykkeinä, kuin niiden ei-transformoidut rinnakkaisviljelmät.

61 95810

Esimerkki 10

Plasmidien pPS30, pPS30,l, pPS31 ja pPS31,l konstruointi A. Plasmidin pPS6 noin 3,7 Xmal-restriktiofragmen- 5 tin eristäminen

Plasmidi pPS6 kuvataan EP-patenttijulkaisun 177 243 esimerkissä 13, joka sisällytetään tähän viitteenä. Noin 10 pg plasmidia pPS6 liuotettiin 20 pl:aan 10 x Xmal-reak-tiopuskuria (250 mM NaCl, 100 mM Tris-ELCl, pH 7,5, 100 mM 10 MgCl, 100 mM 2-merkaptoetanoli, ja 1 mg/ml BSA) ja 165 pl:aan H20. Noin 15 μΐ (30 yksikköä) restriktioentsyymiä Xmal lisättiin plasmidin pPS6 DNA-liuokseen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin neljä tuntia 37eC:ssa.

Xmalillä hajotettu plasmidin pPS6 DNA laitettiin 1 15 % agaroosigeelille ja sille tehtiin elektroforeesi, kunnes noin 3,7 kb:n Xmal-restriktiofragmentti erottui selvästi muista hajotustuotteista. Noin 3,7 kb:n Xmal-restriktiofragmentti eristettiin sitten oleellisesti esimerkin 2B menetelmän mukaisesti. Noin 5 pg haluttua noin 3,7 kb:n 20 Xmal-restriktiofragmenttia saatiin ja suspendoitiin 10 pl: aan H20.

B. Plasmidien pPS30 ja pPS30,l lopullinen konstruoiminen

Noin 1 pg plasmidin pPS21A DNA:ta liuotettiin 2 25 pl:aan 10 x Xmal-reaktiopuskuria ja 6 pl:aan H20. Noin 2 pl (6 yksikköä) restriktioentsyymiä Xmal lisättiin plasmidin pPS21A DNA-liuokseen ja syntynyttä reaktiota inkuboitiin neljä tuntia 37°C:ssa. Reaktio lopetettiin uuttamalla puskuroidulla fenolilla, mitä seurasi kaksi uuttoa klorofor-30 millä. Reaktioseos seostettiin sitten, otettin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin 23 pl:aan H20.

Noin 2 pl plasmidin pPS6 noin 3,7 kb:n Xmal-restriktiofragmenttia, 3 pl 10 x ligaasi-puskuria ja 2 pl T4 DNA-ligaasia lisättiin Xmal:llä hajotetun plasmidin pPS21A 35 DNA-liuokseen, ja syntynyttä ligaatioreaktioseosta inku- 62 95810 boitiin yli yön 15°C:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutut plasmidit pPS30 ja pPS30,l, jotka eroavat toisistaan ainoastaan noin 3,7 kb:n Xmal-fragmentin orientaation puolesta.

5 Ligatoitua DNA:ta käytettiin E. coli K12 C600 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 7 menetelmän mukaisesti. E. coli K12 C600/pPS30 - ja E.coli K12 C600/ pPS30,l -transformantit identifioitiin niiden ampisillii-niresistentin fenotyypin osalta ja niiden plasmidi-DNA:n 10 restriktioentsyymianalyysillä.

Plasmideja pPS30 ja pPS30,l käytettiin myös Cepha-losporium acremoniumin transformoimiseksi. C. acremonium/ pPS30 ja C. acremonium/pPS30,1 -transformantit olivat resistenttejä hygromysiinille.

15 C. Plasmidien pPS31 ja pPS31,l lopullinen kons truointi

Plasmidit pPS31 ja pPS31,l konstruoitiin ja sitten transformoitiin E. coliin K12 C600 ja Cephalosporiurn ac-remoniumiin oleellisesti esimerkin 10B menetelmän mukai-20 sesti sillä poikkeuksella, että plasmidia pPS29, eikä plasmidia pPS21A, käytettiin lähtömateriaalina konstruoinnissa.

Esimerkki 11

Plasmidin pPS27 konstruointi 25 A. Plasmidin pIT336 konstruointi

Noin 1 pg plasmidia pUC8 liuotettiin 2 pl:aan 10 x BamHI-reaktiopuskuria ja 16 yl:aan H20. Noin 2 μΐ (20 yksikköä) restriktioentsyymiä BamHI lisättiin plasmidin pUC8 DNA-liuokseen, ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 30 kaksi tuntia 37°C:ssa. BamHI:llä hajotettu plasmidin pUC8 DNA seostettiin, otettiin talteen sentrifugoimalla ja sus-pendoitiin 2 pliaan 10 x Sall-reaktiopuskuria (1,5 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, pH 7,9, 60 mM MgCl2; 60 mM 2-merkaptoeta-noli, ja 1 mg/ml BSA) ja 16 pl:aan HzO. Noin 2 μΐ (20 yk-35 sikköä) restriktioentsyymiä Sali lisättiin BamHI :llä hajo- 63 95810 tetun plasmidin pUC8 DMA-liuokseen ja syntynyttä reaktio-seosta lnkuboitiin kaksi tuntia 37°C:ssa. Reaktio lopetettiin fenolilla uuttamalla kanssa, mitä seurasi kaksi uut-toa kloroformilla SalI-BamHI:llä hajotetun plasmidin pUC8 5 DNA saostettiin, otettiin talteen sentrifugoimalla ja sus-pendoitiin 5 pl:aan H20.

Noin 10 pg plasmidia pIT335 liuotettiin 10 pl:aan 10 x BamHI-reaktiopuskuria ja 80 pl:aan H20. Noin 5 μΐ (50 yksikköä) kumpaakin restriktioentsyymiä XhoI ja BamHI li-10 sättiin plasmidin pIT335 DNA:n liuokseen ja syntynyttä reaktioseosta lnkuboitiin kaksi tuntia 37°C:ssa. Reak-tioseos laitettiin sitten 1 % agaroosigeelilla ja sitten tehtiin elektroforeesi kunnes noin 1,4 kb:n BamHI-Xhol -restriktiofragmentti erottui muista reaktiotuotteista, 15 jotka olivat 5,6 kb:n, 1,3 kb:n ja 0,01 kb:n fragmentit.

Noin 1,4 kb:n BamHI-XhoI -restriktiofragmentti, joka sisälsi IPS-geenin transkription lopetus- ja mRNA:n polyade-nylaatio- ja prosessisignaalit, eristettiin oleellisesti esimerkin 2B mukaisesti. Noin 2 pg haluttua fragmenttia 20 saatiin ja suspendoitiln 5 pl:aan H20.

5 pl SalI-BamBI:llä hajotettua plasmidia pUC8 lisättiin seokseen, jossa oli 2 pl plasmidin pIT335 noin 1,4 kb:n BamHI-XhoI -restriktiofragmenttia, 3 pl 10 x ligaasi-puskuria, 18 pl H20 ja 2 pl T4 DNA -ligaasia. Syntynyttä 25 reaktioseosta lnkuboitiin yli yön 15*C:ssa. Sali- ja Xhol-"overlap!t" (päällekkäisfragmentlt) sopivat yhteen liga-tiota varten mutta kerran ligatoituvaan ei Sali eikä XhoI katkaise DNA:ta liitoskohdasta. Ligatoitu DNA muodosti halutun plasmidin pIT336 ja sitä käytettiin E. colin K12 30 RR1 A Ml5 transformoimiseksi, joka on saatavissa NRRL:stä talletusnumerolla NRRLB-15440, oleellisesti esimerkin 7A

(iv) menetelmän mukaisesti. Transformoidut solut viljeltiin L-agarmaljoilla, jotka sisälsivät 100 pg/ml ampisil-liinia, 40 pg/ml X-gal ja 40 pg/ml IPTG. Pesäkkeitä, jotka 35 eivät osoittaneet sinistä väriä transformaatiomaljoilla, „ 95810 64 viljeltiin, käytettiin plasmidi-DNA:n valmistamiseksi ja plasmidi-DNA analysoitiin restriktioentsyymianalyysillä E. coli K12 RR1 Δ M15/pIT336 -transformanttien identifioimiseksi. Plasmidin pIT336 restriktiopaikka- ja toimintakart-5 ta on esitetty kuviossa 14.

B. Plasmidin pPS35 konstruointi

Noin 2 pl plasmidia pIT226 liuotettiin 2 plraan 10 x Pstl-reaktiopuskuria ja 17 pl:aan H20. Noin 1 μΐ (10 yksikköä) restriktioentsyymiä PstI lisättiin pIT336:n DNA-10 liuokseen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin 2 tuntia 37°C:ssa. Reaktio lopetettiin uuttamalla fenolilla, mitä seurasi kaksi uuttoa kloroformilla. Pstl:llä hajotettu plasmidin pIT336 DNA seostettiin sitten, otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin 86 pl:aan H20:ta.

15 Noin 10 μΐ 10 x ligaasi-puskuria ja 4 μΐ T4 DNA

-ligaasia lisättiin PstI-hajotetun plasmidin pIT336 DNA-liuokseen ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin yli yön 15°C:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutun plasmidin pPS35 ja sitä käytettiin E. colin K12 JA221 transformoimiseksi,

20 joka on saatavissa NRRL:stä talletusnumerolla NRRL

B-15211, oleellisesti esimerkin 7A (iv) menetelmän mukaisesti. Transformoidut solut viljeltiin L-agar-maljoilla, joissa oli 100 pg/ml ampisilliinia. Useita ampisilliinille resistenttejä pesäkkeitä eristettiin ja käytettiin plasmi-25 di DNA:n valmistukseen. Halutut E. coli K12 JA221/pPS35 -transformantit identifioitiin niiden plasmidi-DNA:n restriktioentsyymianalyysillä. Plasmidin pPS35 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 15.

C. Plasmidin pPS27 lopullinen konstruointi 30 Noin 2 μΐ plasmidia pPS35 liuotettiin 2 pl:aan 10 x

Hindlll-reaktiopuskuria ja 17 pl:aan vettä. Noin 1 μΐ (10 yksikköä) restriktioentsyymiä Hindlll lisättiin plasmidin pPS35 DNA-liuokseen, ja syntynyttä reaktioseosta inkuboitiin kaksi tuntia 37”C:ssa. Reaktio lopetettiin uuttamalla 35 fenolilla, mitä seurasi kaksi uuttoa kloroformilla. Hind- · 11 1 «lltl 1:1 l ii : i · 65 - 9 5 8 1 0 III-hajotettu plasmidin pPS35 DNA saostettiin, otettiin talteen sentrifugoimalla ja suspendoitiin 3 μΐ:aan 10 χ ligaasipuskuria ja 23 pl:aan H20.

Noin 2 μΐ plasmidin pPS29 noin 2,3 kb:n Hindlll-5 restriktiofragmenttia, joka plasmidi valmistettiin ja eristettiin oleellisesti esimerkin 9 menetelmän mukaisesti käyttäen lähtömateriaalina plasmidia pPS29 plasmidin pPS2lA sijasta, ja joka sisältää hygromysiiniresistenssin antavan geenin, jonka IPS-geenin aktivoiva sekvenssi to-10 teuttaa, ja 2 μΐ T4 DNA -ligaasia lisättiin Hindlll-hajo-tetun plasmidin pPS35 DNA-liuokseen. Syntynyttä ligaatio-reaktioseosta inkuboitiin yli yön 15°C:ssa. Ligatoitu DNA muodosti halutun plasmidin pPS27 ja sitä käytettiin E. Colin K12 JA221 transformoimiseksi oleellisesti esimerkin 15 11B menetelmän mukaisesti.

Ampisilliiniresistenttejä transformantteja viljeltiin ja käytettiin plasmidi-DNA:n valmistamiseen, joka analysoitiin restriktioentsyymianalyysillä haluttujen E. coli K12 JA221/pP527 -transformanttien identifioimiseksi.

20 Vain yksi lisätyn 3,45 kb:n Hindlll-restriktiofragmentin orientaatio tuottaa halutun plasmidin pPS27. Plasmidin pPS27 restriktiopaikka- ja toimintakartta on esitetty kuviossa 12.

Plasmidi pPS27 transformoi Cephalosporium acremo- 25 niumin hygromysiiniresistentiksi fenotyypiksi suurella frekvenssillä. C. acremonium/pPS27 -transformantteja valmistetaan oleellisesti esimerkin 6 menetelmän mukaisesti.

Claims (21)

66 95810

1. Eristetty DNA-yhdiste, tunnettu siitä, että se on 5 a) kuviossa 1 esitetyn plasmidin plT335 noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI -restriktiofragmentti, joka voidaan saada E. coli -bakteerin kannasta K12 JA221/pIT335 (NRRL B-15960), tai b) DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu edellä määri-10 tellyn DNA-yhdisteen kanssa rajoittavissa olosuhteissa ja joka koodaa isopenisilliini N -syntetaasia.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA-yhdiste, tunnettu siitä, että se on plasmidin pIT335 noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI -restriktiofragmentti.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen eristetty DNA- yhdiste, tunnettu siitä, että sen koodaavan säikeen sekvenssi on 5'-ATG GGT TCC GTT CCA GTT CCA GTG GCC AAC GTC CCC CGA 2Q AXC GAT GTC TCG CCC CTA TTC GGC GAT GAC AAG GAG AAG AAG CTC GAG GTA GOT CGC GCC ATC GAC GCC GCA TCG CGC GAC ACA GGC TTC TTT TAC GCG GTG AAC CAC GGT GTC GAC CTG CCG TGG CTC TCG CGC GAG ACG AAC AAA TTC CAC ATG AGC ATC ACG GAC GAG GAG AAG TGG CAG CTC GCC ATC CGG GCC TAC AAC AAG GAG

25 CAC GAG TCC CAG ATC CGG GCG GGC TAC TAC CTG CCG ATC CCG GGC AAG AAG GCG GTC GAA TCG TTC TGC TAC CTG AAC CCC TCC TTC AGC CCA GAC CAC CCG CGA ATC AAG GAG CCC ACC CCT ATG CAC GAG GTC AAC GTC TGG CCG GAC GAG GCG AAG CAC CCG GGG TTC CGG GCC TTC GCC GAG AAG TAC TAC TGG GAC GTC TTC GGC 3Q CTC TCC TCC GCG GTG CTG CGC GGC TAC GCT CTC GCC CTA GGT CGC GAC GAG GAC TTC TTC ACC CGC CAC TCC CGC CGT GAC ACG ACG CTC TCG TCG GTC GTG CTC ATC CGT TAC CCG TAC CTC GAC CCG TAC CCG GAG CCG GCC ATC AAG ACG GCC GAC GAC GGC ACC AAG CTC AGC TTC GAG TGG CAC GAG GAC GTG TCC CTC ATC ACG

35 GTG TTG TAC CAG TCC GAC GTG CAG AAT CTG CAG GTC AAG ACC CCG CAG GGC TGG CAG GAC ATC CAG GCT GAC GAC ACG GGC TTC 67 - 9 5 8 1 0 CTC ATC AAC TGC GGC AGC TAC ATG GCC CAT ATC ACC GAC GAC TAC TAC CCG GCC CCG ATC CAC CGC GTC AAA TGG GTC AAC GAG GAG CGC CAG TCA CTG CCC TTC TTC GTC AAC CTC GGC TGG GAG

4. Rekombinantti-DNA-vektori, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaisen DNA-yhdisteen.

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, t u n -15 n e t t u siitä, että se on plasmidi.

5 GAC ACC ATC CAG CCG TGG GAC CCC GCG ACC GCC AAG GAT CCC GCC AAG GAT GCC GCC AAG GAC AAG CCG GCC ATC TCC TAC GGA GAG TAT CTG CAG GGG GGA CTG CGG GGC TTG ATC AAC AAG AAT GGT CAG ACC TAA-3' jossa sekvenssissä A on deoksiadenyyli, G on deoksiguanyy-10 li, C on deoksisytidyyli ja T on tymidyyli.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on plasmidi pIT335 (NRRL B-15960), joka on esitetty kuviossa 1.

7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen vektori, t u n -20 n e t t u siitä, että se on plasmidi pIT337, joka muodostaan liittämällä plasmidin pCZ106 (NRRL B-15959) noin 1,6 kb:n NcoI-BamHI - ja noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol -restriktio-fragmentit plasmidin pIT335 (NRRL B-15960) noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI -restriktiofragmenttiin, ja joka on esitetty 25 kuviossa 3.

8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se käsittää Saccharomyces cerevi-siae -hiivan fosfoglyseraattikinaasin geenin transkriptio-naalisen ja translaationaalisen aktivoivan sekvenssin val- 30 miudessa hygromysiiniresistenssin antavaa geeniä koodaavan DNA-sekvenssin ekspressiota varten.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen vektori, tunnettu siitä, että se on kuviossa 5 esitetty plasmidi pPS20, joka muodostetaan insertoimalla plasmidin pIT221 35 noin 2,7 kb:n HindiII-restriktiofragmentti, joka käsittää ee 95810 Saccharomyces cerevisiae -hiivan transkriptionaalisen ja translaationaalisen aktivoivan sekvenssin, edellä patenttivaatimuksessa 2 määritellyn plasmidin pIT335 ainoaan HindiII-restriktioentsyymin tunnistuskohtaan, tai sen 5 funktionaalisesti ekvivalentti isomeeri, plasmidi pPS20,l.

10 E. coli -bakteerin kannasta K12 JA221/pIT335 (NRRL B-15960).

10. Menetelmä isopenisilliini N -syntetaasiaktii-visuuden tuottamiseksi isäntäsolussa, tunnettu siitä, että se käsittää vaiheet, joissa: (1) transformoidaan bakteeri- tai homesieni-isäntä 10 rekombinantti-DNA-ekspressiovektorilla, joka käsittää pa tenttivaatimuksen 1, 2 tai 3 mukaista DNA-yhdistettä, joka on varustettu ekspressiota varten transkriptionasiisella ja translaationaalisella aktivoivalla sekvenssillä, joka on toiminnallinen mainitussa isäntäsolussa, ja *5 (2) viljellään vaiheessa (1) transformoitua isän- täsolua olosuhteissa, jotka mahdollistavat mainitun DNA:n ekspression.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-yhdiste on kuviossa 1 20 esitetyn plasmidin pIT335 noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI -rest-riktiofragmentti, joka voidaan saada E. coli -bakteerin kannasta K12 JA221/pIT335 (NRRL B-15960).

12. Patenttivaatimuksen 10 tai 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että DNA-yhdiste koodaa ami- 25 nohapposekvenssiä: MET GLY SER VAL PRO VAL PRO VAL ALA ASH VAL PRO ARG ILE ASP VAL SER PRO LEU PHE GLY AS? ASP LYS GLU LYS LYS LEU GLU VAL ALA ARG ALA ILE ASP ALA ALA SER ARG ASP TER GLY

30 PHE PHE TYR ALA VAL ASN HIS GLY VAL ASP LEU PRO TRP LEU SER ARG GLU THR ASN LYS PEE HIS MET SER ILE TER ASP GLU GLU LYS TRP GLN LEU ALA ILE ARG ALA TYR ASN LYS GLU HIS GLU SER GLN ILE ARG ALA GLY TYR TYR LEU PRO ILE PRO GLY LYS LYS ALA VAL GLU SER PHE CYS TYR LEU ASN PRO SER PHE

35 SER PRO ASP HIS PRO ARG ILE LYS GLU PRO- THR PRO MET HIS 69 - 9 5 8 1 0 GLU VAL ASH VAL TRP PRO AS? GLU ALA LYS HIS PRO GLY ΡΗΣ ARG ALA PEE ALA GLU LYS TYR TYR TRP AS? VAL PEE GLY LEU ~SER SER ALA VAL LEU ARG GLY TYR ALA LEU ALA LEU GLY ARG ASP GLU AS? ΡΗΞ PHE TER ARG HIS SER ARG ARG ASP TER THR LEU SER SER VAL VAL LEU ILE ARG TYR PRO TYR LEU AS? PRO TYR PRO GLU PRO ALA ILE LYS THR ALA AS? AS? GLY TER LYS LEU SER PEE GLU TRP HIS GLU AS? VAL SER LEU ILE TER VAL LEU TYR CLN SER ASP VAL GLN ASN LEU GLN VAL LYS TER PRO 10 GLN GLY TRP GLN ASP ILE GLN ALA ASP ASP THR GLY PEE LEU ILE ASN CYS GLY SER TYR MET ALA HIS ILE THR AS? AS? TYR TYR PRO ALA PRO ILE HIS ARG VAL LYS TRP VAL ASN GLU GLU ARG GLN SER LEU PRO PHE PHE VAL ASN LEU GLY TRP GLU AS? TER ILE GLN PRO TRP AS? PRO ALA THR ALA LYS AS? GLY ALA 15 LYS AS? ALA ALA LYS AS? LYS PRO ALA ILE SER TYR GLY GLU TYR LEU GLN GLY GLY LEU ARG GLY LEU ILE ASN LYS ASN GLY GLN THR 20 jossa sekvenssissä ALA on alanllnltähde, ARG on arginii-nitähde, ASN on asparagiinitähde, ASP on asparagiinihap-potähde, CYS on kysteiinitähde, GLN on glutamiinitähde, GLU on glutamiinihappotähde, GLY on glysiinitähde, HIS on histidiinitähde, ILE on isoleusiinitähde, LEU on leusiini-25 tähde, LYS on lysilnltähde, MET on metionilnitähde, PHE on fenyylialaniinitähde, PRO on proliinitähde, SER on serii-nitähde, THR on treoniinitähde, TRP on tryptofaanitähde, TYR on tyrosiinitähde ja VAL on valiinitähde.

13. Patenttivaatimuksen 10, 11 tai 12 mukainen me-30 netelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu kuuluu sukuihin Cephalosporium tai E. coli.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on Cephalosporium acremonium tai E. coli. 70 95810

15. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelty isäntäsolu on E. coli/pIT337, joka saadaan transformoimalla E. coli plasmidilla pIT337, joka saadaan eristämällä 5 plasmidi pCZl06 E. coli -bakteerikannasta K12 RV308/pCZ106 (NRRL B-15959), hajottamalla ja eristämällä noin 8,7 kb:n Ncol-Ncol - ja noin 1,6 kb:n NcoI-BamHI -fragmentit ja li-gatoimalla nämä fragmentit plasmidin pIT335:n noin 1,5 kb:n NcoI-BamHI-restriktiofragmentti, joka voidaan saada

16. Minkä tahansa patenttivaatimuksen 10 - 14 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että viljelty isäntäsolu on Cephalosporium acremonium/pPS20, joka saa- 15 daan transformoimalla Cephalosporium acremonium kuviossa 5 esitetyllä plasmidilla pPS20.

17. Bakteeri tai homesieni, tunnettu siitä, että se on transformoitu minkä tahansa patenttivaatimuksen 4-9 mukaisella rekombinantti-DNA-vektorilla.

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coli.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on E. coli K12/pIT335 (NRRL B-15960).

20. Patenttivaatimuksen 17 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Cephalosporium acremonium .

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on Cephalosporium acremo- 30 nium/pPS21, joka saadaan transformoimalla Cephalosporium acremonium kuviossa 7 esitetyllä plasmidilla pPS21. 71 95810